CN109563501A - 肽片段的制备方法和其中所使用的蛋白酶的制备方法、以及肽片段制备用试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明的肽片段的制备方法使Fc结构域被固定在多孔体的细孔内的抗体与被固定在微粒的表面的蛋白酶接触。由此通过蛋白酶位点特异性地切断抗体的Fab结构域，得到以高浓度含有来自Fab结构域的肽片段的试样。本发明中使用的蛋白酶为混入有胰凝乳蛋白酶的来自动物的胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶已失活，胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基进行了化学修饰。

Description

肽片段的制备方法和其中所使用的蛋白酶的制备方法、以及 肽片段制备用试剂盒
技术领域
本发明涉及用蛋白酶位点特异性地切断抗体而制备肽片段的方法和其中所使用的蛋白酶的制备方法、以及肽片段制备用试剂盒。
背景技术
抗体药物的需求正迅速扩大，在临床现场，对血液中的抗体浓度进行简便定量的重要性在提高。一直以来，虽然并未重视正确测定给药抗体药物后的血药浓度，但在伴随曲妥珠单抗(商品名：Herceptin)的应用扩展到胃癌的临床试验中，发现其血药浓度与生存期之间存在显著性差异之后，在抗体药物的临床试验等中，测定抗体的血药浓度也逐渐成为必须。例如，在确认药代动力学等质量管理、确认仿制药在临床试验等中与原药的等效性等方面也要求进行抗体药物的鉴定、其血药浓度的定量。
抗体具有由重链构成的1个Fc(Fragmentcrystallizable，可结晶片段)结构域和由重链和轻链构成的2个Fab(Fragment antigen binding，抗原结合片段)结构域。Fab结构域中，N末端侧的部分的氨基酸序列可观察到丰富的变化，以便可以与多种抗原结合。该区域被称为可变区(V区)，抗体的特异性(即对抗原的特异性结合性)由V区的氨基酸序列的组合决定。轻链和重链分别在V区内具有3个互补决定区(CDR)。CDR是表征抗体的区域，通过确定抗体的CDR的氨基酸序列可以鉴定抗体。
随着蛋白质组学的发展，已开发出能够通过质谱分析包罗性检测、定量蛋白质的技术，近年，抗体等巨大生物分子的分析也已成为可能。质谱分析中需要将测定对象分子进行离子化，多数情况下难以直接通过质谱分析来分析抗体等巨大生物分子。因此采用如下方法：通过蛋白酶消化将蛋白质切断(片段化)，从片段化的肽中选择具有对分析对象蛋白质而言特异性的氨基酸序列的肽片段，利用质谱分析装置进行检测、定量。
来自抗体的CDR的肽片段具有对抗体而言特异性的氨基酸序列，因此通过利用质谱分析来检测/定量来自CDR的肽片段，从而能够定量特定的抗体。作为由抗体选择性生成来自CDR的肽片段的方法，已开发了如下方法：通过固定在多孔体的细孔内的抗体与固定在纳米粒子表面的蛋白酶的反应，位点特异性地切断抗体而生成肽片段的方法(nano-Surface and Molecular-Orientation Limited proteolysis；nSMOL法)(例如专利文献1)。
nSMOL法中，通过使抗体的Fc结构域结合到多孔体的细孔内来限制蛋白酶接近Fc结构域，使包含CDR的Fab结构域位点特异性地与蛋白酶反应。因此，与蛋白酶反应后的试样中相对于总生成肽以高浓度含有来自抗体的CDR的肽片段，能够进行高精度的定量分析。
已报道了利用nSMOL法能够对各种抗体药物进行高精度的定量分析。具体而言，已报道了利用nSMOL法对曲妥珠单抗(非专利文献1和非专利文献2)、贝伐珠单抗(非专利文献1和非专利文献3)和纳武利尤单抗(nivolumab)(非专利文献4)等人源化抗体、以及西妥昔单抗(非专利文献5)和利妥昔单抗(非专利文献6)等嵌合抗体的血药浓度进行定量的例子。
上述的专利文献和非专利文献中，均使用胰蛋白酶作为用于将抗体片段化的蛋白酶。胰蛋白酶是主要在胰脏中产生的分子量约23kDa的丝氨酸蛋白酶，通过水解来切断碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)的C末端的羧基。胰蛋白酶由于底物特异性极高，因此作为用于产生质谱分析用的肽片段的蛋白酶有用性高，被用于多种蛋白质的结构分析。
由动物的胰脏提取的胰蛋白酶中混入有胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶的底物特异性与胰蛋白酶的不同，主要通过水解切断芳香族氨基酸的C末端的羧基。另外，有时天然的胰蛋白酶通过自身消化而生成拟胰蛋白酶，显示包括胰凝乳蛋白酶样活性在内的广泛的特异性。因此，当使用来自动物的胰蛋白酶作为蛋白酶时，由于所混入的胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶的自身消化产物的影响而丧失底物特异性，生成目标以外的肽片段从而分析精度降低，这成为问题。
通过纯化难以从来自动物的胰蛋白酶中彻底除去胰凝乳蛋白酶。因此，来自动物的胰蛋白酶主要被用于细胞培养中的粘附细胞的剥离。已知为了将来自动物的胰蛋白酶用作质谱分析用的蛋白酶而通过使胰凝乳蛋白酶失活、抑制胰蛋白酶的自身消化来提高胰蛋白酶的底物特异性的方法。例如，通过用N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(TPCK)处理，则会使胰蛋白酶中所混入的胰凝乳蛋白酶失活。
这些化学处理对提高来自动物胰蛋白酶的底物特异性有用，但容易产生酶活性的大幅降低、以及批次间的活性偏差。因此，在制备要求高精度的定量性的质谱分析用试样时，主要使用质谱级的基因重组型(Recombinant)胰蛋白酶。重组胰蛋白酶由于不含来自动物的夹杂物而具有高的底物特异性和酶活性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2015/033479号小册子
非专利文献
非专利文献1:Iwamoto et.al,Analyst.,2014,139(3),576-80.
非专利文献2:Iwamoto et.al,Anal.Methods,2015,21,9177-9183.
非专利文献3:Iwamoto et.al,Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2016,31,46-50.
非专利文献4:Iwamoto et.al,J.Chromatogr.B:Analyt.Technol.Biomed.LifeSci.,2016,1023-1024,9-16.
非专利文献5:Iwamoto et.al,Bioanalysis,2016,8(10),1009-1020.
非专利文献6:Iwamoto et.al,Biol.Pharm.Bull.,2016,39(7),1187-1194.
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，重组胰蛋白酶显示高的底物特异性，即使在位点特异性地切断抗体的nSMOL法中，其有用性也已得到确认。但是，重组胰蛋白酶由于是用酵母表达因此其产生量少，而且需要在利用亲和层析纯化后、利用凝胶渗透色谱纯化，因此纯化效率差。因此，重组胰蛋白酶难以确保充足的供给量，而且非常昂贵。因此，重组胰蛋白酶通常被用于蛋白质的结构分析等研究目的，产业性的利用受到限制。本发明的目的在于，提供使用能够确保充足的供给量且廉价的来自动物的胰蛋白酶的、用于进行抗体的血药浓度定量等质谱分析用的试样制备方法。
用于解决问题的方案
本发明涉及一种肽片段的制备方法，通过使Fc结构域被固定在多孔体的细孔内的抗体与被固定在微粒的表面的蛋白酶接触，从而通过蛋白酶将抗体的Fab结构域位点特异性地切断。进而，本发明涉及一种在上述方法中使用的肽片段制备用试剂盒。本发明的试剂盒含有在表面固定有蛋白酶的微粒。
被固定在微粒的表面的蛋白酶为混入有胰凝乳蛋白酶的来自动物的胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶已失活。被固定在微粒的表面的胰蛋白酶，其赖氨酸残基的氨基进行了化学修饰。
胰凝乳蛋白酶例如通过在活性中心的组氨酸残基上结合N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(TPCK)而不可逆地失活。胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基例如被还原烷基化。
多孔体优选在细孔内能够选择性固定抗体的Fc结构域，使用例如包覆有蛋白A、蛋白G的多孔体。
上述的蛋白酶可以通过改造来自动物的胰蛋白酶而制备。胰蛋白酶的改造例如通过实施丝氨酸蛋白酶抑制剂处理和还原烷基化处理来进行。进行胰凝乳蛋白酶的失活和还原烷基化之后的胰蛋白酶优选利用亲和层析进行纯化。
通过使来自动物胰蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂反应，从而胰凝乳蛋白酶失活。作为丝氨酸蛋白酶抑制剂，优选不会使胰蛋白酶失活、而是选择性地使胰凝乳蛋白酶失活的丝氨酸蛋白酶抑制剂，优选使用前述的TPCK等。
通过使用了烷基化剂和还原剂的还原烷基化，胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基被烷基化，胰蛋白酶的自身消化受到抑制。还原烷基化中使用的烷基化剂的合计量优选为胰蛋白酶的200摩尔倍以上。还原烷基化中使用的还原剂的合计量也优选为胰蛋白酶的200摩尔倍以上。作为烷基化剂，优选醛。通过使用甲醛作为烷基化剂，胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基被甲基化。
发明的效果
本发明中使用的改造胰蛋白酶来自动物，因此与广泛用于质谱分析的重组胰蛋白酶相比廉价且容易确保供给量。另外，将改造胰蛋白酶固定在微粒的表面并进行抗体的位点特异性片段化时，显示与重组胰蛋白酶同等或同等以上的底物特异性和酶活性。因此，根据本发明，可以廉价且简便地实施血液等生物试样中的抗体浓度的定量。
附图说明
图1是用于说明利用蛋白酶位点特异性地切断抗体的原理的示意图。
图2是色谱的各组分的蛋白质浓度和酶活性的测定结果。
图3是示出底物的特异性片段的生成量的图表。
图4A是示出实施例的改造酶的化学适应性的评价结果的图表。
图4B是示出实施例的改造酶的化学适应性的评价结果的图表。
图4C是示出实施例的改造酶的化学适应性的评价结果的图表。
图4D是示出实施例的改造酶的化学适应性的评价结果的图表。
图4E是示出实施例的改造酶的化学适应性的评价结果的图表。
图5是示出白蛋白、血红蛋白和乳球蛋白的通过胰蛋白酶消化得到的底物特异性片段的生成量的图表。
图6A是对血浆中的贝伐珠单抗浓度与位点特异性片段化而生成的肽片段在质谱分析中的峰面积的关系绘制而得的图表。
图6B是对血浆中的贝伐珠单抗浓度与位点特异性片段化而生成的肽片段在质谱分析中的峰面积的关系绘制而得的图表。
图7是对血浆中的曲妥珠单抗浓度与位点特异性片段化而生成的肽片段在质谱分析中的峰面积的关系绘制而得的图表。
图8是对血浆中的纳武利尤单抗浓度与位点特异性片段化而生成的肽片段在质谱分析中的峰面积的关系绘制而得的图表。
图9是示出胰蛋白酶改造时的烷基化剂的使用量与酶活性和来自抗体的CDR片段的生成量的关系的图表。
具体实施方式
本发明的方法通过使被固定在多孔体的细孔内的底物与被固定在微粒的表面的蛋白酶接触，底物被蛋白酶位点特异性地切断而得到肽片段。图1是用于说明底物被位点特异性地切断的原理的示意图。微粒10(平均粒径D1)的表面固定有蛋白酶15。多孔体20具有多个细孔29(平均细孔径D2)，细孔内固定有底物25。
[底物]
底物25为抗体，优选抗体的Fc结构域被固定在多孔体20的细孔29内。通过使抗体的Fc结构域被固定在多孔体内，抗体在细孔内的取向受到控制，从而能够利用蛋白酶进行Fab结构域的位点特异性切断。抗体的种类没有特别限制，优选为单克隆抗体，其中优选需要进行生物试样(例如血液)中的浓度的定量的抗体(例如分子靶向治疗药)。抗体可以为人抗体、人源化抗体和嵌合抗体等。
[多孔体]
多孔体20只要具有多个细孔29则对其材料没有特别限定，可使用活性炭、多孔膜、多孔树脂珠、金属粒子等。图1中示出半球形状的细孔，但对细孔的形状没有特别限定。也可以使用多孔膜之类的形成有贯穿多孔体的细孔的物质。
多孔体优选能够与抗体特异性结合，特别优选能够与抗体的Fc结构域位点特异性结合。为了实现与抗体的特异性结合，优选在多孔体的细孔内的表面固定有能够与抗体特异性结合的连接体21。作为能够与抗体的Fc结构域位点特异性结合的连接体，可列举蛋白A、蛋白G。即，优选多孔体20被蛋白A、蛋白G等能够与抗体特异性结合的分子包覆。蛋白A与Fc结构域结合的位点特异性高。因此，为了提高蛋白酶消化的位点特异性，优选使用被蛋白A包覆的多孔体。
多孔体20的细孔29的大小没有特别限定。多孔体20的平均细孔径D 2比微粒10的平均粒径D 1小时，微粒10不能接近细孔29的深部。与此相伴地，被固定在微粒10表面的蛋白酶15也不能接近细孔29的深部。
图1中，细孔29附近的虚线表示蛋白酶15能够接近的区域的边界。从而，限制了蛋白酶接近细孔内的表面所结合的抗体的Fc结构域，蛋白酶接近位于远离与细孔的结合部位的位置的Fab结构域概率相对提高。由此可以通过蛋白酶位点特异性地切断抗体的Fab结构域，得到肽片段。
为了在细孔内固定Fc结构域、位点特异性地用蛋白酶消化Fab结构域,多孔体的平均细孔径优选为30nm～150nm，更优选为40nm～120nm，进一步优选为50nm～100nm。
[微粒]
微粒10在其表面固定有蛋白酶15，控制蛋白酶接近被固定在多孔体20的细孔29内的抗体25。为了避免进入多孔体20的细孔29的深部，微粒10优选其平均粒径D 1大于多孔体20的平均细孔径D 2。微粒10的形状没有特别限定，从使蛋白酶能够接近多孔体20的细孔29的区域均匀化的观点出发，优选球状的微粒。另外，微粒10优选平均粒径均匀。
微粒10的平均粒径D1更优选为多孔体20的平均细孔径D2的1.2倍以上，进一步优选为1.5倍以上，特别优选为1.8倍以上。微粒10的平均粒径D1优选为100nm以上，更优选为150nm以上。微粒10的平均粒径D1的上限没有特别限定，从提高蛋白酶的消化效率的观点出发，优选为1μm以下，更优选为500nm以下。
微粒10只要能够在表面固定蛋白酶则对其材质没有特别限定，适合使用金属、树脂等。微粒10优选抑制蛋白质向表面的非特异性的吸附、能够选择性固定蛋白酶的微粒，例如适合使用被能与蛋白酶特异性结合的间隔物11修饰的微粒。间隔物优选能够与蛋白酶结合且不使蛋白酶失活的物质。
从控制微粒10的表面所固定的蛋白酶15的接近范围的观点出发，间隔物11优选分子直径小。间隔物的分子直径优选为5nm以下，更优选为3nm以下，进一步优选为2nm以下。能够固定蛋白酶的间隔物11优选不是蛋白质，优选具有氨基、酰胺基、酯基、环氧基、羧基、生物素、亲和素、螯合物等官能团的分子。
[蛋白酶]
本发明中，使用胰蛋白酶作为蛋白酶。胰蛋白酶的分子直径小且活性部位存在于分子的内部。因此，被固定在微粒表面的胰蛋白酶的活性部位能够接近作为底物的抗体的区域受到限制，抗体的切断部位的选择性提高。
作为蛋白酶使用的胰蛋白酶为来自动物的胰蛋白酶，例如来自猪、牛的胰脏。利用基因重组而得的胰蛋白酶不含来自动物的夹杂物，与此相对地，来自动物的胰脏的胰蛋白酶不可避免地混入有胰凝乳蛋白酶。本发明中，作为蛋白酶使用的胰蛋白酶中所混入的胰凝乳蛋白酶是失活的。
胰凝乳蛋白酶可以由于各种丝氨酸蛋白酶抑制剂而失活。作为能够用于胰凝乳蛋白酶的失活的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可列举：苯甲磺酰氟(PMSF)、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、氟磷酸二异丙酯(DFP)、苄脒、胰凝乳蛋白酶抑制剂、N-甲苯磺酰基-L-赖氨酰氯甲基酮(TLCK)和N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酰氯甲基酮(TPCK)等。这些中，从能够维持胰蛋白酶的酶活性、选择性且不可逆地使胰凝乳蛋白酶失活的角度出发，优选TPCK。
TPCK与胰凝乳蛋白酶的活性中心中所含的组氨酸残基不可逆地结合，因此通过TPCK处理能够维持胰蛋白酶的活性、且使胰凝乳蛋白酶失活。通过使混入有胰凝乳蛋白酶的来自动物的胰蛋白酶在溶液中与TPCK混合，从而使胰凝乳蛋白酶失活。TPCK处理例如在4℃左右进行1小时～5小时左右即可。
本发明中使用的蛋白酶中所含的胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基进行了化学修饰。通过对胰蛋白酶的赖氨酸残基中所含的ε-氨基进行化学修饰，从而抑制自身消化，胰蛋白酶的酶活性和底物特异性提高。作为氨基的化学修饰，优选烷基化。例如，通过在还原剂存在下与醛反应，从而赖氨酸残基的氨基被还原烷基化。还原烷基化中使用的还原剂优选在水溶液中稳定且可以将在还原烷基化的最初阶段形成的席夫碱选择性还原的物质。作为优选的还原剂，可列举硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲基胺硼烷、三甲基胺硼烷、和吡啶硼烷等。
通过使相对于赖氨酸残基的量为过量的醛和还原剂存在，赖氨酸残基的氨基被二烷基化。例如，通过使甲醛和还原剂过量存在，赖氨酸残基的氨基被还原二甲基化。为了抑制胰蛋白酶的自身消化、提高底物特异性，烷基化剂(醛)的使用量(合计量)优选为胰蛋白酶量的200摩尔倍以上，更优选为600摩尔倍以上，进一步优选为1000摩尔倍以上。还原剂的使用量优选为胰蛋白酶量的200摩尔倍以上，更优选为500摩尔倍以上，进一步优选为800摩尔倍以上。另一方面，当还原剂和烷基化剂的使用量过多时，有时会导致酶活性下降、纯化时回收率下降。因此，还原剂和烷基化剂的使用量优选为胰蛋白酶量的20000摩尔倍以下，更优选为10000摩尔倍以下，进一步优选为5000摩尔倍以下。还原剂和烷基化剂既可以一次性添加全部量，也可以将全部量分成多次来添加。
在进行胰凝乳蛋白酶失活和胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基修饰后，优选进行纯化。纯化方法没有特别限定，优选使用能够可逆地吸附胰蛋白酶的亲和柱通过亲和层析进行纯化。作为亲和柱的载体，使用偶联有苄脒等丝氨酸蛋白酶抑制剂的琼脂糖珠等。通过从洗脱液中选择酶活性高的组分，而得到底物特异性和活性高的胰蛋白酶。
使用来自动物的胰蛋白酶进行TPCK处理等胰凝乳蛋白酶失活和还原二甲基化等修饰、并且利用色谱进行纯化后的改造胰蛋白酶如后述的实施例所示，显示与重组胰蛋白酶同等或更高的底物特异性和酶活性。另外，改造胰蛋白酶与重组胰蛋白酶相比，容易应对供给量的增加等且廉价。
本发明中，除了经改造的来自动物的胰蛋白酶以外，还可以组合使用其它蛋白酶。例如，可以组合使用选择性水解赖氨酸残基的C末端的羧基的赖氨酰肽链内切酶。在使用胰蛋白酶以外的蛋白酶时，优选将总蛋白酶中的胰蛋白酶的量设为90％以上。
[试样制备方法]
本发明的肽片段的制备方法中，将血液等试样中所含的抗体固定于多孔体后，使固定有抗体的多孔体与固定有蛋白酶的微粒接触，由此抗体被蛋白酶位点特异性地切断，产生肽片段。
在多孔体的细孔内固定作为底物的抗体的方法没有特别限定。在多孔体被蛋白A、蛋白G等能够与抗体特异性结合的分子包覆的情况下，可以通过将多孔体的悬浮液与含有抗体的溶液混合而将抗体容易地固定在多孔体的细孔内。
作为含有抗体的溶液，可列举血液等来自生物的试样。来自生物的试样中，除了抗体以外还含有多种多样的夹杂物。将多孔体与作为被检体的来自生物的试样混合，在抗体被选择性固定于多孔体的状态下进行洗涤，从而除去非选择性地附着于多孔体的夹杂成分。在夹杂成分容易凝集而牢固附着的情况下，优选使用表面活性剂等使夹杂成分变性而溶解在液体中。优选在用表面活性剂处理后，使用不含表面活性剂的液体进行洗涤而除去附着于多孔体的表面活性剂。
将蛋白酶固定在微粒的表面的方法没有特别限定，可以根据蛋白酶和微粒(或者对微粒表面进行修饰的间隔物分子)的特性等采用合适的方法。例如，在将胰蛋白酶固定到经间隔物修饰的微粒的表面的情况下，可以通过将微粒的悬浮液和含有胰蛋白酶的溶液混合而将蛋白酶固定到微粒表面。在将蛋白酶固定到微粒的表面后，可以利用化学修饰等使微粒表面的未与蛋白酶结合的活性部分失活。
蛋白酶既可以以预先固定于微粒的状态提供，也可以在即将使用之前将蛋白酶固定到微粒的表面而使用。固定有蛋白酶的微粒优选以悬浮液形式来提供。
固定有上述的改造胰蛋白酶的微粒可以作为肽片段制备用试剂盒的一部分来提供。胰蛋白酶即使在固定于微粒表面的状态下也可保持活性，因此如果以蛋白酶被固定于微粒表面的状态作为试剂盒的构成要素来提供，则可以简化肽片段制备的操作。肽片段制备用试剂盒除了固定有改造胰蛋白酶的微粒以外，还可以含有可在细孔内选择性固定抗体的Fc结构域的多孔体。作为能够在细孔内选择性固定抗体的Fc结构域的多孔体，如前所述优选被蛋白A、蛋白G等包覆的多孔体。肽片段制备用试剂盒还可以含有在使被检体中的抗体固定于多孔体、反应等中使用的容器、溶液等。
通过使固定有抗体的多孔体与固定有蛋白酶的微粒在液体中混合，而进行抗体的位点特异性的蛋白酶消化。反应条件没有特别限定，可以适宜采用与蛋白酶消化同样的条件。例如，优选在调节为胰蛋白酶的最适pH附近(pH7～9左右)的缓冲溶液中、通常在35～60℃左右的温度下孵育3小时～30小时左右。
通过与蛋白酶反应而产生的肽片段游离在溶液中。由于蛋白酶与作为与多孔体结合部位的抗体的Fc结构域的接近受到限制，因此包含抗体的互补决定区(CDR)的Fab结构域被蛋白酶位点特异性地切断。因此，游离到液体中的肽片段以高浓度包含含有对于鉴定抗体而言重要的互补决定区的氨基酸序列的肽片段。
[利用质谱分析进行的抗体浓度的定量]
用色谱、质谱分析对含有上述而得到的肽片段的试样进行分析，从而可进行抗体的鉴定、定量。本发明中，由于抗体的Fab结构域被胰蛋白酶位点特异性地切断，因此试样中所含的肽片段的种类少，且以高浓度包含含有互补决定区的氨基酸序列的肽片段。因此，可容易地进行利用质谱分析等的分析条件的设定。
出于更切实地分离肽片段、提高分析精度等目的，可以将供于质谱分析前的试样用液相色谱(LC)、固相萃取(SPE)等进行分离、浓缩。
在基于质谱分析结果进行抗体鉴定时，可以使用已有的数据库。使用LC/MS/MS的多重反应监测(Multiple Reaction Monitoring；MRM)适合于抗体浓度的定量。在对血液等被检体中的抗体的含量(浓度)进行定量时，可以基于来自肽片段的离子的峰面积、峰强度来算出抗体的量。例如，利用预先求出的标准曲线(校正曲线)与峰面积的关系、来自添加于试样中的内标的峰面积与来自试样的峰面积的关系等算出试样中的肽片段的浓度，基于该浓度算出血液等被检体中的抗体的量、浓度。
上述的改造胰蛋白酶具有与广泛用于质谱分析的重组胰蛋白酶同等优异的底物特异性且抗体的切断部位的位点特异性也优异。因此，定量分析的再现性高，在血液等被检体中的抗体药物浓度的定量中也可以使用。
本发明的方法操作简便且能够确保再现性、定量性，并且能自动化。进而，试样制备中使用的蛋白酶的供给稳定且廉价，因此产业利用价值也高。本发明的方法还可以用于药代动力学分析、使用了抗原抗体反应的相互作用的分析、各种相互作用组分析、免疫沉淀蛋白的鉴定等基础研究。此外，也可期待用于抗体药物等生物分子药物的序列分析、质量保证、仿制药的等效性确认等。
实施例
以下示出实施例来更具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例限定。以下的％的记载只要没有特别说明则表示重量％。
[胰蛋白酶的改造和色谱纯化]
(TPCK处理)
将猪胰脏胰蛋白酶(SIGMA ALDRICH,T0303)溶解于50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.4)，制备1mg/mL(约40μM)的溶液。向该溶液中添加N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(TPCK)的DMSO溶液(40mM)并使TPCK浓度为100μM，在4℃下温和地搅拌2小时。
(还原二甲基化处理)
向TPCK处理后的胰蛋白酶溶液中添加1M二甲基胺硼烷和1M甲醛，并且相对于胰蛋白酶1mg使二甲基胺硼烷为20μmol、甲醛为40μmol，在4℃下温和地搅拌1.5小时。然后，再添加与上述等量的二甲基胺硼烷和甲醛，在4℃下温和地搅拌1.5小时。然后，相对于胰蛋白酶1mg添加10μmol的二甲基胺硼烷，在4℃下平稳地搅拌过夜。在该处理中，相对于胰蛋白酶使用约2000摩尔倍的甲醛和约1250摩尔倍的二甲基胺硼烷。
(色谱纯化)
向容量2mL的苄脒琼脂糖柱(GE Healthcare HiTrap Benzamidine FF柱，将2根容量1mL的柱连接)中通入柱容量的10倍的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.4)而进行平衡化后，通入上述的处理后的胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶量：25mg)而固定在柱上。通入为柱容量的10倍量的含有150mM的氯化钠浓度的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.4)洗涤柱后，向柱中通入为柱容量的4倍的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)进行脱盐。然后，用10mM盐酸10mL进行洗脱，将最初的0.5mL设为组分No.1，此后将1mL设为1个组分来回收洗脱液(组分No.2～10)。
(蛋白质浓度的定量)
从上述的各组分中取50μL，加入1M Tris盐酸缓冲液(pH8.0)，利用Micro BCA TM蛋白质分析试剂盒定量蛋白质浓度。
(胰蛋白酶的酶活性)
向50mM Tris盐酸缓冲溶液(pH8.0)中添加作为底物的N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐(BANA)，并使浓度为50μL/mL。向该溶液中添加各组分的洗脱液，并使胰蛋白酶浓度为10μL/mL。边在37℃下温和地搅拌边每隔一定时间测定405nm的吸光度，由其经时变化(利用分解底物而生成对硝基苯胺的速度)算出胰蛋白酶的活性。
(特异性片段的生成量)
使用白蛋白(Alb)、血红蛋白(Hb)、和乳球蛋白(Lac)作为底物，向底物中添加上述的组分No.1～10，在37℃下进行消化反应过夜。进行消化反应后的溶液的MS/MS分析，通过数据库(Mascot server)分析求出各底物的特异性片段的生成量。作为酶，使用仅进行TPCK处理但未进行还原二甲基化的胰蛋白酶、和重组胰蛋白酶的市售品(Promega TrypsinGold)，与上述同样求出底物的特异性片段的生成量。
(评价结果和回收组分的确定)
将组分No.1～10的蛋白质浓度和酶活性的测定结果示于图2。将使用组分No.1～10、以及重组胰蛋白酶(rec)和仅进行了TPCK处理的胰蛋白酶(TPCK)进行底物(Alb，Hb和Lac)的消化时的特异性片段的生成量示于图3。
如图2所示，组分No.3～7的蛋白质浓度高，显示几乎同等的酶活性。另外，如图3所示，组分No.3～8的底物特异性片段的生成量与使用市售的重组胰蛋白酶时同等。基于这些结果而将组分No.3～7确定为回收组分。此后，使用该回收组分(此后有时记作“改造胰蛋白酶”。)来实施评价。
[酶活性的评价]
(与重组胰蛋白酶的酶活性的比较)
以N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐为底物来测定改造胰蛋白酶和市售的重组胰蛋白酶的酶活性，改造胰蛋白酶显示出重组胰蛋白酶的约2倍的酶活性。
(化学适应性)
使Tris盐酸缓冲溶液的pH在7.0～9.0的范围内变化，在反应温度37℃和50℃下测定改造胰蛋白酶的酶活性。图4A示出将pH8.0下的酶活性设为1而对37℃和50℃时分别进行标准化而得的图表。
将在乙腈(10％和20％)、DMSO(10％)以及甲醇(10％)和甘油(10％)各溶液中的酶活性的测定结果示于图4B。将在尿素(1M和2M)、氯化钠(50mM、150mM和500mM)、硫酸铵(50mM、150mM和500mM)、吲哚-3-乙酸(50mM)以及乙二胺四乙酸(1mM和10mM)各溶液中的酶活性的测定结果示于图4C。将在二硫苏糖醇(1mM、2mM、5mM、10mM和20mM)、以及三(2-羧基甲基)膦(0.5mM、1mM、1.5mM、2mM和5mM)各溶液中的酶活性的测定结果示于图4D。将在正辛基-β-D-硫代葡糖苷(0.1％)、正辛基-β-D-葡糖苷(0.1％)、十二烷基硫酸钠(0.1％)、以及棉子糖(100mM和200mM)各溶液中的酶活性的测定结果示于图4E。图4B～E中的酶活性示出将pH8.0的Tris盐酸缓冲溶液中的37℃和50℃下的酶活性(参照图4A)设为1而进行标准化的值。
[胰蛋白酶在微粒表面的固定]
将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯包覆铁素体纳米粒子(FG beads；多摩川精机制、粒径约200nm)的异丙醇悬浮液50μL在4℃下离心而使微粒沉降，除去上清后用甲醇洗涤。将含有50μg的改造胰蛋白酶的溶液加入到上述的微粒中而使微粒悬浮。将微粒的悬浮液在4℃下搅拌30分钟，在4℃下离心而使微粒沉降，除去上清。将用50mM Tris盐酸缓冲溶液(pH8.0)洗涤和离心重复进行2次后，在Tris盐酸缓冲溶液(pH8.0)中悬浮微粒，得到被固定在微粒的表面的胰蛋白酶的浓度为1μg/μL的悬浮液。
使用重组胰蛋白酶的市售品代替改造胰蛋白酶，而制备在表面固定有重组胰蛋白酶的微粒的悬浮液。
(酶活性的比较)
以N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐为底物测定被固定在微粒表面的改造胰蛋白酶和重组胰蛋白酶的酶活性，结果，被固定在微粒表面的改造胰蛋白酶显示被固定在微粒表面的重组胰蛋白酶的约4倍的酶活性。
(特异性片段的生成量)
使用白蛋白(Alb)、血红蛋白(Hb)、和乳球蛋白(Lac)作为底物，添加固定有胰蛋白酶的微粒，在37℃下进行消化反应过夜，通过MS/MS分析结果的数据库分析求出各底物的特异性片段的生成量。将结果示于图5。被固定在微粒上的改造胰蛋白酶(mod)显示与重组胰蛋白酶(rec)同等的特异性片段生成量。
[利用nSMOL法的抗体的片段化]
向人血浆中添加规定浓度(3.7，11.1，33.3，100和300μg/mL)的单克隆抗体。作为抗体，使用了贝伐珠单抗、曲妥珠单抗和纳武利尤单抗。将添加抗体后的血浆10μL用含有0.1％的辛基硫代葡糖苷的磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释至10倍。
向上述的试样中加入用蛋白A包覆的多孔体的悬浮液(TOYOPEARL AF-rProtein AHC-650F；东曹制、粒径30～60μm、孔隙率86％、树脂浓度50重量％、IgG静态吸附量80g/L)25μL，在室温下温和地搅拌15分钟，使血浆中的抗体固定到蛋白A包覆树脂上。用含有0.1％的辛基硫代葡糖苷的PBS进行洗涤后，用PBS进行洗涤而除去辛基硫代葡糖苷。
向固定有抗体的蛋白A包覆树脂中添加25mM Tris盐酸盐(pH8.0)75μL和固定有胰蛋白酶的微粒的悬浮液10μL，边在50℃下温和地搅拌5小时边进行反应。加入甲酸并使终浓度为0.5％而终止反应，通过离心过滤除去树脂，利用LC-MS/MS(岛津制作所、LCMS-8050)对回收的滤液进行分析。分析条件如下所述。
＜LC条件＞
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液
自动取样器洗涤：超纯水
柱：Shim-Pack GISS(内径：2.1mm、柱长：50mm、粒径：1.9μm、孔径：20nm)
流速：0.4mL/分钟
柱温箱温度：50℃
样品冷却器温度：5℃
＜MS条件＞
接口电圧：1.5kV
雾化气体流量：3L/分钟
加热气体流量：10L/分钟
干燥气体流量：10L/分钟
接口温度：350℃
DL温度：250℃
加热块温度：400℃
将对血浆中的贝伐珠单抗浓度和来自贝伐珠单抗的CDR的胰蛋白酶消化肽片段(FTFSLDTSK和VLIYFTSSLHSGVPSR)的检测量(质谱分析的峰面积)关系绘制而得的图示于图6A和图6B。将对血浆中的曲妥珠单抗浓度和来自曲妥珠单抗的CDR的胰蛋白酶消化肽片段(IYPTNGYTR)的检测量的关系绘制而得的图示于图7。将对血浆中的纳武利尤单抗浓度和来自纳武利尤单抗的CDR的胰蛋白酶消化肽片段(ASGITFSNSGMHWVR)的关系绘制而得的图示于图8。
就全部的3种抗体药物(4种来自CDR肽片段)而言，使用改造胰蛋白酶时与使用重组胰蛋白酶时同样地，在血浆中的抗体药物浓度与肽片段的检测量之间可见高的线性关系。由这些结果可知，使用改造胰蛋白酶时，能够与使用重组胰蛋白酶时同样地定量血浆中的抗体药物浓度。
[酶活性与利用nSMOL法的肽片段生成量的关系]
在上述的实施例中，在用于胰蛋白酶改造的还原二甲基化处理中使用了胰蛋白酶的约2000摩尔倍的烷基化剂(甲醛)。这是按照在通过nSMOL法进行抗体的片段化时使来自CDR的特异性肽片段的产生量达到最大的方式来进行制备的。图9是示出烷基化剂的使用量、与被固定在微粒上的蛋白酶的酶活性(以BANA为底物而求出)和来自抗体的CDR片段(贝伐珠单抗的FTFSLDTSK片段)的产生量(质谱分析的峰面积)的关系的图表。图9中也一并示出市售的重组胰蛋白酶(rec)的评价结果。
还原烷基化剂的使用量为胰蛋白酶的30倍、40倍、50倍和60倍的情况下，固定在微粒上的改造胰蛋白酶显示出固定在微粒上的重组胰蛋白酶的约10倍的酶活性，而利用nSMOL法的来自CDR的特异性肽片段的产生量为重组胰蛋白酶的1/20以下。另一方面，将还原烷基化剂的使用量设为胰蛋白酶的2000摩尔倍时，固定在微粒上的改造胰蛋白酶的酶活性为固定在微粒上的重组胰蛋白酶的约4倍，利用nSMOL法的来自CDR的特异性肽片段的产生量与重组胰蛋白酶为同等。
由这些结果可知，酶活性与抗体的位点特异性切断所得的肽片段的产生量未必相关。另外可知，通过在还原烷基化时使用相对于胰蛋白酶为过量的还原烷基化剂，可得到能够位点特异性地切断抗体的改造胰蛋白酶。

Claims (12)

1.一种肽片段的制备方法，其通过使Fc结构域被固定在多孔体的细孔内的抗体与被固定在微粒的表面的蛋白酶接触而通过所述蛋白酶位点特异性地切断所述抗体的Fab结构域，
所述蛋白酶为混入有胰凝乳蛋白酶的来自动物的胰蛋白酶，
所述胰凝乳蛋白酶已失活，所述胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基进行了化学修饰。
2.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，
所述胰凝乳蛋白酶由于在组氨酸残基上结合N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮而失活。
3.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，
所述胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基被二甲基化。
4.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，
所述微粒的平均粒径比所述多孔体的平均细孔径大。
5.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，
所述多孔体的平均细孔径为30～150nm，所述微粒的平均粒径为100nm以上。
6.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，
所述多孔体的表面包覆有蛋白A或蛋白G。
7.一种肽片段制备用试剂盒，其为在权利要求1～6中任一项所述的方法中使用的肽片段制备用试剂盒，
其含有在表面固定有蛋白酶的微粒，
所述蛋白酶为混入有胰凝乳蛋白酶的来自动物的胰蛋白酶，
所述胰凝乳蛋白酶已失活，所述胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基进行了还原烷基化。
8.根据权利要求7所述的肽片段制备用试剂盒，
其还含有能够在细孔内选择性固定抗体的Fc结构域的多孔体。
9.一种蛋白酶的制备方法，其为制备在权利要求1～6中任一项所述的方法中使用的蛋白酶的方法，具有：
通过使来自动物的胰蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂反应而使混入到胰蛋白酶中的胰凝乳蛋白酶失活的步骤；和
通过使用烷基化剂和还原剂的还原烷基化而对胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基进行烷基化的步骤，
所述还原烷基化中使用的烷基化剂的合计量为胰蛋白酶的200摩尔倍以上。
10.根据权利要求9所述的蛋白酶的制备方法，其中，
所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮。
11.根据权利要求9所述的蛋白酶的制备方法，其中，
所述烷基化剂为甲醛。
12.根据权利要求9所述的蛋白酶的制备方法，其中，
在实施胰凝乳蛋白酶失活和胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基的烷基化后，利用亲和层析进行纯化。
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