TWI655202B - 肽片段的製備方法、其中所使用的蛋白酶的製備方法以及肽片段製備用套組 - Google Patents

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Abstract

在本發明的肽片段的製備方法中，使Fc區固定於多孔質體的細孔內的抗體與固定於微粒子表面的蛋白酶接觸。藉此利用蛋白酶將抗體的Fab區位置選擇性地切斷，獲得高濃度地含有源自Fab區的肽片段的試樣。本發明中所使用的蛋白酶是混入有胰凝乳蛋白酶的源自動物的胰蛋白酶，對胰凝乳蛋白酶進行了去活化，對胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基進行了化學修飾。

Description

肽片段的製備方法、其中所使用的蛋白酶的製備方法以及肽片段製備用套組
本發明是有關於一種使用蛋白酶而對抗體進行位置選擇性地切斷，從而製備肽片段的方法、及其中所使用的蛋白酶的製備方法、以及肽片段製備用套組。
抗體醫藥的需要急速擴大，在臨床現場中，對血液中的抗體濃度進行定量的重要性提高。在先前，並未重視準確地測量抗體醫藥的投予後的血液中濃度，但在伴隨著曲妥珠單抗（商品名：赫賽汀（Herceptin））在胃癌中擴大應用的臨床試驗中，於其血液中濃度與生存時間（survival time）中發現顯著差異，從此以後在抗體醫藥的臨床試驗等中亦變得需要測定抗體的血中濃度。例如，在藥物動態確認等品質管理，或仿製藥的臨床試驗等中的與原研藥的同一性確認等中，亦變得要求抗體醫藥的鑑定、或其血液中濃度的定量。
抗體具有包含重鏈的一個可結晶片段（Fragment crystallizable，Fc）區與包含重鏈及輕鏈的兩個抗原結合片段（Fragment antigen binding，Fab）區。在胺基酸序列中發現豐富多彩的變化，例如在Fab區中，N末端側的部分可與多種抗原結合。該區域被稱為「可變區（V區）」，抗體的特異性（亦即於抗原上的特異性結合性）由V區的胺基酸序列的組合而決定。輕鏈及重鏈的各個在V區內具有3個互補決定區（complementarity determining region，CDR）。CDR是對抗體賦予特徵的區域，可藉由確定抗體的CDR的胺基酸序列而鑑定抗體。
隨著蛋白質體學（proteomics）的發展，開發可藉由質量分析對蛋白質進行收羅性檢測、定量的技術，於近年來，抗體等巨大生物分子的分析亦成為可能。在質量分析中，需要對測定對象分子進行離子化，難以直接藉由質量分析而分析抗體等巨大生物分子的情況較多。因此開始採用如下的手法：藉由蛋白酶消化而將蛋白質切斷（片段化），自片段化的肽中選擇在分析對象的蛋白質中具有特異的胺基酸序列的肽片段，藉由質譜儀（mass spectrometer）進行檢測、定量。
抗體的源自CDR的肽片段具有在抗體中特異的胺基酸序列，因此藉由質量分析對源自CDR的肽片段進行檢測、定量而變得可定量特定的抗體。作為自抗體選擇性生成源自CDR的肽片段的方法，開發了藉由使固定於多孔質體的細孔內的抗體與固定於奈米粒子表面的蛋白酶反應而位置選擇性地切斷抗體，從而生成肽片段的手法（奈米表面分子定向限制性蛋白分解法，nano-Surface and Molecular-Orientation Limited proteolysis；nSMOL法）（例如專利文獻1）。
在nSMOL法中，使抗體的Fc區結合於多孔質體的細孔內，藉此限制蛋白酶於Fc區的存取，使包含CDR的Fab區位置選擇性地與蛋白酶反應。因此，於與蛋白酶反應後的試樣中，相對於所有生成肽而言高濃度地含有抗體的源自CDR的肽片段，變得可進行高精度的定量分析。
關於各種抗體醫藥，報告了可藉由nSMOL法而進行高精度的定量分析。具體而言，報告了藉由nSMOL法而定量曲妥珠單抗（非專利文獻1及非專利文獻2）、貝伐珠單抗（非專利文獻1及非專利文獻3）及納武單抗（非專利文獻4）等人源化抗體、以及西妥昔單抗（非專利文獻5）及利妥昔單抗（非專利文獻6）等嵌合抗體的血中濃度的例子。
於所述專利文獻及非專利文獻中，均使用胰蛋白酶而作為用以將抗體片段化的蛋白酶。胰蛋白酶是主要在胰腺中產生的分子量約23 kDa的絲胺酸蛋白酶，藉由水解將鹼性胺基酸（離胺酸及精胺酸）的C末端的羧基切斷。胰蛋白酶的受質特異性（substrate specificity）極高，因此作為用以產生質量分析用肽片段的蛋白酶的有用性高，用於很多蛋白質的結構分析中。
在自動物的胰腺萃取的胰蛋白酶中混入有胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶的受質特異性與胰蛋白酶的受質特異性不同，主要藉由水解而切斷芳香族胺基酸的C末端的羧基。而且，存在如下情況：天然胰蛋白酶由於自溶而生成偽胰蛋白酶，顯示出包括如胰凝乳蛋白酶那樣的活性的廣泛的特異性。因此，如果蛋白酶使用源自動物的胰蛋白酶，則由於所混入的胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的自溶產物的影響，失去受質特異性，生成目標以外的肽片段，因此分析精度降低的現象成為問題。
難以藉由純化而自源自動物的胰蛋白酶中完全除去胰凝乳蛋白酶。因此，源自動物的胰蛋白酶主要用於細胞培養中的接著細胞的剝離中。已知有為了將源自動物的胰蛋白酶用作質量分析用蛋白酶，藉由胰凝乳蛋白酶的去活化、或抑制胰蛋白酶的自溶而提高胰蛋白酶的受質特異性的方法。例如，藉由N-甲苯磺醯基-L-***醯氯甲基酮（TPCK）進行處理而使混入至胰蛋白酶中的胰凝乳蛋白酶去活化。
該些化學處理於源自動物的胰蛋白酶的受質特異性提高方面有用，但容易產生酶活性的大幅降低、或批次間的活性的不均一。因此，在要求高精度定量性的質量分析用試樣的製備中，主要使用質量分析級的基因重組型（recombinant）胰蛋白酶。重組胰蛋白酶不含源自動物的夾雑物，因此具有高的受質特異性及酶活性。 [現有技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：WO2015/033479號說明書 [非專利文獻]
非專利文獻1：岩本（Iwamoto）等人，分析師（Analyst.），2014，139（3），576-80. 非專利文獻2：岩本（Iwamoto）等人，分析方法（Anal. Methods），2015，21，9177-9183. 非專利文獻3：岩本（Iwamoto）等人，藥物代謝動力學（Drug Metabolism and Pharmacokinetics），2016，31，46-50. 非專利文獻4：岩本（Iwamoto）等人，色譜法雜誌B：分析技術及生物與生命科學（J. Chromatogr. B: Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.），2016，1023-1024，9-16. 非專利文獻5：岩本（Iwamoto）等人，生物分析（Bioanalysis），2016，8(10)，1009-1020. 非專利文獻6：岩本（Iwamoto）等人，生物與醫藥學報（Biol. Pharm. Bull.），2016，39（7），1187-1194.
[發明所欲解決之課題]
如上所述，重組胰蛋白酶顯示出高的受質特異性，在位置選擇性切斷抗體的nSMOL法中亦確認其有用性。然而，重組胰蛋白酶是由酵母而表現，因此其產生量少，另外需要在利用親和層析法的純化之後利用凝膠過濾層析法而進行純化，因此純化效率差。因此，重組胰蛋白酶難以確保充分之供給量，而且非常昂貴。因此，重組胰蛋白酶大部分以蛋白質的結構分析等研究目的而利用，產業上的利用受到限制。本發明的目的在於提供使用可確保充分的供給量且廉價的源自動物的胰蛋白酶，製備用以進行抗體的血中濃度定量等的質量分析用試樣的方法。 [解決課題之手段]
本發明是有關於一種肽片段的製備方法，其是使Fc區固定於多孔質體的細孔內的抗體與固定於微粒子表面的蛋白酶接觸，藉此利用蛋白酶而位置選擇性地切斷抗體的Fab區。進而，本發明是有關於一種於所述方法中使用的肽片段製備用套組。本發明的套組包含在表面固定有蛋白酶的微粒子。
固定於微粒子表面的蛋白酶是混入有胰凝乳蛋白酶的源自動物的胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶得到了去活化。固定於微粒子表面的胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基進行了化學修飾。
胰凝乳蛋白酶例如藉由於活性中心的組胺酸殘基上結合N-甲苯磺醯基-L-***醯氯甲基酮（TPCK）而進行不可逆地去活化。胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基例如進行了還原烷基化。
多孔質體較佳為可於細孔內選擇性固定抗體的Fc區，例如使用藉由蛋白質A或蛋白質G包覆的多孔質體。
所述蛋白酶可藉由源自動物的胰蛋白酶的改造而製備。胰蛋白酶的改造例如可藉由實施利用絲胺酸蛋白酶抑制劑的處理及還原烷基化處理而進行。進行了胰凝乳蛋白酶的去活化及還原烷基化後的胰蛋白酶較佳為藉由親和層析法而進行純化。
藉由使源自動物的胰蛋白酶與絲胺酸蛋白酶抑制劑反應而將胰凝乳蛋白酶去活化。作為絲胺酸蛋白酶抑制劑，較佳為可並不使胰蛋白酶去活化地選擇性使胰凝乳蛋白酶去活化的化合物，可較佳地使用所述TPCK等。
藉由使用烷基化劑及還原劑的還原烷基化，胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基得到烷基化，胰蛋白酶的自溶得到抑制。還原烷基化中所使用的烷基化劑的合計量較佳為胰蛋白酶的200莫耳倍以上。還原烷基化中所使用的還原劑的合計量亦較佳為胰蛋白酶的200莫耳倍以上。烷基化劑較佳為醛。藉由使用甲醛而作為烷基化劑，可對胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基進行甲基化。 [發明的效果]
本發明中所使用的改造胰蛋白酶源自動物，因此與作為質量分析用而廣泛使用的重組胰蛋白酶相比而言，廉價且容易確保供給量。而且，於微粒子表面固定改造胰蛋白酶，進行抗體的位置選擇性片段化的情況下，顯示出與重組胰蛋白酶同等或同等以上的受質特異性及酶活性。因此，藉由本發明可廉價且簡便地實施血液等生物試樣中的抗體濃度的定量。
在本發明的方法中，藉由使固定於多孔質體的細孔內的基質與固定於微粒子表面的蛋白酶接觸而藉由蛋白酶位置選擇性切斷基質，獲得肽片段。圖1是用以說明位置選擇性切斷基質的原理的概念圖。於微粒子10（平均粒徑D1 ）的表面固定有蛋白酶15。多孔質體20具有許多細孔29（平均細孔徑D2 ），於細孔內固定有基質25。
[基質] 較佳為基質25是抗體，抗體的Fc區固定於多孔質體20的細孔29內。藉由將抗體的Fc區固定於多孔質體上而控制細孔內的抗體的配向，變得可進行利用蛋白酶的Fab區的位置選擇性切斷。抗體的種類並無特別限制，較佳為單株抗體，其中較佳為需要定量於生物試樣（例如血液）中的濃度的抗體（例如分子靶向治療藥）。抗體亦可為人類抗體、人源化抗體、及嵌合抗體等。
[多孔質體] 多孔質體20若為具有許多細孔29者，則其材料並無特別限定，可使用活性碳、多孔質膜、多孔質樹脂珠粒、金屬粒子等。於圖1中圖示了半球形狀的細孔，但細孔的形狀並無特別限定。亦可使用如多孔質膜那樣，形成有貫通多孔質體的細孔者。
多孔質體較佳為可與抗體特異性結合，特佳為可與抗體的Fc區部位特異性結合。為了實現與抗體的特異性結合，較佳為於多孔質體的細孔內的表面固定有可與抗體特異性結合的連接子21。作為可與抗體的Fc區部位特異性結合的連接子，可列舉蛋白質A或蛋白質G。亦即，較佳為多孔質體20經蛋白質A或蛋白質G等可與抗體特異性結合的分子包覆。特別是蛋白質A的與Fc區結合的部位特異性高。因此，為了提高蛋白酶消化的位置選擇性，較佳為使用經蛋白質A包覆的多孔質體。
多孔質體20的細孔29的大小並無特別限定。於多孔質體20的平均細孔徑D2 比微粒子10的平均粒徑D1 小的情況下，微粒子10無法於細孔29的深處存取。伴隨於此，固定於微粒子10表面的蛋白酶15亦無法於細孔29的深處存取。
於圖1中，細孔29附近的虛線表示蛋白酶15可存取的區域的邊界。如上所示，蛋白酶向結合於細孔內的表面的抗體的Fc區的存取得到限制，由此使蛋白酶向Fab區的存取概率相對性提高，所述Fab區位於自與細孔的結合部位離開的部位。由此可藉由蛋白酶而位置選擇地切斷抗體的Fab區，從而獲得肽片段。
為了將Fc區固定於細孔內，位置選擇地蛋白酶消化Fab區，多孔質體的平均細孔徑較佳為30 nm～150 nm，更佳為40 nm～120 nm，進而較佳為50 nm～100 nm。
[微粒子] 微粒子10將蛋白酶15固定於其表面，控制蛋白酶向固定於多孔質體20的細孔29內的抗體25的存取。微粒子10為了不進入至多孔質體20的細孔29的深處，較佳為其平均粒徑D1 比多孔質體20的平均細孔徑D2 大。微粒子10的形狀並無特別限定，但自使蛋白酶可向多孔質體20的細孔29存取的區域均一化的觀點考慮，較佳為球狀的微粒子。而且，較佳為微粒子10的平均粒徑均一。
微粒子10的平均粒徑D1 更佳為多孔質體20的平均細孔徑D2 的1.2倍以上，進而較佳為1.5倍以上，特佳為1.8倍以上。微粒子10的平均粒徑D1 較佳為100 nm以上，更佳為150 nm以上。微粒子10的平均粒徑D1 的上限並無特別限定，但自提高蛋白酶的消化效率的觀點考慮，較佳為1 μm以下，更佳為500 nm以下。
微粒子10若為可將蛋白酶固定於表面者，則其材質並無特別限定，可適宜地使用金屬或樹脂等。微粒子10較佳為可抑制非特異性蛋白質吸附於表面，選擇性固定蛋白酶者，例如可適宜使用經與蛋白酶特異性結合的間隔物11修飾的微粒子。間隔物較佳為可與蛋白酶結合，且並不使蛋白酶去活化者。
自控制固定於微粒子10表面的蛋白酶15的存取範圍的觀點考慮，較佳為間隔物11的分子直徑較小。間隔物的分子直徑較佳為5 nm以下，更佳為3 nm以下，進一步較佳為2 nm以下。可固定蛋白酶的間隔物11較佳為非蛋白質，較佳為具有胺基、醯胺基、酯基、環氧基、羧基、生物素、抗生物素蛋白、螯合物等官能基的分子。
[蛋白酶] 在本發明中，蛋白酶使用胰蛋白酶。胰蛋白酶的分子直徑小，且活性部位存在於分子的內部。因此，固定於微粒子表面的胰蛋白酶限制活性部位可在作為基質的抗體上存取的區域，抗體的切斷部位的選擇性得到提高。
作為蛋白酶而使用的胰蛋白酶是源自動物的胰蛋白酶，例如源自豬或牛的胰腺。基因重組的胰蛋白酶不含源自動物的夾雑物，相對於此，源自動物的胰腺的胰蛋白酶不可避免地混入有胰凝乳蛋白酶。在本發明中，混入至作為蛋白酶而使用的胰蛋白酶中的胰凝乳蛋白酶得到去活化。
胰凝乳蛋白酶可藉由各種絲胺酸蛋白酶抑制劑而去活化。作為可在胰凝乳蛋白酶的去活化中使用的絲胺酸蛋白酶抑制劑，可列舉：苯基甲基磺醯氟（PMSF）、4-(2-胺基乙基)苯磺醯氟（AEBSF）、二異丙基氟磷酸（DFP）、苄脒、胰凝乳蛋白酶抑制劑、N-甲苯磺醯基-L-離胺醯氯甲基酮（TLCK）及N-甲苯磺醯基-L-***醯氯甲基酮（TPCK）等。自可維持胰蛋白酶的酶活性而選擇性且不可逆地使胰凝乳蛋白酶去活化考慮，該等中較佳為TPCK。
TPCK不可逆地與胰凝乳蛋白酶的活性中心所含的組胺酸殘基結合，因此可藉由TPCK處理而在維持胰蛋白酶的活性的狀態下使胰凝乳蛋白酶去活化。混入胰凝乳蛋白酶的源自動物的胰蛋白酶可藉由於溶液中與TPCK混合而將胰凝乳蛋白酶去活化。TPCK處理例如可於4℃左右下進行1小時～5小時左右。
本發明中所使用的蛋白酶中所含的胰蛋白酶對離胺酸殘基的胺基進行化學修飾。藉由對胰蛋白酶的離胺酸殘基中所含的ε-胺基進行化學修飾，可抑制自溶，提高胰蛋白酶的酶活性及受質特異性。作為胺基的化學修飾，較佳為烷基化。例如，藉由在還原劑的存在下與醛反應，對離胺酸殘基的胺基進行還原烷基化。還原烷基化中所使用的還原劑較佳為在水溶液中穩定，可選擇性地還原在還原烷基化的最初階段所形成的希夫鹼。較佳的還原劑可列舉硼氫化鈉、氰硼氫化鈉、二甲基胺硼烷、三甲基胺硼烷、及吡啶硼烷等。
藉由使相對於離胺酸殘基的量而言為過剩量的醛及還原劑存在，對離胺酸殘基的胺基進行二烷基化。例如，藉由使甲醛及還原劑過剩地存在，對離胺酸殘基的胺基進行還原二甲基化。為了抑制胰蛋白酶的自溶而提高受質特異性，烷基化劑（醛）的使用量（合計量）較佳為胰蛋白酶量的200莫耳倍以上，更佳為600莫耳倍以上，進而較佳為1000莫耳倍以上。還原劑的使用量較佳為胰蛋白酶量的200莫耳倍以上，更佳為500莫耳倍以上，進而較佳為800莫耳倍以上。另一方面，若還原劑及烷基化劑的使用量過多，則存在導致酶活性降低、或純化時的回收率降低的情況。因此，還原劑及烷基化劑的使用量較佳為胰蛋白酶量的20000莫耳倍以下，更佳為10000莫耳倍以下，進而較佳為5000莫耳倍以下。還原劑及烷基化劑可一次性添加總量，亦可分為多次而添加。
較佳為於進行胰凝乳蛋白酶的去活化及胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基的修飾後進行純化。純化方法並無特別限定，較佳為使用能夠可逆地吸附胰蛋白酶的親和管柱，藉由親和層析法而進行純化。作為親和管柱的載體，使用偶合有苄脒等絲胺酸蛋白酶抑制劑的瓊脂糖凝膠珠粒等。藉由自溶析液選擇酶活性高的組分而獲得受質特異性及活性高的胰蛋白酶。
使用源自動物的胰蛋白酶，進行利用TPCK處理等的胰凝乳蛋白酶的去活化及還原二甲基化等修飾，藉由層析法進行純化的改造胰蛋白酶如後述的實施例所示那樣，顯示出與重組胰蛋白酶同等或其以上的受質特異性及酶活性。而且，改造胰蛋白酶與重組胰蛋白酶相比而言容易對應供給量增加等，且廉價。
在本發明中，除了改造源自動物的胰蛋白酶而成者以外，亦可併用其他蛋白酶。例如亦可併用將離胺酸殘基的C末端的羧基選擇性水解而成的離胺醯肽鏈內切酶（Lysyl endopeptidase）。在使用胰蛋白酶以外的蛋白酶的情況下，亦較佳為將所有蛋白酶中的胰蛋白酶的量設為90%以上。
[試樣製備方法] 在本發明的肽片段的製備方法中，將血液等試樣中所含的抗體固定於多孔質體上之後，使固定有抗體的多孔質體與固定有蛋白酶的微粒子接觸，藉此利用蛋白酶而位置選擇地切斷抗體，產生肽片段。
於多孔質體的細孔內固定作為基質的抗體的方法並無特別限定。於藉由可與蛋白質A或蛋白質G等抗體特異性結合的分子而包覆多孔質體的情況下，藉由將多孔質體的懸浮液與包含抗體的溶液加以混合，可於多孔質體的細孔內容易地固定抗體。
作為包含抗體的溶液，可列舉血液等源自生物的試樣。源自生物的試樣除了抗體以外，亦包含多種多樣的夾雑物。將多孔質體與作為被測物的源自生物的試樣混合，在抗體選擇性固定於多孔質體上的狀態下進行清洗，藉此將非選擇性附著於多孔質體上的夾雑成分除去。於夾雑成分容易凝聚而牢固地附著的情況下，較佳為使用界面活性劑等而使夾雑成分改性，使其溶解於液體中。較佳為於利用界面活性劑進行處理後，使用不含界面活性劑的液體進行清洗，將附著於多孔質體上的界面活性劑除去。
將蛋白酶固定於微粒子表面的方法並無特別限定，可根據蛋白酶與微粒子（或對微粒子表面進行修飾的間隔物分子）的特性等而採用適宜的方法。例如，於進行了間隔物修飾的微粒子表面固定胰蛋白酶的情況下，可藉由將微粒子的懸浮液與包含胰蛋白酶的溶液加以混合而將蛋白酶固定於微粒子表面。亦可於微粒子的表面固定蛋白酶之後，藉由化學修飾等而使並未與微粒子表面的蛋白酶結合的活性部分去活化。
蛋白酶可以預先固定於微粒子上的狀態而提供，亦可於使用之間將蛋白酶固定於微粒子表面而使用。較佳為以懸浮液的形式提供固定有蛋白酶的微粒子。
所述固定有改造胰蛋白酶的微粒子亦可作為肽片段製備用套組的一部分而提供。胰蛋白酶即使在固定於微粒子表面的狀態下亦可保持活性，因此若在將蛋白酶固定於微粒子表面上的狀態下作為套組的構成要素而進行提供，則可使肽片段製備的操作簡略化。肽片段製備用套組除了固定有改造胰蛋白酶的微粒子以外，亦包含可將抗體的Fc區選擇性固定於細孔內的多孔質體。作為可將抗體的Fc區選擇性固定於細孔內的多孔質體，較佳為如上所述那樣經蛋白質A或蛋白質G等包覆的多孔質體。肽片段製備用套組亦可進而包含於將被測物中的抗體固定於多孔質體中、反應等中所使用的容器或溶液等。
藉由將固定有抗體的多孔質體與固定有蛋白酶的微粒子於液體中加以混合而進行抗體的位置選擇性蛋白酶消化。反應條件並無特別限定，可適宜採用與一般的蛋白酶消化同樣的條件。例如較佳為於調整為胰蛋白酶的最適pH附近（pH為7～9左右）的緩衝溶液中，於通常為35℃～60℃左右的溫度下進行3小時～30小時左右的培育。
藉由與蛋白酶反應而產生的肽片段游離於溶液中。蛋白酶於作為與多孔質體的結合部位的抗體的Fc區的存取得到控制，因此藉由蛋白酶而位置選擇性地切斷抗體的包含互補決定區（CDR）的Fab區。因此，在液體中游離的肽片段以高濃度包含如下肽片段，所述肽片段含有在抗體的鑑定中重要的互補決定區的胺基酸序列。
[利用質量分析的抗體濃度的定量] 可藉由層析法或質量分析而對包含上述所獲得的肽片段的試樣進行分析，藉此進行抗體的鑑定或定量。在本發明中，藉由胰蛋白酶而位置選擇性地切斷抗體的Fab區，因此在試樣中所含的肽片段的種類少，以高濃度包含含有互補決定區的胺基酸序列的肽片段。因此可容易地設定質量分析等的分析條件。
亦可以使肽片段的分離更確實、提高分析精度等目的，藉由液相層析法（LC）、固相萃取（SPE）等而對供至質量分析之前的試樣進行分離、濃縮。
於基於質量分析結果而進行抗體的鑑定的情況下，亦可使用已有的資料庫。使用LC/MS/MS的多重反應監控（Multiple Reaction Monitoring；MRM）適合抗體濃度的定量。在定量血液等被測物中的抗體的含量（濃度）的情況下，基於源自肽片段的離子的峰面積或峰強度而算出抗體的量。例如根據預先求出的檢量線（校準曲線）與峰面積的關係、或源自試樣中所添加的內標準的峰面積與源自試樣的峰面積的關係等而算出試樣中的肽片段的濃度，基此而算出血液等被測物中的抗體的量或濃度。
所述改造胰蛋白酶具有與在質量分析中廣泛使用的重組胰蛋白酶同等優異的受質特異性，且抗體的切斷部位的位置選擇性亦優異。因此，定量分析的再現性高，亦可於血液等被測物中的抗體醫藥濃度的定量中使用。
本發明的方法操作簡便、且可確保再現性或定量性，而且亦可進行自動化。另外，在試樣製備中所使用的蛋白酶的供給穩定且廉價，因此產業利用價值亦高。本發明的方法亦可應用於藥物動態分析、使用抗原抗體反應的相互作用的分析、各種分子互動組（interactome）分析、免疫沈降蛋白質的鑑定等基礎研究中。另外，亦可期待於抗體醫藥等生物分子醫藥的序列分析、品質保證、仿製藥的同一性確認等中的應用。 [實施例]
以下表示實施例而對本發明加以更具體的說明，但本發明並不限定於下述實施例。於以下中，「%」的記載若無特別說明則表示「重量%」。
[胰蛋白酶的改造及層析法純化] （TPCK處理） 將豬胰腺胰蛋白酶（西格瑪奧德里奇（SIGMA ALDRICH），T0303）溶解於50 mM磷酸鈉緩衝溶液（pH為7.4）中而製備1 mg/mL（約40 μM）的溶液。在該溶液中，添加N-甲苯磺醯基-L-***醯氯甲基酮（TPCK）的DMSO溶液（40 mM）以使TPCK濃度成為100 μM，在4℃下平穩地攪拌2小時。
（還原二甲基化處理） 在TPCK處理後的胰蛋白酶溶液中，以相對於1 mg胰蛋白酶而言二甲基胺硼烷成為20 μmol、甲醛成為40 μmol的方式添加1 M二甲基胺硼烷及1 M甲醛，在4℃下進行1.5小時的平穩攪拌。其後，進而添加與所述等量的二甲基胺硼烷及甲醛，在4℃下進行1.5小時的平穩攪拌。其後，相對於1 mg胰蛋白酶而添加10 μmol的二甲基胺硼烷，在4℃下進行徹夜平穩攪拌。在該處理中，使用相對於胰蛋白酶而言為約2000莫耳倍的甲醛及約1250莫耳倍的二甲基胺硼烷。
（層析法純化） 在容量為2 mL的苄脒瓊脂糖凝膠管柱（奇異醫療集團（GE Healthcare）的HiTrap 苄脒(Benzamidine） FF管柱，連結有2根容量為1 mL的管柱）中，通過管柱容量的10倍的50 mM磷酸鈉緩衝溶液（pH為7.4）而進行平衡化後，通過所述已處理的胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶量：25 mg）而固定於管柱上。通過管柱容量的10倍量的包含150 mM的氯化鈉的50 mM磷酸鈉緩衝溶液（pH為7.4）而對管柱進行清洗後，使管柱容量的4倍的10 mM磷酸鈉緩衝液（pH為7.4）通過管柱而進行脫鹽。其後，藉由10 mL的10 mM鹽酸而進行溶析，將最初的0.5 mL作為組分No.1，以後將1 mL作為一個組分而回收溶析液（組分No.2～組分No.10）。
（蛋白質濃度的定量） 自所述各組分中採取50 μL，加入1 M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCL）緩衝液（pH為8.0），藉由Micro BCATM 蛋白質分析套組（Protein Assay Kit）而對蛋白質濃度進行定量。
（胰蛋白酶的酶活性） 在50 mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液（pH為8.0）中，以濃度成為50 μL/mL的方式添加作為基質的N-α-苯甲醯基-DL-精胺酸-對硝基苯胺鹽酸鹽（BANA）。在該溶液中，以胰蛋白酶濃度成為10 μL/mL的方式添加各組分的溶析液。一面於37℃下平穩地進行攪拌，一面每隔一定時間地測定405 nm的吸光度，根據其經時變化（基質分解的對硝基苯胺的生成速度）算出胰蛋白酶的活性。
（特異性片段的生成量） 使用作為基質的白蛋白（Alb）、血色素（Hb）、及乳球蛋白（Lac），將所述組分No.1～組分No.10添加於基質中，於37℃下徹夜地進行消化反應。進行消化反應後的溶液的MS/MS分析，藉由資料庫（馬斯科特伺服器（Mascot server））分析而求出各個基質的特異性片段的生成量。酶使用僅僅進行TPCK處理而未進行還原二甲基化的胰蛋白酶、及重組胰蛋白酶的市售品（普洛麥格（Promega）公司的金牌胰蛋白酶（Trypsin Gold）），與所述同樣地求出基質的特異性片段的生成量。
（評價結果及回收組分的確定） 將組分No.1～組分No.10的蛋白質濃度及酶活性的測定結果表示於圖2中。將使用組分No.1～組分No.10、以及重組胰蛋白酶（rec）及僅僅進行了TPCK處理的胰蛋白酶（TPCK）而進行基質（Alb、Hb及Lac）的消化時的特異性片段的生成量表示於圖3中。
如圖2所示那樣，組分No.3～組分No.7的蛋白質濃度高，顯示出大致同等的酶活性。而且，如圖3所示那樣，組分No.3～組分No.8的受質特異性片段的生成量與使用市售的重組胰蛋白酶的情況同等。基於該些結果，將組分No.3～組分No.7確定為回收組分。於以後，使用該回收組分（以後有時記載為「改造胰蛋白酶」）而實施評價。
[酶活性的評價] （與重組胰蛋白酶的酶活性的比較） 將N-α-苯甲醯基-DL-精胺酸-對硝基苯胺鹽酸鹽作為基質，測定改造胰蛋白酶及市售的重組胰蛋白酶的酶活性，結果改造胰蛋白酶顯示出重組胰蛋白酶的約2倍的酶活性。
（化學適應性） 使三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液的pH於7.0～9.0的範圍內變化，於反應溫度為37℃及50℃下測定改造胰蛋白酶的酶活性。關於37℃及50℃的各個，將pH為8.0的酶活性作為1進行標準化而成的圖表表示於圖4A中。
將乙腈（Acetonitrile，MeCN）（10%及20%）、二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide，DMSO）（10%）、以及甲醇（Methanol，MeOH）（10%）、及甘油（Glycerol）（10%）的各溶液中的酶活性的測定結果表示於圖4B中。將尿素（Urea ）（1 M及2 M）、氯化鈉（NaCl）（50 mM、150 mM及500 mM）、硫酸銨（Diazanium sulfate，AS）（50 mM、150 mM及500 mM）、吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）（50 mM）、以及乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（1 mM及10 mM）的各溶液中的酶活性的測定結果表示於圖4C中。將二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）（1 mM、2 mM、5 mM、10 mM及20 mM）、以及三(2-羧基甲基)膦（Tris(2-carboxymethyl) phosphine，TCEP）（0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM及5 mM）的各溶液中的酶活性的測定結果表示於圖4D中。將正辛基-β-D-硫葡糖苷（N-octyl-β-D-thioglucoside，OTG）（0.1%）、正辛基-β-D-葡糖苷（N-octyl-β-D-glucoside，OG）（0.1%）、十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）（0.1%）、以及棉子糖（raffinose）（100 mM及200 mM）的各溶液中的酶活性的測定結果表示於圖4E中。圖4B～圖4E中的酶活性表示為將pH為8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液中的37℃及50℃的酶活性（參照圖4A）作為1進行標準化而得的值。
[胰蛋白酶在微粒子表面的固定] 將聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)包覆肥粒鐵奈米粒子（FG beads；多摩川精機製造、粒徑約200 nm）的異丙醇懸浮液50 μL在4℃下進行離心而使微粒子沈降，除去上清液後藉由甲醇進行清洗。將包含50 μg的改造胰蛋白酶的溶液加入至所述微粒子中而使微粒子懸浮。將微粒子的懸浮液在4℃下進行30分鐘攪拌，在4℃下進行離心而使微粒子沈降，除去上清液。反覆進行2次利用50 mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液（pH為8.0）的清洗與離心後，使微粒子懸浮於三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液（pH為8.0）中，獲得固定於微粒子表面的胰蛋白酶的濃度為1 μg/μL的懸浮液。 使用重組胰蛋白酶的市售品而代替改造胰蛋白酶，製備於表面固定有重組胰蛋白酶的微粒子的懸浮液。
（酶活性的比較） 將N-α-苯甲醯基-DL-精胺酸-對硝基苯胺鹽酸鹽作為基質，測定固定於微粒子表面的改造胰蛋白酶及重組胰蛋白酶的酶活性，結果是固定於微粒子表面的改造胰蛋白酶顯示出固定於微粒子表面的重組胰蛋白酶的約4倍的酶活性。
（特異性片段的生成量） 使用作為基質的白蛋白（Alb）、血色素（Hb）、及乳球蛋白（Lac），添加固定有胰蛋白酶的微粒子，在37℃下徹夜地進行消化反應，根據MS/MS分析結果的資料庫分析而求出各個基質的特異性片段的生成量。將結果表示於圖5中。固定於微粒子上的改造胰蛋白酶（mod）顯示出與重組胰蛋白酶（rec）同等的特異性片段生成量。
[利用nSMOL法的抗體的片段化] 在人類血漿中添加規定濃度（3.7 μg/mL、11.1 μg/mL、33.3 μg/mL、100 μg/mL及300 μg/mL）的單株抗體。抗體使用貝伐珠單抗、曲妥珠單抗及納武單抗。藉由包含0.1%的辛硫基糖苷的磷酸鹽緩衝液（PBS）將10 μL添加有抗體的血漿稀釋為10倍。
於所述試樣中加入25 μL經蛋白質A包覆的多孔質體的懸浮液（濤姚帕魯（TOYOPEARL） AF-rProtein A HC-650F；東曹（Tosoh）公司製造、粒徑為30 μm～60 μm、孔隙率為86%、樹脂濃度為50重量%、IgG靜態吸附量為80 g/L），於室溫下進行15分鐘的平穩攪拌，將血漿中的抗體固定於蛋白質A包覆樹脂上。藉由包含0.1%的辛硫基糖苷的PBS進行清洗後，藉由PBS進行清洗，將辛硫基糖苷除去。
在固定有抗體的蛋白質A包覆樹脂中加入75 μL的25 mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽（pH為8.0）、及10 μL固定有胰蛋白酶的微粒子的懸浮液，一面在50℃下進行5小時的平穩攪拌一面進行反應。以最終濃度成為0.5%的方式加入甲酸而使反應停止，藉由離心過濾將樹脂除去，藉由LC-MS/MS（島津製作所、LCMS-8050）而對所回收的濾液進行分析。分析條件如下所示。
＜LC條件＞ 流動相A：0.1%甲酸水溶液 流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液 自動採樣機清洗：超純水 管柱：Shim-Pack GISS（內徑：2.1 mm、管柱長：50 mm、粒徑：1.9 μm、孔徑：20 nm） 流速：0.4 mL/min 管柱烘箱溫度：50℃ 樣品冷卻器溫度：5℃ ＜MS條件＞ 介面電壓：1.5 kV 霧化氣體流量：3 L/min 加熱氣體流量：10 L/min 乾燥氣體流量：10 L/min 介面溫度：350℃ DL溫度：250℃ 加熱塊溫度：400℃
將對血漿中的貝伐珠單抗濃度與貝伐珠單抗的源自CDR的胰蛋白酶消化肽片段（FTFSLDTSK及VLIYFTSSLHSGVPSR）的檢測量（質量分析的峰面積）的關係進行繪圖而成者表示於圖6A及圖6B中。將對血漿中的曲妥珠單抗濃度與曲妥珠單抗的源自CDR的胰蛋白酶消化肽片段（IYPTNGYTR）的檢測量的關係進行繪圖而成者表示於圖7中。將對血漿中的納武單抗濃度與納武單抗的源自CDR的胰蛋白酶消化肽片段（ASGITFSNSGMHWVR）的關係進行繪圖而成者表示於圖8中。
在3種抗體醫藥（4種源自CDR的肽片段）的全部中使用改造胰蛋白酶的情況下，與使用重組胰蛋白酶的情況同樣地於血漿中的抗體醫藥濃度與肽片段的檢測量之間發現高的線性（linearity）。根據該些結果可知：在使用改造胰蛋白酶的情況下，亦與使用重組胰蛋白酶的情況同樣地可定量血漿中的抗體醫藥的濃度。
[酶活性與利用nSMOL法的肽片段生成量的關係] 於所述實施例中，在用以胰蛋白酶改造的還原二甲基化處理中使用胰蛋白酶的約2000莫耳倍的烷基化劑（甲醛）。其是在利用nSMOL法進行抗體的片段化時，以源自CDR的特異性肽片段的產生量成為最大的方式而製備者。圖9是表示烷基化劑的使用量、與固定於微粒子上的蛋白酶的酶活性（將BANA作為基質而求出者）及抗體的源自CDR的片段（貝伐珠單抗的FTFSLDTSK片段）的產生量（質量分析的峰面積）的關係的圖表。於圖9中亦一併表示市售的重組胰蛋白酶（rec）的評價結果。
於還原烷基化劑的使用量為胰蛋白酶的30倍、40倍、50倍及60倍的情況下，固定於微粒子上的改造胰蛋白酶顯示出固定於微粒子上的重組胰蛋白酶的約10倍的酶活性，但利用nSMOL法的源自CDR的特異性肽片段的產生量是重組胰蛋白酶的1/20以下。另一方面，將還原烷基化劑的使用量設為胰蛋白酶的2000莫耳倍的情況下，固定於微粒子上的改造胰蛋白酶的酶活性是固定於微粒子上的重組胰蛋白酶的約4倍，利用nSMOL法的源自CDR的特異性肽片段的產生量與重組胰蛋白酶同等。
根據該些結果可知：酶活性與抗體的位置選擇性切斷的肽片段產生量未必相關。而且，可知在還原烷基化時，藉由使用相對於胰蛋白酶而言為過剩量的還原烷基化劑而獲得可對抗體進行位置選擇性切斷的改造胰蛋白酶。
10‧‧‧微粒子
11‧‧‧間隔物
15‧‧‧蛋白酶
20‧‧‧多孔質體
21‧‧‧連接子
25‧‧‧基質
29‧‧‧細孔
D1‧‧‧微粒子10的平均粒徑
D2‧‧‧多孔質體20的平均細孔徑
圖1是用以說明藉由蛋白酶而位置選擇性切斷抗體的原理的概念圖。 圖2是層析法的各組分（fraction）的蛋白質濃度及酶活性的測定結果。 圖3是表示基質的特異性片段的生成量的圖表。 圖4A是表示實施例的改造酶的化學適應性的評價結果的圖表。 圖4B是表示實施例的改造酶的化學適應性的評價結果的圖表。 圖4C是表示實施例的改造酶的化學適應性的評價結果的圖表。 圖4D是表示實施例的改造酶的化學適應性的評價結果的圖表。 圖4E是表示實施例的改造酶的化學適應性的評價結果的圖表。 圖5是表示白蛋白、血色素及乳球蛋白的由於胰蛋白酶消化的受質特異性片段的生成量的圖表。 圖6A是對血漿中的貝伐珠單抗濃度、與藉由位置選擇性片段化而生成的肽片段的質量分析中的峰面積的關係進行繪圖而成的圖表。 圖6B是對血漿中的貝伐珠單抗濃度、與藉由位置選擇性片段化而生成的肽片段的質量分析中的峰面積的關係進行繪圖而成的圖表。 圖7是對血漿中的曲妥珠單抗濃度、與藉由位置選擇性片段化而生成的肽片段的質量分析中的峰面積的關係進行繪圖而成的圖表。 圖8是對血漿中的納武單抗濃度、與藉由位置選擇性片段化而生成的肽片段的質量分析中的峰面積的關係進行繪圖而成的圖表。 圖9是表示胰蛋白酶的改造時的烷基化劑的使用量與酶活性及抗體的源自CDR的片段的生成量的關係的圖表。

Claims (9)

  1. 一種肽片段的製備方法，其是使可結晶片段區固定於多孔質體的細孔內的抗體與固定於微粒子表面的蛋白酶接觸，藉此利用所述蛋白酶而位置選擇性地切斷所述抗體的抗原結合片段區的肽片段的製備方法，所述蛋白酶是混入有胰凝乳蛋白酶的源自動物的胰蛋白酶，所述胰凝乳蛋白酶藉由於組胺酸殘基上結合N-甲苯磺醯基-L-***醯氯甲基酮而得到去活化，所述胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基進行了二甲基化。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的肽片段的製備方法，其中，所述微粒子的平均粒徑比所述多孔質體的平均細孔徑大。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的肽片段的製備方法，其中，所述多孔質體的平均細孔徑為30nm~150nm，所述微粒子的平均粒徑為100nm以上。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的肽片段的製備方法，其中，所述多孔質體的表面經蛋白質A或蛋白質G包覆。
  5. 一種肽片段製備用套組，其是用以在如申請專利範圍第1項至第4項中任一項中所述的方法中使用的肽片段製備用套組，其包含在表面固定有蛋白酶的微粒子，所述蛋白酶是混入有胰凝乳蛋白酶的源自動物的胰蛋白酶，所述胰凝乳蛋白酶得到了去活化，所述胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基進行了還原二甲基化。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的肽片段製備用套組，其進而包含可將抗體的可結晶片段區選擇性固定於細孔內的多孔質體。
  7. 一種蛋白酶的製備方法，其是製備用以在如申請專利範圍第1項至第4項中任一項中所述的方法中使用的蛋白酶的方法，其包含：藉由使源自動物的胰蛋白酶與絲胺酸蛋白酶抑制劑反應而對混入至胰蛋白酶中的胰凝乳蛋白酶進行去活化的步驟；及藉由使用二甲基化劑及還原劑的還原二甲基化而對胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基進行二甲基化的步驟，所述還原二甲基化中所使用的二甲基化劑的合計量是胰蛋白酶的200莫耳倍以上，所述絲胺酸蛋白酶抑制劑是N-甲苯磺醯基-L-***醯氯甲基酮。
  8. 如申請專利範圍第7項所述蛋白酶的製備方法，其中，所述二甲基化劑是甲醛。
  9. 如申請專利範圍第7項所述蛋白酶的製備方法，其中，在實施胰凝乳蛋白酶的去活化及胰蛋白酶的離胺酸殘基的胺基的二甲基化後，進行利用親和層析法的純化。
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