CN109535209B - 一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法。将甜叶菊干叶加入乙醇浸泡，压滤，收集滤渣，滤液回收乙醇；将甜菊叶浆料通过高压喷雾机雾化，以乙醇和/或水作为溶媒，浸提出甜菊糖甙目标组份，过滤得到甜菊叶醇水提取液；所得甜菊叶醇水提取液通过陶瓷超滤膜，收集透过液；透过液再过陶瓷纳滤膜，获得提取物浓缩液；浓缩液通过反相填料层析柱纯化获得甜菊糖粗糖；或，粗糖再进一步纯化获得甜菊糖粗糖；纯化获得甜菊糖粗糖经凝胶色谱脱色获得RA粗糖，RA粗糖浓缩而后重结晶获得纯度97％以上高纯度RA。本发明工艺简单，成本可控，操作性强，产品纯度和收率高，甜菊糖苷的最终总收率95％以上，较现有传统工艺有明显优势。

Description

一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法

技术领域

本发明设涉及甜菊糖甙的方法，具体的说是一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法。

背景技术

甜菊糖是从甜叶菊的叶子中提取的含有8种成分的双萜糖甙的混合物，甜叶菊的叶子中含有8％～16％的甜菊糖甙，按照天然植物化学的划分，属于四环二萜糖甙类，其甜度为蔗糖的200～300倍，而热量仅为蔗糖的1/300，它以高甜度、低热量、安全无毒、纯天然等特点逐渐受到人们的青睐，广泛应用于食品、饮料、医药、日化工业等行业。在甜菊糖已知的9种糖甙中，各种成分的含量，口感和甜度各不相同，其中甜菊甙(stevioside)、莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷C(RC)的含量较高，共占90％以上。RA甜度最高，甜味特性也与蔗糖相接近，是一种具有高甜度、低热量、易溶解、耐热、稳定等特点的新型天然甜味剂。长期食用对肥胖、高血压、高血糖等疾病有保健治疗作用。

传统工艺中李玉秀等人报道了，用不同的醇溶液(甲醇、乙醇、乙醇-水)提取甜菊糖苷的方法。但传统的加热和回流方法能耗大，后续采用丙酮析晶，挥发性强，并且氧化铝柱层析分离纯化分离效果低，最终纯度仅为90％。

石任兵等公开了采用溶剂提取，硅胶柱层析、反相柱层析或Sephadex LH-20，重结晶的方法进行甜菊糖甙的分离纯化。但是由于传统的有机溶剂室温提取耗时长加热提取方法能耗大，超声和微波提取物料量小不适于工业化生产。由于柱层析之前的提取和纯化手段欠缺，柱层析上样时样品杂质较多导致最终RA的最高纯度只有90.80％。

邢飞等(CN 106046075 A)和董燕敏(CN105418703 A)公开了乙醇浸泡、***提取、大孔吸附树脂吸附分离甜菊糖的工艺路线。其中，主要技术缺陷在于引入毒性较大的有机溶剂***，对人员和环境造成很大危害。树脂利用度低、树脂、溶剂及水消耗量大、酸碱废水难治理，产品收率低。邢飞等进一步引入复合酶破壁、超临界萃取的工艺路线。其中，复合酶与超临界萃取成本较高不利于工业生产。

可见现有甜菊糖甙的水提取工艺，提取液杂质多，分离纯化困难；提取时间长，水耗及产生有机废水量大。传统的甜菊糖甙提取需加入一定量价格昂贵的防腐剂TG，造成分离困难，成本增加。提取液絮凝除杂工艺，采用化学絮凝，需加入絮凝剂，导致絮凝液含有大量的有色金属离子，需用离子交换树脂进行去除，使整个生产工艺过程繁琐，生产周期长，生产成本高。目前的树脂吸附分离甜菊糖主流工艺，树脂利用度低、树脂、溶剂及水消耗量大、酸碱废水难治理，产品收率低，已成为行业痛点。

发明内容

本发明目的在于提供一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法，将甜叶菊干叶加入乙醇浸泡，压滤，收集滤渣，滤液回收乙醇；将打浆后获得甜菊叶浆料通过高压喷雾机雾化成细小的雾滴，以乙醇和/或水作为溶媒，通过逆流接触方式浸提出甜菊糖甙目标组份，过滤得到甜菊叶醇水提取液；所得甜菊叶醇水提取液通过陶瓷超滤膜，收集透过液；透过液再过陶瓷纳滤膜，收集截留获得提取物浓缩液；浓缩液通过反相填料层析柱纯化获得甜菊糖粗糖；粗糖再进一步的亲水色谱纯化、凝胶色谱脱色获得RA粗糖，RA粗糖浓缩而后重结晶即获得纯度97％以上高纯度RA。

所述甜菊叶浆料为将去除砂土杂质、晾干后甜菊叶粉碎，甜叶菊碎叶在无水乙醇中反复浸泡，过滤后滤渣碎叶通过乙醇和/或水打浆，浆料待用。

所述甜叶菊碎叶在无水乙醇中反复浸泡为将甜叶菊干叶洗涤后粉碎，而后反复浸泡于无水乙醇中，浸泡后压滤，合并反复浸泡后压滤收集的浸泡滤渣，滤液回收乙醇套用；其中，每次浸泡过程中甜叶菊碎叶与无水乙醇料液比为1:1.5～20(质量比)，浸泡时间1～3h。

所述将打浆后获得甜菊叶浆料通过高压喷雾机，以乙醇和/或水作为溶媒，在室温下浸提20～60min，实现雾化成细小的雾滴，进而浸提出甜菊糖甙目标组份，过滤得到浸提液。

所述浸泡滤渣与乙醇和/或水的料液比为1:6-12(质量比)的比例混合打浆。其中，所述溶媒乙醇/水混合溶剂的浓度为30-70％(体积百分比)；提取温度为常温(25℃)。

所述浸提液依次经超滤膜和纳滤膜进行两级膜处理；其中，浸提液所过的超滤膜被截留分子量＞10kD(直径孔径10～50nm)；陶瓷钠滤膜为截留分子量0.2～1kD(孔径1～2nm)。

所述浓缩液通过反相填料层析柱进行梯度洗脱，洗脱液为醇-水体系，经HPLC测试收集含甜菊糖甙量在30-100wt％的洗脱组分，其中，将含甜菊糖甙量在30-80wt％(即，含糖甙量小于80％)的洗脱组分经纳滤膜浓缩，浓缩后溶解于乙醇-水体系中，溶解后经亲水色谱层析柱进行梯度洗脱，经HPLC测试收集含甜菊糖甙量在80-100wt％的洗脱组分，而后与上述反相填料层析柱收集的含甜菊糖甙量在80-100wt％的洗脱组分合并经纳滤浓缩，浓缩液过凝胶色谱柱脱色即得RA粗糖；所述反相填料层析柱的洗脱液中醇与水的体积0-10:10-0；所述亲水色谱层析的洗脱液为乙醇-水体系中乙醇与水的体积比为0-10:10-0；溶解洗脱组分的乙醇-水体系中乙醇与水的体积比为0-10:10-0。

所述纯化过程中浓缩液中的溶质与反相填料的质量比为1：5～1：80，溶质主要为甜菊糖总甙。

所述反相填料层析柱中填料为粒径在40～60μm的中低压层析柱填料；所述纯化过程中各步骤收集组分经纳滤膜浓缩所得乙醇回收套用。

所述中低压层析柱填料为硅胶键合C18填料、SKR系列硅胶、HP-Silica、Bio-C18、以聚丙烯酸酯为骨架的Uni PMM50-Carb、嘉众专用填料(35～100μm)、键合乙酸的PS-DVB填料等，

所述亲水色谱填料为Polar-Silica、Polar-100、Polar-Diol等，优选Polar-Silica(孔径40～60nm)；

所述凝胶脱色填料有G-型葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶等，优选Octyl琼脂糖凝胶。

所述RA粗糖与溶剂按体积比为1:8-1:10的比例混合，采用循环结晶法进行重结晶，所述溶剂氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水中的两种或两种以上的混合。

上述重结晶溶剂优选为90-95％的乙醇溶液，RA含量提升至97％以上，精制收率有所提高，缘于粗糖提取中对杂质的选择性去除彻底，增溶物质去除充分。

本发明所具有的优点：

本发明甜菊糖苷的提取纯化方法，首先采用乙醇预处理，先除去较低极性的杂质，降低了后续提取液的粘度，有助于后续膜过滤及色谱分离纯化；其次采用连续逆流常温高压雾化提取，提取时间由传统的20-60小时缩短到3-8小时，使得提取溶剂节省60％以上；此过程中由高压及醇和/或水提取，取消了传统水提工艺中有害防腐剂的添加，对产品的天然绿色安全提供了保证，同时大幅减少了浸提水用量，并减少了其他杂质成分的浸出、减轻了能耗和环保压力，提高分离，过滤的效率；而后通过色谱技术纯化，制备色谱技术选择性和分离效率高，生产周期和产品品质优于大孔吸附树脂，不需要树脂和酸碱液再生处理，减少大量的废水，凝胶填料用量少、上样量大、脱色效果好，可脱除掉绝大部分色素，成本较脱色大孔树脂优势明显。

本发明工艺简单，成本可控，操作性强，产品纯度和收率高，适合工厂生产，本发明工艺过程中将连续逆流提取和制备色谱分离相结合，大大提高目标物的收率和纯度；可直接得到高纯度RA(含量大于97％)，所得产品颜色浅，口感及水溶性好，甜菊糖苷的最终总收率95％以上，较现有传统工艺有明显优势。

附图说明

图1为本发明实施例提供的提取纯化流程图。

图2为本发明实施例提供的提取上样原液HPLC图。

图3为本发明实施例提供的水+10％甲醇洗脱液HPLC(GP-C18反相填料)图。

图4为本发明实施例提供的30％甲醇洗脱液HPLC(GP-C18反相填料)图。

图5为本发明实施例提供的70％甲醇洗脱液HPLC(GP-C18反相填料)图。

图6为本发明实施例提供的100％甲醇洗脱液HPLC(GP-C18反相填料)图。

图7为本发明实施例提供的70％乙醇洗脱液HPLC(Polar-Silica亲水色谱填料)图。

图8为本发明实施例提供的重结晶后RA HPLC图。

图9为本发明实施例提供的RA标准品HPLC图，其中，出峰时间7.5min。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。本实施例按质量份数计算，以1份质量晒干去除沙土等杂质后粉粹的甜菊叶碎叶为基准。

实施例1

一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖苷的工艺，包括如下步骤：

甜菊叶前处理：甜菊叶晾干后去除砂土等杂质粉碎，称取1份质量的甜菊叶碎叶；

浸泡预处理：将粉碎后的甜菊叶置于浸提罐中，加入1份质量的乙醇浸泡二次，每次1.5h，二次浸提液合并过滤，滤液蒸馏回收乙醇。

高压雾化连续逆流提取：实验采用连续逆流提取设备。滤渣加入适量的水分散打浆，制成混悬液，通过高压雾化器把料液分散成细小的液滴喷入逆流提取罐中，50％的乙醇水溶液在高位压力下从底部流入提取罐中，二者充分接触使提取进行完全，测试甜菊糖甙提取率为99％；其中，甜菊叶浆料与50％的乙醇水溶液的体积比例为1:8，高压喷雾机的压力为2-4MPa，流速200-250L/h，提取罐内提取温度为室温，提取时间30min。

两级膜过滤浓缩：离心分离浸提液和甜菊渣，浸提液过一级陶瓷超滤膜(50nm)，一级陶瓷膜进口压力为0.20MPa，出口压力为0.15MPa，过程平均通量100(L·m^-2·h^-1)左右；透过液过陶瓷纳滤膜,操作压力0.4Mpa，过程平均通量180(L·m^-2·h^-1)，透过液作为浸提溶剂回用，截留液进一步浓缩得到甜菊糖浓缩液。

反相色谱纯化：将上述浓缩液上样至预先用甲醇浸泡平衡过的装填有15g GP-C18反相色谱填料的玻璃层析柱，依次采用纯水、10％的甲醇水溶液(v/v)、30％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液、100％甲醇进行梯度洗脱，每份洗脱液用量20个柱体积，收集得到杂质流出液和粗糖流出液。经HPLC测试，纯水及10％甲醇洗脱液主要为杂质流出液(图3)，30％甲醇水溶液—100％甲醇洗脱液为粗糖流出液，收集这部分组分，如图4-6所示，其中70％甲醇水溶液洗脱液中甜菊糖甙STV、RA和RC的总归一含量达到89.2％，30％甲醇水溶液洗脱液三种糖甙含量达到68.7％，100％甲醇洗脱液三种糖甙含量达到80.4％，保留70％甲醇水溶液和100％甲醇洗脱液为目标物1,30％甲醇洗脱液为目标物2，保留目标物1经纳滤浓缩的浓缩物。

亲水色谱纯化、凝胶脱色：将上述粗品含糖甙量低的洗脱组分(即目标物2)经纳滤膜浓缩，浓缩后继续上样到亲水色谱填料Polar-Silica(粒径60μm)层析柱中，依次采用纯水、乙醇/水淋洗和洗脱，依次采用纯水、10％的乙醇水溶液、30％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、100％甲醇进行梯度洗脱每份洗脱液用量12个柱体积，收集70％的乙醇水溶液洗脱液，HPLC测试谱图如图7，STV、RA和RC的归一含量82.5％，洗脱液纳滤浓缩。

将上述经反向色谱纯化收集的目标物1浓缩物与亲水色谱70％乙醇水浓缩物获得组分分别过葡聚糖凝胶G-75，吸附脱色，以水作为洗脱液，脱色后接收液喷雾干燥，得到RA粗糖。

重结晶：将上述RA粗糖用90％的乙醇溶液进行重结晶，样品与溶剂比例为1:8(v/v)，HPLC检测谱图如图8，RA纯度97.3％，总收率78.9％。(质量的百分比)

实施例2

一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖苷的工艺，包括如下步骤：

甜叶菊前处理：甜菊叶晾干后去除砂土等杂质粉碎。

浸泡预处理：称取1份质量甜菊叶碎叶置于浸提罐中，按甜菊叶重量加入2份质量的食用乙醇，常温浸泡2h，离心过滤，滤液蒸馏回收乙醇，滤液测试固含量为1.6％，对乙醇浸提物HPLC测试甜菊糖总甙占0.18％(占甜菊叶重量)，乙醇浸泡提取只损失很少的甜菊糖甙(1.5％左右)，可浸提除掉鞣质、果胶、色素等杂质，有助于膜过滤。

高压雾化连续逆流提取：滤渣加入适量的50％乙醇溶液分散打浆，制成混悬液，通过高压雾化器把料液分散成细小的液滴喷入逆流提取罐中，50％的乙醇溶剂在高位压力下从底部流入提取罐中，二者充分接触使提取进行完全，溶质与溶剂的比例为1:6，高压喷雾机的压力为2-4MPa，流速200-250L/h，提取罐内提取温度为室温，测试甜菊糖甙提取率为98.8％。

两级膜过滤浓缩：离心分离浸提液和甜菊渣，浸提液过一级陶瓷超滤膜(50nm)，一级陶瓷膜进口压力为0.20MPa，出口压力为0.15MPa，过程平均通量100(L·m^-2·h^-1)左右；透过液过陶瓷纳滤膜,操作压力0.4Mpa，过程平均通量180(L·m^-2·h^-1)，透过液作为浸提溶剂回用，截留液进一步浓缩得到甜菊糖浓缩液。

反相色谱纯化：将上述浓缩液上样至预先用甲醇浸泡平衡过的装填有30g UniPMM50-Carb聚丙烯酸酯骨架微球反相色谱填料(载量120mg/g左右)的玻璃层析柱，依次采用纯水、10％乙醇水溶液(v/v)、20％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、100％乙醇进行梯度洗脱，每份洗脱液用量15个柱体积，收集得到杂质流出液和粗糖流出液。经HPLC测试，纯水、10％乙醇水溶液和20％乙醇水溶液洗脱液主要为杂质不含甜菊糖甙，40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液和100％乙醇洗脱液杂质较少，主要为目标糖甙组分，其中70％乙醇水溶液洗脱液中甜菊糖甙STV、RA和RC的总归一含量达到90.4％，40％乙醇水溶液、100％乙醇水溶液归一含量为68.9％，保留70％乙醇水溶液洗脱液为目标物1，40％乙醇水溶液和100％乙醇洗脱液为目标物2，保留目标物1经纳滤浓缩的浓缩物。

亲水色谱纯化、凝胶脱色：目标物2纳滤膜浓缩后，继续上样到亲水色谱填料Polar-Silica(粒径60μm)层析柱中，纯水、乙醇/水淋洗和洗脱，依次采用纯水、10％乙醇水溶液、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、100％乙醇进行梯度洗脱每份洗脱液用量15个柱体积，收集70％的乙醇水溶液洗脱液，HPLC测试RA归一含量94.5％，洗脱液纳滤浓缩。

目标物1浓缩物与亲水色谱70％乙醇水溶液浓缩物分别过葡聚糖凝胶G-15，吸附脱色，水洗脱液，脱色后接收液喷雾干燥，得到RA粗糖。

重结晶：将上述RA粗糖用93％的乙醇溶液进行重结晶，样品与溶剂体积比为1:10，HPLC检测RA纯度97.2％，总收率88.9％。

实施例3

一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖苷的工艺，包括如下步骤：

甜叶菊前处理：甜菊叶晾干后去除砂土等杂质粉碎。

浸泡预处理：称取1份质量甜菊叶碎叶置于浸提罐中，按甜菊叶重量加入5份质量的食用乙醇，常温浸泡2.5h，离心过滤，滤液蒸馏回收乙醇。

高压雾化连续逆流提取：甜菊滤渣加入适量的60％乙醇溶液分散打浆，制成混悬液，通过高压雾化器把料液分散成细小的液滴喷入逆流提取罐中，60％的乙醇溶剂在高位压力下从底部流入提取罐中，二者充分接触使提取完全，溶质与总溶剂的比例为1:10，高压喷雾机的压力为2-4MPa，流速200-250L/h，提取罐内提取温度为室温，测试甜菊糖甙提取率为99.2％。

两级膜过滤浓缩：离心分离浸提液和甜菊渣，浸提液过一级陶瓷超滤膜(50nm)，一级陶瓷膜进口压力为0.20MPa，出口压力为0.15MPa，过程平均通量100(L·m^-2·h^-1)左右；透过液过陶瓷纳滤膜,操作压力0.4Mpa，过程平均通量180(L·m^-2·h^-1)，透过液作为浸提溶剂回用，截留液进一步浓缩得到甜菊糖浓缩液。

反相色谱纯化：将上述浓缩液上样至预先用乙醇浸泡平衡过的装填有30g嘉众专用反相色谱填料(50μm)的玻璃层析柱，上样量按树脂量的12％，依次采用纯水、10％乙醇水溶液、70％的乙醇水溶液、100％乙醇进行梯度洗脱，每份洗脱液用量15个柱体积，收集得到杂质流出液和粗糖流出液。经HPLC测试，纯水、10％乙醇水溶液洗脱液主要为杂质，70％乙醇水溶液、100％乙醇洗脱液杂质较少，主要为目标糖甙组分，其中70％乙醇水溶液洗脱液中总甙归一含量达到87.5％，100％乙醇水溶液洗脱液中总甙归一含量达到92.5％，保留70％乙醇水溶液洗脱液和100％乙醇洗脱液为目标物。

亲水色谱纯化、凝胶脱色：目标洗脱液纳滤浓缩，过琼脂糖凝胶，吸附脱色，水洗脱液，脱色后接收液喷雾干燥，得到RA粗糖。

重结晶：将上述RA粗糖用95％的乙醇溶液进行重结晶，样品与溶剂比例为1:9，HPLC检测RA纯度97.0％，总收率91.2％。

实施例4

一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖苷的工艺，包括如下步骤：

甜叶菊前处理：甜菊叶晾干后去除砂土等杂质粉碎。

浸泡预处理：称取1份质量甜菊叶碎叶置于浸提罐中，用乙醇浸泡甜叶菊，料液比为1:1.5，浸泡时间1h。

高压雾化连续逆流提取：滤渣加入适量的30％乙醇溶液分散打浆，制成混悬液，通过高压雾化器把料液分散成细小的液滴喷入逆流提取罐中，30％的乙醇溶剂在高位压力下从底部流入提取罐中，二者充分接触使提取进行完全，料液比为1:6，提取温度为常温(25℃左右)；浸提时间20min。

两级膜过滤浓缩：离心分离浸提液和甜菊渣，浸提液过一级陶瓷超滤膜(50nm)，一级陶瓷膜进口压力为0.20MPa，出口压力为0.15MPa，过程平均通量100(L·m^-2·h^-1)左右；透过液过陶瓷纳滤膜,操作压力0.4Mpa，过程平均通量180(L·m^-2·h^-1)，透过液作为浸提溶剂回用，截留液进一步浓缩得到甜菊糖浓缩液。

反相色谱纯化：将上述浓缩液上样至预先用甲醇浸泡平衡过的装填有SKR系列硅胶反相色谱填料的玻璃层析柱，依次采用纯水、10％、20％、40％、70％的甲醇水溶液、100％甲醇水溶液进行梯度洗脱，每份洗脱液用量15个柱体积，收集得到杂质流出液和粗糖流出液。经HPLC测试，纯水、10％甲醇水溶液、20％甲醇水溶液洗脱液主要为杂质不含甜菊糖甙，40％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液、100％甲醇洗脱液杂质较少，主要为目标糖甙组分，其中70％甲醇水溶液洗脱液中甜菊糖甙STV、RA和RC的总归一含量达到93.6％，40％甲醇水溶液、100％甲醇水溶液归一含量为75.9％，保留70％甲醇水溶液洗脱液为目标物1，40％甲醇水溶液和100％甲醇洗脱液为目标物2，保留目标物1经纳滤浓缩的浓缩物。

亲水色谱纯化、凝胶脱色：目标物2纳滤膜浓缩后，继续上样到亲水色谱填料Polar-100层析柱中，依次采用纯水、20％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液、100％乙醇进行梯度洗脱，每份洗脱液用量15个柱体积，收集80％的乙醇洗脱液，HPLC测试RA归一含量98.7％，洗脱液纳滤浓缩。目标物1浓缩物与80％乙醇浓缩物分别过葡聚糖凝胶G-15，吸附脱色，水洗脱液，脱色后接收液喷雾干燥，得到RA粗糖。

重结晶：将上述RA粗糖用90％的乙醇溶液进行重结晶，样品与溶剂比例为1:8HPLC检测RA纯度99.3％，总收率95.6％。

实施例5

一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖苷的工艺，包括如下步骤：

甜叶菊前处理：甜菊叶晾干后去除砂土等杂质粉碎。

浸泡预处理：称取1份质量甜菊叶碎叶置于浸提罐中，用乙醇浸泡甜叶菊，料液比为1:20，浸泡时间3h。

高压雾化连续逆流提取：滤渣加入适量的70％乙醇溶液分散打浆，制成混悬液，通过高压雾化器把料液分散成细小的液滴喷入逆流提取罐中，70％的乙醇溶剂在高位压力下从底部流入提取罐中，二者充分接触使提取进行完全，料液比为1:12；提取温度为常温(25℃左右)；浸提时间60min。

两级膜过滤浓缩：离心分离浸提液和甜菊渣，浸提液过一级陶瓷超滤膜(50nm)，一级陶瓷膜进口压力为0.20MPa，出口压力为0.15MPa，过程平均通量100(L·m^-2·h^-1)左右；透过液过陶瓷纳滤膜,操作压力0.4Mpa，过程平均通量180(L·m^-2·h^-1)，透过液作为浸提溶剂回用，截留液进一步浓缩得到甜菊糖浓缩液。

反相色谱纯化：将上述浓缩液上样至预先用甲醇浸泡平衡过的装填有HP-Silica反相色谱填料的玻璃层析柱，依次采用纯水、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％的甲醇水溶液、100％甲醇进行梯度洗脱，每份洗脱液用量15个柱体积，收集得到杂质流出液和粗糖流出液。经HPLC测试，纯水、10％-30％甲醇洗脱液主要为杂质不含甜菊糖甙，40％-70％甲醇、甲醇洗脱液杂质较少，主要为目标糖甙组分，其中70％甲醇洗脱液中甜菊糖甙STV、RA和RC的总归一含量达到91.4％，保留70％甲醇洗脱液为目标物1。合并40％，50％，60％和100％甲醇水溶液，其甜菊糖甙STV、RA和RC的总归一含量达到71.4％，设为目标物2。

亲水色谱纯化、凝胶脱色：目标物2纳滤膜浓缩后，继续上样到亲水色谱填料Polar-100层析柱中，依次采用纯水、20％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液、100％乙醇进行梯度洗脱，每份洗脱液用量15个柱体积，收集80％的乙醇水溶液洗脱液，HPLC测试RA归一含量88.5％，洗脱液纳滤浓缩。目标物1浓缩物与70％乙醇水溶液浓缩物分别过葡聚糖凝胶G-15，吸附脱色，水洗脱液，脱色后接收液喷雾干燥，得到RA粗糖。

重结晶：将上述RA粗糖用95％的乙醇溶液进行重结晶，样品与溶剂比例为1:10，HPLC检测RA纯度97.4％，总收率87.6％。

综上可见本发明提取纯化方法，采用乙醇预处理，先除去较低极性的杂质，降低了后续提取液的粘度，有助于后续膜过滤及色谱分离纯化；采用连续逆流常温高压雾化提取，提取时间由传统的20-60小时缩短到3-8小时，提取溶剂节省60％以上；高压及醇水混合提取，取消了传统水提工艺中有害防腐剂的添加，对产品的天然绿色安全提供了保证，同时大幅减少了浸提水用量，同时减少了其他杂质成分的浸出，减轻了能耗和环保压力。制备色谱技术选择性和分离效率高，生产周期和产品品质优于大孔吸附树脂，不需要树脂和酸碱液再生处理，减少大量的废水，凝胶填料用量少、上样量大、脱色效果好，可脱除掉绝大部分色素，成本较脱色大孔树脂优势明显。本发明工艺简单，操作性强，产品纯度和收率高，适合工厂生产。本发明创造性的结合连续逆流提取，制备色谱分离，并通过大量实验，确定最终工艺参数，大大提高目标物的收率和纯度。从实施例1-5可以看出，实施例4的效果最好，充分说明本发明是需要通过大量实验后获得的最佳工艺参数。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，描述较为具体，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对本领域的技术人员来说，在不脱离本专利发明构思的情况下，可做若干变形和改进，这都属于本发明的保护范围，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法，其特征在于：将甜叶菊干叶加入乙醇浸泡，压滤，收集滤渣，滤液回收乙醇；将打浆后获得甜菊叶浆料通过高压喷雾机雾化成细小的雾滴，以乙醇和/或水作为溶媒，通过逆流接触方式浸提出甜菊糖甙目标组份，过滤得到甜菊叶醇水提取液；所得甜菊叶醇水提取液通过陶瓷超滤膜，收集透过液；透过液再过陶瓷纳滤膜，收集截留获得提取物浓缩液；浓缩液通过反相填料层析柱纯化获得甜菊糖粗糖；或，粗糖再进一步的亲水色谱纯化得进一步纯化获得甜菊糖粗糖；上述纯化获得甜菊糖粗糖经凝胶色谱脱色获得RA粗糖，RA粗糖浓缩而后重结晶即获得纯度97%以上RA；

所述甜菊叶浆料为将去除砂土杂质、晾干后甜菊叶粉碎，甜叶菊碎叶在无水乙醇中反复浸泡，过滤后滤渣碎叶通过乙醇和/或水打浆，浆料待用；

所述甜叶菊碎叶在无水乙醇中反复浸泡为将甜叶菊干叶洗涤后粉碎，而后反复浸泡于无水乙醇中，浸泡后压滤，合并反复浸泡后压滤收集的浸泡滤渣，滤液回收乙醇套用；其中，每次浸泡过程中甜叶菊碎叶与无水乙醇料液质量比为1:1.5～20，浸泡时间1～3 h；

所述将打浆后获得甜菊叶浆料通过高压喷雾机，以乙醇和/或水作为溶媒，在室温下浸提20～60 min，实现雾化成细小的雾滴，进而浸提出甜菊糖甙目标组份，过滤得到浸提液；

所述浸提液依次经超滤膜和纳滤膜进行两级膜处理；其中，浸提液所过的超滤膜被截留分子量＞10 kD，直径孔径10～50nm；陶瓷纳滤膜为截留分子量0.2～1 kD，孔径1～2 nm；

所述浓缩液通过反相填料层析柱进行梯度洗脱，洗脱液为醇-水体系，经HPLC测试收集含甜菊糖甙量在30-100wt%的洗脱组分，其中，将含甜菊糖甙量在30-80wt%的洗脱组分经纳滤膜浓缩，浓缩后溶解于乙醇-水体系中，溶解后经亲水色谱层析柱进行梯度洗脱，经HPLC测试收集含甜菊糖量在80-100wt%的洗脱组分，而后与上述反相填料层析柱收集的含甜菊糖甙量在80-100wt%的洗脱组分合并经纳滤浓缩，浓缩液过凝胶色谱柱脱色即得RA粗糖；所述反相填料层析柱的洗脱液中醇与水的体积比为 0-10:10-0；所述亲水色谱层析的洗脱液为乙醇-水体系中乙醇与水的体积比为0-10:10-0；溶解洗脱组分的乙醇-水体系中乙醇与水的体积比为0-10:10-0；

所述RA粗糖与溶剂按体积比为1:8-1:10的比例混合，采用循环结晶法进行重结晶，所述溶剂为氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水中的两种或两种以上的混合。

2.按权利要求1所述的从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法，其特征在于：所述浸泡滤渣与乙醇和/或水的料液质量比为1:6-12的比例混合打浆；

其中，所述溶媒乙醇/水混合溶剂的体积百分比为30-70%。

3.按权利要求1所述的从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的工艺方法，其特征在于：所述反相填料层析柱中填料为粒径在40～60 μm的中低压层析柱填料；所述纯化过程中各步骤收集组分经纳滤膜浓缩所得乙醇回收套用。

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