CN109557230A - 一种测定烟草中三类二硫代氨基甲酸酯残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定烟草中三类二硫代氨基甲酸酯残留量的方法。将待测烟草粉末用碱性提取液处理后过滤，收集滤液用LC‑MS‑MS进行分析，再经标准曲线绘制和计算后得到结果。本发明首次实现了对烟草中三类DCs物质残留量的准确测定。三种DCs物质的线性范围为20～100mg/L，相关系数均不小于0.99，检出限分别是2.3、4.3、5.2μg/kg，定量限分别是7.7、14.3、17.3μg/kg，基质效应范围分别为0.19～0.50、0.78～1.70、0.35～0.87，烤烟基质各DTCs的日内RSD11.33～16.80％，日间RSD5.84～6.54％，加标回收率84.5％～103.5％。该方法操作简便、分析速度快，准确度和精密度高、稳定性强，满足定量分析的要求。

Description

一种测定烟草中三类二硫代氨基甲酸酯残留量的方法

技术领域

本发明属于烟草理化检验技术领域，具体是涉及一种能够准确测定烟草中三类二硫代氨基甲酸酯残留量的方法。

背景技术

二硫代氨基甲酸酯(DTCs)为有机硫类保护性杀菌剂。它可抑制病菌体内丙酮酸的氧化，从而起到杀菌作用，在烟草上主要用于防治炭疽、立枯、根腐病、赤星病或黑胫病等。DTCs类农药在烟叶表面比较稳定，故很容易在烟草中造成残留。根据化合物结构，DTCs分为三类，即：二甲基二硫代氨基甲酸盐(DMDC)，乙撑双二硫代氨基甲酸酯(EBDC)，和亚丙基双(二硫代氨基甲酯)(PBDC)。

现有技术主要采用二硫化碳法(包括分光光度法、气相色谱法)来对初烤烟叶、卷烟中二硫代氨基甲酸酯进行检测，但该方法只能测定二硫代氨基甲酸酯总残留量，不能准确识别并定量具体成分。

液相色谱-质谱-质谱联用法(LC-MS/MS)，集LC的高分离能力与 MS的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体，能区分二硫代氨基甲酸酯的不同种类，可以进行该类农药的定性验证及定量，能弥补现行行业标准的不足，如果将该方法应用于烟草的检测，应该能够很好地克服现有检测方法存在的不足，但现有技术中尚未有成功的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种测定烟草中三类二硫代氨基甲酸酯残留量的方法，运用LC-MS-MS法，在保证检测准确度、精密度和稳定性的前提下，分别针对三种不同的二硫代氨基甲酸酯进行准确定量。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

一种测定烟草中三类二硫代氨基甲酸酯残留量的方法，包括以下步骤：

(1)称取研磨后的待测烟草样品0.5g于50mL离心管中，加入10 mL碱性提取液，涡旋1min，转速13000rpm离心5min，上清液经 0.23μm滤膜过滤后，进行LC-MS/MS测定；所述的碱性提取液：称取0. 6058g L-半胱氨酸和1.8612g EDTA-Na2，用450mL水溶解，用2 mol/L的NaOH调至pH 12.0，再用水定容至500mL，配成pH 12.0 的10mmol/L EDTA与10mmol/L L-半胱氨酸的混合液；

(2)LC-MS/MS测定条件

色谱条件流动相：Waters UPLC BEH HILIC色谱柱(50 mm×2.1mm×2.8μm)；流动相A为乙腈，B为10mmol/L氨水，流速： 0.2mL/min；柱温：25℃；进样体积：5μL；梯度洗脱：4分钟内乙腈由 15％线性降至5％，保持0.1分钟，切换为乙腈15％，保持至7分钟；

质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：500V；干燥气温度：300℃；干燥气流量：6L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流量：10L/min；毛细管电压： 4000V；

表1：三类DTC的多反应监测定性、定量离子对以及质谱相关参数

(3)标准溶液的配制

单一标准储备液：按照各标准物质的纯度计算，分别称取纯物质福美铁、福美双、福美锌、代森锌、代森锰、丙森锌和代森福美锌各5mg，用所述的碱性提取液分别溶解并定容至100mL，超声加速溶解5分钟，分别配成7种纯物质的、浓度为50mg/L的单一标准储备液；

单一调试溶液：分别将配制好的各单一标准储备液用所述的碱性提取液稀释，分别得到7种纯物质的、浓度为1mg/L的单一调试溶液；

标准工作曲线单一母液：按照各标准物质的纯度计算，分别称取纯物质福美双、代森锌和丙森锌各100mg，用所述的碱性提取液分别溶解并定容至100mL，超声加速溶解5分钟，分别配成3种纯物质的、浓度为 1000mg/L的标准工作曲线单一母液；

标准工作溶液：分别从3种纯物质的标准工作曲线单一母液中各移取 0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL，分别置于10mL容量瓶中，用所述的碱性提取液分别定容，分别得到3种DTCs浓度为20μg/mL～ 100μg/mL的系列标准工作溶液；用液相色谱串联质谱测定，得到DTCs 的积分峰面积作为纵坐标，根据各标准物质的纯度，计算实际浓度，作为横坐标，制作标准曲线；

基质匹配标准工作溶液：分别称取0.5g研磨后的不含二硫代氨基甲酸酯的烤烟(白肋烟或香料烟)粉末各五份，分别置于50mL聚四氟乙烯离心管中，分别加入3种标准工作曲线单一母液0.2mL、0.4mL、0.6mL、 0.8mL和1.0mL，然后分别加入9.8mL、9.6mL、9.4mL、9.2mL、 9.0mL所述的碱性提取液，涡旋1分钟，转速13000rpm离心5分钟，上清液经0.23μm滤膜过滤后，用液相色谱-质谱/质谱测定；

(4)定性结果：

在相同实验条件先测定标准溶液和样品溶液，然后按如下方法定性判定样品目标物：

1)样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中的某种组分峰的保留时间基本一致，并且所选择的离子对的质荷比一致；

2)样品离子对相对丰度与浓度接近标准工作溶液的离子对的相对丰度进行比较时，相对偏差不超过表2规定的范围；满足以上两点，则能判定样品中存在该组分；

表2定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差

(5)定量结果：

相同实验条件下测定标准溶液和样品溶液，制作标准曲线，样品中 DTCs的含量用外标法定量，按公式(1)进行计算：

式中：X-样品中某种组分的含量，单位μg/g；

c_i-由标准曲线得出的样品中某种组分的浓度，单位μg/mL；

c₀-空白溶液浓度，单位μg/mL；

V-样品最终定容体积，单位mL；

m-样品质量，单位g；

(6)结果计算：根据样品溶液待测定量离子的丰度，从标准曲线上读取结果，扣除空白后得到样品的三类二硫代氨基甲酸酯含量，以两次平行测定结果的算术平均值作为最终测定结果，两次平行测定结果的相对平均偏差应小于10％。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明首创性地将LC- MS/MS法应用于烟草中三类二硫代氨基甲酸酯的测定。在优化条件下，二甲基二硫代氨基甲酸盐(DMDCs)，乙撑双二硫代氨基甲酸酯(EBDCs)，和亚丙基双(二硫代氨基甲酯)(PBDCs)的线性范围为20～100mg/L，相关系数均不小于0.99。DMDCs、EBDCs、PBDCs的检出限分别是2.3、 4.3、5.2μg/kg，定量限分别是7.7、14.3、17.3μg/kg。3种DTCs在白肋烟、香料烟、烤烟溶液中的基质效应范围分别为为0.19～0.50、0.78～ 1.70、0.35～0.87。烤烟基质各DTCs的日内RSD为11.33～16.80％，日间RSD为5.84～6.54％，加标回收率为84.5％～103.5％。该方法操作简便、分析速度快，准确度和精密度高、稳定性强，可满足定量分析的要求，具有良好的应用前景。

附图说明

图1三类二硫代氨基甲酸酯的分子结构式；

图2福美铁离子碎片图；

图3福美锌离子碎片图；

图4福美双离子碎片图；

图5代森锌离子碎片图；

图6代森锰离子碎片图；

图7丙森锌离子碎片图；

图8代森福美锌离子碎片图；

图9代森福美锌的裂解推导过程；

图10DMDC定量离子120＞76的MRM色谱图；

图11EBDC定量离子211＞58的MRM色谱图；

图12PBDC定量离子225＞58的MRM色谱图；

图13白肋烟基质PBDC定量离子225＞58的MRM色谱图；

图14白肋烟基质EBDC定量离子211＞58的MRM色谱图；

图15白肋烟基质DMDC定量离子120＞76的MRM色谱图；

图16烤烟基质PBDC定量离子225＞58的MRM色谱图；

图17烤烟基质EBDC定量离子211＞58的MRM色谱图；

图18烤烟基质DMDC定量离子120＞76的MRM色谱图；

图19香料烟基质PBDC定量离子225＞58的MRM色谱图；

图20香料烟基质EBDC定量离子211＞58的MRM色谱图；

图21香料烟基质DMDC定量离子120＞76的MRM色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作的变化，都应该属于本发明的保护范围。

实施例1

1.实验原理、材料及方法

1.1原理

向研磨的样品中加入碱性提取液，涡旋离心后取上清液经滤膜过滤后，用高效液相色谱-串联质谱仪检测。

1.2主要材料和试剂

实验用水为超纯水；乙酸铵、甲醇均为色谱纯，北京迪马科技公司产品；氨水：分析纯，广东西陇科学公司产品；福美铁(Ferbam，纯度 75.0％)、福美锌(Ziram，纯度75.0％)、福美双(Thiram，纯度97％)、代森锌(Zineb，纯度80.5％)、代森锰(mancozeb，80％)、丙森锌(Propineb，71.3％)、代森福美锌(Polycarbamate，88.4％)标准品：德国EhrenstorferGmbH公司产品。

色谱柱：ZIC-pHILIC柱(150×4.6mmi.d.，5μm)，Waters UPLC BEH C18(150×2.1mm i.d.，2.8μm)和Waters UPLC BEH HILIC (50×2.1mm i.d.，2.8μm)；针筒和滤头；高纯氮气(纯度大于99.999％)；具螺旋盖聚四氟乙烯离心管(50mL)。

1.3主要仪器

1290高效液相色谱-6460串联质谱仪：美国Agilent公司产品；分析天平：瑞士梅特勒公司产品；涡旋混匀器：江苏其林贝尔公司产品； Universal 320R高速离心机：德国Hettich公司产品；pH计：美国ThermoFisher公司产品；纯水机：美国Millipore公司产品。

1.4标准溶液的配制

碱性提取液：称取0.6058g L-半胱氨酸和1.8612g EDTA-Na2，用约450mL水溶解，用2mol/L的NaOH调至pH 12.0，再用水定容至500mL，配成pH 12.0的10mmol/L EDTA与10mmol/L L-半胱氨酸的混合液。

单一标准储备液：按照各标准物质的纯度计算，分别称取纯物质约 5mg福美铁、福美双、福美锌、代森锌、代森锰、丙森锌、代森福美锌，用碱性提取液溶解并定容至100mL，超声加速溶解5分钟，配成浓度约为 50mg/L的单一标准储备液。

单一调试溶液：分别将由50mg/L福美铁、福美双、福美锌、代森锌、代森锰、丙森锌、代森福美锌的单一标准储备液用碱性提取液稀释得到浓度为1mg/L的单一调试溶液。

标准工作曲线单一母液：按照各标准物质的纯度计算，分别称取纯物质约100mg福美双、代森锌、丙森锌，用碱性提取液溶解并定容至 100mL，超声加速溶解5分钟，配成浓度约为1000mg/L的标准工作曲线单一母液。

标准工作溶液：分别移取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0 mL 3种DTCs标准工作曲线单一母液于10mL容量瓶中，采用碱性提取液定容，得到3种DTCs浓度约为20μg/mL～100μg/mL的系列标准工作溶液。用液相色谱串联质谱测定，得到DTCs的积分峰面积作为纵坐标，根据各标准物质的纯度，计算实际浓度，作为横坐标，制作标准曲线。

基质匹配标准工作溶液：称取0.5g研磨后的不合二硫代氨基甲酸酯的烤烟(白肋烟、香料烟)粉末各五份于50mL聚四氟乙烯离心管中，分别加入3种单一母液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL，然后加入9.8mL、9.6m L、9.4mL、9.2mL、9.0mL碱性提取液，涡旋1分钟，转速13000rpm离心5分钟，上清液经0.23μm滤膜过滤后，用液相色谱-质谱/质谱测定。

1.5实验条件

1.5.1色谱条件流动相：Waters UPLC BEH HILIC色谱柱(50 mm×2.1mm×2.8μm)；流动相A为乙腈，B为10mmol/L氨水，流速： 0.2mL/min；柱温：25℃；进样体积：5μL；梯度洗脱：4分钟内乙腈由 15％线性降至5％，保持0.1分钟，切换为乙腈15％，保持至7分钟。

1.5.2质谱条件电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：500V；干燥气温度：300℃；干燥气流量：6L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流量：10L/min；毛细管电压： 4000V。

表1三类DTC的多反应监涮定性、定量离子对以及质谱相关参数

2.结果与讨论

2.1质谱条件优化

2.1.1质谱离子源条件优化DTCs在碱性溶液中以负离子的形式存在，因此选择负离子模式进行检测。分别将浓度为1mg/L的福美铁、代森锌、代森锰、丙森锌、代森福美锌、福美双、福美锌单一调试溶液，50％10mmol 氨水-乙腈溶液做流动相，流速为0.2mL/min，进样量5μL，不过色谱柱直接进一级质谱分析，优化电喷雾电压、干燥气温度、干燥气流量、鞘气温度、鞘气流量、毛细管电压，使获得的分子离子峰趋于稳定。最终得到1.4.2的质谱参数。

2.1.2二级质谱条件优化取1mg/L的福美铁、代森锌、代森锰、丙森锌、代森福美锌、福美双、福美锌单一调试溶液连续进样，优化合适的锥孔电压和碰撞能量。然后综合考虑定量离子的选择性和其灵敏度，尽量选择丰度最大的离子为定量离子，以提高整个方法的灵敏度，再选择丰度第二大的离子为辅助定性离子。最终得到了表1所示的DTCs质谱测定参数和各类DTCs的定量/定性离子对，DTCs的二级离子图见图2-8。

可以看出，DMDCs(如福美钠、福美铁、福美锌、福美双等)、 EBDCs(如代森钠、代森锰、代森锌、代森锰锌等)和PBDCs(如丙森钠、丙森锌等)的离子碎片均一致。根据代森福美锌的离子情况推测一分子的代森福美锌能够被EDTA络合后分解为一分子的代森类(EBDC)和两分子的福美类(DMDC)。

2.1.3定性结果在相同实验条件先测定标准溶液和样品溶液，然后按如下方法定性判定样品目标物：1)样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中的某种组分峰的保留时间基本一致，并且所选择的离子对的质荷比一致；2）样品离子对相对丰度与浓度接近标准工作溶液的离子对的相对丰度进行比较时，相对偏差不超过表2规定的范围；满足以上两点，则可判定样品中存在该组分。

表2定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差

2.2液相色谱条件的优化

2.2.1流动相的选择二硫代氨基甲酸酯类在碱性溶液中以负离子的形式存在，因此采用负离子扫描模式；对比了LC-MS/MS最常用的负离子模式流动相：乙腈-水、甲醇-水、乙腈-10mmol/L乙酸铵、乙腈-10mmol/L氨水作为流动相时DTCs的分离效果。以甲醇-水、乙腈-10mmol/L乙酸铵为流动相，DTCs不论如何改变流动相比例，目标物均无响应。分析原因为：甲醇-水为流动相时由于甲醇的雾化效果不好而导致目标物无响应；而以乙腈 -10mmol/L乙酸铵为流动相时由于两者的水相中分别含有大量的乙酸酸铵等离子，产生了离子抑制效应，导致目标物无响应。以乙腈-水、乙腈- 10mmol/L氨水作为流动相时，目标物均显示了很强的响应，乙腈-10 mmol/L氨水目标物的响应大于乙腈-水流动相，并且乙腈-10mmol/L 氨水能更好的将色谱柱中的杂质除去，因此实验最终采用乙腈-10mmol /L氨水作为最佳流动相。

2.2.2色谱柱的选择由于DTCs的极性较强，在不同的色谱柱上有不同保留，因此，考察在Waters UPLC BEH C18(150×2.1mm i.d.，2.8μm)、ZIC- pHILIC柱(150×4.6mmi.d.，5μm)和Waters UPLC BEH HILIC(50 mm×2.1mm×2.8μm)色谱柱上DTCs的分离效果。在Waters UPLC BEH C18色谱柱上，无论怎样调整梯度，DTCs很快被冲出可以看出C18 色谱柱对DTCs没有保留，没能达到分离效果，且很快出峰，非常容易收到溶剂影响；在ZIC-pHILIC色谱柱上，3种DTCs峰型较差，且峰型展宽；在Waters UPLC BEH HILIC色谱柱上，HILIC色谱柱对于DTCs有很快的分离效果，且峰形较好。综上，选择Waters UPLC BEH HILIC作为DTCs 的分离液相柱。

2.2.3梯度洗脱的优化采用等度洗脱时，若用97∶3的乙腈-10mmol/L 氨水进行等度洗脱时，流动相对目标物的洗脱效果不好，会形成很宽的峰； 60∶40的乙腈-10mmol/L氨水进行等度洗脱时，则由于水含量太高，雾化效果不好，导致目标物的响应很低。DTCs适用氨水溶液/乙腈流动相体系，分离效果优于其他流动相体系。反复优化流动相梯度程序。最终确定了1.4.1的色谱分离条件，该HILIC柱分离三者时，虽然保留时间较为接近，但可通过两者的定性离子分别对其进行鉴定，并不影响定性和定量测定。从图中可看出在2.5min内快速分离，且峰形良好。图10～12为不同 DTCs的定量离子MRM图。

2.3方法学验证

2.3.1线性关系用液相色谱串联质谱测定标准工作溶液，DTCs峰面积作为纵坐标，各DTCs浓度为横坐标制作标准曲线，线性回归方程、线性范围和相关系数见表3。从表3可以看出，三类DTCs浓度与响应回归方程相关系数均大于0.99，表明在20～100mg/L浓度范围内有良好的线性关系。

表3 DTCs的校正曲线方程、相关系数及线性范围

注：线性方程中x为峰面积；y为各组分的浓度，单位为mg/L。

2.3.2检出限和定量限将检测器产生的响应信号为噪声值3倍、10倍时所对应的浓度分别代入公式(1)，换算得到DMDC、EBDC、PBDC的检出限分别是2.3、4.3、5.2μg/kg，定量限分别是7.7、14.3、17.3μg/kg。该方法有较好的灵敏度、较低的检测限，能够较好的满足DTCs检测要求。 2.3.3基质效应的影响建立准确测定DTCs的LC-MS/MS方法，基质影响是必须考虑的，基质效应会对分析方法的灵敏度、精密度以及准确度造成影响，当比值接近1时，说明不存在基质效应的影响；当比值大于或小于1 时，说明基质对待测组分的响应有增强或抑制效应[17]。但在实际检测中，相对比值在0.85～1.15之间则认为基质效应不明显[18]。选取了白肋烟、香料烟和烤烟为基质效应研究对象，采用配制基质匹配标准溶液以及优化色谱-质谱条件减少基质效应。通过基质匹配标准曲线的斜率与纯溶剂配制标准曲线的斜率之比进行评价。具体结果见表4。从上表可以看出，不同烟叶基质效应不同，其中DMDC基质效应最严重，为了能够定量测定 DTCs化合物，最好选择相同样品的基质配置基质工作曲线，以消除基质影响。

表4不同烟叶样品基质效应情况

2.3.4重复性和重现性称取0.5g某一不含二硫代氨基甲酸酯的烤烟样品6 份，分别加标使DTCs提取液浓度约为15.0μg/mL，按照1.5的步骤处理，在等同操作条件下，用LC-MS/MS测定DTCs含量，计算日内RSD值。按照相同方法分3天进行检测，计算日间RSD值。结果见表5。从表5可见，各DTCs的日内RSD为11.33～16.80％，日间RSD为5.84～ 6.54％，表明重现性较好。

表5重复性和重现性

注：表中数值为六次测定结果的相对偏差

2.3.5回收率称取0.5g某一不含二硫代氨基甲酸酯的烤烟样品，加入DTCs，使得提取液浓度分别为3.0、6.0、15.0μg/mL，进行回收率实验，每个浓度平行进行3次，得到DTCs的回收率，见表6。表6可知，DTCs的回收率为84.5％～103.5％，平均/回收率87.6％～97.7％说明建立的分析方法回收率较好，符合农残检测方法的要求，准确可靠。

表6回收塞

3.结果与讨论

针对建立测定烟草中DTCs的的LC-MS/MS法进行了方法学验证研究，结果显示：

(1)日内RSD均小于RSD为2.62％～6.60％，连续对DTCs测定的RSD均小于6.60％，表明方法具有较好的重复性和重现性。

(2)该方法的检出限2.3～5.2μg/kg；定量限为5.2～17.3μg/kg。检出限和定量限较低，表明该方法具有较高的灵敏度。

(3)DTCs回收率均在84.5％～103.5％范围内，说明建立的分析方法回收率较好。

综上所述，本方法可用于同时测定烟叶中DTCs，具有灵敏、准确等特点，满足烟叶中DTCs含量的检测要求。

4.结论

本方法可用于同时测定烟叶中DTCs，具有灵敏、准确等特点，满足烟叶中DTCs含量的检测要求。

Claims (1)

1.一种测定烟草中三类二硫代氨基甲酸酯残留量的方法，其特征在于，包括以下骤：

(1)称取研磨后的待测烟草样品0.5g于50mL离心管中，加入10mL碱性提取液，涡旋1min，转速13000rpm离心5min，上清液经0.23μm滤膜过滤后，进行LC-MS/MS测定；所述的碱性提取液：称取0.6058g L-半胱氨酸和1.8612g EDTA-Na2，用450mL水溶解，用2mol/L的NaOH调至pH 12.0，再用水定容至500mL，配成pH 12.0的10mmol/L EDTA与10mmol/L L-半胱氨酸的混合液；

(2)LC-MS/MS测定条件

色谱条件流动相：Waters UPLC BEH HILIC色谱柱(50mm×2.1mm×2.8μm)；流动相A为乙腈，B为10mmol/L氨水，流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样体积：5μL；梯度洗脱：4分钟内乙腈由15％线性降至5％，保持0.1分钟，切换为乙腈15％，保持至7分钟；

质谱条件：电喷雾电离源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：500V；干燥气温度：300℃；干燥气流量：6L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流量：10L/min；毛细管电压：4000V；

表1：三类DTC的多反应监测定性、定量离子对以及质谱相关参数

(3)标准溶液的配制

单一标准储备液：按照各标准物质的纯度计算，分别称取纯物质福美铁、福美双、福美锌、代森锌、代森锰、丙森锌和代森福美锌各5mg，用所述的碱性提取液分别溶解并定容至100mL，超声加速溶解5分钟，分别配成7种纯物质的、浓度为50mg/L的单一标准储备液；

单一调试溶液：分别将配制好的各单一标准储备液用所述的碱性提取液稀释，分别得到7种纯物质的、浓度为1mg/L的单一调试溶液；

标准工作曲线单一母液：按照各标准物质的纯度计算，分别称取纯物质福美双、代森锌和丙森锌各100mg，用所述的碱性提取液分别溶解并定容至100mL，超声加速溶解5分钟，分别配成3种纯物质的、浓度为1000mg/L的标准工作曲线单一母液；

标准工作溶液：分别从3种纯物质的标准工作曲线单一母液中各移取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL，分别置于10mL容量瓶中，用所述的碱性提取液分别定容，分别得到3种DTCs浓度为20μg/mL～100μg/mL的系列标准工作溶液；用液相色谱串联质谱测定，得到DTCs的积分峰面积作为纵坐标，根据各标准物质的纯度，计算实际浓度，作为横坐标，制作标准曲线；

基质匹配标准工作溶液：分别称取0.5g研磨后的不含二硫代氨基甲酸酯的烤烟或白肋烟或香料烟粉末各五份，分别置于50mL聚四氟乙烯离心管中，分别加入3种标准工作曲线单一母液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL，然后分别加入9.8mL、9.6mL、9.4mL、9.2mL、9.0mL所述的碱性提取液，涡旋1分钟，转速13000rpm离心5分钟，上清液经0.23μm滤膜过滤后，用液相色谱-质谱/质谱测定；

(4)定性结果：

在相同实验条件先测定标准溶液和样品溶液，然后按如下方法定性判定样品目标物：

1)样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中的某种组分峰的保留时间基本一致，并且所选择的离子对的质荷比一致；

2)样品离子对相对丰度与浓度接近标准工作溶液的离子对的相对丰度进行比较时，相对偏差不超过表2规定的范围；满足以上两点，则能判定样品中存在该组分；

表2定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差

(5)定量结果：

相同实验条件下测定标准溶液和样品溶液，制作标准曲线，样品中DTCs的含量用外标法定量，按公式(1)进行计算：

式中：X-样品中某种组分的含量，单位μg/g；

c_i-由标准曲线得出的样品中某种组分的浓度，单位μg/mL；

c₀-空白溶液浓度，单位μg/mL；

V-样品最终定容体积，单位mL；

m-样品质量，单位g；

(6)结果计算：根据样品溶液待测定量离子的丰度，从标准曲线上读取结果，扣除空白后得到样品的三类二硫代氨基甲酸酯含量，以两次平行测定结果的算术平均值作为最终测定结果，两次平行测定结果的相对平均偏差应小于10％。