CN108660144A

CN108660144A - 一种牛支原体多功能蛋白CDNPase

Info

Publication number: CN108660144A
Application number: CN201710200623.7A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 朱习芳; 董亚旗; 李茜茜; 陈颖钰; 胡长敏; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2018-10-16

Abstract

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一种牛支原体多功能蛋白基因CDNPase，蛋白基因Mbov_0328是从牛支原体HB0801基因组中克隆获得。根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，申请人对Mbov_0328基因进行了修饰，将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中编码色氨酸的密码子UGG，最终获得由大肠杆菌表达的重组蛋白rCDNPase。本发明克隆的蛋白的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO:11中1‑969位碱基所示的序列，其蛋白质的序列如SEQ ID NO:12所示。本发明的重组蛋白具有磷酸二酯酶和超小片段核酸酶的活性。

Description

一种牛支原体多功能蛋白CDNPase

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体多功能蛋白CDNPase，该蛋白可以降解环二核苷酸和超小片段核酸。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是牛的一种重要的致病性病原，可以引起牛的肺炎，关节炎，乳腺炎及角膜结膜炎等症状。牛支原体于1961年首次在美国从患***炎奶牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎的重要病原体。该病对任何月龄肉牛和奶牛呼吸均易感，感染牛的发病率为40％，死亡率为10％。目前，牛支原体病在世界范围内广泛流行，已成为危害养牛业的主要传染病和常发病，给全球养牛业带来了严重的经济损失。美国每年由于牛支原体感染所致牛呼吸***疾病和乳腺疾病造成的损失分别为3200万和1.08亿美元，单个牛场最高感染率可达70％(Rosengarten等，1999)；在英国，每年约有190万头牛患牛支原体肺炎，导致的经济损失达到5400万英镑(Nicholas&Ayling，2003)；

2008年，在湖北省从外地引进的肉牛中爆发呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，率先在全国确定该病为“传染性牛支原体肺炎”。此后牛支原体肺炎呈全国性流行，主要发生在新引入的育肥牛中，一般在引入后10-15天左右发病，发病率为80％以上。该病临床治疗效果差，死亡率高，平均死亡率为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。该病的发生与我国肉牛养殖产业化的快速发展直接相关。由于我国养牛业向规模化和集约化发展，牛养殖量大大增加，专门化程度大幅度提高，肉牛“异地育肥”已经成为重要的肉牛养殖模式，全国出现大规模的“北牛南调、西牛东运”的牛群转运现象。架子牛反复倒运引起的运输应激成了该病暴发流行的诱因(郭爱珍等，2011)。

然而，由于支原体本身的生物学特征及研究手段有限，50多年来一直缺乏针对该病原体的特异性防控手段，既无有效疫苗也无特效药物。阐明其毒力机制和致病机理是研究特效防治措施的前提条件。但目前对牛支原体的毒力机制仍知之甚少，尚未发现其具有经典的毒素和毒力因子和毒力岛。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重要的牛支原体功能蛋白CDNPase，该蛋白具有环二核苷酸磷酸二酯酶和超小片段核酸酶活性，即可以降解环二核苷酸和超小片段核酸。

为了实现本发明的目的，申请人所在农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体基因缺失突变体库中筛选出一株生长缺陷菌株。经分析，该缺失基因具有DHH-DHHA1结构域，预测其具有环二核苷酸磷酸二酯酶(cyclic dinucleotidephosphodiesterase，CDNPase)活性。进一步验证确定其重组蛋白具有环二核苷酸磷酸二酯酶活性，可以降解c-di-AMP和c-di-GMP等环二核苷酸。同时本发明发现，该蛋白还具有超小片段核酸酶的功能，能降解pApA和pGpG等超小片段核酸。环二核苷酸是细胞内的第二信使分子，对病原菌的生理活动、毒力和抗宿主防御反应具有重要作用。该信号分子在细胞内环境中的稳定受二核苷酸环化酶和环二核苷酸磷酸二酯酶的调控，因此CDNPase对细菌生理活动和致病因子具有重要的调控作用，是研发新药和疫苗的重要潜在靶点。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovisHB0801,于2010年2月1日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2010040。进一步地，本发明的前期工作包括构建了牛支原体HB0801的随机突变体库。

本发明首先利用细胞模型从突变体库中筛选生长缺陷的突变株，从中选择生长缺陷最明显的突变株进行突变基因鉴定，确定为Mbov_0328株。进一步以牛支原体HB0801(基因组在GenBank上的登录号为CP002058)中基因组为模板克隆该基因。克隆过程中，根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行了基因修饰，即将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中的色氨酸密码子UGG，共进行了5个密码子的突变，以保证其在大肠杆菌中表达。

经过人工突变后的牛支原体基因Mbov_0328的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO:11的1-969位碱基所示的序列，其长度为969bp；其中在该序列的372位，435位，771位，906位和957位发生等位基因突变；

该牛支原体CDNPase蛋白基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:12所示，共编码323个氨基酸。

将本发明的牛支原体Mbov_0328基因的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-28b-Mbov_0328转化大肠杆菌DH5α得到重组大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pET-28b-Mbov_0328，Escherichia coli pET-28b-Mbov_0328，于2017年3月9日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2017100。该菌株在IPTG诱导下，表达Mbov_0328基因编码的重组蛋白rCDNPase。

经过验证，本发明纯化的重组蛋白rCDNPase具有环二核苷酸磷酸二酯酶及超小片段核酸酶的功能。

本发明所述的牛支原体rCDNPase在降解环二核苷酸及超小片段核酸中的作用，包括下列步骤：

利用HPLC方法对rCDNPase活性进行检测，将重组蛋白rCDNPase与环二核苷酸c-di-AMP/c-di-GMP以及超小片段核酸pApA/pGpG在37℃条件下分别进行反应，同时设置阴性对照。将反应产物利用高压液相色谱法(HPLC)进行分离，同时设置标准品(c-di-AMP、c-di-GMP、pApA、pGpG、AMP、GMP)对照，在紫外吸收波长A₂₅₄nm条件下进行检测，样品检测结果与标准品进行比较，出峰时间相同即为相应的降解产物。

本发明具有以下优点：

1、本发明的牛支原体CDNPase基因是发明人从牛支原体基因缺失突变体库中筛选获得的生长相关基因，并根据大肠杆菌密码子偏爱性进行了人工修饰。

2、本发明的牛支原体CDNPase重组蛋白已被发明人证实具有环二核苷酸磷酸二酯酶及超小片段核酸酶活性。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328a1的序列。

序列表SEQ ID NO:2是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328a2的序列。

序列表SEQ ID NO:3是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328b1的序列。

序列表SEQ ID NO:4是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328b2的序列。

序列表SEQ ID NO:5是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328c1的序列。

序列表SEQ ID NO:6是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328c2的序列。

序列表SEQ ID NO:7是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328d1的序列。

序列表SEQ ID NO:8是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328d2的序列。

序列表SEQ ID NO:9是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328e1的序列。

序列表SEQ ID NO:10是扩增Mbov_0328基因片段的引物0328e2的序列。

序列表SEQ ID NO:11是本发明人工突变牛支原体Mbov_0328基因的核苷酸序列，序列长度为969bp。其中在该序列的372位，435位，771位，906位和957位发生等位基因突变。

序列表SEQ ID NO:12是本发明的牛支原体CDNPase蛋白的蛋白质序列，编码 323个氨基酸。

图1：是本发明牛支原体生长缺陷菌株定量检测分析图。方框所示为生长缺陷最显著的突变菌株T9.386。

图2：是本发明实施例中空质粒pET-28b的质粒图谱。pET-28b为商业化质粒，购自Novagen公司。

图3：是本发明制备的重组质粒pET-28b-Mbov_0328的图谱。重组质粒pET-28b-Mbov_0328是由pET-28b质粒和突变后的Mbov_0328基因全长(TAA终止密码子除外)经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

图4：是本发明纯化的牛支原体rCDNPase蛋白胶图。附图标记说明：泳道M：蛋白质marker；1：纯化的牛支原体rCDNPase重组蛋白。

图5：是本发明牛支原体rCDNPase蛋白环二核苷酸磷酸二酯酶活性。附图标记说明：图5中的A图：AMP标准品；图5中的B图：c-di-AMP标准品；图5中的C图：GMP标准品；图5中的D图：c-di-GMP标准品；图5中的E图：rCDNPase体外降解c-di-AMP结果；图5中的F图：rCDNPase体外降解c-di-GMP结果。

图6：是本发明牛支原体rCDNPase蛋白超小片段核酸酶活性。附图标记说明：图6中的A图：AMP标准品；图6中的B图：pApA标准品；图6中的C图：GMP标准品；图6中的D图：pGpG标准品；图6中的E图：rCDNPase体外降解pApA结果；图6中的F图：rCDNPase体外降解pGpG结果。

具体实施方式

实施例1：牛支原体生长缺陷突变体的筛选鉴定

(1)牛支原体生长缺陷突变体高通量筛选

利用PEG8000介导的转化方法，成功构建了牛支原体HB0801的Tn4001转座子突变体库(Mahairas and Minion,1989)，该突变体库共包含2285个突变体，已按单个菌株分别保存。利用本实验室构建的生长缺陷实验细胞感染模型和96针复制器，对牛支原体突变体库进行高通量筛选。具体步骤如下：将牛胚胎肺细胞(Embryonic bovine lung，EBL)细胞按照4×104cells/cm2铺至96孔细胞培养板，利用96针复制器将突变体库分别接种至细胞培养板孔中，在37℃二氧化碳培养箱中共培养72h。经一次冻融循环(-80℃/+37℃)裂解细胞，利用96针复制器将各株突变体涂布PPLO固体平皿，于37℃二氧化碳培养箱中培养3-7天。初步筛选出26株没有可见菌落的突变体。

(2)牛支原体生长缺陷突变体定量检测复筛

将EBL细胞按照4×10⁴cells/cm²铺至24孔细胞培养板，利用感染比为0.5将初筛的26株突变体接种至EBL细胞中，设置野生株HB0801为阳性对照。将突变体与EBL细胞在37℃二氧化碳培养箱中共培养72h。经一次冻融(-80℃/+37℃)循环裂解细胞，利用菌落计数法定量测定26株突变体菌落数。结果显示T9.386突变菌株生长缺陷表型最显著(图1)。

(3)对T9.386菌株突变基因的鉴定

利用细菌基因组提取试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司，即Takara)，提取T9.386突变体全基因组，对Tn4001转座子与牛支原体全基因组连接处进行直接测序，将测序结果与牛支原体HB0801全基因组序列进行比对，结果显示，T9.386突变基因为Mbov_0328。

实施例2：牛支原体CDNPase蛋白的表达

1.牛支原体Mbov_0328基因克隆表达

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在本发明中牛支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体基因进行突变，使密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到牛支原体地方分离株，将其命名牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010040。本发明利用自行设计的PCR引物对该基因进行了突变，具体步骤是：以牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为CP002058)中的Mbov_0328基因为模板，利用如下设计的5对引物(编号分别为：0328 a1/0328 a2，0328 b1/0328 b2，0328 c1/0328 c2，0328 d1/0328 d2，0328 e1/0328 e2)分别扩增出突变后的Mbov_0328基因的5个片段，然后，以突变后的5个片段为模板，利用0328 a1/0328 e2引物对扩增得到突变后的Mbov_0328基因的全序列(TAA终止密码子除外)，序列长度为966bp(见序列表SEQ ID NO：13中1-966位碱基所示的序列，其编码区也是1-966位碱基对应的序列)。

扩增Mbov_0328基因的引物序列如下所示：

1.引物0328a1/0328a2，扩增片段在Mbov_0328基因中的位置为388431-388818碱基处，PCR扩增产物长度为388bp。

(1)正向引物0328a1:5’CATGCCATGGGCATGAAAATAGGTAATGCA 3’，(对应序列表SEQID NO：1所示的序列)。

(2)反向引物0328a2:5’CATAGTGCTCATCAACCCAGA 3’，(对应序列表SEQ ID NO：2所示的序列；下划线部分为突变位点，即由T突变为C)

2.0328b1/0328b2扩增片段在Mbov_0328基因中的位置为388369-388432碱基处，PCR扩增产物长度为64bp。

(1)正向引物0328b1:5’ATATCTGGGTTGATGAGCACTAT 3’(其中：下划线部分为突变位点，即由A突变为G；对应序列表SEQ ID NO：3所示的序列)。

(2)反向引物0328b2:5’TCTCTGATTAACAATCCATTTTGCTT 3’(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；对应序列表SEQ ID NO：4所示的序列)。

3.0328c1/0328c2扩增片段在Mbov_0328基因中的位置为388032-388392碱基处，PCR扩增产物长度为361bp。

(1)正向引物0328c1:5’GCAAAATGGATTGTTAATCAGAGAG 3’(下划线部分为突变位点，即由A突变为G；对应序列表SEQ ID NO：5所示的序列)。

(2)反向引物0328c2:5’ATTGTATAAAGAAGGCCCAGCA 3’(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；对应SEQ ID NO：6所示的序列)。

4、0328d1/0328d2扩增片段在Mbov_0328基因中的位置为387891-388051碱基处，PCR扩增产物长度为161bp。

(1)正向引物0328d1:5’CTGGGCCTTCTTTATACAATTAGAA 3’(下划线部分为突变位点，即由A突变为G；对应序列表SEQ ID NO：7所示的序列)。

(2)反向引物0328d2:5’TAATTACATCATTAACTTGACTCCATTTAG 3’(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；对应序列表SEQ ID NO：8所示的序列)。

5.0328e1/0328e2扩增片段在Mbov_0328基因中的位置为387853-387921碱基处，PCR扩增产物长度为69bp：

(1)正向引物0328e1:5’ACTAAATGGAGTCAAGTTAATGATGTAAT 3’，(下划线部分为突变位点，即由A突变为G；对应序列表SEQ ID NO：9所示的序列)。

(2)反向引物0328e2:5’CCGCTCGAGTTTTGCCTCCCATTCAATAATTA 3’，(对应序列表SEQ ID NO：10所示的序列)。

6.0328a1/0328e2扩增片段在Mbov_0328基因中的位置为387853-388818碱基处，PCR扩增产物长度为966bp

(1)正向引物0328a1:5’CATGCCATGGGCATGAAAATAGGTAATGCA 3’，(下划线部分为NcoⅠ酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；对应序列表SEQ ID NO：1所示的序列)。

(2)反向引物0328e2:5’CCGCTCGAGTTTTGCCTCCCATTCAATAATTA 3’，(下划线部分为XhoI酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；对应序列表SEQ ID NO：9所示的序列)。

上述5个片段的PCR反应体系如下：

模板DNA 2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfu buffer with MgSO₄(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各2μL，超纯水36μL。

回收以上五个片段的PCR扩增产物，以此为模板，使用引物0328a1/0328e2扩增突变后的Mbov_0328基因，其PCR反应体系如下：每个片段2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfubuffer with MgSO₄(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各2μL，超纯水36μL。上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

回收Mbov_0328基因的扩增产物，用NcoⅠ和XhoI酶切，同时将pET-28b质粒(图2)(购自默克中国有限公司)用NcoⅠ和XhoI进行双酶切。将酶切后的Mbov_0328基因和pET-28b质粒用DNA连接酶(T4DNA ligase)连接，得到重组质粒pET-28b-Mbov_0328(图3)。用该重组质粒pET-28b-Mbov_0328转化大肠杆菌DH 5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌BL21，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养至OD＝_0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3小时。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液【1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水】重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

将本发明的蛋白的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-28b-Mbov_0328转化到大肠杆菌DH5α中得到重组大肠杆菌，申请人将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌pET-28b-Mbov_0328；Escherichia coli pET-28b-Mbov_0328，于2017年3月9日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2017100。

2.牛支原体rCDNPase重组蛋白的纯化

将重组的大肠杆菌BL21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rCDNPase蛋白大部分表达于上清中。

rCDNPase蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；(5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mL washing buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mL elute buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白(图4)。

实施例3：牛支原体rCDNPase重组蛋白多功能验证

1.牛支原体rCDNPase重组蛋白磷酸二酯酶活性试验

(1)反应体系配制：加入如下反应溶液至1.5ml EP管中，Tris-HCL(pH 7.0)100mM,Mncl₂10mM,底物环二核苷酸(环二腺苷酸c-di-AMP和环二鸟苷酸c-di-GMP)50μM,rCDNPase重组蛋白5μM，反应总体系为100mL将配制的反应体系混匀，于37℃进行反应。

(2)磷酸二酯酶活性测定：采用HPLC分离检测方法对样品进行检测，具体设置如下：利用10％甲醇与0.2％的乙酸铵作为流动相，流速1mL/min，柱温箱控制在25℃，自动进样器进样量为10μL，将反应产物进行分离，紫外检测器波长设置为254nm，对反应产物进行检测。同时对标准品c-di-AMP、c-di-GMP、AMP、GMP进行检测，作为标准品对照。

(3)结果判断：利用相同物质的在色谱柱中的保留时间对测定结果进行判定，将反应产物出峰时间与标准品进行比较，确定反应产物类型。结果显示，重组蛋白rCDNPase可以将环二核苷酸c-di-AMP降解为AMP，将c-di-GMP降解为GMP(图5)。

2.牛支原体rCDNPase重组蛋白超小片段核酸酶活性

(1)反应体系配制：加入如下反应溶液至1.5ml EP管中，Tris-HCL(pH 7.0)100mM,Mncl₂10mM,底物超小片段核酸(pApA/pGpG)50μM,rCDNPase重组蛋白5μM，反应总体系为100mL将配制的反应体系混匀，于37℃进行反应。

(2)超小片段核酸酶活性测定：采用HPLC分离检测方法对样品进行检测，具体设置如下：利用10％甲醇与0.2％的乙酸铵作为流动相，流速1mL/min，柱温箱控制在25℃，自动进样器进样量为10μL，将反应产物进行分离，紫外检测器波长设置为254nm，对反应产物进行检测。同时对标准品pApA、pGpG、AMP、GMP进行检测，作为标准品对照。

(3)结果判断：利用相同物质的在色谱柱中的保留时间对测定结果进行判定，将反应产物出峰时间与标准品进行比较，确定反应产物类型。结果显示，重组蛋白rCDNPase可以将超小片段核酸pApA降解为AMP，将pGpG降解为GMP(图6)。

附录：说明书中名词术语说明：

牛支原体CDNPase重组蛋白以rCDNPase表示；

牛支原体CDNPase蛋白基因以Mbov_0328表示；

牛支原体本地分离株以牛支原体HB0801表示。

主要参考文献

1.郭爱珍,彭清洁,胡长敏.繁华牛市让人欢喜让人愁？——牛支原体肺炎调研东北行.养殖与饲料.第9页,2011,1:99-100.

2.石磊,龚瑞,尹争艳,周勇,裴洁,胡智斌,王利霞,胡长敏,刘涛,陈颖钰,廖娟红,赵俊龙,陈焕春,郭爱珍.肉牛传染性牛支原体肺炎流行的初步诊断.华中农业大学学报,2008：572.

3.Nicholas RA,Ayling RD.Mycoplasma bovis:disease,diagnosis,andcontrol.Res Vet Sci.2003Apr；74(2):105-12.

4.Rosengarten R,Citti C.The role of ruminant mycoplasmas in systemicinfection.In:Stipkovits,L,Rosengarten,R,Frey,J.Mycoplasmas of ruminants:pathogenicity,diagnostics,epidemiology and molecular genetics,EuropeanCommission,Brussels,1999.pp14-17.5.

5.Mahairas GG,Minion FC.Transformation of Mycoplasma pulmonis:demonstration of homologous recombination,introduction of cloned genes,andpreliminary description of an integrating shuttle system.J Bacteriol.1989，Apr；171(4):1775-80。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种牛支原体多功能蛋白CDNPase

<130>

<141> 2017-03-26

<160> 12

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(30)

<223>

<400> 1

catgccatgg gcatgaaaat aggtaatgca 30

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 2

catagtgctc atcaacccag a 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 3

atatctgggt tgatgagcac tat 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 4

tctctgatta acaatccatt ttgctt 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

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<221> gene

<222> (1)..(25)

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gcaaaatgga ttgttaatca gagag 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 6

attgtataaa gaaggcccag ca 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(25)

<223>

<400> 7

ctgggccttc tttatacaat tagaa 25

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(30)

<223>

<400> 8

taattacatc attaacttga ctccatttag 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(29)

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<400> 9

actaaatgga gtcaagttaa tgatgtaat 29

<210> 10

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<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

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<222> (1)..(32)

<223>

<400> 10

ccgctcgagt tttgcctccc attcaataat ta 32

<210> 11

<211> 969

<212> DNA

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(969)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (4)..(969)

<223>

<400> 11

atg aaa ata ggt aat gca aaa gtt gct ata gat gca att gaa aaa tac 48

Lys Ile Gly Asn Ala Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Glu Lys Tyr

1 5 10 15

aaa aat ata atc att ttt cac cat att cgt cct gat gga gac tgt tta 96

Lys Asn Ile Ile Ile Phe His His Ile Arg Pro Asp Gly Asp Cys Leu

20 25 30

ggc tca caa gct gga tta gct gaa tta att aga act aac tac ccc gaa 144

Gly Ser Gln Ala Gly Leu Ala Glu Leu Ile Arg Thr Asn Tyr Pro Glu

35 40 45

aaa aac gtt tat act gtt ggt gat aat gtt ggt gta ttt gac ttt atg 192

Lys Asn Val Tyr Thr Val Gly Asp Asn Val Gly Val Phe Asp Phe Met

50 55 60

aac tat aaa tat gat caa att gaa aaa ata gac ttt agt gac tct tta 240

Asn Tyr Lys Tyr Asp Gln Ile Glu Lys Ile Asp Phe Ser Asp Ser Leu

65 70 75

gga att gtg gtg gat gct tct agc tca aat cga att gaa tgt gct gag 288

Gly Ile Val Val Asp Ala Ser Ser Ser Asn Arg Ile Glu Cys Ala Glu

80 85 90 95

ctt tta tta aac aaa aaa att act gct gca ctt aga ata gac cat cat 336

Leu Leu Leu Asn Lys Lys Ile Thr Ala Ala Leu Arg Ile Asp His His

100 105 110

cct aat gat agt gat ata gaa tat caa tat atc tgg gtt gat gag cac 384

Pro Asn Asp Ser Asp Ile Glu Tyr Gln Tyr Ile Trp Val Asp Glu His

115 120 125

tat gta gct gct gca gaa atg att gca aaa att gct tat gaa gca aaa 432

Tyr Val Ala Ala Ala Glu Met Ile Ala Lys Ile Ala Tyr Glu Ala Lys

130 135 140

tgg att gtt aat cag aga gct gct gag cat ata ttt tta gga ata gta 480

Trp Ile Val Asn Gln Arg Ala Ala Glu His Ile Phe Leu Gly Ile Val

145 150 155

act gat agc gga aga ttt tta tat cct gat act tct gca aga aca cac 528

Thr Asp Ser Gly Arg Phe Leu Tyr Pro Asp Thr Ser Ala Arg Thr His

160 165 170 175

caa cta gtt tca ttt tta tat gaa aaa ggg aat ttg aag cca aag ttt 576

Gln Leu Val Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Gly Asn Leu Lys Pro Lys Phe

180 185 190

atg ttc aat gaa cta agc aaa aga acg atg gat gac att aaa ttc tcg 624

Met Phe Asn Glu Leu Ser Lys Arg Thr Met Asp Asp Ile Lys Phe Ser

195 200 205

ggt gaa ata ctt tca aat ttc aaa aaa caa ggc aga gtt tta tac tat 672

Gly Glu Ile Leu Ser Asn Phe Lys Lys Gln Gly Arg Val Leu Tyr Tyr

210 215 220

gag gtt act aat gaa gtg tta caa aaa ttt ggt cta agt agc ctt aaa 720

Glu Val Thr Asn Glu Val Leu Gln Lys Phe Gly Leu Ser Ser Leu Lys

225 230 235

gca gca aca ttt gtt aat gaa tta gct gat att gaa gat aat tct tgc 768

Ala Ala Thr Phe Val Asn Glu Leu Ala Asp Ile Glu Asp Asn Ser Cys

240 245 250 255

tgg gcc ttc ttt ata caa tta gaa gat ggc aaa att aga gga cgt ctt 816

Trp Ala Phe Phe Ile Gln Leu Glu Asp Gly Lys Ile Arg Gly Arg Leu

260 265 270

cgc tca aat ggc cca tta gtt aat aaa gta gct cca aaa tat ggt ggt 864

Arg Ser Asn Gly Pro Leu Val Asn Lys Val Ala Pro Lys Tyr Gly Gly

275 280 285

ggt ggt cat gat aat gct gct ggt att acg tta act aaa tgg agt caa 912

Gly Gly His Asp Asn Ala Ala Gly Ile Thr Leu Thr Lys Trp Ser Gln

290 295 300

gtt aat gat gta att aat gac cta aac cag tta att att gaa tgg gag 960

Val Asn Asp Val Ile Asn Asp Leu Asn Gln Leu Ile Ile Glu Trp Glu

305 310 315

gca aaa taa 969

Ala Lys

320

<210> 12

<211> 321

<212> PRT

<213> 牛支原体 (Mycoplasma bovis)

<400> 12

Lys Ile Gly Asn Ala Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Glu Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Asn Ile Ile Ile Phe His His Ile Arg Pro Asp Gly Asp Cys Leu Gly

20 25 30

Ser Gln Ala Gly Leu Ala Glu Leu Ile Arg Thr Asn Tyr Pro Glu Lys

35 40 45

Asn Val Tyr Thr Val Gly Asp Asn Val Gly Val Phe Asp Phe Met Asn

50 55 60

Tyr Lys Tyr Asp Gln Ile Glu Lys Ile Asp Phe Ser Asp Ser Leu Gly

65 70 75 80

Ile Val Val Asp Ala Ser Ser Ser Asn Arg Ile Glu Cys Ala Glu Leu

85 90 95

Leu Leu Asn Lys Lys Ile Thr Ala Ala Leu Arg Ile Asp His His Pro

100 105 110

Asn Asp Ser Asp Ile Glu Tyr Gln Tyr Ile Trp Val Asp Glu His Tyr

115 120 125

Val Ala Ala Ala Glu Met Ile Ala Lys Ile Ala Tyr Glu Ala Lys Trp

130 135 140

Ile Val Asn Gln Arg Ala Ala Glu His Ile Phe Leu Gly Ile Val Thr

145 150 155 160

Asp Ser Gly Arg Phe Leu Tyr Pro Asp Thr Ser Ala Arg Thr His Gln

165 170 175

Leu Val Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Gly Asn Leu Lys Pro Lys Phe Met

180 185 190

Phe Asn Glu Leu Ser Lys Arg Thr Met Asp Asp Ile Lys Phe Ser Gly

195 200 205

Glu Ile Leu Ser Asn Phe Lys Lys Gln Gly Arg Val Leu Tyr Tyr Glu

210 215 220

Val Thr Asn Glu Val Leu Gln Lys Phe Gly Leu Ser Ser Leu Lys Ala

225 230 235 240

Ala Thr Phe Val Asn Glu Leu Ala Asp Ile Glu Asp Asn Ser Cys Trp

245 250 255

Ala Phe Phe Ile Gln Leu Glu Asp Gly Lys Ile Arg Gly Arg Leu Arg

260 265 270

Ser Asn Gly Pro Leu Val Asn Lys Val Ala Pro Lys Tyr Gly Gly Gly

275 280 285

Gly His Asp Asn Ala Ala Gly Ile Thr Leu Thr Lys Trp Ser Gln Val

290 295 300

Asn Asp Val Ile Asn Asp Leu Asn Gln Leu Ile Ile Glu Trp Glu Ala

305 310 315 320

Lys

Claims

1.一种牛支原体DHH-DHHA1结构域蛋白编码基因CDNPase，其特征在于，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

2.权利要求1所述的牛支原体蛋白编码基因CDNPase，其蛋白质序列如SEQ ID NO:12所示。

3.一种含有表达权利要求1所述的牛支原体CDNPase蛋白编码基因的重组质粒pET-28b-Mbov_0328的大肠杆菌，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017100。

4.一种纯化的牛支原体重组蛋白rCDNPase，其蛋白质序列如SEQ ID NO:12所示，该重组蛋白具有磷酸二酯酶和超小片段核酸酶功能。