CN103571826A - 高效全血基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速、高效全血基因组DNA提取方法，属于核酸纯化领域。首先向全血中加入红细胞裂解液，涡旋，直至红细胞完全裂解，弃上清，吸干残留液体。加入白细胞裂解液和蛋白酶K，37oC水浴裂解白细胞，直至沉淀溶解。加入氯化钠和氯仿，离心分离DNA，并将上清液转移至另一洁净的EP管中。加入醋酸铵和冰乙醇沉淀DNA，75％乙醇洗涤后自然干燥，加入TE溶解得到DNA。本发明方法具有快速、高效和无毒的特点。所提取的DNA可用于聚合酶链反应（PCR）、甲基化检测、基因克隆等多种后续分子生物学研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速、高效全血基因组DNA提取方法，属于核酸纯化领域。
背景技术
目前，分子生物学理论和技术发展十分迅速，已经与生物学、医学、遗传学和动物学等多个学科密切结合，获得高纯度和完整的基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础，是其它研究工作的前提。外周血可作为造血***疾病研究中分子标志，以及用于体外诊断***的开发，还可用于血液***外众多***疾病的分子监测。从外周血中提取DNA，进行核酸水平的研究是临床分子生物学重要的研究手段。
在遗传性疾病和肿瘤以及心脑血管病等研究中，可以利用外周血作为生物材料，检测患病个体与正常健康个体之间的DNA差异，例如DNA甲基化分析和基因突变检测。寻找快速、经济的DNA提取方法是群体分子生物学实验面临的首要问题。然而，从血液中提取DNA面临的难题之一是DNA易受到多种物质的污染，使得DNA纯度下降，致使实验结果准确性降低。有些传统的外周血DNA提取方法使用饱和酚等有害物质，且操作复杂，过程繁琐，用时过长；开放的自动化DNA提取装置，虽然不再使用饱和酚等有害物质，操作过程也相对比较简单，但所用仪器和试剂极为昂贵，不适用于普通实验室大规模DNA的提取。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、高效提取全血基因组DNA方法，保证提取出的基因组DNA完整，并使提取过程高效、快速、无毒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种高效全血基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
（1）按全血：红细胞裂解液=1：1的体积比，向EP管中的全血中加入红细胞裂解液，涡旋2分钟后静置5分钟以上，直至溶液澄清透明，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液；
（2）向步骤（1）的EP管中再加入占全血体积1/3的红细胞裂解液，涡旋1分钟，直至沉淀完全散开，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃去上清液；重复本步骤一次，并用吸水纸吸干残留液体；
（3）向步骤（2）的EP管中加入占全血体积1/3的白细胞稀释液，另加入占全血体积1/600的蛋白酶K，混匀，37oC水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解；
（4）向步骤（3）的EP管中分别加入占全血体积1/12的5摩尔/升氯化钠溶液和占全血体积2/3的氯仿，充分摇匀，然后对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟，将上层液体转移至另一洁净的EP管中；
（5）向步骤（4）的洁净的EP管中加入占管内溶液1／10体积的醋酸铵溶液和2倍体积的冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA，然后对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃去上清液；
（6）向步骤（5）的洁净的EP管中加入占全血体积1/3的75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，然后进行离心分离，转速为12000转／分，离心时间为1分钟，弃去上清液；重复本步骤两次；
（7）将步骤（6）的洁净的EP管倒立放置在放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分钟；
（8）向步骤（7）的洁净的EP管中加入与全血同等体积的TE缓冲液，溶解DNA沉淀。
采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，其优点是：
①本发明个步骤中涉及的离心时间、离心机转速，使全血中基因组DNA的提取过程具有高效、快速、简便的特点；
②本发明整个过程不需要使用有毒的苯酚的试剂，且所有试剂成本较低，使整个过程不仅安全可靠，而且比较经济；
②使用本发明方法纯化的基因组DNA完整性好，纯度高，可用于聚合酶链反应（PCR)、实时定量荧光聚合酶链反应(Real Time PCR)、芯片分析、分子克隆等分子生物学实验。
作为优选，本发明更进一步的技术方案是：
所述红细胞裂解液中各组分的配方为：
Tris-HCl (PH7.6或8.0) 0.01M
Sucrose 320mM
MgCl2 5mM
Triton×100 1%。
所述白细胞裂解液中各组分的配方为：
Tris-HCl (PH7.6或8.0) 0.01M
EDTA (PH8.0) 4mM
SDS 0.2%
NaCl 50mM。
所述TE缓冲液中各组分的配方为：
Tris-HCl (PH7.6或8.0) 1M
EDTA (PH8.0) 0.5M。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，目的仅在于更好地理解本发明内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。
实施例1：从人的全血中提取DNA。
（1）向600微升人全血中加入红细胞裂解液600微升，加入的体积比为全血：红细胞裂解液=1：1，涡旋2分钟，静置5分钟以上，直至溶液澄清透明。对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液。其中红细胞裂解液按下述方法制备：取10ml1MTris-HCl (PH7.6)，109.54g Sucrose，1.01g MgCl2，加10ml Triton×100，加水至800ml，溶解定容至1000ml。
（2）向步骤（1）的EP管中加入200微升的红细胞裂解液，涡旋1分钟，直至沉淀完全散开。对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃上清。重复一次，并用吸水纸吸干残留液体。
（3）向步骤（2）的EP管中加入200微升白细胞稀释液，1微升蛋白酶K，混匀，37oC水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解。其中白细胞裂解液按下述方法制备： 加10ml 1MTris-HCl (PH7.6)，8ml 0.5 M EDTA，20ml 10% SDS，10ml 5M NaCl，定容至1000ml。
（4）向步骤（3）的EP管中加入50微升5摩尔/升氯化钠溶液和400微升氯仿，充分摇匀。对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟。将上层液体转移至另一洁净EP管中。
（5）向步骤（4）的EP管中加入1／10体积醋酸铵溶液和2倍体积冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA。对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃上清。
（6）向步骤（5）的EP管中加入200毫升75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，于12000转／分离心1分钟，弃上清。重复两次。
（7）将步骤（6）的EP管倒立放置与放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分钟。
（8）加入600微升TE溶解DNA沉淀。其中TE缓冲液按下述方法制备：取10ml 1M Tris-HCl (PH8.6)，2ml 0.5 M EDTA，加水至1000ml。
依照实施例1所述方法从600微升人全血中提取的DNA，通过其1%琼脂糖凝胶电泳检测发现DNA在23130bp处有一条单一亮条带。
实施例2：从小鼠的全血中提取DNA。
（1）向600微升小鼠全血中加入红细胞裂解液600微升，加入的体积比为全血：红细胞裂解液=1：1，涡旋2分钟，静置5分钟以上，直至溶液澄清透明。对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液。其中红细胞裂解液，其制备方法是：取10ml1MTris-HCl (PH7.6)，109.54g Sucrose，1.01g MgCl2，加10ml Triton×100，加水至800ml，溶解定容至1000ml。
（2）向步骤（1）的EP管中加入200微升的红细胞裂解液，涡旋1分钟，直至沉淀完全散开。对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃上清。重复一次，并用吸水纸吸干残留液体。
（3）向步骤（2）的EP管中加入200微升白细胞稀释液，1微升蛋白酶K，混匀，37oC水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解。其中白细胞裂解液，其制备方法是： 加10ml 1MTris-HCl (PH7.6)，8ml 0.5 M EDTA，20ml 10% SDS，10ml 5M NaCl，定容至1000ml。
（4）向步骤（3）的EP管中加入50微升5摩尔/升氯化钠溶液和400微升氯仿，充分摇匀。对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟。将上层液体转移至另一洁净EP管中。
（5）向步骤（4）的EP管中加入1／10体积醋酸铵溶液和2倍体积冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA。对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃上清。
（6）向步骤（5）的EP管中加入200毫升75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，于12000转／分离心1分钟，弃上清。重复两次。
（7）将步骤（6）的EP管倒立放置与放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分钟。
（8）加入600微升TE溶解DNA沉淀。其中TE缓冲液，其制备方法是：取10ml 1M Tris-HCl (PH8.6)，2ml 0.5 M EDTA，加水至1000ml。
依照实施例2所述方法从从600微升小鼠全血中提取的DNA，通过其1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA在23130bp处有一条单一较亮带。
Claims (4)
1.一种高效全血基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按全血：红细胞裂解液=1：1的体积比，向EP管中的全血中加入红细胞裂解液，涡旋2分钟后静置5分钟以上，直至溶液澄清透明，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液；
（2）向步骤（1）的EP管中再加入占全血体积1/3的红细胞裂解液，涡旋1分钟，直至沉淀完全散开，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃去上清液；重复本步骤一次，并用吸水纸吸干残留液体；
（3）向步骤（2）的EP管中加入占全血体积1/3的白细胞稀释液，另加入占全血体积1/600的蛋白酶K，混匀，37oC水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解；
（4）向步骤（3）的EP管中分别加入占全血体积1/12的5摩尔/升氯化钠溶液和占全血体积2/3的氯仿，充分摇匀，然后对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟，将上层液体转移至另一洁净的EP管中；
（5）向步骤（4）的洁净的EP管中加入占管内溶液1／10体积的醋酸铵溶液和2倍体积的冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA，然后对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为1分钟，弃去上清液；
（6）向步骤（5）的洁净的EP管中加入占全血体积1/3的75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，然后进行离心分离，转速为12000转／分，离心时间为1分钟，弃去上清液；重复本步骤两次；
（7）将步骤（6）的洁净的EP管倒立放置在放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分钟；
（8）向步骤（7）的洁净的EP管中加入与全血同等体积的TE缓冲液，溶解DNA沉淀。
2.如权利要求1所述的高效全血基因组DNA提取方法，其特征在于，所述红细胞裂解液中各组分的配方为：
Tris-HCl (PH7.6或8.0) 0.01M
Sucrose 320mM
MgCl2 5mM
Triton×100 1%。
3.如权利要求1所述的高效全血基因组DNA提取方法，其特征在于，所述白细胞裂解液中各组分的配方为：
Tris-HCl (PH7.6或8.0) 0.01M
EDTA (PH8.0) 4mM
SDS 0.2%
NaCl 50mM。
4.如权利要求1所述的高效全血基因组DNA提取方法，其特征在于，所述TE缓冲液中各组分的配方为：
Tris-HCl (PH7.6或8.0) 1M
EDTA (PH8.0) 0.5M。
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