CN109691432A - 一种口腔拭子保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种口腔拭子保存液，包括如下组分和含量：Tris‑HCl 5‑50mmol/L，EDTA 1‑10mmol/L，氯化钠50‑500mmol/L，SDS 0.1‑3%（w/v），体系pH范围在7‑10之间。所述口腔拭子保存液成分明确，制备方法简单，成本低廉，稳定性好，安全性高，无毒副作用，操作容易实现，便于细胞的保存和运输，适应大规模采样使用，应用前景广阔。其用于保存人体口腔拭子样本，可在15‑25℃的温度范围内（室温）长期保存，能有效的保护口腔上皮细胞中的基因组在数周内不被破坏，DNA完整性好，且口腔拭子样本不被微生物污染。

Description

一种口腔拭子保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞保存技术领域，具体涉及一种口腔拭子保存液及其制备方法和应用。

背景技术

DNA的提取是分子生物学检验工作中最基本的应用技术，传统上大多使用人全血作为基因提取的标本，采样过程存在一定困难，如抽血对人体的损害性，采血过程中的安全隐患，血液样本易遭污染，患者拒绝率较高等问题，同时采取血样的成本高，操作较为繁琐，需要具有专业技能的人员进行操作才可靠。因此，探索更为取材简便、操作便捷，同时易于被患者接收的基因采集方法具有非常重要的意义。

口腔黏膜上皮细胞的采集十分简便快捷，不仅方便易得，而且基本上无创，患者自行操作即可完成。现有技术中，许多医学领域中人体细胞提取的过程已适用提取口腔细胞进行分析，研究表明，口腔上皮细胞中提取到的DNA数量与质量比较理想，可作为人体细胞分析的样本进行使用。

口腔拭子是用专用的取样棉签在颊粘膜两侧轻刮数次，使采样拭头各处都蘸取口腔黏膜脱落的细胞，然后将拭子头置入细胞保存液中，让拭子头上留存的患者细胞落入口腔拭子保存液中，然后将含有患者细胞的拭子保存液密封，最后送到各分析中心。该采样方式是一种简单、无痛、无创的DNA标本采集方法。该方法适用于采集任何年龄段人群的DNA样本。在家即可自行完成采样。口腔黏膜脱落细胞主要由口腔上皮细胞、腺体细胞和人体白细胞组成。这些脱落口腔细胞虽然会细胞核固缩，但同样具有完整的人类基因组DNA序列。因此口腔拭子或唾液可以代替血液成为基因组DNA的简易来源。

口腔拭子样本采集相对于血液样本采集来讲，对个体无创伤且无痛、操作简便、便于大量采样。此外，室温条件下保存时间较长的口腔拭子样本仍然可以提取得到完整的基因组DNA。并且当大范围收集样本时，口腔拭子样本适合在各地区的实验室和收集点之间传递。

口腔拭子采集到的样本中，除脱落的上皮细胞外，口腔中还有细菌及DNA酶、RNA酶，唾液中还有大量人体分泌的体液，包含粘蛋白、球蛋白、消化酶和白蛋白等物质，多种有机物的存在容易滋生大量微生物，细菌在25℃及以上的温度环境中，繁殖迅速，导致保存液pH值的下降。酸性的保存液环境加速上皮细胞的破裂，DNA释放出来。在DNA酶的分解下，DNA迅速降解。如何避免微生物生长的同时保证脱落细胞中基因组DNA的完整，成为口腔拭子保存液的关键所在。

已有专利都是唾液保存液，与口腔拭子保存液原理一致，其保护剂成分复杂，如专利公布号CN102440234B和CN102919218B。其中CN102919218B中含有氯化镁，镁离子是核酸酶激活剂，容易引起DNA的降解，不利于DNA的稳定性和完整性的保存；CN102440234B中含有蛋白质变性剂如异硫氰酸胍，可以抑制核酸酶的活性，但同时也裂解了细胞，使得DNA处于游离状态，不利于DNA的完整性保存。CN102919218B和CN105039306A中分别含有蔗糖和葡萄糖成分，虽然可以很好地保持该唾液保存固定液的粘度并维持细胞渗透压，但是容易引起细菌等微生物的滋生；CN105368812A中成分复杂，尿素、乙醇等成分虽然可以将唾液中的粘蛋白和球蛋白等有机物质进行变性处理，但同时也会对细胞造成裂解，不利于DNA的完整性保存，而且在该申请文件中提供的这些成分均为必须成分，即所有成分缺一不可才能保持DNA的稳定性。

总之，现有技术存在如下问题，冷冻保存法能够有效抑制微生物的生长，但是口腔上皮细胞经过反复冻融，容易导致细胞裂解，不利于维护遗传物质的稳定。生理盐水保存法虽然能够维护口腔上皮细胞细胞形态的稳定，但长时间存放易滋生细菌、真菌等微生物。

发明内容

本发明提供一种简单的口腔拭子保存液，用于保存口腔拭子，能够长期保持细胞中DNA的完整性，并且能够避免细菌等微生物的滋生。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种口腔拭子保存液，包括如下组分和含量：Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)5-50mmol/L，EDTA(乙二胺四乙酸)1-10mmol/L，氯化钠50-500mmol/L，SDS(十二烷基硫酸钠)0.1-3％(w/v)，体系pH范围在7-10之间。

优选地，上述口腔拭子保存液中，上述Tris-HCl的含量为10-50mmol/L，上述EDTA的含量为1-8mmol/L，上述氯化钠的含量为80-300mmol/L，上述SDS的含量为0.1-2％(w/v)，上述体系pH范围在7.5-9之间。

更优选地，上述口腔拭子保存液中，上述Tris-HCl的含量为20-45mmol/L，上述EDTA的含量为1-5mmol/L，上述氯化钠的含量为100-200mmol/L，上述SDS的含量为0.2-1％(w/v)，上述体系pH范围在7.5-8.5之间。

作为最优选的方案，上述口腔拭子保存液中，上述Tris-HCl的含量为35mmol/L，上述EDTA的含量为3.2mmol/L，上述氯化钠的含量为150mmol/L，上述SDS的含量为0.5％(w/v)，上述体系pH范围为8.0。

上述w/v表示质量体积分数，上述口腔拭子保存液的溶剂为无菌水。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种口腔拭子保存液的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照如下组分和含量称取各组分：Tris-HCl 5-50mmol/L，EDTA 1-10mmol/L，氯化钠50-500mmol/L，SDS 0.1-3％(w/v)，加入无菌水溶解并搅拌均匀；

(2)调节步骤(1)所得溶液的pH至7-10之间，并用无菌水定容；

(3)将步骤(2)所得溶液通过微孔滤膜过滤除菌，得到口腔拭子保存液。

优选地，上述口腔拭子保存液的制备方法包括如下步骤：

(1)按照如下组分和含量称取各组分：上述Tris-HCl的含量为10-50mmol/L，上述EDTA的含量为1-8mmol/L，上述氯化钠的含量为80-300mmol/L，上述SDS的含量为0.1-2％(w/v)，加入无菌水溶解并搅拌均匀；

(2)调节步骤(1)所得溶液的pH至7.5-9之间，并用无菌水定容；

(3)将步骤(2)所得溶液通过微孔滤膜过滤除菌，得到上述口腔拭子保存液。

更优选地，上述口腔拭子保存液的制备方法包括如下步骤：

(1)按照如下组分和含量称取各组分：上述Tris-HCl的含量为20-45mmol/L，上述EDTA的含量为1-5mmol/L，上述氯化钠的含量为100-200mmol/L，上述SDS的含量为0.2-1％(w/v)，加入无菌水溶解并搅拌均匀；

(2)调节步骤(1)所得溶液的pH至7.5-8.5之间，并用无菌水定容；

(3)将步骤(2)所得溶液通过微孔滤膜过滤除菌，得到上述口腔拭子保存液。

最优选地，上述口腔拭子保存液的制备方法包括如下步骤：

(1)按照如下组分和含量称取各组分：上述Tris-HCl的含量为35mmol/L，上述EDTA的含量为3.2mmol/L，上述氯化钠的含量为150mmol/L，上述SDS的含量为0.5％(w/v)，加入无菌水溶解并搅拌均匀；

(2)调节步骤(1)所得溶液的pH至8，并用无菌水定容；

(3)将步骤(2)所得溶液通过微孔滤膜过滤除菌，得到上述口腔拭子保存液。

优选地，步骤(1)中Tris-HCl母液可以配制成0.5-1mol/L备用，EDTA母液可以配置成0.1-0.5mol/L备用；SDS母液可以配制成5-10％(w/v)备用，氯化钠母液可以配制成1-3mol/L备用；步骤(2)中调节pH用盐酸调节；步骤(3)中微孔滤膜可以选用孔径0.45微米以下、优选0.22微米以下的微孔滤膜，如Millipore的微孔滤膜。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种第一方面的口腔拭子保存液在保存口腔拭子中的用途。

优选地，上述口腔拭子为人类口腔拭子。

本发明提供的口腔拭子保存液中，Tris-HCl组分作为缓冲液，可以维持溶液环境pH在7-10、优选7.5-8.5范围内；EDTA组分作为螯合剂可以螯合镁离子、钙离子等核酸酶的激活剂，从而抑制核酸酶类对核酸分子的降解作用，达到保护核酸的作用；氯化钠组分可以维持细胞渗透压，保护唾液细胞稳定性，维持细胞正常形态，同时因不含蔗糖、葡萄糖等糖类进一步减少微生物滋生；SDS组分可以作为变性剂和抑菌剂，可以将唾液中的粘蛋白和球蛋白等有机物质进行变性处理，在降低液体粘性的同时使得微生物不易于滋生，可以杀灭或抑制保存后的唾液中的微生物滋生；同时，SDS还可以作为助溶剂，可以与蛋白质形成复合物而增强蛋白质的可溶性。

因此，本发明的口腔拭子保存液成分明确，制备方法简单，成本低廉，稳定性好，安全性高，无毒副作用，操作容易实现，便于细胞的保存和运输，适应大规模采样使用，应用前景广阔。其用于保存人体口腔拭子样本，可在15-25℃的温度范围内(室温)长期保存，能有效的保护口腔上皮细胞中的基因组在数周内不被破坏，DNA完整性好，且口腔拭子样本不被微生物污染。

附图说明

图1示出了本发明实施例中来源于两个个体的口腔拭子样本保存1周、2周、3周、4周和2个月后提取得到的DNA电泳结果，其中M1和M2表示DNA Marker，1、2、3、4、5分别是第一个个体的口腔拭子样本保存1周、2周、3周、4周和2个月后提取得到的DNA电泳结果，6、7、8、9、10分别是第二个个体的口腔拭子样本保存1周、2周、3周、4周和2个月后提取得到的DNA电泳结果；

图2示出了本发明实施例中采集的口腔拭子样本室温保存1周、2周、3周、4周和2个月后提取得到的DNA作为模板用两对引物对进行PCR扩增电泳结果，其中M表示DNA Marker，1、2、3、4、5分别是第一对引物对扩增保存1周、2周、3周、4周和2个月后的口腔拭子样本提取得到的DNA电泳结果，6、7、8、9、10分别是第二对引物对扩增保存1周、2周、3周、4周和2个月后的口腔拭子样本提取得到的DNA电泳结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。除非特别说明，下面实施例中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器、设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。

本发明实施例的口腔拭子保存液，包括如下组分和含量：Tris-HCl 5-50mmol/L，EDTA 1-10mmol/L，氯化钠50-500mmol/L，SDS 0.1-3％(w/v)，体系pH范围在7-10之间。

其中，Tris-HCl的含量5-50mmol/L，优选为10-50mmol/L，更优选为20-45mmol/L，例如6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、38mmol/L、40mmol/L、42mmol/L、45mmol/L、48mmol/L、50mmol/L，最优选为35mmol/L；EDTA的含量1-10mmol/L，优选为1-8mmol/L，更优选为1-5mmol/L，例如1.2mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、3.2mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6.5mmol/L、7mmol/L、8.5mmol/L、9mmol/L、9.2mmol/L、9.8mmol/L，最优选为3.2mmol/L；氯化钠的含量50-500mmol/L，优选为80-300mmol/L，更优选为100-200mmol/L，例如60mmol/L、80mmol/L、120mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L、350mmol/L、400mmol/L、420mmol/L、450mmol/L、480mmol/L，最优选为150mmol/L；SDS的含量0.1-3％(w/v)，优选为0.1-2％(w/v)，更优选为0.2-1％(w/v)，例如，0.12％(w/v)、0.15％(w/v)、0.3％(w/v)、0.5％(w/v)、0.7％(w/v)、0.9％(w/v)、1.2％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、2.8％(w/v)，最优选为0.5％(w/v)；体系pH范围在7-10之间，优选在7.5-9之间，更优选在7.5-8.5之间，例如，7.2、7.5、7.8、8.0、8.5、9、9.2、9.5、9.8，最优选为8.0。

以下通过实施例详细说明本发明的方案和效果，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1口腔拭子保存液的配制

本实施例的口腔拭子保存液包括如下组分和含量：Tris-HCl 35mmol/L，EDTA3.2mmol/L，NaCl 150mmol/L，SDS 0.5％(w/v)，体系pH为8。

本实施例的唾液保存液的制备方法如下：

(1)分别量取3.5mL Tris-HCl(1mol/L)、0.32mL EDTA(0.5mol/L)、15mL NaCl(1mol/L)以及5mL SDS(10％)，依次加入到100mL烧杯中(烧杯用纯水清洗干净)，用洁净的玻璃棒搅拌均匀，或通过磁力搅拌器混合均匀；

(2)用稀盐酸调整溶液pH值到8.0；

(3)将烧杯中混合液转移至100mL容量瓶中，并用超纯水定容至刻度；

(4)用一次性滤膜装置将上述保存液进行过滤，保存于储液瓶中，室温保存备用。

步骤(4)微孔滤膜可以选用孔径0.45微米以下、优选0.22微米以下的微孔滤膜。

实施例2口腔拭子样本采集与保存

本实施例中口腔细胞采集和保存方法如下：

(1)采样前30分钟漱口以除去食物残渣及残留微生物，漱口之后30分钟内不要进食、饮水、刷牙、吸烟或嚼口香糖，以免混入食物的DNA，也不要刷牙或大量饮水，以免影响脱落细胞的回收数量。

(2)撕开口腔拭子外包装，小心取出口腔拭子。

(3)握住手柄，将拭子伸进左侧口腔，使拭子头部充分接触左侧脸颊内部(以腮部微凸为准)，用刷牙的力度上下擦动20次以上。

(4)采样后，拿出包装盒内的2mL采样管(内装保存液500μL)，用手指推按采样拭子后端活动杆，使采样拭子头落入采样管的保存液中，并将管盖拧紧。

(5)用同样的方法在右侧脸颊内部以腮部微凸为准，使用第二根拭子和采样管进行取样。

(6)采集好的样品可以放置室温保存，并分别于1周、2周、1个月时提取保存的样本中的DNA。

实施例3口腔拭子样本DNA提取

本实施例中采样天根柱提法口腔拭子基因组DNA提取试剂盒提取，方法如下：

(1)取一支采样管，管内有500μL保存液和口腔拭子，加入20μL蛋白酶K溶液，涡旋10sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混数次。

(2)加入400μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中。

(3)加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

(5)向吸附柱CR2中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

(6)向吸附柱CR2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管。

(7)重复操作步骤(6)。

(8)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(9)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μL洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。

(10)取提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。

结果显示：来源于两个个体的口腔拭子样本保存1周、2周、3周、4周和2个月后提取得到的DNA电泳条带清晰锐利，没有弥散现象。说明使用本发明实施例制备的口腔拭子保存液能够维持从不同个体获取的口腔拭子样本在室温条件下保存至少2个月，并且完整性良好，因此本发明的口腔拭子保存液可用于口腔拭子样本的长期室温保存。

实施例4 PCR鉴定

本实施例是对从口腔拭子样本中提取到的基因组DNA进行基因PCR扩增，使用实施例3中采集的口腔拭子样本室温保存1周、2周、3周、4周和2个月后提取得到的DNA作为模板用两对引物对进行PCR扩增。

扩增引物如下：

引物对1：

F:5’-AGCATTTCCTTGCGACTC-3’(SEQ ID NO：1)；

R:5’-GCCTGACGGTTCTAACTC-3’(SEQ ID NO：2)。

引物对2：

F:5’-AGTTTAGGTCAGCCTCTTAG-3’(SEQ ID NO：3)；

R:5’-GGACTTTACCGTGACAGC-3’(SEQ ID NO：4)。

所扩增基因片段长度分别为474bp和432bp。

PCR反应体系如下表1所示：

表1

PCR反应程序如下表2：

表2

PCR结果如图2所示，结果显示：扩增出的目的基因片段与预期大小相符，条带清晰，说明口腔拭子样本使用实施例1的口腔拭子保存液保存1周、2周、3周、4周和2个月后提取的基因组DNA完整，并且基本无外源细菌等微生物污染影响。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市乐土精准医疗科技有限公司

<120> 一种口腔拭子保存液及其制备方法和应用

<130> 17I24858

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成序列

<222>

<400> 1

agcatttcct tgcgactc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成序列

<222>

<400> 2

gcctgacggt tctaactc 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成序列

<222>

<400> 3

agtttaggtc agcctcttag 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成序列

<222>

<400> 4

ggactttacc gtgacagc 18

Claims (9)

1. 一种口腔拭子保存液，其特征在于，所述保存液包括如下组分和含量：Tris-HCl 5-50mmol/L，EDTA 1-10mmol/L，氯化钠50-500mmol/L，SDS 0.1-3%（w/v），体系pH范围在7-10之间。

2. 根据权利要求1所述的口腔拭子保存液，其特征在于，所述保存液包括如下组分和含量：Tris-HCl 10-50mmol/L，EDTA 1-8mmol/L，氯化钠80-300mmol/L，SDS 0.1-2%（w/v），体系pH范围在7.5-9之间；

优选地，所述保存液包括如下组分和含量：Tris-HCl 20-45mmol/L，EDTA 1-5mmol/L，氯化钠100-200mmol/L，SDS 0.2-1%（w/v），体系pH范围在7.5-8.5之间；

优选地，所述保存液包括如下组分和含量：Tris-HCl 35mmol/L，EDTA 3.2mmol/L，氯化钠150mmol/L，SDS 0.5%（w/v），体系pH为8.0。

3.根据权利要求1或2所述的口腔拭子保存液，其特征在于，所述保存液的溶剂为无菌水。

4.一种口腔拭子保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

（1）按照如下组分和含量称取各组分：Tris-HCl 5-50mmol/L，EDTA 1-10mmol/L，氯化钠50-500mmol/L，SDS 0.1-3%（w/v），加入无菌水溶解并搅拌均匀；

（2）调节步骤（1）所得溶液的pH至7-10之间，并用无菌水定容；

（3）将步骤（2）所得溶液通过微孔滤膜过滤除菌，得到所述口腔拭子保存液。

5. 根据权利要求4所述的口腔拭子保存液的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）按照如下组分和含量称取各组分：Tris-HCl 10-50mmol/L，EDTA 1-8mmol/L，氯化钠80-300mmol/L，SDS 0.1-2%（w/v）；所述步骤（2）将所得溶液的pH调节至7.5-9之间；

优选地，所述步骤（1）按照如下组分和含量称取各组分：Tris-HCl 20-45mmol/L，EDTA1-5mmol/L，氯化钠100-200mmol/L，SDS 0.2-1%（w/v）；所述步骤（2）将所得溶液的pH调节至7.5-8.5之间；

优选地，所述步骤（1）按照如下组分和含量称取各组分：Tris-HCl 35mmol/L，EDTA3.2mmol/L，氯化钠150mmol/L，SDS 0.5%（w/v）；所述步骤（2）将所得溶液的pH调节至8.0。

6.根据权利要求4或5所述的口腔拭子保存液的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径在0.45微米以下。

7.根据权利要求6所述的口腔拭子保存液的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径在0.22微米以下。

8.如权利要求1-3任一项所述的口腔拭子保存液在保存口腔拭子中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述口腔拭子为人类口腔拭子。