CN104395749A - 含胰液成分的试样的调制方法、以及含胰液成分的生物试样的室温储存用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供调制含胰液成分的试样的方法,所述含胰液成分的试样能够在室温下稳定地储存含胰液成分的生物试样中的蛋白质、特别是S100P;和适合于该方法的试剂盒。本发明的特征在于,通过向含胰液成分的生物试样中添加至少一种具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和至少一种作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,从而调制直至供于S100P的检测为止在室温下能够储存的含胰液成分的试样。
Description
技术领域
本发明涉及调制直至供于检查为止能够在室温下稳定地储存胰液中所包含的S100P的储存用试样的方法、以及适合于该方法的、含胰液成分的生物试样的室温储存用试剂盒。
背景技术
体液是用于知晓脏器状态的重要的生物试样。特别是,胰液是对于早期难发现、预后非常差的胰腺癌的早期发现重要的生物试样,应用于细胞诊断、碳酸氢盐测定、细菌检查、包括蛋白质、核酸等的标记物的检查等中。另外,近年来,对于解析胰液中的蛋白质的研究例如胰腺癌等胰脏相关疾病的新的标记物的探索盛行。
特别是报告了,作为S100蛋白质家族的成员的、糖化最终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts:RAGE)的S100P,已确认非常多地在胰腺癌中被表达,并且参与胰腺癌的增殖·浸润。例如,非专利文献1中报告了,S100P作为胰脏早期的致癌标记物是有用的,以及胰液中的S100P浓度解析对于肿瘤和慢性胰腺炎的识别是有用的。另外,非专利文献2中报告了,正常的胰脏导管上皮中没有观察到S100P的表达,而胰管内***状粘液性肿瘤细胞的全部待检体中观察到了S100P的表达。即,S100P作为胰腺癌的标记物是有用的,可以期待通过测定胰液中的S100P量而有助于胰腺癌的早期发现、发展程度的诊断等。
另一方面,由于胰液是消化液,包含各种各样的消化酶。已知,这些消化酶在胰脏内以非活性的状态存在,排出至十二指肠之后进行活化。胰液中的消化酶通过由十二指肠上皮细胞分泌的小肠肠激酶进行分解的级联反应。已知,通过小肠肠激酶胰液中所包含的胰蛋白酶原被活化而成为胰蛋白酶,进而该胰蛋白酶成为诱因,从而胰凝乳蛋白酶原、酯酶原等各种消化酶(蛋白酶)被活化。通过这些各种蛋白酶的活化,胰液中所包含的蛋白质、核酸、脂质、细胞等各种生物分子排出至十二指肠后被分解、变性。因此,将排出至十二指肠的胰液作为生物试样对该生物试样中的S100P进行定量时,存在该生物试样中的S100P受到蛋白酶的影响,不能正确地测定的担心。因此,重要的是怎样抑制被排出至十二指肠的胰液中的蛋白酶的活性。
蛋白酶的活性通常依赖于温度,所以可以认为通过预先对从生物体中采集的胰液、十二指肠液进行冷冻储存直至供于S100P的检查为止,能够某种程度抑制储存期间中的S100P的分解·变性。但是,实施S100P的检查作为临床检查的情况下,很难说所有的医疗机关、检查机关中待检体的储存设备是充分齐备的,考虑到这一点,从生物体采集的胰液、十二指肠液优选在供于检查为止尽可能地在室温下储存。因此,将胰液、十二指肠液在室温下储存的情况下,和在室温的溶液状态下,为了能够稳定地储存这些待检体中所包含的S100P,都需要充分地抑制来源于胰液、十二指肠液的蛋白酶的活性。
作为在室温下储存含生物体成分的溶液的方法,例如:在临床检查的领域中进行酶免疫测定法、放射线免疫测定法等免疫测定时,对于包含作为测定对象的抗原的试样,作为在溶液的状态下防止该试样中抗原的失活并稳定地储存的方法,有向该试样中加入酪蛋白或乳清蛋白的方法(例如,参照专利文献1)。另外,作为用于在室温下稳定地储存体液的方法,还有:使目标体液浸渍于多孔材料中保持有蛋白酶抑制剂的检查器具之后,使之干燥的方法(例如,参照专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平8-5634号公报
专利文献2:日本特开2003-270237号公报
非专利文献
非专利文献1:オオウチダ(Ohuchida)、其他9名、クリニカル·キャンサー·リサーチ(Clinical Cancer Research)、2006年、第12卷、第18号、第5411~5416页。
非专利文献2:ナカタ(Nakata)、其他9名、ヒューマン·パソロジー(Human Pathology)、2010年、第41卷、第824~831页。
发明内容
发明要解决的问题
专利文献1所述的方法如免疫测定中所使用的标准溶液等,对于蛋白酶等夹杂物非常少的试样是有效的,但对于如胰液、十二指肠液这样含有各种大量的蛋白酶的试样,则不怎么能期待效果。
另外,专利文献2所述的方法由于在干燥状态下存储待检体,所以对于检查对象为肽等利用比较干燥的处理而难以产生变性的物质是某种程度有效的;然而对于以S100P为代表的蛋白质,由于干燥处理而立体结构受到影响,存在变性的担心。进一步,专利文献2中虽然记载了大量能够保持于多孔材料的蛋白酶抑制剂,但并没有公开用于抑制胰液、十二指肠液中的S100P分解的最优化的蛋白酶抑制剂的组合。因此,以临时省略了进行干燥处理的方式即便施用专利文献2所述的方法而储存胰液等,也不能得到充分的S100P的室温储存效果。
本发明目的在于提供:调制能够在室温下稳定地储存胰液、十二指肠液等含胰液成分的生物试样中的蛋白质中的特别是S100P的含胰液成分的试样的方法、以及适合于该方法的含胰液成分的生物试样的室温储存用试剂盒。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究,结果发现,通过向含胰液成分的生物试样中组合添加具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和特定种类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,即便在室温下储存试样也能够稳定地储存该生物试样中所包含的S100P,至此完成了本发明。
即,本发明的含胰液成分的试样的调制方法以及含胰液成分的试样的室温储存用试剂盒采用下述(1)~(10)的构成。
(1)一种含胰液成分的试样的调制方法,其具有如下调制含胰液成分的试样的工序:向含胰液成分的生物试样中添加至少一种具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和至少一种作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,从而调制含胰液成分的试样。
(2)根据前述(1)的含胰液成分的试样的调制方法,其中,在前述调制含胰液成分的试样的工序之后,进而具有在室温下储存该含胰液成分的试样的工序。
(3)根据前述(1)所述的含胰液成分的试样的调制方法,其中,前述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂选自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟代磺酰基)苯甲酸、3-(氟代磺酰基)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟和4-硝基苯磺酰氟组成的组。
(4)根据前述(1)或(2)的含胰液成分的试样的调制方法,其中,作为前述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂,使用选自由PMSF、AEBSF和p-APMSF组成的组中的两种以上的化合物。
(5)根据前述(1)~(3)中的任一项的含胰液成分的试样的调制方法,其中,前述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂为TLCK。
(6)根据前述(1)的含胰液成分的试样的调制方法,其中,在前述含胰液成分的试样的调制工序中,作为具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂,以最终浓度分别为1mM以上、4mM以上、2mM以上的方式添加PMSF、AEBSF或p-APMSF;作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,以最终浓度为0.1mM以上的方式添加TLCK。
(7)根据前述(1)~(5)中的任一项的含胰液成分的试样的调制方法,其中,前述生物试样为胰液或十二指肠液。
(8)一种含胰液成分的生物试样的室温储存用试剂盒,其包括:至少一种具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂;至少一种作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂。
(9)根据前述(8)的室温储存用试剂盒,其中,前述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂为选自由PMSF、AEBSF和p-APMSF组成的组的一种以上的化合物。
(10)根据前述(8)或(9)的室温储存用试剂盒,其中,前述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂为TLCK。
(11)根据前述(8)~(10)中的任一项的室温储存用试剂盒,其进而包括储存用容器,所述储存用容器具备用于贮存所采集的体液的贮存部;前述贮存部中预先填充有前述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和前述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂。
发明的效果
通过本发明的含胰液成分的试样的调制方法,可以调制出能够充分抑制该生物试样中所包含的S100P的分解·变性并且在室温下稳定地储存含胰液成分的生物试样的储存用试样。即,可以期待通过更稳定地储存非常容易被分解的胰液中的蛋白质,能够提供质量高的试样,进而有助于加快胰腺癌的研究。特别是,由于能够调制在室温下能够储存的试样,所以本发明的含胰液成分的试样的调制方法也可以期待广泛地应用于临床检查。
另外,通过使用本发明的含胰液成分的生物试样的室温储存用试剂盒,能够更简便地从由生物体采集的胰液、十二指肠液调制能够室温储存的S100P检查用的生物试样。
附图说明
图1为表示PMSF、AEBSF和p-APMSF的化学式的图。
图2为表示参考例1中各胰酶溶液的蛋白酶活性(相对值:%)的结果的图。
图3为表示参考例2中各试样溶液中的S100P量的测定结果的图。
图4为表示实施例1中各试样溶液中的S100P量的测定结果的图。
图5为表示参考例3中各试样溶液中的S100P量的测定结果的图。
具体实施方式
胰液是指由胰管排出的体液。本发明和本说明书中,含胰液成分的生物试样是指包含含有来源于胰液的成分的体液的试样。作为含有来源于胰液的成分的体液,可列举出:由胰脏通过导管直接采集的胰液、由十二指肠采集的液体(十二指肠液)等。十二指肠液中除了胰液还包含同样地被***部排出的胆汁、原本存在于十二指肠的液体、血液等。需要说明的是,胰液、十二指肠液可以通过常规方法采集。
<含胰液成分的试样的调制方法>
本发明的含胰液成分的试样的调制方法(以下,有时称为“本发明的调制方法”)为调制含胰液成分的生物试样的方法,使得即便在室温下,也能够抑制该生物试样中包含的成分中特别是S100P的分解·变性并稳定地储存。即,本发明的调制方法的特征在于,其具有如下调制含胰液成分的试样的工序:向含胰液成分的生物试样中添加至少一种具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和至少一种作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,从而调制含胰液成分的试样;进而根据需要具有在室温下储存该试样直至供于S100P的检测为止的工序。
胰液、十二指肠液等含胰液成分的生物试样中,除了作为检查对象的蛋白质(本发明的调制方法中,S100P)之外,还包含有大量的蛋白酶,所以在室温下储存该生物试样的情况下,由于蛋白酶的影响,目标蛋白质分解·变性。因此,对于室温储存后的生物试样进行检查的情况下,存在如下问题:刚从生物体采集后,即便是包含有该蛋白质的生物试样,在检查中也不能检测到该蛋白质,检查精度降低。与此相对,通过本发明的调制方法调制含胰液成分的生物试样,即便在室温的溶液状态下,也能够有效地抑制来源于该生物试样的蛋白酶的活性,能够飞跃地提高S100P的稳定性。即,通过利用本发明的调制方法得到的含胰液成分的试样即便在室温储存后也会为一向没有的高品质,适合于要求高的精度的S100P检查(用于检测S100P的检查)。
具体而言,本发明的调制方法中,向含胰液成分的生物试样中添加至少一种具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和至少一种作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂(以下,有时称为“特定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂”。),从而调制含胰液成分的试样。通过组合使用具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,尽管在室温的溶液中也能够有效地抑制S100P的分解·变性。
如后述参考例1所示,利用对于TLCK(N-a-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮)等胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶具有抑制活性的氨基酸氯甲基酮类的、抑制胰液、十二指肠液中的蛋白酶的活性的效果,只与卡莫司他、FOY是相同程度的,极大地低于亮肽素等其他常用的蛋白酶抑制剂。尽管如此,通过组合使用具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和TLCK等作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,能够得到非常优异的S100P的室温稳定性提高效果,该效果是组合使用具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂与亮肽素等其他的蛋白酶抑制剂时观察不到的。本发明人等首次发现了应令人吃惊的以下发现:组合使用具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,对于室温下的S100P的稳定性提高是特别有效的。
本发明的调制方法中使用的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂只要是具有氟化磺酰基且具有蛋白酶抑制活性的化合物,则没有特别的限定,优选为具有与苯环直接键合的结构或者具有通过碳原子数1~6的烃基键合有氟化磺酰基的结构的化合物,优选为PMSF(苯甲基磺酰氟)、AEBSF(4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟))、p-APMSF(对脒基苯基甲烷磺酰氟盐酸盐)、4-(氟代磺酰基)苯甲酸(CAS号:455-26-5)、3-(氟代磺酰基)苯甲酸(CAS号:454-95-5)、2-氨基苯磺酰氟(CAS号:392-86-9)、3-氨基苯磺酰氟(CAS号:368-50-3)、4-氨基苯磺酰氟(CAS号:98-62-4)、2-硝基苯磺酰氟(CAS号:433-98-7)、3-硝基苯磺酰氟(CAS号:349-78-0)或4-硝基苯磺酰氟(CAS号:349-96-2),更优选为PMSF、AEBSF或p-APMSF。图1中示出PMSF、AEBSF和p-APMSF的化学式。图1中,被虚线包围的官能团为氟化磺酰基。
本发明的调制方法中使用的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂可以为1种,也可以组合使用2种以上。特别还优选使用选自由PMSF、AEBSF和p-APMSF组成的组中的至少1种化合物,更优选使用选自由PMSF、AEBSF和p-APMSF组成的组中的2种以上化合物,还可以使用全部3种。由于胰液中包含活性不同的各种蛋白酶,所以通过混合使用多种蛋白酶抑制剂,可以期待能够更切实地抑制生物试样中的蛋白酶活性。进而,相比于单独使用的情况,可以期待能够通过以低的浓度组合抑制蛋白酶活性。
对于添加至含胰液成分的生物试样中的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂的量,只要是能发挥出利用该蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制效果和S100P的室温稳定性提高效果的量,则没有特别的限定,可以考虑含胰液成分的生物试样的种类、使用的蛋白酶抑制剂的种类等适宜调整。例如,向含胰液成分的生物试样中只添加作为具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂的PMSF的情况下,可以以最终浓度为1mM以上、优选为5mM以上、更优选为10mM以上的方式进行添加。另外,只使用作为具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂的AEBSF的情况下,可以向含胰液成分的生物试样中添加AEBSF以使最终浓度为4mM以上、优选为10mM以上、更优选为20mM以上。只使用作为具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂的p-APMSF的情况下,可以向含胰液成分的生物试样中添加AEBSF以使最终浓度为2mM以上、优选为5mM以上、更优选为10mM以上。
本发明的调制方法中所使用的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,只要是氨基酸氯甲基酮类、且对于以胰蛋白酶为代表的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶具有抑制活性的化合物,则没有特别地限定。本发明中,特别优选使用TLCK。
对于添加至含胰液成分的生物试样中的特定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂的量,只要是利用该蛋白酶抑制剂发挥出蛋白酶抑制效果和S100P的室温稳定性提高效果的量,则没有特别地限定,可以考虑含胰液成分的生物试样的种类、使用的蛋白酶抑制剂的种类等适宜调整。例如,向含胰液成分的生物试样中只添加作为特定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂的TLCK的情况下,可以以最终浓度为0.1mM以上、优选为1mM以上、更优选为5mM以上、进而优选为10mM以上的方式进行添加。
本发明的调制方法中,向含胰液成分的生物试样中添加的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和前述特定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,可以为粉末状、颗粒状等固体状;也可以为溶解于适当的缓冲液等中的蛋白酶抑制剂溶液。另外,具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和前述特定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,可以同时向含胰液成分的生物试样中添加,也可以先行添加其中的任一者,之后添加另一者。从充分地发挥本发明的S100P的室温稳定性提高效果的观点出发,优选同时添加具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和前述特定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂。
本发明的调制方法中,可以向含胰液成分的生物试样中只添加具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和前述特定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,也可以进一步添加其他的蛋白酶抑制剂。作为其他的蛋白酶抑制剂,只要是不有损本发明的S100P的室温稳定性提高效果的物质,则没有特别地限定;可列举出例如:抑肽酶、亮肽素、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性酶抑制剂、抗凝血酶等肽系蛋白酶抑制剂、EDTA等螯合剂、弹性蛋白酶抑制剂(Elastase Inhibitor)、胰蛋白酶抑制剂、大肠杆菌素即Ecotin(E.coli,大肠杆菌)等。另外,也可以使用甲磺酸加贝酯(FOY)、甲磺酸卡莫司他(卡莫司他)、甲磺酸萘莫司他(Futhan)、乌司他丁等胰腺炎治疗药。
供于本发明的调制方法的含胰液成分的生物试样,只要为包含含有来源于胰液的成分的体液的试样即可,可以为只包含含有来源于胰液成分的体液的试样,也可以为将该体液用适当的缓冲液等稀释而成的液体,还可以为向该体液或其稀释液中添加了各种添加剂而成的试样。作为添加剂,可列举出:表面活性剂、核酸分解酶抑制剂、pH调节剂、pH指示剂等。作为供于本发明的调制方法的含胰液成分的生物试样,优选为包含胰液或十二指肠液的试样。具体而言,可列举出:胰液、十二指肠液、胰液或十二指肠液的稀释液、或者向其中加入了前述各种添加剂的液体等。
本发明的调制方法中,也可以向从生物体中采集之后进行了储存等的含胰液成分的生物试样中添加具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂;然而从生物体中采集含胰液成分的体液的时刻起至添加这些蛋白酶抑制剂的时刻为止的间隔优选短,特别优选在从生物体中刚采集后的胰液或十二指肠液中添加这些蛋白酶抑制剂。这是由于,包含胰液的生物试样由于所含有的蛋白酶的功能非常强,刚采集后开始蛋白质的分解加剧,所以优选进一步缩短采集的生物试样与前述蛋白酶抑制剂混合为止的时滞。例如,通过预先向设置于用于从生物体采集胰液或十二指肠液的采集工具的贮存部(用于贮存所采集的体液的容器样构件)内填充具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,由生物体采集的胰液或十二指肠液在回收容器内直接与蛋白酶抑制剂混合。另外,采集工具不具有贮存部而采集工具与作为贮存部的储存用容器连接的情况下,预先向该储存用容器内填充具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂。
本发明的调制方法中,为了抑制来源于胰液的成分中的特别是S100P的分解·变性,使用最适的蛋白酶抑制剂的组合,所以通过该方法调制的含胰液成分的试样所包含的S100P,即便在室温下也能够前所未有地稳定地储存。由此,通过利用本发明的调制方法调制的含胰液成分的试样进行S100P检查,该含胰液成分的试样即便在室温下储存直至供于S100P检查为止,也能够得到充分的检查精度。需要说明的是,通过本发明的调制方法调制的含胰液成分的试样,通过室温储存能够充分地发挥其效果,但也可以进行冷冻储存、冷藏储存等。
对于通过本发明的调制方法调制的含胰液成分的试样进行的S100P检查,只要是以S100P的检测或定量为目的的检查,则没有特别地限定。可以通过例如:应用了ELISA、免疫层析、二维电泳、免疫印迹(Western blot)、质谱分析法等的各种蛋白质解析,应用了PCR、RT-PCR、使用了探针的杂交等的各种核酸解析,细胞数计数、细胞诊断这样的细胞解析等检测S100P。
需要说明的是,可以期待本发明的调制方法对于S100P以外的来源于胰液的成分,也能够提高室温稳定性。因此,通过本发明的调制方法调制的含胰液成分的试样可以作为用于针对含胰液成分试样中的、S100P以外的成分的各种检查的测定试样而使用。作为检查对象的物质,只要是可以期待包含于胰液或十二指肠液的生物体成分,则没有特别地限定,可以为蛋白质,也可以为DNA、RNA等核酸,还可以为细胞。例如,该含胰液成分的试样可以应用于:应用了ELISA、免疫层析、二维电泳、免疫印迹、质谱分析法等的各种蛋白质解析,应用了PCR、RT-PCR、使用了探针的杂交等的各种核酸解析,细胞数计数、细胞诊断这样的细胞解析等中。
<含胰液成分的生物试样的储存用试剂盒>
本发明的含胰液成分的生物试样的储存用试剂盒(以下,有时称为“本发明的储存用试剂盒”)的特征在于,其具有:至少一种具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和至少一种作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂。通过向含胰液成分的生物试样中添加该储存用试剂盒所具备的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和特定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,能够在直至供于S100P的检测为止的期间内,更简便地调制能够在室温下储存的含胰液成分的试样。
本发明的储存用试剂盒中所包括的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂可以只有一种,也可以组合两种以上。本发明中,优选使用选自由PMSF、AEBSF和p-APMSF组成的组中的一种以上的化合物,更优选使用选自由这些化合物组成的组中的两种以上的化合物。同样地,本发明的储存用试剂盒所包括的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂可以只使用1种,也可以组合2种以上。本发明中,优选使用TLCK作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂。
另外,本发明的储存用试剂盒所包括的各种蛋白酶抑制剂可以为冷冻干燥粉末,也可以为将冷冻干燥粉末与适当的赋形剂等一起成型而成的片剂或颗粒剂等,还可以为溶解于适当的缓冲液中而成的蛋白酶抑制剂溶液。
本发明的储存用试剂盒也可以进而包括:用于稀释所采集的体液的缓冲液、其他的蛋白酶抑制剂、表面活性剂、pH调节剂、pH指示剂等。表面活性剂、pH调节剂、pH指示剂等各种添加剂也可以预先溶解于稀释用的缓冲液中。除此之外,本发明的储存用试剂盒也可以包括盖,所述盖能够由填充有该含胰液成分的试样的容器滴加一定量所调制的含胰液成分的试样(向含胰液成分的生物试样中添加本发明的储存用试剂盒所包括的各种蛋白酶抑制剂、根据需要添加其他的成分而成的样品)、且能够与该容器的开口部连接。
本发明的储存用试剂盒也可以包括储存用容器,所述储存用容器具备用于贮存由生物体采集的胰液或十二指肠液等体液的贮存部。该情况下,优选该贮存部中预先包含本发明的蛋白酶抑制剂。该储存用容器刻有刻度的情况下,能够以目视确认添加至该储存用容器中的生物试样的量(该储存容器内预先填充有蛋白酶抑制剂的情况下,为生物试样和蛋白酶抑制剂的总量),进而能够一眼知道蛋白酶抑制剂的终浓度。
另外,含胰液成分的生物试样通常经内窥镜采集。因此,作为本发明的储存用试剂盒的构成品,也可以包括经内窥镜采集含胰液成分的生物试样的采集工具。作为该采集工具,有例如:能够***至内窥镜装置中的导管与注射器组合而成的工具,能够***至内窥镜装置中的前端具备吸收体的探针等。作为能够***至内窥镜装置中的导管,可列举出例如:日本特开2011-5009号公报中记载的标本采集立方体(cube)等。作为这些采集工具,优选具有预先分注了前述蛋白酶抑制剂的贮存部。另外,该贮存部能够拆卸的情况下,也可以作为储存容器使用。
实施例
接着,示出实施例对本发明更具体地说明,但本发明不受以下的实施例限定。
[参考例1]
已知,胰液中的消化酶中,作为其分解级联的触发物的酶为丝氨酸蛋白酶。因此,首先,筛选对于胰液中所包含的蛋白酶抑制效果高的丝氨酸蛋白酶抑制剂。
具体而言,从市售的蛋白酶抑制剂中,寻找以丝氨酸蛋白酶作为靶标,对于胰液抑制效果高的抑制剂。所使用的蛋白酶抑制剂有:抑肽酶(Roche公司制)、亮肽素(Roche公司制)、PMSF(Roche公司制)、AEBSF(Roche公司制)、p-APMSF(SIGMA公司制)、甲磺酸卡莫司他(卡莫司他;和光纯药公司制)、甲磺酸加贝酯(FOY;和光纯药公司制)、TLCK(SIGMA公司制)、TPCK(SIGMA公司制)。需要说明的是,TPCK为对于胰凝乳蛋白酶具有抑制活性、而对于胰蛋白酶没有表现出抑制活性的氨基酸氯甲基酮类。
使用胰酶以活化的状态存在的由猪的胰脏制成的消化酶剂即“Pancreatin”作为模拟人工胰液,以最终浓度为制造商建议浓度范围的方式添加各蛋白酶抑制剂,之后测定蛋白酶活性。蛋白酶活性使用EnzCheckProtease Assay Kits(Molecular Probes公司制)进行测定。具体而言,向添加了各蛋白酶抑制剂的Pancreatin溶液中添加试剂盒附带的被荧光标记的酪蛋白,在37℃下进行2小时孵育之后,在Ex/Em=485/535nm的荧光波长下测定荧光量。另外,作为对照,对于向Pancreatin中添加了直接被荧光标记的酪蛋白而成的试样溶液(无抑制剂),也同样地测定蛋白酶活性。
将各Pancreatin溶液的荧光量的测定结果示于图2中。纵轴的荧光量表示分解了酪蛋白的量,将该值作为蛋白酶活性的值进行估算。横轴表示向各Pancreatin溶液中添加的蛋白酶抑制剂及其最终浓度。由该结果可知,PMSF、AEBS和p-APMSF与其他的蛋白酶抑制剂相比较,抑制效果非常高。它们均为具有氟化磺酰基的砜系化合物。
[参考例2]
着眼于由参考例1可知对于胰液中的消化酶的抑制效果高的砜系化合物,调查各种砜系化合物对于作为胰腺癌的标记物蛋白质已知的S100P(钙结合蛋白质)在胰液中的室温稳定性的效果。即,使用4种人临床待检体的胰液,添加了S100P的标准品蛋白质之后,调查室温储存前后S100P浓度是否变化。
具体而言,首先,调制:各人临床待检体中混合了25ng/mL的S100P(标准品)溶液的试样溶液(试样溶液1:无抑制剂)、向试样溶液1中添加了AEBSF(最终浓度:4mM)的试样溶液(试样溶液2:AEBSF)、向试样溶液1中添加了AEBSF(最终浓度:4mM)和PMSF(最终浓度:1mM)的试样溶液(试样溶液3:AEBSF+PMSF)。各试样溶液使用CircuLex S100P ELISA Kit(Cyclex公司制、目录号:CY-8060)附带的缓冲液进行调制。通过将这些试样溶液在25℃下进行16小时孵育而使之反应(室温储存)。之后,对于将各试样溶液使用CircuLex S100P ELISA Kit(Cyclex公司制、目录号:CY-8060)附带的缓冲液进行了10倍稀释的稀释液,使用CircuLex S100P ELISA Kit,进行S100P的检测。作为对照,对于刚调制后(即,室温储存前)的试样溶液1,也同样地,进行S100P的检测。
将测定结果示于图3中。纵轴表示S100P浓度,横轴表示试样溶液1在室温储存前(图中,“室温储存前”)、以及试样溶液1~3的室温储存后(图中,“无抑制剂”、“AEBSF”、“AEBSF+PMSF”)。通过室温储存,没有添加蛋白酶抑制剂的试样溶液1中,所有的胰液待检体的S100P几乎都分解了。与此相对,添加了蛋白酶抑制剂的试样溶液2和3中,所有的胰液待检体均检测到S100P;特别是添加了AEBSF和PMSF两者的试样溶液3中,较高地维持了S100P浓度。由这些结果可知,通过将具有氟化磺酰基的砜系化合物混合至少一种以上、优选为两种以上,胰液中的S100P即便在室温下也会更稳定。
[实施例1]
为了检测人胰液待检体中原本含有的S100P而不是人工添加的标准品,只添加具有氟化磺酰基的砜系化合物是不充分的。因此,为了以进一步提高S100P的储存性能,通过具有氟化磺酰基的砜系化合物与作为其他砜系化合物的TLCK是否组合使用来调查S100P的储存稳定性是否受到影响。使用7种人临床待检体。
具体而言,调制:对各人临床待检体添加了AEBSF(最终浓度:4mM)的试样溶液(试样溶液1:AEBSF),对各人临床待检体添加了AEBSF(最终浓度:4mM)和PMSF(最终浓度:1mM)的试样溶液(试样溶液2:AEBSF+PMSF),对各人临床待检体添加了AEBSF(最终浓度:4mM)、PMSF(最终浓度:1mM)和抑肽酶(最终浓度:3μM)的试样溶液(试样溶液3:AEBSF+PMSF+抑肽酶(Aprotinin)),对各人临床待检体添加了AEBSF(最终浓度:4mM)、PMSF(最终浓度:1mM)和TPCK(最终浓度:1mM)的试样溶液(试样溶液4:AEBSF+PMSF+TPCK),对各人临床待检体添加了AEBSF(最终浓度:4mM)、PMSF(最终浓度:1mM)和TLCK(最终浓度:1mM)的试样溶液(试样溶液5:AEBSF+PMSF+TLCK)。各试样溶液使用附属于CircuLex S100P ELISAKit(Cyclex公司制、目录号:CY-8060)的缓冲液进行调制。通过使这些试样溶液在25℃下进行16小时孵育使之反应之后(室温储存后),与参考例2同样地进行S100P的检测。
另外,作为对照,代替室温储存进行冷冻储存,除此以外,与上述同样地,由相同人临床待检体调制试样溶液1~5,对于这些试样溶液,与参考例2同样地,进行S100P的检测。
将测定结果示于图4中。纵轴表示S100P浓度,横轴表示针对人胰液待检体1~7的试样溶液1~5(图中,“AEBSF”、“AEBSF+PMSF”、“AEBSF+PMSF+Aprotinin”、“AEBSF+PMSF+TPCK”、“AEBSF+PMSF+TLCK”)。另外,图中,分别地,“FT”表示冷冻储存后并且没有室温储存情况下的结果;“25℃、16h”表示在25℃下进行16小时孵育后(室温储存后)情况下的结果。结果,进行了冷冻储存的试样溶液,无论添加的蛋白酶抑制剂的种类,所有的人胰液待检体中,无论量的多寡均检测到S100P。与此相对,可知,只添加了AEBSF的试样溶液1、添加了AEBSF和PMSF的试样溶液2中,尽管所有的人胰液待检体中均检测到了S100P,但与进行了冷冻储存的情况相比较,其量非常少,室温储存中大部分的S100P发生分解·变性。与此相对,添加了AEBSF、PMSF和TLCK的试样溶液5中,所有的人胰液待检体表现了进行了冷冻储存的情况的约70%以上的S100P浓度的剩余率。另一方面,向AEBSF和PMSF中添加了抑肽酶的试样溶液3、向AEBSF和PMSF中添加了TPCK的试样溶液4,都没有表现出如添加了AEBSF、PMSF和TLCK的试样溶液5那样高的剩余率。由这些结果可知,通过组合使用至少一种以上的具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和TLCK等具有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制活性的氨基酸氯甲基酮类,即便在室温下也能够非常稳定地储存胰液中的S100P。
[参考例3]
将蛋白酶抑制剂对于模拟人工胰液中的S100P的储存稳定性、和蛋白酶抑制剂对于人临床待检体中的S100P的储存稳定性的效果进行比较。作为含S100P的模拟人工胰液,使用向胰酶溶液中以成为25ng/mL的方式添加了S100P(标准品)的溶液。
具体而言,首先,调制:实施例1中使用的人临床待检体两种(人胰液待检体1和2)和模拟人工胰液中分别混合了25ng/mL的S100P(标准品)溶液的试样溶液(试样溶液1:无抑制剂),向试样溶液1中添加了AEBSF(最终浓度:4mM)的试样溶液(试样溶液2:AEBSF),向试样溶液1中添加了AEBSF(最终浓度:4mM)和PMSF(最终浓度:1mM)的试样溶液(试样溶液3:AEBSF+PMSF),向试样溶液1中添加了AEBSF(最终浓度:4mM)、PMSF(最终浓度:1mM)和TLCK(最终浓度:1mM)的试样溶液(试样溶液4:AEBSF+PMSF+TLCK)。各试样溶液使用CircuLex S100P ELISA Kit(Cyclex公司制、目录号:CY-8060)所附带的缓冲液进行调制。通过使这些试样溶液在25℃下进行16小时孵育使之反应之后(室温储存后),与参考例2同样地进行S100P的检测。
另外,作为对照,对于与前述同样调制的试样溶液1,代替室温储存进行冷冻储存之后,立即与参考例2同样地进行S100P的检测。
将测定结果示于图5中。纵轴表示S100P浓度;横轴表示对应于人胰液待检体1、2、和含S100P模拟人工胰液的试样溶液1~4(图中为“无抑制剂”、“AEBSF”、“AEBSF+PMSF”、“AEBSF+PMSF+TLCK”)。另外,图中,分别地,“FT”表示冷冻储存后并且没有室温储存情况下的结果;“25℃、16h”表示25℃下进行16小时孵育后(室温储存后)情况下的结果。结果,冷冻储存的试样溶液中,人胰液待检体与胰酶溶液的任一者均检测到添加的S100P。另一方面,对于室温储存后的试样溶液,无论是否添加蛋白酶抑制剂、种类,胰酶溶液中完全检测不到S100P。另外,对于人胰液待检体1和2,添加了AEBSF或AEBSF和PMSF的试样溶液2和3,S100P的检测量比没有添加蛋白酶抑制剂的试样溶液1多,由于添加的蛋白酶抑制剂,可见S100P的室温储存稳定性有所改善。与此相对,人胰液待检体1和2的两者,与实施例1的结果不同,添加了AEBSF、PMSF和TLCK的试样溶液3,S100P的检测量比没有添加TLCK的试样溶液2或3明显少。由这些结果可知,虽然理由不明确,但通过组合使用AEBSF等具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和TLCK等作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,S100P的室温储存稳定性效果对于由生物体采集的胰液、十二指肠液等生物试样中本来就含有的S100P(内源性的S100P)发挥出来了,但是对于后添加的S100P(外源的S100P)则没有发挥出该效果。
产业上的可利用性
本发明的调制方法和本发明的室温储存用试剂盒能够在室温下稳定地储存胰液、十二指肠液等生物试样中的蛋白质特别是S100P,所以能够利用于解析胰液中的S100P的领域、特别是用于胰腺癌的诊断·治疗的临床检查等领域中。
Claims (11)
1.一种含胰液成分的试样的调制方法,其具有如下调制含胰液成分的试样的工序:
向含胰液成分的生物试样中添加至少一种具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂、和至少一种作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,从而调制含胰液成分的试样。
2.根据权利要求1所述的含胰液成分的试样的调制方法,其中,在所述调制含胰液成分的试样的工序后,进而具有在室温下储存该含胰液成分的试样的工序。
3.根据权利要求1所述的含胰液成分的试样的调制方法,其中,所述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂选自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟代磺酰基)苯甲酸、3-(氟代磺酰基)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟和4-硝基苯磺酰氟组成的组。
4.根据权利要求1所述的含胰液成分的试样的调制方法,其中,作为所述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂,使用选自由PMSF、AEBSF和p-APMSF组成的组中的两种以上的化合物。
5.根据权利要求1所述的含胰液成分的试样的调制方法,其中,所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂为TLCK。
6.根据权利要求1所述的含胰液成分的试样的调制方法,其中,在所述含胰液成分的试样的调制工序中,作为具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂,以最终浓度分别为1mM以上、4mM以上、2mM以上的方式添加PMSF、AEBSF或p-APMSF;作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,以最终浓度为0.1mM以上的方式添加TLCK。
7.根据权利要求1所述的含胰液成分的试样的调制方法,其中,所述生物试样为胰液或十二指肠液。
8.一种含胰液成分的生物试样的室温储存用试剂盒,其包括:
至少一种具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂,和
至少一种作为氨基酸氯甲基酮类的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂。
9.根据权利要求8所述的室温储存用试剂盒,其中,所述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂为选自由PMSF、AEBSF和p-APMSF组成的组的一种以上的化合物。
10.根据权利要求9所述的室温储存用试剂盒,其中,所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂为TLCK。
11.根据权利要求8所述的室温储存用试剂盒,
其进而包括储存用容器,所述储存用容器具备用于贮存所采集的体液的贮存部,
所述贮存部中预先填充有所述具有氟化磺酰基的蛋白酶抑制剂和所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂。
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