CN109517818A - 一种唾液、口腔拭子基因组dna保护液 - Google Patents

一种唾液、口腔拭子基因组dna保护液 Download PDF

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孙子奎
丁方美
王�锋
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Abstract

本发明公开了一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液，其特征在于，其特征在于，按1升的浓度计，包括如下组分：SDS(十二烷基硫酸钠)0.10～0.2％；NaCL 0.90％；Tris(三羟甲基氨基甲烷)5～15mM；EDTA 20～25mM；蛋白酶K 150‑160mg。该唾液、口腔拭子保存液以SDS、Tris‑HCl、EDTA、NaCl和蛋白酶K为主要成分，可用于唾液保存。NaCl可以维持细胞渗透压，SDS表面活性剂在蛋白酶K作用下可以破坏蛋白成分抑制细菌的滋生，容易引起DNA的降解；Tris‑HCl、EDTA可以保护游离DNA。本发明的DNA保存液是一种针对口腔拭子保存的保存液，其可以较好的保存口腔细胞；其更加卫生，不易滋生细菌；且保存时间长比信封长3‑5倍；制备方法简单，具有较好的社会价值。

Description

一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液。
背景技术
人体组织及体液中提取得到的核酸DNA样本在法医鉴定、疾病检测与治疗等领域应用广泛。当前科研人员和临床医生主要用抗凝血提取DNA，然而抗凝血保存时间稍长后出现凝集现象对提取过程造成不便。同时，通过采血提取DNA还有如下几点不便：(1)对采血人员要求有专业的培训；(2)耗费人力，需要有人辅助完成；(3)部分人心理对抽血无法接受，甚至出现晕血等状况；(4)通量低，无法大量随时随地采集样本。
近些年来，科研和医药领域逐渐采用唾液、口腔拭子取样的方式获取个体的DNA，因为唾液里有一些口腔上皮细胞和唾液腺来源的白细胞，这些细胞里面有DNA。唾液、口腔拭子样本采集相对于传统血液样本采集来讲，是一种对人体无伤害、无痛苦的获取基因组DNA的方法，不易引起被采集者的不适和畏惧心理，该法不会对被采样者造成任何不适，且易接受，因而能最大限度的扩大基因研究的取样范围，特别适合分子流行病学大规模调查，唾液、口腔拭子基因子DNA样品的采集主要为唾液或者口腔黏膜上皮细胞。唾液、口腔拭子样品中含有大量人体分泌的体液，其中包含粘蛋白、球蛋白、消化酶和白蛋白等物质，多种有机物的存在容易滋生大量的微生物，保存需低温且保存时间短，如何避免微生物的生长同时保证脱落细胞中基因组DNA的完整，成为唾液保存液的关键作用所在。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液，按1升的浓度计，包括如下组分：
SDS(十二烷基硫酸钠)0.10～0.2％；
NaCL 0.90％；
Tris(三羟甲基氨基甲烷)5～15mM；
EDTA 20～25mM；
蛋白酶K 150-160mg。
在本发明的一个优选实施例中，所述SDS(十二烷基硫酸钠)浓度为0.10。
在本发明的一个优选实施例中，所述Tris(三羟甲基氨基甲烷)浓度为15mM。
在本发明的一个优选实施例中，所述EDTA浓度为20mM。
在本发明的一个优选实施例中，所述蛋白酶K浓度为150mg。
本发明的有益效果在于：
该唾液、口腔拭子保存液以SDS、Tris-HCl、EDTA、NaCl和蛋白酶K为主要成分，可用于唾液保存。
NaCl可以维持细胞渗透压，SDS表面活性剂在蛋白酶K作用下可以破坏蛋白成分抑制细菌的滋生，容易引起DNA的降解；Tris-HCl、EDTA可以保护游离DNA。
本发明的DNA保存液是一种针对口腔拭子保存的保存液，其可以较好的保存口腔细胞；其更加卫生，不易滋生细菌；且保存时间长比信封长3-5倍；制备方法简单，具有较好的社会价值。
附图说明
图1为数据结果示意图1；
图2为数据结果示意图2。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。
取10克的几丁胺糖混合物，内含80％(W/W)几丁胺糖高分子(分子量Mw＝340000，脱乙酰度＝84％)以及20％的几丁胺糖寡糖(2-10糖)，将上列几丁胺糖加入到1公升的纯水下，在室温下，搅拌至几丁胺糖均匀分散于水中后，慢慢滴入冰醋酸，并同时继续搅拌经过半小时滴加3.6克冰醋酸以后，几丁胺糖完全溶解，再加入1克的柠橡酸，继续搅拌半小时后，停止搅拌，得到均匀的溶液；取出上述几丁胺糖溶液100毫升，加水稀释至1公升，再加0.5克的氯化钠(NaCl)及0.01克的氟化钠(NaF)，即得到口腔保护液。
此项产品进一步验证其成膜性，以100毫升的烧杯，盛装50毫升唾液样品，符上述口腔保护液涂布在显微镜盖玻片上，再将此盖玻片浸入唾液中，10分钟以后取出，以100倍显微镜检视盖玻片表面，可以观察到完全覆盖一层几丁胺糖薄膜。
1.配制0.5M EDTA母液：将EDTA.Na2.2H2O与约20g NaOH直接加入到1L容器中，搅拌至完全溶解，微调pH值至8.0NaOH不作为最终成分，起辅助溶解作用,最终生成Na3EDTA,定溶至1L，灭菌，备用。
2.配制2M Tris母液：将Tris称量好，接加入到1L容器中，搅拌至完全溶解，溶解后,用HCl将pH调至pH8.0(25℃)，定溶至1L，最后用0.22um膜过滤。
3.配制DNA保护液：按比例将上述母液直接加入到1L容器中，按规定的量称取十二烷基硫酸钠(温水溶解)、氯化钠、蛋白酶K到1L容器中，搅拌至完全溶解，用HCl将pH调至pH7.5(25℃)，定溶至1L，最后用0.22um膜过滤。
基因组DNA抽提
一、实验材料预处理
1、转移唾液/口腔拭子样品细胞保护液400μL至2.0mL EP管中；
2、向EP管中加入300μL裂解液和20μL蛋白酶K溶液，涡旋混匀后置于60℃水浴锅中温浴30～40min，每隔5min摇晃混匀一次，裂解完毕低速瞬离将管内液体集中至管底。
注：若需去除RNA，请在上述混合液中加入4μL RNase A溶液。
二、提取基因组DNA
1.核酸结合：向裂解完毕液EP管中加入300μL异丙醇和80μL磁珠悬浮液(提前摇晃均匀)，高速涡旋震荡5min。
2.磁性分离将EP管置于磁力架上静置20s至磁珠吸附完全(如EP管内盖有磁珠液残留，可保持EP管在磁力架上，整体上下颠倒2～3次至磁珠被完全吸附)，吸弃上清液。
3.清洗：1)向EP管中加入700μL清洗液1，吹散磁珠后涡旋震荡2min，参照步骤4进行磁性分离、吸弃上清液；
4.使用700μL清洗液2，参照步骤5(1)操作2次；
5.使用700μL80％乙醇，参照步骤5(1)操作1次。
6.除醇将除尽上清液后EP管同磁力架一并置于45℃真空干燥箱中，干燥10min。注：亦可置于通风橱通风或电风扇直吹约10min，具体时间以磁珠干透无乙醇味为准。
7.核酸洗脱向EP管中加入100μL洗脱液，吹散磁珠，58℃温浴10min，每隔3min涡旋振荡30s。
8.核酸转移将EP管置于磁力架上至磁珠吸附完全，将洗脱液转移至干净EP管中，提取过程完毕。
9.取4μL洗脱液加入1μL上样缓冲液进行电泳检测。
10.使用Thermo NanoDrop-2000进行核酸浓度的测定。
数据结果参加图1、图2和表1、表2，其中：
1、2：为未加保护液的唾液样本，3、4：为未加保护液的口腔拭子样本，5、6：为加保护液的唾液样本，7、8：为加保护液的口腔拭子样本。
表1
Sample 1、2：为未加保护液的唾液样本，sample3、4：为未加保护液的口腔拭子样本，sample5、6：为加保护液的唾液样本，sample7、8：为加保护液的口腔拭子样本。
结论：采取唾液样本和口腔拭子样本，对照组加入800uL的本保护液，
9、10：为未加保护液的唾液样本室温放置1个月，11、12：为未加保护液的口腔拭子样本室温放置1个月，13、14：为加保护液的唾液样本室温放置1个月，15、16：为加保护液的口腔拭子样本室温放置1个月。
表2
Sample 1、2：为未加保护液的唾液样本室温放置1个月，sample3、4：为未加保护液的口腔拭子样本室温放置1个月，sample5、6：为加保护液的唾液样本室温放置1个月，sample7、8：为加保护液的口腔拭子样本室温放置1个月。
由表1和2可知：
本发明的DNA保存液是一种针对口腔拭子保存的保存液，其可以较好的保存口腔细胞；其更加卫生，不易滋生细菌；且保存时间长比信封长3-5倍；制备方法简单，具有较好的社会价值。

Claims (5)

1.一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液，其特征在于，按1升的浓度计，包括如下组分：
SDS(十二烷基硫酸钠)0.10～0.2％；
NaCL 0.90％；
Tris(三羟甲基氨基甲烷)5～15mM；
EDTA 20～25mM；
蛋白酶K 150-160mg。
2.如权利要求1所述的一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液，其特征在于，所述SDS(十二烷基硫酸钠)浓度为0.10。
3.如权利要求1所述的一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液，其特征在于，所述Tris(三羟甲基氨基甲烷)浓度为15mM。
4.如权利要求1所述的一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液，其特征在于，所述EDTA浓度为20mM。
5.如权利要求1所述的一种唾液、口腔拭子基因组DNA保护液，其特征在于，所述蛋白酶K浓度为150mg。
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