CN109553647A - 代谢产物的提取方法、添加剂 - Google Patents
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Abstract
一种代谢产物的提取方法、添加剂，属于农产品加工领域。提取方法包括：提供待提取物。该待提取物包括具有第一目标产物的第一液体部分物质、具有第二目标产物的固体部分物质。采用微孔树脂对第一液体部分物质执行第一纯化操作，获得具有第一目标产物的第二液体部分物质，并通过液相色谱的方式对第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质。以上提取方法可以实现对蛹虫草中的代谢产物较完全的提取。
Description
技术领域
本发明涉及农产品加工领域，具体而言，涉及一种代谢产物的提取方法、添加剂。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris L.Link)又称蛹草、北虫草、北冬虫夏草。其与冬虫夏草同属异种，是一种药食两用真菌具有丰富的营养价值和药用价值。现代药理学研究证实：蛹虫草具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗疲劳、抗糖尿病和提高机体免疫力等多种药理活性。其药用和食用价值可与冬虫夏草相媲美，因此现在普遍采用人工栽培的蛹虫草来替代天然的冬虫夏草。
蛹虫草中含有腺苷、虫草素、虫草酸、多糖等多种生物活性成分。
其中，腺苷对心血管***和肌体的许多其它***及组织均有生理作用，也是2015版《中国药典》中检验冬虫夏草中的指标性成分。
虫草素又被称为虫草菌素、蛹虫草素、3'-脱氧腺苷。研究者对虫草素在抗炎及调节免疫、抗肿瘤、降糖降脂、抗病原微生物、抗衰老及神经保护等方面开展了大量研究，并取得了突破性进展。
虫草酸能抑制各种病菌的成长，可预防与治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞、长期衰竭。
因此，从蛹虫草中将各种物质进行高效提取是很有必要的。然而，目前的一些提取方法中多强调对单一组分的高提取率，而对于蛹虫草中多组分的同时提取手段却研究甚少。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明提供了一种代谢产物的提取方法、添加剂，以部分或全部地改善、甚至解决以上问题。
本发明是这样实现的：
在第一方面，本发明的示例提供了一种代谢产物的提取方法。
示例中所提供的提取方法所针对的代谢产物包括由蛹虫草产生的第一目标物质和第二目标物质。换言之，提取方法用于从蛹虫草中提取目标物质。
提取方法包括：
提供待提取物，待提取物包括具有第一目标产物的第一液体部分物质、具有第二目标产物的固体部分物质。
其中，待提取物通过蛹虫草依次进行浸提、醇沉、固液分离获得。并且浸提包括水提蛹虫草以获得水提液，醇沉包括醇提水提液以获得醇提液，醇提液经过固液分离获得第一液体部分物质、固体部分物质。
采用微孔树脂对第一液体部分物质执行第一纯化操作，获得具有第一目标产物的第二液体部分物质，并通过液相色谱的方式对第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质。
通过利用水提醇沉法将代谢产物从蛹虫草中分离，然后再结合微孔树脂与液相色谱联用进行纯化，可将代谢产物中的多糖蛋白等大分子与小分了成分分离，起到为蛹虫草次生代谢产物除杂的作用。应用此方法可以有效锁定目标代谢产物，直接快速有效分离，提高分离效率，降低分离成本，得到高纯度蛹虫草代谢产物纯品。
结合第一方面，在本发明的第一方面的第一种可能的实施方式的一些可选示例中，第二目标产物为蛹虫草多糖，由固体部分物质获得第二目标产物的方法包括：冷冻干燥。
可选地，第二目标产物为海藻糖。
可选地，冷冻干燥的条件包括真空度为0.06～0.09MPa，温度为45～65℃。
由于涉及水提醇沉，固体部分物质含有部分的液体如水提中的水以及醇沉中的醇。因此，通过固液分离将固体部分物质中的液体去除，有利于提高第二目标产品的含量，也利于进行保存或用作其他处理。
结合第一方面，在本发明的第一方面的第二种可能的实施方式的一些可选示例中，第一目标物质包括虫草素、腺苷、虫草酸，由第三液体部分物质获得第一目标产物的方法包括：使第一目标物质从第三液体部分物质中析出。
可选地，使第一目标物质从第三液体部分物质中析出的方法包括结晶以及可选的重结晶。
从液体中结晶以获得固体物质是一种易于实施的手段，且易于进行规模化化操作。同时，结晶处理的能耗小，晶体物质的纯度高。进一步地，通过对结晶产生的晶体进行重结晶能够进一步提高纯度、减少杂质。
结合第一方面，在本发明的第一方面的第三种可能的实施方式的一些可选示例中，水提蛹虫草以获得水提液的方法包括：
对被粉碎为颗粒物的蛹虫草且分散在水中得到的分散液进行加热。
水提是通过溶剂提取固体原料中某一或某类成分的提取分离操作，或称固液萃取。其中，溶剂被选择采用为水。即用水作溶剂，将药材(蛹虫草)加热一定的时间以提取其所含成分。水提具有溶剂价格成本可控，原料环保的优势。
通过将蛹虫草粉碎为颗粒物，更易于其浸透于水中，从而使目标中的物质更易于进入水中，有利于提高蛹虫草的利用率，减少目标物质的损失，提高目标物质的得率。
结合第一方面的第三种可能的实施方式，在本发明的第一方面的第四种可能的实施方式的一些可选示例中，分散液的料液比为1千克/5～50升，通过加热分散液的温度达到50～85℃。
可选地，每次提取时间为1～3小时，提取次数为1～3次。
由于浸提过程中涉及到固液传质过程，主要是涉及目标物质从固体的蛹虫草中转移至液相水中的传质过程，且其包括湿润、渗透、解吸、溶解及扩散等阶段。而在示例中，温度和料液比能够在相对更大的程度上对目标物质的浸出起到相当的影响。
结合第一方面，在本发明的第一方面的第五种可能的实施方式的一些可选示例中，醇提水提液以获得醇提液的方法包括：将提取剂与水提液混合以产生沉淀。
可选地，在醇提水提液以获得醇提液的步骤中，提取剂包括乙醇，且提取剂的用量为水提液的体积的2～4倍。
可选地，提取剂的用量为水提液的体积的3倍；
可选地，由固体部分物质制得第二目标产物之前，对固体部分物质进行至少一次再分离，再分离的方法包括用水作为分散剂将固体部分物质分散，并随后进行醇提，再通过离心获得第二目标产物的含量提高的固体物质；
可选地，当对固体部分物质进行两次及以上的再分离操作时，在每次再分离操作中的离心步骤所产生的上清液被合并入第一液体部分物质。
如前述，本发明示例中，通过水提醇沉的方式获得目标物质。其中，目标物质为水溶性，其能够在水中较好地溶解。然后通过在水提也中加入醇，考虑到目标物质与醇之间以及水与醇之间的溶解性差异，可以使目标物质在竞争性溶解过程中以沉淀的方式被析出，从而达到以固体物与液体分离开。
结合第一方面，在本发明的第一方面的第六种可能的实施方式的一些可选示例中，采用微孔树脂对第一液体部分物质执行第一纯化操作的方法包括：
利用微孔树脂吸附第一液体部分物质，并采用洗脱剂进行洗脱以收集第二液体部分物质。
可选地，第一液体部分物质的用量为微孔树脂的重量的1～5％，且第一液体部分物质与微孔树脂混合以进行吸附的时间为30～120分钟；
可选地，采用洗脱剂进行洗脱的方法以收集第二液体部分物质的方法包括：依次进行的第一洗脱步骤和第二洗脱步骤。
可选地，对洗脱液进行浓缩，在第一洗脱步骤中的洗脱剂为水；在第二洗脱步骤中的洗脱剂为甲醇水溶液。
可选地，在第二洗脱步骤中，洗脱剂的流速为1～2BV/h且收集的洗脱液的收集量为微孔树脂的体积的2～7倍。
由于蛹虫草中含有多种代谢物质，通过微孔树脂可以较好(更彻底)地去除固体杂质。另外，为了排除其他的杂质，通过分步进行洗脱的方式，并对应收集相应的洗脱液，以便能够获得目标物质。进一步地，通过对洗脱条件的控制，可以获得更好的洗脱效率。
结合第一方面，在本发明的第一方面的第七种可能的实施方式的一些可选示例中，通过液相色谱的方式对第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质的步骤中，液相色谱采用的是反相色谱柱，优选为C18反相色谱柱。
反向色谱柱是固定相的极性小于流动相的极性。其可以采用极性更大的液体作为流动相，相应地也可采用非极性的介质作为固定相。C18柱是一种常用的通用性色谱柱。反向色谱柱具有性能稳定、分离效率高，可分离物质种类多样的优势。
结合第一方面的第七种可能的实施方式，在本发明的第一方面的第八种可能的实施方式的一些可选示例中，采用反向色谱住通过液相色谱的方式对第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质的步骤中，液相色谱的操作条件包括：流动相的流速为30～100mL/min，检测波长为254nm，流动相为乙腈水溶液，且乙腈的体积含量为95～98％。
通过对液相色谱操作条件的选择—如流动相组成、流动相速度以及检测波长—可以实现更好的分离效率、分离准确性，以便提高分离获得物质的纯度、收率等。
在第二方面，本发明的示例提供了一种添加剂。
该添加剂用于保健品和功能食品。添加剂包括根据前述的代谢产物的提取方法获得第一目标物质和/或第二目标物质。
有益效果：
本发明实施例提供的提取方法能够将蛹虫草中的更多种类的代谢产物一并提取，且提取率可以被较好地提高。通过将微孔树脂和液相色谱连用，可以更准确和高效地将蛹虫草中的多糖、蛋白与其他的杂质分离开，提高分离的产物的纯度和得率。并且，由于蛹虫草代谢产物活性高，可以应用于医药食品等相关领域，也可以直接作为保健品和功能食品的添加剂，具有广阔的市场发展前景。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下针对本发明实施例的代谢产物的提取方法、添加剂进行具体说明：
由于蛹虫草的众多药学和医学方面的应用潜力，关于蛹虫草的研究报道较多。而其关键在于获得蛹虫草中的各种活性物质。相关技术中，对蛹虫草中的各种活性物质的提取主要是从其代谢产物获得的。
发明人确信：当前，蛹虫草活性物质的提取研究主要集中于对某一特定组分的获得。由于蛹虫草中各种活性物质的多样性，在更理想的条件下获得纯度高、收率高的单一组分是期望达到的。然而，基于实际的需要，我们希望能够以更好的方式对蛹虫草活性物质进行提取。其中一个主要的任务和难点在于，对蛹虫草中多种活性物质的同步提取和分离。
目前，发明人已知的一些手段并不能较好地实现以上任务和期望。有鉴于此，本发明示例中给出了一种对蛹虫草中多种活性物质的提取方法。
提取方法所要操作的对象是蛹虫草的代谢产物。并且，该代谢产物包括由蛹虫草产生的第一目标物质和第二目标物质。鉴于，蛹虫草的代谢产物的组分/成分的复杂性，通常可以根据需要选择适当的条件来控制所期望获得的物质。例如，将在后文被提及的蛹虫草多糖、虫草素、腺苷、虫草酸。其中，蛹虫草多糖为第二目标物质。虫草素、腺苷、虫草酸为第一目标物质。
应当理解的是，前述的第二目标物质可以是单一物质(如海藻糖)，也可以是多种物质(如海藻糖和多缩戊糖，该多种物质通常可以是具有相同或相似性能—如水溶性、油溶性、极性等—的物质)。第一目标物质可以是单一物质(如虫草素)，也可以是多种物质(如腺苷和虫草酸)。换言之，第一目标物质和第二目标物质均可以是单组分的物质，可以是多组分的组合物的物质。
提取方法包括：
步骤S101、提供待提取物。
待提取物是一种粗产品，且是从蛹虫草中获得。该待提取物包括具有第一目标产物的第一液体部分物质、具有第二目标产物的固体部分物质。应当指出的是，前述的第一液体部分物质是指的其绝大部分为液体，但是也不排除其中混杂有部分的固体或难溶物。相应地，固体部分物质是指的其绝大部分为固体，但是也不排除其中混杂有部分的液体。例如，在溶液中进行聚沉操作以进行固液分离时，液体和固体分层后，液体中可能会存在部分的沉淀物，相应地，固体中也可能会存在部分的液体。
另外，前述的待提取物可以是预先制作的，也可以是现场直接制作获得。换言之，待提取物可以被作为原料直接购得或作为预制原料。
考虑到，蛹虫草中各种活性物质的稳定性，以及保存的难度和复杂性等方面考虑，可以根据实际的生产需要选择对待提取物的使用方式。
示例中，待提取物可以通过蛹虫草依次进行浸提、醇沉、固液分离获得。
其中，浸提包括水提蛹虫草以获得水提液。水提蛹虫草以获得水提液的方法包括：对被粉碎为颗粒物的蛹虫草且分散在水中得到的分散液进行加热。
为了便于进行处理，蛹虫草可以选择新收集的。当然，蛹虫草也可以采集干燥品。进一步，基于后续处理需要，将蛹虫草进行粉碎处理可以获得好的水提效果。粉碎的方法可以是通过粉碎机械进行如研磨、切割等方式进行。或者，在另一些示例中，通过低温辅助粉碎。即将蛹虫草采用低温介质进行冷却至冻结状态，然后在冻结状态下进行粉碎。应当注意的是，冻结过程中的温度不宜过低(如零下摄氏一百度以内即可)，否则会造成部分的活性物质结构的破坏。
另外，由于蛹虫草包括虫体部分(子实体)和草体部分(菌丝体)。而蛹虫草的代谢产物在两者中的成分和分布可能存在差异，因此，通过将两者分别处理可能取得更好的期望产品纯度和得率。并且，由于将两者进行分别独立的提取操作，可以减少更多种的杂质的干扰，从而有利于目标物质的获得。
考虑到水中杂质可能引起的对分离、纯化的不利影响，水以较高的纯度被使用。一些示例中，水提可选择使用去离子水、纯净水、蒸馏水、反渗水、超纯水。
进一步地，通过对水提的用水量及温度的选择可以实现适当的提取效果。分散液的料液比为1千克/5～50升，通过加热分散液的温度达到50～85℃。料液比即是指的蛹虫草颗粒物与水之间的比例。即1千克蛹虫草颗粒物采用5～50升的水。
在其他的一些示例中，分散液的料液比也可以是1千克/12升，或1千克/16升，或1千克/21升，或1千克/25升，或1千克/30升，或1千克/37升，或1千克/46升。相似地，分散液的温度也可以是53℃，或56℃，或62℃，或67℃，或72℃，或79℃，或83℃。分散液的料液比和温度可以进行自由的选择配合，本发明不对其做具体限定。例如，分散液可以是料液比为1千克/21升、温度为82℃；或者，料液比为1千克/10升、温度为51℃。分散液也可以是料液比为1千克/48升、温度为80℃；或者，料液比为1千克/49升、温度为50℃。一些研究中，尝试通过超声波辅助提取，但是，由于超声波萃取常常会要求特定的超声波频率和强度(如功率)，且往往只能针对相对单一组分的物质。对于需要对多组分进行提取时，超声波的选择和控制是一个有待考虑的问题。
一般地，温度增加可以对所期望提取获得目标物质在水中的溶解度提高是有益的。然而，温度太高也可能导致目标物质的发生不可逆的非期望转变。相似地，通过调整料液比(如增加用水比例)可以使分散液能够溶解更多的目标物质。当用水比例太高时可能对后续的纯化步骤带来不利。例如水难易在相对简单、容易实施的温和条件下被去除。
可选地，在本发明的其他示例中，可以对提取时间进行控制以便平衡提取效率和提成的彻底程度。例如，每次提取时间为1～3小时，提取次数为1～3次。
通过以上水提处理后，期望获得目标物质(第一目标物质和第二目标物质)相对较易且彻底地分散在水提液中，然后通过醇提水提液以获得醇提液。醇提水提液以获得醇提液的方法包括：将提取剂与水提液混合以产生沉淀。
由于不同的蛹虫草中活性物质在水、醇中的溶解性差异，且水与醇(如乙醇)具有相对较好的相容性，因此，当将醇加入到水提液中时，不同物质之间的溶解性差异导致部分的活性物质以沉淀的形式析出，而另一部分的活性物质则可以继续存在与水层中。
可选地，在醇提水提液以获得醇提液的步骤中，提取剂可以采用乙醇(可以是乙醇提及含量为95％的酒精)，且提取剂的用量为水提液的体积的2～4倍，也可以是3倍。
如正前述，通过醇沉之后，水提液在外观上大致呈现分层的情况。如此，分别收集水层和沉淀层可以实现活性物质的分离。其中，水层作为第一液体部分物质，且其中具有第一目标物质；沉淀层作为固体部分物质，且其中具有第二目标物质。
根据蛹虫草代谢产物的分析可以知晓，其中水层中的第一目标物质主要包括虫草素、腺苷、虫草酸。沉淀层中的第二目标物质主要是蛹虫草多糖；例如，第二目标产物也可以是海藻糖。
显然地，由于沉淀层中的第二目标物质主要为蛹虫草多糖，而各种物质性质和功能相接近，因此可以作为独立的物质被一并分离，而可以选择直接提取。当然，为了获得相对更纯，且成分更单一的组分，也可以对蛹虫草多糖进行再分离、纯化。
承上述，为了获得第二目标物质，可以对固体部分物质进行干燥或脱水处理(其中可能混杂的醇也可同时被去除)。例如，由固体部分物质获得第二目标产物的方法包括：冷冻干燥。可选地，冷冻干燥的条件包括真空度为0.06～0.09MPa，温度为45～65℃。冷冻干燥通过将有待干燥的物质在低于自然条件的于气压下进行适当的加热来实现液体的去除。通过减压，液体的沸点降低(更易受热而气化)，从而可以在相对更低的温度通过加热而去除。如此，可以避免高沸点液体通过加热蒸发时所需的高温，进而避免活性物质受损。
另外，为了避免固体部分物质中可能存在的其他活性成分(如第一目标物质)的损失，可以对该固体部分物质进行回收处理。例如，由固体部分物质制得第二目标产物之前，对固体部分物质进行至少一次再分离。再分离的方法包括用水作为分散剂将固体部分物质分散，并随后进行醇提，再通过离心获得第二目标产物的含量提高的固体物质。进一步，当对固体部分物质进行两次及以上的再分离操作时，在每次再分离操作中的离心步骤所产生的上清液被合并入第一液体部分物质。
如上述，蛹虫草经过一次水提、醇沉、分离获得第一液体部分物质和固体部分物质。然而，容易理解的是，仅仅通过依次操作得到的第一液体部分物质可能还存在一定量的第一目标物质，固体部分物质中也可能存在一定量的第二目标物质。因此，通过多次的水提、醇沉、分离操作，且将每次的液体部分混合，固体部分混合，可以使第一目标物质和第二目标物质更彻底地相互分离开。
步骤S102、对待提取物中获得具有第一目标物质的第一液体部分物质进行纯化。
如步骤S01中所提及的，第一目标物质通常是多种性质和结构明显差异的物质，如虫草素、腺苷、虫草酸(与之相对的是，第二目标物质通常是多种性质和结构相近的物质，蛹虫草多糖、海藻糖)。因此，有必要对第一目标物质中的各种物质进行分离。
示例中，第一液体部分物质通过两部纯化操作处理，而使其中的各种活性物质获得了相对较好的分离。
例如，第一液体部分物质通过两部纯化操作处理中的第一步骤包括：采用微孔树脂对第一液体部分物质执行第一纯化操作，获得具有第一目标产物的第二液体部分物质。
示例中，采用微孔树脂对第一液体部分物质执行第一纯化操作的方法包括：利用微孔树脂吸附第一液体部分物质，并采用洗脱剂进行洗脱以收集第二液体部分物质。
作为一种可选示例，第一液体部分物质的用量为微孔树脂的重量的1～5％(也可以是1.3％、2％、2.7％、3％、4％等)，且第一液体部分物质与微孔树脂混合以进行吸附的时间为30～120分钟(也可以是33分钟、41分钟、58分钟、62分钟、75分钟、89分钟等)。微孔树脂的吸附时间不易太长，避免其解吸难度增大。微孔树脂可选择使用如下型号：NS4205，DAC-HB50、DAC-HB80、DAC-HB100、DAC-HB150、DAC-HB200。
采用洗脱剂进行洗脱的方法以收集第二液体部分物质的方法包括：依次进行的第一洗脱步骤和第二洗脱步骤，并且收集第二洗脱步骤的洗脱液以及可选地对洗脱液进行浓缩。
在第一洗脱步骤中的洗脱剂为水。第一洗脱步骤可以出去部分的杂质，避免随后的脱吸目标物质时带来污染和干燥。
在第二洗脱步骤中的洗脱剂为甲醇水溶液。进一步，在第二洗脱步骤中，洗脱剂的流速可选为1～2BV/h且收集的洗脱液的收集量为微孔树脂的体积的2～7倍。
承前述，第一液体部分物质通过两部纯化操作处理中的第二步骤包括：通过液相色谱的方式对第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质。
可选地，通过液相色谱的方式对第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质的步骤中，液相色谱采用的是反相色谱柱，优选为C18反相色谱柱(具体型号例如dubhe C18、hedera C18、megres C18、Benetnach C18、phecdaC18、Xmide C18、XCharge C18，ODS C18等)。液相色谱的操作条件可以是：流动相的流速为30～100mL/min，检测波长为254nm，流动相为乙腈水溶液，且乙腈的体积含量为95～98％。
通过液相色谱可以将各中活性物质进行较清晰和明确的区分，以便获得各种纯度较高且组分相对单一(期望提取的目标物质的含量较高)的物至。在液相色谱中获得物质是不同的液体混合物。液体混合物包括流动相和溶解于流动相中的对应一种或多种物质。
其中，由第三液体部分物质(如前述的多个液体混合物)获得第一目标产物的方法包括：使第一目标物质从第三液体部分物质中析出。可选地，使第一目标物质从第三液体部分物质中析出的方法包括结晶以及可选的重结晶。结晶可以通过对温度的选择来实现，由于不同物质在某一液体(可以是混合物)中的溶解度是与温度相关联的。因此，将第三液体部分物质置于不同的温度下使其通过溶解、结晶方式可以获得更高纯度的物质。
例如，当虫草素、腺苷、虫草酸三者分别存在于不同的液体混合物时，为了分别获得纯度更高的虫草素、腺苷、虫草酸时，通过使对应的液体混合物进行结晶和重结晶的方式使其各自以固体方式从液体中析出而获得。
以上所提及的活性物质主要是指蛹虫草中各种具有生物医药学活性的物质，如腺苷、虫草素、虫草酸、多糖等。
经过实验验证，利用上述提供的提取方法，在一些具体的示例中，提取的产物中的蛹虫草多糖含量可达66％，虫草素，腺苷，虫草酸，海藻糖的含量均可达到98％以上。通过微孔树脂与高效制备液相色谱联用技术大大提高了蛹虫草中代谢产物的提取率，极大的提高了有效次生代谢产物的纯度。具有生产成本低，技术成熟，周期短等特点。
据发明人所知，蛹虫草代谢产物具有多种药理活性，具有潜在和巨大的药用和食用价值。有鉴于此，现有的蛹虫草提取物通过直接服用的方式来使用，本发明的示例中，提供了基于上述的提取自蛹虫草的代谢产物的添加剂。这样的添加剂可以用于保健品和功能食品。添加剂的成分可根据需要调整。换言之，添加剂包括第一目标物质。或者，添加剂包括第二目标物质。或者，添加剂包括第一目标物质和第二目标物质。
添加剂可以作为粉剂或颗粒剂等方式被制备和使用。
以下结合实施例对本发明的代谢产物的提取方法、添加剂作进一步的详细描述。
实施例1
(1)蛹虫草中代谢产物的提取：蛹虫草原料2kg粉碎，过40目筛，然后加入去离子水提取，再将提取液过滤，制得蛹虫草代谢产物提取液；提取条件为料液比为1kg：5L、温度为50℃、提取时间为1、提取次数为1次。
(2)蛹虫草中代谢产物的分离：
将蛹虫草代谢产物提取液浓缩，得蛹虫草代谢产物提取液浓缩液，加入其3倍量95％的乙醇，沉淀24h，离心，收集沉淀层和收集上清液。将离心部分再溶解于去离子水，重复上述操作1次，收集沉淀层和上清液，合并上清液。将离心部分冷冻干燥，得蛹虫草多糖提取物。
用旋转蒸发仪将上清液浓缩，将蛹虫草次级代谢产物浓缩部分上MCI微孔树脂，上样量为填料量的1％；吸附30分钟，用去离子水洗脱，再用60％甲醇水溶液为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱液为2倍树脂柱体积，流速1BV/h，收集60％甲醇洗脱液。浓缩，得蛹虫草次生代谢产物浓缩液。减压干燥条件均是指真空度为0.06MPa，温度为45℃。
(3)蛹虫草中代谢产物的纯化：
将上述次生代谢产物浓缩液，上制备液相色谱(DAC-HB50)，收集各次生代谢产物馏分，结晶与重结晶。制备色相色谱条件是乙腈：水(2％：98％)，流速30mL/min，检测波长254nm，色谱柱为C18反相色谱柱(megres C18)。结晶与重结晶溶剂为乙醇、水。
蛹虫草多糖得率43.98％，含量65.40％，次生代谢产物得率14.80％，虫草素，腺苷，虫草酸，海藻糖的含量均可达到98％以上。
实施例2
(1)蛹虫草中代谢产物的提取：蛹虫草原料4kg粉碎，过120目筛，然后加入去离子水提取，再将提取液过滤，制得蛹虫草代谢产物提取液；提取条件为料液比为1kg：50L、温度为85℃、提取时间为3h、提取次数为3次。
(2)蛹虫草中代谢产物的分离：
将蛹虫草代谢产物提取液浓缩，得蛹虫草代谢产物提取液浓缩液，加入其3倍量95％的乙醇，沉淀48h，离心，收集沉淀层和收集上清液。将离心部分再溶解于去离子水，重复上述操作3次，收集沉淀层和上清液，合并上清液。将离心部分冷冻干燥，得蛹虫草多糖提取物。
用旋转蒸发仪将上清液浓缩，将蛹虫草次级代谢产物浓缩部分上MCI微孔树脂，上样量为填料量的5％；吸附120分钟，用去离子水洗脱，再用60％甲醇水溶液为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱液为7倍树脂柱体积，流速2BV/h，收集60％甲醇洗脱液。浓缩，得蛹虫草次生代谢产物浓缩液。减压干燥条件均是指真空度为0.06MPa，温度为45℃。
(3)蛹虫草中代谢产物的纯化：
将上述次生代谢产物浓缩液，上制备液相色谱(DAC-HB80)，收集各次生代谢产物馏分，结晶与重结晶。制备色相色谱条件是乙腈：水(5％：95％)，流速100mL/min，检测波长254nm，色谱柱为C18反相色谱柱(dubhe C18)。结晶与重结晶溶剂为乙醇，甲醇，水。
蛹虫草多糖得率47.3％，含量65.82％，次生代谢产物得率17.39％，虫草素，腺苷，虫草酸，海藻糖的含量均可达到98％以上。
实施例3
(1)蛹虫草中代谢产物的提取：蛹虫草原料10kg粉碎，过60目筛，然后加入去离子水提取，再将提取液过滤，制得蛹虫草代谢产物提取液；提取条件为料液比为1kg：20L、温度为75℃、提取时间为2h、提取次数为2次。
(2)蛹虫草中代谢产物的分离：
将蛹虫草代谢产物提取液浓缩，得蛹虫草代谢产物提取液浓缩液，加入其3倍量95％的乙醇，沉淀36h，离心，收集沉淀层和收集上清液。将离心部分再溶解于去离子水，重复上述操作2次，收集沉淀层和上清液，合并上清液。将离心部分冷冻干燥，得蛹虫草多糖提取物。
用旋转蒸发仪将上清液浓缩，将蛹虫草次级代谢产物浓缩部分上MCI微孔树脂，上样量为填料量的2％；吸附60分钟，用去离子水洗脱，再用60％甲醇水溶液为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱液为4倍树脂柱体积，流速1BV/h，收集60％甲醇洗脱液。浓缩，得蛹虫草次生代谢产物浓缩液。减压干燥条件均是指真空度为0.06MPa，温度为45℃。
(3)蛹虫草中代谢产物的纯化：
将上述次生代谢产物浓缩液，上制备液相色谱(DAC-HB80)，收集各次生代谢产物馏分，结晶与重结晶。制备色相色谱条件是乙腈：水(3％：97％)，流速100mL/min，检测波长254nm，色谱柱为C18反相色谱柱(dubhe C18)。结晶与重结晶溶剂为乙醇，甲醇，水。蛹虫草多糖得率47.34％，含量64.13％，次生代谢产物得率15.22％，虫草素，腺苷，虫草酸，海藻糖的含量均可达到98％以上。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种代谢产物的提取方法，所述代谢产物包括由蛹虫草产生的第一目标物质和第二目标物质，其特征在于，所述提取方法包括：
提供待提取物，所述待提取物包括具有第一目标产物的第一液体部分物质、具有第二目标产物的固体部分物质；
其中，所述待提取物通过蛹虫草依次进行浸提、醇沉、固液分离获得，所述浸提包括水提所述蛹虫草以获得水提液，所述醇沉包括醇提所述水提液以获得醇提液，所述醇提液经过固液分离获得所述第一液体部分物质、所述固体部分物质；
采用微孔树脂对所述第一液体部分物质执行第一纯化操作，获得具有所述第一目标产物的第二液体部分物质，并通过液相色谱的方式对所述第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质。
2.根据权利要求1所述的代谢产物的提取方法，其特征在于，所述第二目标产物为蛹虫草多糖，由所述固体部分物质获得所述第二目标产物的方法包括：冷冻干燥，优选地，所述第二目标产物为海藻糖；进一步优选地，冷冻干燥的条件包括真空度为0.06～0.09MPa，温度为45～65℃。
3.根据权利要求1所述的代谢产物的提取方法，其特征在于，所述第一目标物质包括虫草素、腺苷、虫草酸，由所述第三液体部分物质获得所述第一目标产物的方法包括：使所述第一目标物质从所述第三液体部分物质中析出；优选地，使所述第一目标物质从所述第三液体部分物质中析出的方法包括结晶以及可选的重结晶。
4.根据权利要求1所述的代谢产物的提取方法，其特征在于，水提所述蛹虫草以获得水提液的方法包括：
对被粉碎为颗粒物的蛹虫草且分散在水中得到的分散液进行加热。
5.根据权利要求4所述的代谢产物的提取方法，其特征在于，所述分散液的料液比为1千克/5～50升，通过加热所述分散液的温度达到50～85℃；优选地，每次提取时间为1～3小时，提取次数为1～3次。
6.根据权利要求1所述的代谢产物的提取方法，其特征在于，醇提所述水提液以获得醇提液的方法包括：将提取剂与所述水提液混合以产生沉淀；
优选地，在醇提所述水提液以获得醇提液的步骤中，提取剂包括乙醇，且提取剂的用量为所述水提液的体积的2～4倍，优选为3倍；
更优选地，由所述固体部分物质制得所述第二目标产物之前，对所述固体部分物质进行至少一次再分离，所述再分离的方法包括用水作为分散剂将固体部分物质分散，并随后进行醇提，再通过离心获得所述第二目标产物的含量提高的固体物质；
进一步优选地，当对所述固体部分物质进行两次及以上的再分离操作时，在每次再分离操作中的离心步骤所产生的上清液被合并入所述第一液体部分物质。
7.根据权利要求1所述的代谢产物的提取方法，其特征在于，采用微孔树脂对所述第一液体部分物质执行第一纯化操作的方法包括：
利用微孔树脂吸附所述第一液体部分物质，并采用洗脱剂进行洗脱以收集所述第二液体部分物质；
优选地，第一液体部分物质的用量为微孔树脂的重量的1～5％，且第一液体部分物质与微孔树脂混合以进行吸附的时间为30～120分钟；
更优选地，采用洗脱剂进行洗脱的方法以收集所述第二液体部分物质的方法包括：依次进行的第一洗脱步骤和第二洗脱步骤，并且收集所述第二洗脱步骤的洗脱液以及可选地对所述洗脱液进行浓缩，在所述第一洗脱步骤中的洗脱剂为水；在所述第二洗脱步骤中的洗脱剂为甲醇水溶液；
进一步优选地，在所述第二洗脱步骤中，洗脱剂的流速为1～2BV/h且收集的洗脱液的收集量为微孔树脂的体积的2～7倍。
8.根据权利要求1所述的代谢产物的提取方法，其特征在于，通过液相色谱的方式对所述第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质的步骤中，液相色谱采用的是反相色谱柱，优选为C18反相色谱柱。
9.根据权利要求8所述的代谢产物的提取方法，其特征在于，采用反向色谱住通过液相色谱的方式对所述第二液体部分物质执行第二纯化操作以获得具有第一目标物质的第三液体部分物质的步骤中，液相色谱的操作条件包括：流动相的流速为30～100mL/min，检测波长为254nm，所述流动相为乙腈水溶液，且乙腈的体积含量为95～98％。
10.一种添加剂，用于保健品和功能食品，其特征在于，所述添加剂包括根据权利要求1～9中任意一项所述的代谢产物的提取方法获得所述第一目标物质和/或所述第二目标物质。
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