CN111378719B

CN111378719B - 用于保存人类唾液中核酸完整性的试剂组合物和方法

Info

Publication number: CN111378719B
Application number: CN201811652460.7A
Authority: CN
Inventors: 林源吉; 丁佳女; 叶俊波
Original assignee: Hangzhou Kbm Life Sciences Co ltd
Current assignee: Hangzhou Kbm Life Sciences Co ltd
Priority date: 2018-12-31
Filing date: 2018-12-31
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2038-12-31
Also published as: CN111378719A

Abstract

本发明提供了一种用于保存人类唾液中核酸完整性的试剂组合物及其应用和方法。试剂组合物包括尿素、十二烷基硫酸钠、反式‑1，CDTA、Tris‑HCl、抗坏血酸钠、对羟基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲、乙醇、蔗糖和蛋白酶K。将所述试剂组合物与人体唾液混合均匀后常温保存。本发明所述试剂组合物和保存方法可以抑制核酸酶活性，避免其受到外界微生物的污染或自身氧化，从而保证基因组DNA的纯度和完整度，而且保存时间长，适用保存温度广，能够确保唾液样本在各采集地之间运输过程中的稳定性。

Description

用于保存人类唾液中核酸完整性的试剂组合物和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更为具体的是涉及用于保存人类唾液中核酸完整性的试剂组合物和方法。

背景技术

目前分子生物学检测技术已日益用于法医、军事、人类医药以及科学研究等多项领域。如在人类健康方面，通过对检测者的血液、其他体液或细胞中的DNA提取，并进行核酸序列扩增，进而检测其目的序列或易感位点收集相关基因信息后，通过对已知信息的解读使人们了解自己的基因信息，预知身体患病的风险，从而改善自己的生活环境与习惯，避免或延缓疾病的发生。又如在法医鉴定领域，通过提取家属的DNA可对死者的身份进行辨认。

目前用于提取基因组DNA的体液通常来自于血液，但使用血液作为检测来源具有很多缺点。首先，血液中的DNA主要来自于白细胞，而血液中存在大量不含有DNA的红细胞，所以在提取纯度较高的DNA时需要去除红细胞的影响。其次血液的采集需要经过训练的专业人员操作。此外，血液采集作为一种侵入性方式，经常给供试者带来一定程度的不适与疼痛，再者，血液采集过程还需要避免一些血源性病原体与细菌造成的感染，并且采集好的血液必须要冷藏或尽快进行DNA提取。而与其相比，唾液作为一种人体较易获得的体液，采集更为方便。纯净的唾液并不含有人体DNA，但由于口腔上皮细胞处于不断的新陈代谢，每时每刻都存在细胞脱落，因此，通过唾液可以得到DNA。

相比于血液采集，唾液采集具有以下明显优势：1无刺痛，无伤害取样，避免了对供试者造成不必要的痛苦；2操作简便，采集人员不需要进行专业培训，可自行取样寄送；3适用广泛，一些人群不适合采血，例如老人与小孩等，另外一些人群则抗拒采血，如晕血和精神疾病患者；4廉价高效，节省了注射器与抗凝管等耗材的费用；5运输方便，若要进行大范围长距离的运输，唾液显然更适合在实验室与各个收集地之间传递。

用于基因检测的DNA首先应保证其纯度与完整性，如果DNA发生断裂降解等损伤，则势必会直接影响到后续实验，进而影响分析结果的准确性；而唾液中含有的有机物与细菌等也会对细胞DNA的完整性造成一定影响；另外唾液保存液作为唾液DNA的保存介质，也存在被氧化和微生物污染的风险。微生物会将DNA作为养料，甚至分泌出促进DNA加速降解的酶，破坏DNA的完整性，进而导致后续实验数据的可信度大大降低。因此，将唾液较好的保存起来，对于唾液作为基因组DNA的来源应用于基因检测中将具有至关重要左右。而就目前市场上的大部分唾液保存液都无法很好的保证唾液DNA的纯度与完整性，而市面上较好的唾液保存液又无法对唾液DNA进行长期保存。因此，研究开发一种保存效果好，保存方便，保存时间长的人体唾液样本保存液具有十分重要的意义。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种保存人体体液如唾液中的DNA组合物以及其制备方法。本发明涉及从人类体液，如唾液的样品中提取核酸的试剂组合物，所述试剂组合物包括变性剂、去污剂、金属离子螯合剂、还原剂、抑菌剂以及缓冲剂和蛋白酶，使得样品中的核酸在室温条件下稳定保存至少24个月，并可直接用于聚合酶链反应、基因检测等下游实验而无需其他处理。具体的，所述组合物中包含尿素、十二烷基硫酸钠、反式-1，2-环已二胺四乙酸(CDTA)、Tris-HCl、抗坏血酸钠、对羟基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲、乙醇、蔗糖和蛋白酶K。更为具体的，为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案包括：提供一种用于保存人类唾液中核酸完整性的试剂组合物，包括变性剂、去污

进一步的，包括Tris-HCl、尿素、SDS、CDTA、乙醇、NaAc、对羟基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲、抗坏血酸钠、蔗糖和蛋白酶K。

进一步的，包括CDTA 1-10mmol/L；乙醇10％-50％；NaAc 0.1-1mol/L；对羟基苯甲酸丙酯1-5mg/mL；重氮烷基咪唑脲1-5mg/mL；抗坏血酸钠0.01-0.5mol/L；蔗糖1％-10％。

进一步的，包括PH为6.5-8.5的Tris-HCl 0.05-0.5mol/L；尿素0.1-1mol/L；SDS0.1％-1％；CDTA 1-10mmol/L；乙醇10％-50％；NaAc 0.1-1mol/L；对羟基苯甲酸丙酯1-5mg/mL；重氮烷基咪唑脲1-5mg/mL；抗坏血酸钠0.01-0.5mol/L；蔗糖1％-10％；蛋白酶K10ug/mL，体系PH 7-9。

进一步的，包括PH8.0的Tris-HCl 0.2mol/L；尿素0.45mol/L；SDS0.6％；CDTA3.6mmol/L；乙醇40％；对羟基苯甲酸丙酯2mg/mL；重氮烷基咪唑脲2mg/mL；醋酸钠0.67mol/L；抗坏血酸钠0.05mol/L；蔗糖4％；蛋白酶K 10ug/mL；体系PH 8.0。

本发明还提供所述的试剂组合物在保存人类唾液中核酸完整性的应用。

本发明还提供了一种用于保存人类唾液中核酸完整性的方法，包括提供所述的试剂组合物，并将所述试剂组合物与人体唾液样本混合。

进一步的，试剂组合物与人体唾液样本混合按1:1混合均匀。

进一步的，混合均匀后常温保存。

本发明中提供的人体唾液保存组合物中引入的CDTA是强效金属离子螯合剂，一方面可以螯合唾液中本身含有的Mg、Ga等二价金属阳离子，抑制核酸酶的活性，防止DNA被降解，另一方面是抑制以金属离子为基础的氧化还原反应的发生；引入的醋酸钠可以沉淀部***解细胞释放的DNA防止悬浮断裂，同时可以提供保证DNA稳定的弱碱性环境；引入的对羟基苯甲酸丙酯和重氮烷基咪唑脲，能够较好的抑制微生物菌落的生长而不会破坏DNA，且两者配合使用，能够构成非常广谱的抗菌体系，有效抑菌杀菌，防止微生物的污染及对DNA的破坏，可以延长样本的保存时间；引入的乙醇，不仅能破坏蛋白质的结构，起到变性剂的作用而且同时在另一方面能抑制微生物的生长；引入的蔗糖，可以起到增加体系粘度，维持适当渗透压达到防止DNA受机械力损伤的作用；最关键的是引入了强还原剂抗坏血酸钠，它是一种内源性自由基清除剂，能够起到抗氧化作用，其本身在水溶液中随着时间的延长会发生变色反应，逐渐从无色变色为黄色，以此可以指示保存液的保存时间。综上，本发明通过引入上述组分，按照设定配比配合使用，达到了使人体唾液样本中的DNA不会被核酸酶以及其他外界条件产生的因素进行酶解或氧化从而导致DNA断裂不完整，或者被污染而导致DNA纯度低的问题，同时也能维持唾液样本处于适宜的条件下，如PH、体系粘度等而使唾液样本DNA能长期稳定保存，达到较好较长时间保存唾液样本的目的。

本发明的人体唾液保存用组合物用于保存人体唾液样本，可以抑制核酸酶活性，避免其受到外界微生物的污染或自身氧化，从而保证基因组DNA的纯度和完整度，而且保存时间长，适用保存温度广，能够确保唾液样本在各采集地之间运输过程中的稳定性。

附图说明

图1为从实施例1制备的人体唾液保存用组合物于室温保存不同时间后的唾液样本中抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，图中：M：HindIII Marker；1：室温放置3d；2：室温放置7d；3：室温放置14d；4：室温放置1个月；5：室温放置3个月；6：室温放置6个月；7：室温放置12个月；8：室温放置18个月；9：室温放置24个月

图2为从实施例1制备的人体唾液保存用组合物于37℃保存不同时间后的唾液样本中抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，图中：M：HindIII Marker；1：37℃放置3d；2：37℃放置7d；3：37℃放置14d；4：37℃放置1个月；5：37℃放置2个月；6：37℃放置3个月；7：37℃放置6个月；8：37℃放置9个月；9：37℃放置12个月。

图3为从实施例1制备的人体唾液保存用组合物于45℃高温保存不同时间后的唾液样本中抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，图中：M：HindIII Marker；1：45℃放置14d；2：45℃放置1个月；3：45℃放置3个月；4：45℃放置6个月；5：45℃放置9个月；6：45℃放置12个月。

图4为从实施例1制备的人体唾液保存用组合物于涡旋混匀器上震荡混匀不同时间后的唾液样本中抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，图中：M：HindIII Marker；1：涡旋震荡1天；2：涡旋震荡3天；3：涡旋震荡5天；4：涡旋震荡7天；5：涡旋震荡9天；6：涡旋震荡12天；7：涡旋震荡15天。

具体实施方式

实施例1

人体唾液保存用组合物，其组分和含量为：PH8.0的Tris-HCl 0.2mol/L；尿素0.45mol/L；SDS0.6％；CDTA 3.6mmol/L；乙醇40％；对羟基苯甲酸丙酯2mg/mL；重氮烷基咪唑脲2mg/mL；醋酸钠0.67mol/L；抗坏血酸钠0.05mol/L；蔗糖4％；蛋白酶K 10ug/mL；体系PH8.0。

上述人体唾液保存用组合物的保存效果测试：

在收集唾液样本前30分钟受试者需清洁口腔，并保持口腔洁净，清洁口腔后请勿进食、吸烟、嚼口香糖。开始收集唾液之前，放松脸颊，并用手指轻轻按摩脸颊15-30秒以产生唾液。向唾液采集管中轻轻吐入唾液，尽量避免出现过多泡沫。收集到2ml左右唾液后与2ml实施例1的人体唾液保存用组合物颠倒混匀后，根据下述保存条件进行保存，备用。

1、用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本在室温环境放置不同时间后的稳定性测试

将上述用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本分别于室温下放置3天、7天、14天、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月后，利用Koning柱法唾液基因组提取试剂盒得到的各唾液样本基因组DNA，分别编号1-9，备用。

琼脂糖凝胶电泳：取上述各唾液样本DNA2ul加样于1％琼脂糖凝胶，用HingIIIMarker作标记，电泳。电泳后用凝胶成像***拍照，具体见图1。

浓度和纯度检测：取上述各唾液样本DNA2ul，用Nano-100检测其浓度和纯度，具体见表1。

表1：室温放置不同时间的唾液样本DNA检测：

样本编号	浓度(ng/ul)	A260/A280
			1	46.3	1.86
2	45.6	1.84
			3	48.2	1.85
4	42.8	1.84
			5	38.8	1.83
6	42.1	1.83
			7	39.7	1.82
8	42.6	1.85
			9	46.1	1.83

总结：如图1和表1所示，该唾液样本室温放置3天直至24个月，DNA没有发生降解现象，电泳结果显示基因组DNA完整性良好。

2、用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本在37℃环境放置不同时间后的稳定性测试

将上述用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本分别于37℃环境下放置3天、7天、14天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月后，利用Koning柱法唾液基因组提取试剂盒得到的各唾液样本基因组DNA，分别编号1-9，备用。

琼脂糖凝胶电泳：取上述各唾液样本DNA2ul加样于1％琼脂糖凝胶，用HingIIIMarker作标记，电泳。电泳后用凝胶成像***拍照，具体见图2。

浓度和纯度检测：取上述各唾液样本DNA2ul，用Nano-100检测其浓度和纯度，具体见表2。

表2：37℃放置不同时间的唾液样本DNA检测：

样本编号	浓度(ng/ul)	A260/A280
			1	44.2	1.81
2	44.8	1.84
			3	45.9	1.86
4	46.6	1.82
			5	45.1	1.88
6	43.8	1.83
			7	42.6	1.89
8	45.1	1.86
			9	44.7	1.82

总结：如图2和表2所示，该唾液样本37℃环境放置3天直至12个月，DNA没有发生降解现象，电泳结果显示基因组DNA完整性良好。

3、用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本在45℃环境放置不同时间后的稳定性测试

将上述用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本分别于45℃环境下放置14天、1个月、3个月、6个月、9个月、12个月后，利用Koning柱法唾液基因组提取试剂盒得到的各唾液样本基因组DNA，分别编号1-6，备用。

琼脂糖凝胶电泳：取上述各唾液样本DNA2ul加样于1％琼脂糖凝胶，用HingIIIMarker作标记，电泳。电泳后用凝胶成像***拍照，具体见图3。

浓度和纯度检测：取上述各唾液样本DNA2ul，用Nano-100检测其浓度和纯度，具体见表3。

表3：室温放置不同时间的唾液样本DNA检测：

样本编号	浓度(ng/ul)	A260/A280
			1	40.5	1.88
2	43.9	1.82
			3	46.7	1.86
4	42.8	1.84
			5	39.8	1.86
6	43.7	1.83

总结：如图3和表3所示，该唾液样本45℃环境放置14天直至12个月，DNA没有发生降解现象，电泳结果显示基因组DNA完整性良好。

4、用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本在涡旋混匀器上震荡混匀不同时间后的稳定性测试

将上述用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本分别于涡旋混匀器上震荡混匀1天、3天、5天、7天、9天、12天、15天后，利用Koning柱法唾液基因组提取试剂盒得到的各唾液样本基因组DNA，分别编号1-7，备用。

琼脂糖凝胶电泳：取上述各唾液样本DNA2ul加样于1％琼脂糖凝胶，用HingIIIMarker作标记，电泳。电泳后用凝胶成像***拍照，具体见图4。

浓度和纯度检测：取上述各唾液样本DNA2ul，用Nano-100检测其浓度和纯度，具体见表4。

表4：室温放置不同时间的唾液样本DNA检测：

总结：如图4和表4所示，该唾液样本在涡旋混匀器上震荡混匀1天直至15天，DNA没有发生降解现象，电泳结果显示基因组DNA完整性良好。

相关唾液保存及基因组DNA抽提检测实验表明，本发明的人体唾液保存用组合物在室温条件下可以稳定保存唾液样本两年以上；在高温(37以及45℃)条件下，可以稳定保存唾液样本一年以上；在剧烈震荡条件下，可以稳定保存7天以上。

Claims

1.一种用于保存人类唾液中核酸完整性的试剂组合物，其特在在于，由PH8.0的Tris-HCl0.2mol/L；尿素0.45mol/L；SDS0.6％；CDTA3.6mmol/L；乙醇40％；对羟基苯甲酸丙酯2mg/mL；重氮烷基咪唑脲2mg/mL；醋酸钠0.67mol/L；抗坏血酸钠0.05mol/L；蔗糖4％；蛋白酶K10ug/mL组成；体系PH8.0。

2.根据权利要求1所述的试剂组合物在保存人类唾液中核酸完整性的应用。

3.一种用于保存人类唾液中核酸完整性的方法，其特征在于，包括提供权利要求1所述的试剂组合物；并将所述试剂组合物与人体唾液样本混合。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，试剂组合物与人体唾液样本混合按1:1混合均匀。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，混合均匀后常温保存。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，收集人体唾液样本前30分钟受试者需清洁口腔。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，避免唾液出现过多泡沫。