CN108689852B - 一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其包括以下步骤：将新鲜平卧菊三七叶烘干、粉碎，得到粉料；粉料与乙醇溶液混合，采用超声波提取得到提取液，然后离心、过滤、浓缩得浑浊的深绿色浓缩液；浓缩液中加入澄清剂进行澄清；澄清的浓缩液中加入改性二氧化硅微球进行脱色，浓缩液的颜色由深绿色变成淡青色；淡青色浓缩液中加入无水乙醇进行除糖；除糖后的回收液经中高压色谱柱吸附；吸附完全后，分级解吸，浓缩、干燥后得到绿原酸成品干粉和异绿原酸混合物。本发明工艺简单，操作方便，成本低，无有害溶剂，产物纯度高，且纯化、除杂效果更好，节能环保，生产安全性高，适合工业化生产具有良好的市场前景。

Description

一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，尤其是涉及一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法。
背景技术
平卧菊三七，又名蔓三七、蛇接骨、续命草、神仙草，味辛、微苦、性凉，为多年生草本药食两用植物。民间利用其通经活络，消肿止痛，消炎止咳，治疗跌打损伤，支气管肺炎、肺结核等。现代生物化学和医学研究证明，蔓三七对人体既有营养价值，又有药理作用。2009年上半年，中国疾病预防控制中心、国家食品质量监督检验中心、中国食品发酵工业研究院等有关单位完成了平卧菊三七毒理学检验、卫生学检验和多种成分的检验，结论是：无毒、无致畸影响；其有效成份具有通经活络，消炎止咳，散淤消肿，活血生肌等功效；能延缓衰老、激活免疫细胞、改善机体免疫功能、提高人体免疫力，增强人体的新陈代谢并对记忆障碍有一定改善作用；具有降血压、降血糖和预防慢性肾病、抑制乙型肝炎的显著效果；对预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病等有一定的疗效；还具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志贺样毒素细胞的活性。平卧菊三七能够广泛利用于食品医药工业、日用化工等领域，是一种极具潜力和高经济价值的药食两用植物。
绿原酸是由咖啡酸（Caffeic acid）与奎尼酸（Quinic acid，1-羟基六氢没食子酸）生成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，化学名3-O-咖啡酰奎尼酸，是植物在有氧呼吸过程中由磷酸戊糖途径(HMS)的中间产物合成的一种苯丙素类物质，其包括绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莱蓟素等十多种同分异构体，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、降糖、清除自由基等药理作用，是保健品、食品、药品及化妆品的重要原料，因此从植物中提取分离绿原酸具有重要的意义。目前，提取纯化绿原酸的传统方法主要有水石灰乳法、水提醇沉法、乙酸乙酯提取法、稀酸提取、单相水提取法等。这些方法单一使用，绿原酸总收率为2.5%左右，纯度在40%以下，很难达到95%以上的纯度。目前，绿原酸的生产主要存在以下问题：能够提取高纯度绿原酸的方法不适用于工业化大规模生产，适于工业化大规模生产的方法得到的绿原酸的纯度又较低，不能满足高纯度绿原酸的市场需求。
异绿原酸是二咖啡酰奎宁酸类化合物，是一类由奎宁酸与数目不等的咖啡酸通过酯化反应缩合而成的有机酸类天然成分，包括异绿原酸A（3,5-二咖啡酰奎尼酸）、异绿原酸B（3，4-二咖啡酰奎尼酸）、异绿原酸C（4，5-二咖啡酰奎尼酸），广泛存在于植物界中。研究发现，异绿原酸具有重要生物活性，极具临床应用价值。主要的药理活性有抗氧化、抑制氧酶、抗动脉粥样硬化、抗动脉粥样硬化、抗血小板活性物质、调血脂、抗炎、抗病毒、抑制组胺释放、抗纤维化、抑制平滑肌收缩等作用。异绿原酸药理活性较好，但是制备高纯度单体的难度较大，这就制约了其药理药效的深入研究。
目前，在对平卧菊三七叶中绿原酸和异绿原酸的研究方面，大部分研究人员都是得到蔓三七绿原酸提取物，而异绿原酸混在绿原酸提取物中，没有使它们得到有效的分离。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其工艺流程简单，易于操作，生产成本低，产品产率高、质量好。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其包括以下步骤：
步骤1、原料预处理：将新鲜平卧菊三七叶放入热风干燥箱中烘干至含水量为14～18%，再进行粉碎，过60～80目筛，得到平卧菊三七叶粉料；
步骤2、提取：将步骤1得到的平卧菊三七叶粉料与体积浓度50～60%的乙醇溶液按质量比1：12～15混合，调节溶液pH值为2.5～3.0，采用超声波提取得到提取液，然后离心分离，得上清液，将上清液浓缩至原体积的1/5～1/3，得浑浊的深绿色浓缩液；
步骤3、澄清：向步骤2得到的浓缩液中加入澄清剂，澄清剂用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的0.5～1.0%，静置2～4h，离心，得澄清的浓缩液；
步骤4、脱色：向步骤3得到的澄清浓缩液中加入改性二氧化硅微球，在温度为35～40℃ 的条件下脱色1～2h，改性二氧化硅微球用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的0.3～0.6%，浓缩液的颜色由深绿色变成淡青色，色素清除率达到了95～98%；
上述改性二氧化硅微球的制备方法，其包括以下步骤：
Figure 977407DEST_PATH_IMAGE001
（a）、将粒径为1～2μm的微米级二氧化硅微球在100～130℃下真空干燥3～5h，再采用质量分数10～30%碱性溶液进行活化处理，然后用纯水冲洗至中性；其中，碱性溶液为三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠或叔丁醇钾；
（b）、步骤a中洗至中性后的溶液与氯代乙酸乙酯在体积浓度50～70%的乙醇溶液中混合搅拌2～3h，继续加入乙二胺，室温下反应5～6h，反应结束后将溶液离心收集产物，再用干燥的二氯甲烷多次洗涤收集后的产物，常温真空干燥过夜，即可得到改性二氧化硅微球；所述的微米级二氧化硅微球、碱性溶液、氯代乙酸乙酯、乙二胺用量比例为：3～8g：0.5～1g：2～6mL：2～6mL；
步骤5、除糖：向步骤4得到的浓缩液中加入无水乙醇，浓缩液与无水乙醇体积比为1：1～1.5，静置3～4小时，用200～300目纱布过滤，回收乙醇后得到回收液；
步骤6、上柱吸附：步骤5得到的回收液先用盐酸调节pH值为 2～3，然后溶液经中高压色谱柱吸附，中高压色谱柱使用的填料为HPD600大孔树脂；
步骤7、分级解吸：吸附完全后，先用蒸馏水对中高压色谱柱进行洗涤，洗至无色后，先用体积浓度30～40%的乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的绿原酸被乙醇溶解而获得绿原酸洗脱液，再用体积浓度60～80%的乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的异绿原酸被乙醇溶解而获得异绿原酸洗脱液；对含有乙醇的绿原酸洗脱液进行乙醇回收、减压浓缩、冷冻干燥后，得到绿原酸成品干粉，HPLC跟踪监测纯度，绿原酸纯度为38.5～42.3%；
步骤8、异绿原酸混合物制备：对含有乙醇的异绿原酸洗脱液进行乙醇回收后，用体积浓度30%的甲醇水溶液溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱柱进行色谱分离，再依次采用体积浓度30～40%、50～70%的甲醇梯度洗脱，TLC薄层色谱跟踪检测；合并体积浓度50～70%的甲醇梯度洗脱液，减压浓缩后，得到异绿原酸混合物成品，HPLC检测纯度，异绿原酸混合物纯度为92.5～94.6%。
进一步地，上述的步骤1中，新鲜平卧菊三七叶在70～75℃的热风干燥箱中烘干1.5～2.0h。
进一步地，上述的步骤2中，超声波提取的条件为：超声功率400～500W，间隙时间为2～5s，提取温度为40～50℃，超声时间为45～60min。
进一步地，上述的步骤3中，澄清剂为明胶类、海藻酸钠、甲壳素及其衍生物、壳聚糖、101果汁澄清剂、聚凝净、ZTC天然澄清剂、丹宁、蛋清中的一种。
进一步地，上述的步骤4中，制备改性二氧化硅微球所用的原料微米级二氧化硅微球采用改良的Stöber法合成，其包括以下步骤：
步骤a1、10～15 g 去离子水溶解 0.03～0.06g KCl后，依次加入 75～80g 无水乙醇、4～7mL NH3•H2O 和 2～5g正硅酸乙酯，混合搅拌均匀至溶液呈乳白色；
步骤a2、4～8 g正硅酸乙酯分散于25～33g 无水乙醇中，溶解 4～8 g正硅酸乙酯，超声分散后得到的混合溶液在常温下加入步骤a1中得到的乳白色溶液中，混合反应1～2h，反应结束后，收集产物；
步骤a3、得到的产物用水和乙醇多次清洗，至上清液完全澄清，再将清洗后的产物干燥得到微米级二氧化硅微球。
由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
绿原酸和异绿原酸都属多羟基酚酸，分子结构中含有羟基、酚羧基等基团，整个分子呈中等偏弱极性；由于绿原酸在六元环上的4'位多一个羟基，使得它二者在HPD600大孔树脂吸附力不同，因此本发明采用HPD600大孔树脂的优良分离效果进行分级解吸，解吸时，采用不同浓度的乙醇进行洗脱，可使平卧菊三七中的绿原酸和异绿原酸得到有效的分离。
本发明从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其浓缩液中加入的澄清剂能够进行有效除杂，有利于进一步提高纯度，降低浊度。
本发明从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其利用后期接枝的方法使微米级二氧化硅微球表面的硅羟基和氯代乙酸乙酯作为桥梁，将乙二胺键合在二氧化硅微球表面上，制备出具有高度规则的多孔道结构、孔道大小能自由调节、吸附目标分子容量高、吸脱附速率快且同时具有大分子协同效应的吸附材料，增大了水溶性色素的吸附性能。
本发明从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其工艺简单，操作方便，成本低，无有害溶剂，产物纯度高，且纯化、除杂效果更好，节能环保，生产安全性高，适合工业化生产具有良好的市场前景。
具体实施方式
图1是30%乙醇溶液洗脱液的HPLC色谱图；
图2是80%乙醇溶液洗脱液的HPLC色谱图。
具体实施方式
参照附图和以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
首先制备改性二氧化硅微球，以备用；制备改性二氧化硅微球的微米级二氧化硅微球为市售的已知原料。
一种改性二氧化硅微球的制备方法，其包括以下具体步骤：
（a）、将粒径为1μm的微米级二氧化硅微球5g在130℃下真空干燥3h，再采用0.5g质量分数30%的氢氧化钠进行处理使其表面活性基团硅羟基活化，然后用纯水冲洗至中性；
（b）、步骤a中洗至中性后的溶液加入3ml氯代乙酸乙酯，在体积浓度70%乙醇溶液中混合搅拌2h，继续加入3ml乙二胺，室温下反应5h，反应结束后将溶液离心收集产物，再用干燥的二氯甲烷以每次5ml用量洗涤收集后的产物3次，以除去剩余的乙二胺和反应生成的HCl，常温真空干燥过夜，即可得到改性二氧化硅微球。
一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其包括以下具体步骤：
步骤1、将新鲜平卧菊三七叶放入热风干燥箱中进行烘干，温度为75℃，时间为1.5h，至含水量为14%，再进行粉碎，过60目筛，得到平卧菊三七叶粉料；
步骤2、将步骤1得到的平卧菊三七叶粉料与体积浓度50%乙醇溶液按质量比1：12混合，调节溶液pH值为2.5，采用超声波提取得到提取液，超声功率500W，间隙时间为2s，提取温度为40℃，超声时间为45min，然后离心分离，得上清液，将上清液浓缩至原体积的1/3，得浑浊的深绿色浓缩液；
步骤3、向步骤2得到的浓缩液中加入壳聚糖，壳聚糖用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的1.0%，静置2h，离心，得澄清的浓缩液；
步骤4、向步骤3得到的澄清浓缩液中加入改性二氧化硅微球，在温度为40℃ 的条件下脱色1.5h，改性二氧化硅微球用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的0.6%，浓缩液的颜色由深绿色变成淡青色；
步骤5、向步骤4得到的浓缩液中加入无水乙醇，浓缩液与无水乙醇体积比为1：1.5，静置4小时，用200目纱布过滤，回收乙醇后得到回收液；
步骤6、步骤5得到的回收液先用盐酸调节pH值为3，然后溶液经中高压色谱柱吸附，中高压色谱柱使用的填料为HPD600大孔树脂；
步骤7、分级解吸：吸附完全后，先用蒸馏水对中高压色谱柱进行洗涤，洗至无色后，先用体积浓度30%乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的绿原酸被乙醇溶解而获得绿原酸洗脱液，再用体积浓度80%乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的异绿原酸被乙醇溶解而获得异绿原酸洗脱液；对含有乙醇的绿原酸洗脱液进行乙醇回收、减压浓缩、冷冻干燥后，得到绿原酸成品干粉，HPLC跟踪监测纯度，绿原酸纯度为38.5%；
步骤8、异绿原酸混合物制备：对含有乙醇的异绿原酸洗脱液进行乙醇回收后，用体积浓度30%甲醇水溶液溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱柱进行色谱分离，再依次采用体积浓度30%、40%、50%、60%、70%甲醇梯度洗脱，TLC薄层色谱跟踪检测；合并体积浓度50～70%甲醇梯度洗脱液，减压浓缩后，得到异绿原酸混合物成品，HPLC检测纯度，异绿原酸混合物纯度为90.5%。
实施例2
首先制备改性二氧化硅微球，以备用；制备改性二氧化硅微球的微米级二氧化硅微球为使用改良的Stöber法所合成，其包括以下具体步骤：
步骤a1、10 g 去离子水溶解 0.03g KCl，将KCl溶液转移到 250 mL 三口烧瓶中后，依次加入75g 无水乙醇，4mL NH3•H2O 和2g正硅酸乙酯，混合搅拌均匀至溶液呈乳白色；
步骤a2、4g正硅酸乙酯分散于25g 无水乙醇中，超声分散后得到的混合溶液在常温下以 0.1 mL/min 的速度滴加到步骤a1中的三口烧瓶中的乳白色溶液中，3 h 滴加完成后，继续反应 1 h，反应结束后，收集产物；
步骤a3、得到的产物用水和乙醇多次清洗，至上清液完全澄清，再将清洗后的产物置于鼓风干燥箱中干燥得到微米级二氧化硅微球。
一种改性二氧化硅微球的制备方法，其包括以下具体步骤：
（a）、将制得的粒径为1.5μm的微米级二氧化硅微球6g在120℃下真空干燥4h，再采用0.8g质量分数20%的氢氧化钾进行处理使其表面活性基团硅羟基活化，然后用纯水冲洗至中性；
（b）、步骤a中洗至中性后的溶液加入4ml氯代乙酸乙酯，在体积浓度70%乙醇溶液中混合搅拌2.5h，继续加入4.5ml乙二胺，室温下反应5.5h，反应结束后将溶液离心收集产物，再用干燥的二氯甲烷以每次5ml用量洗涤收集后的产物5次，以除去剩余的乙二胺和反应生成的HCl，常温真空干燥过夜，即可得到改性二氧化硅微球。
一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其包括以下具体步骤：
步骤1、将新鲜平卧菊三七叶放入热风干燥箱中进行烘干，温度为73℃，时间为1.8h，至含水量为16%，再进行粉碎，过60目筛，得到平卧菊三七叶粉料；
步骤2、将步骤1得到的平卧菊三七叶粉料与体积浓度55%乙醇溶液按质量比1：13.5混合，调节溶液pH值为2.7，采用超声波提取得到提取液，超声功率450W，间隙时间为3s，提取温度为45℃，超声时间为50min，然后离心分离，得上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4，得浑浊的深绿色浓缩液；
步骤3、向步骤2得到的浓缩液中加入101果汁澄清剂，101果汁澄清剂用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的0.8%，静置3h，离心，得澄清的浓缩液；
步骤4、向步骤3得到的澄清浓缩液中加入制备得到的改性二氧化硅微球，在温度为35℃ 的条件下脱色2.0h，改性二氧化硅微球用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的0.45%，浓缩液的颜色由深绿色变成淡青色；
步骤5、向步骤4得到的浓缩液中加入无水乙醇，浓缩液与无水乙醇体积比为1：1.2，静置3.5小时，用300目纱布过滤，回收乙醇后得到回收液；
步骤6、步骤5得到的回收液先用盐酸调节pH值为2.5，然后溶液经中高压色谱柱吸附，中高压色谱柱使用的填料为HPD600大孔树脂；
步骤7、分级解吸：吸附完全后，先用蒸馏水对中高压色谱柱进行洗涤，洗至无色后，先用体积浓度35%乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的绿原酸被乙醇溶解而获得绿原酸洗脱液，再用体积浓度70%乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的异绿原酸被乙醇溶解而获得异绿原酸洗脱液；对含有乙醇的绿原酸洗脱液进行乙醇回收、减压浓缩、冷冻干燥后，得到绿原酸成品干粉，HPLC跟踪监测纯度，绿原酸含量为40.6%；
步骤8、异绿原酸混合物制备：对含有乙醇的异绿原酸洗脱液进行乙醇回收后，用体积浓度30%甲醇水溶液溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱柱进行色谱分离，再依次采用体积浓度30%、40%、50%、60%、70%甲醇梯度洗脱，TLC薄层色谱跟踪检测；合并体积浓度50～70%甲醇梯度洗脱液，减压浓缩后，得到异绿原酸混合物成品，HPLC检测纯度，异绿原酸混合物纯度为92.5%。
实施例3
首先制备改性二氧化硅微球，以备用；制备改性二氧化硅微球的微米级二氧化硅微球为使用改良的Stöber法所合成，其包括以下具体步骤：
步骤a1、15 g 去离子水溶解 0.06g KCl，将KCl溶液转移到 250 mL 三口烧瓶中后，依次加入80g 无水乙醇，7mL NH3•H2O 和5g正硅酸乙酯，混合搅拌均匀至溶液呈乳白色；
步骤a2、8g正硅酸乙酯分散于33g 无水乙醇中，超声分散后得到的混合溶液在常温下以0.3mL/min 的速度滴加到步骤a1中的三口烧瓶中的乳白色溶液中，3 h 滴加完成后，继续反应 1 h，反应结束后，收集产物；
步骤a3、得到的产物用水和乙醇多次清洗，至上清液完全澄清，再将清洗后的产物置于鼓风干燥箱中干燥得到微米级二氧化硅微球。
一种改性二氧化硅微球的制备方法，其包括以下步骤：
（a）、将粒径为2μm的微米级二氧化硅微球8g在100℃下真空干燥5h，再采用1g质量分数10%叔丁醇钾进行活化处理，然后用纯水冲洗至中性；
（b）、步骤a中洗至中性后的溶液加入6mL氯代乙酸乙酯在体积浓度50%乙醇溶液中混合搅拌3h，继续加入6mL乙二胺，室温下反应6h，反应结束后将溶液离心收集，再用干燥的二氯甲烷以每次5ml用量洗涤收集后的产物3次，以除去剩余的乙二胺和反应生成的HCl，常温真空干燥过夜，即可得到改性二氧化硅微球。
一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其包括以下具体步骤：
步骤1、将新鲜平卧菊三七叶放入热风干燥箱中进行烘干，温度为70℃，时间为2h，至含水量为18%，再进行粉碎，过80目筛，得到平卧菊三七叶粉料；
步骤2、将步骤1得到的平卧菊三七叶粉料与体积浓度50%乙醇溶液按质量比1：15混合，调节溶液pH值为3.0，采用超声波提取得到提取液，超声功率400W，间隙时间为5s，提取温度为50℃，超声时间为60min，然后离心分离，得上清液，将上清液浓缩至原体积的1/5，得浑浊的深绿色浓缩液；
步骤3、向步骤2得到的浓缩液中加入海藻酸钠，海藻酸钠用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的1.0%，静置4h，离心，得澄清的浓缩液；
步骤4、向步骤3得到的澄清浓缩液中加入制备得到的改性二氧化硅微球，在温度为35℃ 的条件下脱色1.0h，改性二氧化硅微球用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的0.6%，浓缩液的颜色由深绿色变成淡青色；
步骤5、向步骤4得到的浓缩液中加入无水乙醇，浓缩液与无水乙醇体积比为1：1.5，静置4小时，用300目纱布过滤，回收乙醇后得到回收液；
步骤6、步骤5得到的回收液先用盐酸调节pH值为3，然后溶液经中高压色谱柱吸附，中高压色谱柱使用的填料为HPD600大孔树脂；
步骤7、分级解吸：吸附完全后，先用蒸馏水对中高压色谱柱进行洗涤，洗至无色后，先用体积浓度40%乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的绿原酸被乙醇溶解而获得绿原酸洗脱液，再用体积浓度80%乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的异绿原酸被乙醇溶解而获得异绿原酸洗脱液；对含有乙醇的绿原酸洗脱液进行乙醇回收、减压浓缩、冷冻干燥后，得到绿原酸成品干粉，HPLC跟踪监测纯度，绿原酸含量为42.3%；
步骤8、异绿原酸混合物制备：对含有乙醇的异绿原酸洗脱液进行乙醇回收后，用体积浓度30%甲醇水溶液溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱柱进行色谱分离，再依次采用体积浓度30%、40%、50%、60%、70%甲醇梯度洗脱，TLC薄层色谱跟踪检测；合并体积浓度50～70%甲醇梯度洗脱液，减压浓缩后，得到异绿原酸混合物成品，HPLC检测纯度，异绿原酸混合物纯度为94.6%。
本发明从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其步骤7中，解吸时，采用不同浓度的乙醇进行洗脱，能够使平卧菊三七中的绿原酸和异绿原酸得到有效的分离。先用体积浓度30%～40%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，对洗脱液进行HPLC检测，主要含绿原酸A和少量异绿原酸B，结果见表1；图谱中出现了绿原酸和异绿原酸的峰，但它们的峰面积相差较大，如图1所示。
表1
Figure 903774DEST_PATH_IMAGE002
再用体积浓度80%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，对洗脱液进行HPLC检测，只含有异绿原酸B，结果见表2；图谱中只出现了异绿原酸B的峰，见图2所示。
表2
Figure 281928DEST_PATH_IMAGE004
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其特征是：其包括以下步骤：
步骤1、原料预处理：将新鲜平卧菊三七叶放入热风干燥箱中烘干至含水量为14～18%，再进行粉碎，过60～80目筛，得到平卧菊三七叶粉料；
步骤2、提取：将步骤1得到的平卧菊三七叶粉料与体积浓度50～60%乙醇溶液按质量比1：12～15混合，调节溶液pH值为2.5～3.0，采用超声波提取得到提取液，然后离心分离，得上清液，将上清液浓缩至原体积的1/5～1/3，得浑浊的深绿色浓缩液；
步骤3、澄清：向步骤2得到的浓缩液中加入澄清剂，澄清剂用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的0.5～1.0%，静置2～4h，离心，得澄清的浓缩液；
步骤4、脱色：向步骤3得到的澄清浓缩液中加入改性二氧化硅微球，在温度为35～40℃的条件下脱色1～2h，改性二氧化硅微球用量为干燥后平卧菊三七叶粉料质量的0.3～0.6%，浓缩液的颜色由深绿色变成淡青色；上述的改性二氧化硅微球的制备方法，其包括以下步骤：
（a）、将粒径为1～2μm的微米级二氧化硅微球在100～130℃下真空干燥3～5h，再采用质量分数10～30%碱性溶液进行活化处理，然后用纯水冲洗至中性；其中，碱性溶液为三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠或叔丁醇钾；
（b）、步骤a中洗至中性后的溶液与氯代乙酸乙酯在体积浓度50～70%乙醇溶液中混合搅拌2～3h，继续加入乙二胺，室温下反应5～6h，反应结束后将溶液离心收集产物，再用干燥的二氯甲烷多次洗涤收集后的产物，常温真空干燥过夜，即可得到改性二氧化硅微球；所述的微米级二氧化硅微球、碱性溶液、氯代乙酸乙酯、乙二胺用量比例为：3～8g：0.5～1g：2～6mL：2～6mL；
步骤5、除糖：向步骤4得到的浓缩液中加入无水乙醇，浓缩液与无水乙醇体积比为1：1～1.5，静置3～4小时，用200～300目纱布过滤，回收乙醇后得到回收液；
步骤6、上柱吸附：步骤5得到的回收液先用盐酸调节pH值为 2～3，然后溶液经中高压色谱柱吸附，中高压色谱柱使用的填料为HPD600大孔树脂；
步骤7、分级解吸：吸附完全后，先用蒸馏水对中高压色谱柱进行洗涤，洗至无色后，先用体积浓度30～40%乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的绿原酸被乙醇溶解而获得绿原酸洗脱液，再用体积浓度60～80%乙醇溶液进行洗脱，使HPD600大孔树脂中的异绿原酸被乙醇溶解而获得异绿原酸洗脱液；对含有乙醇的绿原酸洗脱液进行乙醇回收、减压浓缩、冷冻干燥后，得到绿原酸成品干粉，HPLC跟踪监测纯度，绿原酸纯度为38.5～42.3%；
步骤8、异绿原酸混合物制备：对含有乙醇的异绿原酸洗脱液进行乙醇回收后，用体积浓度30%甲醇水溶液溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱柱进行色谱分离，再依次采用体积浓度30～40%、50～70%甲醇梯度洗脱，TLC薄层色谱跟踪检测；合并体积浓度50～70%甲醇梯度洗脱液，减压浓缩后，得到异绿原酸混合物成品，HPLC检测纯度，异绿原酸混合物纯度为92.5～94.6%。
2.根据权利要求1所述的从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其特征是：其步骤1中，新鲜平卧菊三七叶在70～75℃的热风干燥箱中烘干1.5～2.0 h。
3.根据权利要求1所述的从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其特征是：其步骤2中，超声波提取的条件为：超声功率400～500W，间隙时间为2～5s，提取温度为40～50℃，超声时间为45～60min。
4.根据权利要求1所述的从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其特征是：其步骤3中，澄清剂为明胶类、海藻酸钠、甲壳素、壳聚糖、101果汁澄清剂、聚凝净、ZTC天然澄清剂、丹宁、蛋清中的一种。
5.根据权利要求1所述的从平卧菊三七中提取绿原酸和异绿原酸的方法，其特征是：其步骤4中，制备改性二氧化硅微球所用的原料微米级二氧化硅微球采用改良的Stöber法合成，其包括以下步骤：
步骤a1、10～15 g 去离子水溶解 0.03～0.06g KCl后，依次加入 75～80g 无水乙醇、4～7mL NH3•H2O 和 2～5g正硅酸乙酯，混合搅拌均匀至溶液呈乳白色；
步骤a2、4～8 g正硅酸乙酯分散于25～33g 无水乙醇中，溶解 4～8 g正硅酸乙酯，超声分散后得到的混合溶液在常温下加入步骤a1中得到的乳白色溶液中，混合反应1～2h，反应结束后，收集产物；
步骤a3、得到的产物用水和乙醇多次清洗，至上清液完全澄清，再将清洗后的产物干燥得到微米级二氧化硅微球。
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