CN108795931A - 一种痰液微生物的快速提纯试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种痰液微生物的快速提纯试剂，包括液化液、细胞裂解液、核酸外切酶缓冲液；所述细胞裂解液含有胍盐和表面活性剂，所述胍盐在细胞裂解液中的浓度为1～3mol/L。本发明还提出所述痰液微生物的快速提纯试剂的应用。本发明提出的痰液微生物的快速提纯试剂，采用低浓度盐酸胍与表面活性剂及还原剂相结合，完全裂解人细胞(核)，细胞崩解导致基因组DNA释放到溶液中，大部分在离心获取细菌时而被除去，残余的游离DNA将被DNase进一步消化，而细菌由于细胞壁的保护不受影响或者影响很小。

Description

一种痰液微生物的快速提纯试剂及其应用

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种微生物的提纯试剂及应用。

背景技术

痰液中液体主要是由支气管粘膜上皮的分泌粘液的腺体和杯状细胞分泌的。正常情况下，杯状细胞和腺体分泌少量粘液覆盖在粘膜层表面，对粘膜起保护作用，可保持气管粘膜的湿润，以把吸入气管、支气管内的尘埃颗粒、细菌等粘附住，阻挡其进入肺组织深处，然后，再借助于纤毛柱状上皮的纤毛摆动，把它们排到气管上端的喉头部位，经口腔咯出。正常痰一般为无色透明，带有点粘性，略微粘稠，适量的痰液有助于滋润呼吸道，捕捉灰尘和微生物(粘液)。虽然任何咳出痰都可以被认为是异常的，但在没有任何呼吸***病理改变下也能咳出或吐出少量的痰。然而，在某些情况下，特别是与呼吸道发炎有关，痰量可能会产生过多。在这些病理病例中，痰的颜色、质地甚至气味都可能发生变化。

当气管、支气管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而发生炎症时，呼吸道的粘膜充血、水肿，大量炎性细胞浸润，血管扩张，渗出增加，粘膜层的杯状细胞和粘膜下层的腺体增生肥大，粘液分泌大量增多，有利于清除异物。粘液分泌过多，就加重了纤毛柱状上皮的负担，不利于粘液的排出，在细菌及其毒素的作用下，产生一些变性坏死组织细胞，潴留在支气管内，粘液和这些变性坏死的组织细胞就构成了痰，比正常痰来有两个特征：一是粘稠度更高，二是颜色也有可能由白色或灰色变为黄色、绿色、铁锈色或棕色，还也可能因为含有少量的血液，有血丝呈现。

根据痰液的粘稠度增加可以将痰简单分为有泡沫(浆液性)痰、粘液性痰和脓性痰。临床上根据吸痰过程中痰液在吸痰管玻璃接头处的性状及在玻璃管内壁的附着情况将痰液的粘稠度分为三度：1度：痰液如米汤或泡沫样，吸痰后玻璃接头内壁上无痰液滞留。2度：痰的外观较1度粘稠，吸痰后有少量痰液在玻璃接头内壁滞留，但容易被水冲净3度：痰的外观明显粘稠，呈黄色，吸痰管常因负压过大而塌陷，玻璃接头内壁上常滞留大量痰液且不易被水冲净。

痰液的粘稠度主要是由于痰中的酸性糖蛋白含量有关，由于糖蛋白分子依靠不同的键(如二硫键、氢键等)交叉联接在一起，形成一种凝胶网。痰液中的Ca²⁺含量高，可以增加粘稠度，显微镜下观察到的长纤维就是由这些粘多糖、黏蛋白构成。呼吸道感染时，由于大量炎症细胞的核破坏而产生的DNA被组蛋白及粘蛋白包裹，亦可使痰液的粘稠度显著提高，见于脓性痰，常呈粗平行纤维。

目前用于富集痰液微生物同时去除人细胞基因组DNA的化学方法及试剂很少，现有通过低渗方法裂解细胞富集微生物的方法富集细菌效果是不均匀的，大部分样品效率低下，而且见于口腔拭子、唾液样品，痰液中的大量高分子粘蛋白难溶于水，因此，未见该方法用于痰液微生物富集的报道。

发明内容

针对本领域存在的不足之处，本发明的目的之一是提出一种痰液微生物的快速提纯试剂。

本发明的第二个目的是提出所述痰液微生物的快速提纯试剂的应用。

实现本发明上述目的的技术方案为：

一种痰液微生物的快速提纯试剂，包括液化液、细胞(核)裂解液、核酸外切酶缓冲液；所述细胞裂解液含有胍盐和表面活性剂，所述胍盐的浓度细胞裂解液中的浓度为1～3mol/L。

其中，所述液化液中含有还原剂和pH值为7.6～8.0的磷酸盐缓冲溶液，所述还原剂为二硫苏糖醇、乙酰半胱氨酸，三(2-羧乙基)膦盐酸盐中的一种，还原剂的浓度为0.05～0.2g/100mL；每毫升核酸外切酶缓冲液中含有1～30单位的核酸外切酶，所述核酸外切酶为recombinant DNase I。

进一步地，所述液化液中还含有氯化钠和氯化钾，氯化钠和氯化钾浓度分别为0.5～1.0g/100mL和0～0.05g/100mL。

更进一步地，所述胍盐在细胞裂解液中的浓度为1～2mol/L。

优选地，所述细胞裂解液中含有浓度为1～3mol/L的盐酸胍，所述表面活性剂为IGEPAL-CA630，Triton-X100，NP40中的一种。

进一步优选地，所述表面活性剂为IGEPAL-CA630，在细胞裂解液中的体积浓度为0.01％～1％。

更进一步优选地，所述细胞裂解液为1.0～2.0mol/L的盐酸胍和0.03％-0.08％表面活性剂的水溶液。

其中，所述液化液、细胞(核)裂解液、核酸外切酶缓冲液的体积份数分别为1份，1～3份，0.1～0.5份。

本发明所述的痰液微生物的快速提纯试剂在痰液液化、体液内细胞的去除与细菌富集中的应用。

应用所述的快速提纯试剂进行痰液微生物快速提纯的方法，包括操作：

1)将体积为液化剂0.8～1.2倍的痰液转移至容器内，加入液化液液化5～20分钟；

2)加入细胞(核)裂解液，室温放置5～30min，观察溶液呈清水样，离心收集细菌，除去清液，向细菌中加入核酸外切酶缓冲液，30～40℃放置20～40min。

进一步可进行细菌基因组DNA提取，提取方法为本领域已有的技术手段。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点：

本发明提出的痰液痰液微生物的快速提纯试剂，采用低浓度盐酸胍与表面活性剂及还原剂相结合，完全裂解人细胞(核)，细胞崩解导致基因组DNA释放到溶液中，大部分在离心获取细菌时而被除去，残余的游离DNA将被DNase进一步消化，而细菌由于细胞壁的保护不受影响或者影响很小。

通过试验比较确定较低浓度的胍盐，与表面活性剂及还原剂相结合有效完成了细胞的快速完全崩解。二代测序结果(痰液对照组测序通量10G，细菌组5G)显示本痰液微生物的快速提纯试剂能够将COPD病人痰液宏基因组中细菌基因组占比提高20倍以上，与对照相比没有细菌消失，同时新增50多种细菌(单个菌DNA测序reads所占总reads数比例大于0.01％)。综上所述，本痰液微生物的快速提纯试剂能够快速、高效地提纯痰液中细菌。

本发明的试剂优势是操作简单快速、细菌富集效率提高，对不同类型的痰液具有更好的适应性。

附图说明

图1：RT-探针法相对定量检测16s rDNA曲线(代表细菌)，痰液基因组3倍比稀释。

图2：RT-染料法相对定量检测人BTF曲线(代表细胞)，痰液基因组3倍比稀释。

具体实施方式

现以以下实施例来说明本发明，但不局限于本发明的范围。

实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。

实施例1：细胞(核)裂解液成分优化试验

高浓度的盐酸胍(6M)是蛋白的强烈变性剂，采用低浓度盐酸胍(1M以下)作用培养细胞，观察细胞崩解情况。

取刚长满的H460上皮细胞培养瓶，倒去培养基，室温下向各瓶分别加入1M盐酸胍及0.5M盐酸胍，及1M盐酸胍+0.03％IGEPAL-CA630、0.5M+0.03％IGEPAL-CA630盐酸胍的四个实验组，计时观察，在20min内单盐酸胍组细胞没有崩解，而混合有IGEPAL-CA630组细胞很快就崩解了。该实验表明盐酸胍与表面活性剂联合使用能更有效裂解细胞。

在本试验基础上，后续试验中裂解液中IGEPAL-CA630的体积浓度为0.06％，等体积加入则终浓度为0.03％，盐酸胍浓度为2M的，等体积加入则终浓度为1M。

实施例2：

本痰液痰液微生物的快速提纯的试剂包含液化剂、细胞裂解液、核酸外切酶缓冲液。

各组分具体成分如下：

液化剂：0.1g DTT(分子量154.25)、0.78g氯化钠、0.02g氯化钾、0.02g磷酸二氢钾、0.112g磷酸二氢钠，1M NaOH调至pH值为7.6至8.0，加双蒸水至100mL，过滤除菌；

细胞裂解液：用双蒸水配制，其中含2M的盐酸胍，0.06％(体积分数)IGEPAL-CA630，过滤除菌；

核酸外切酶及缓冲液：DNase I recombinant 2，000units/mL(NEB公司)；核酸外切酶2×Buffer：20mM Tris-HCl，5mM MgCl₂，1mMCaCl₂，pH 7.6；

实施例3：痰液微生物的快速提纯的试剂

使用实施例2痰液微生物的快速提纯的试剂。

将1份体积痰液转移至50ml无菌离心管内，加入相对于痰液体积1倍体积的液化剂，振摇液化10分钟。等份分成两份，一份作为对照(对照组)，向另一份(实验组)中加入等体积的细胞裂解液(是和(痰液+液化剂)等体积)，裂解5-15分钟，观察到痰液呈清水样后离心收集细菌，去上清、向收集的细菌中加入200μL DNAase I酶缓冲液及酶(液体体积比例为：1mL痰液，200μL DNAase I酶缓冲液，按每mL酶缓冲液加10μL DNAase I酶)，在37℃下静置30min。(DNAase I酶可置75℃15min灭活)。

使用庄盟生物唾液基因组DNA快速提取试剂盒(货号ZP321T-2)分别提取实验组、对照组总基因组DNA。将对照组基因组DNA3倍比稀释，RT-探针法做出16s rDNA曲线(代表细菌数量)，结果见图1；用RT-染料法(SuperGreen)做出人BTF曲线(代表人细胞数量)，结果见图2；同时检测实验组16s rDNA及BTF的CT值，将所得的CT值代入对应的曲线公式，计算出相对对照组基因组DNA的稀释度，进而计算出纯化倍数，结果列于表1。16S RT-PCR条件:Primer F 1093GYAACGAGCGCAACCC，Primer R 1382GACGGGCGGTGTGTACA，Probel FAM-SCRGGAACGYATTCACCG-BHQ1，95℃10min，95℃20s 54℃20s 72 33s，40cycles；BTF RT-PCR条件：Primer F 5’ATGAGACGACCTTATGGGTAC 3’，PrimerR 5’TTGGACTCCTGGAACGTGAA3’，95℃10min，95℃20s 59℃20s 72℃33s，40cycles。

表1：RT检测细菌与细胞基因组DNA比例富集倍数

进一步对实验组及对照组基因组DNA进行Hiseq-2000双端DNA测序，利用基于k-mer的方法，对宏基因组的测序序列进行物种鉴定，得到细菌、病毒和真菌等物种的种类和丰度信息，分析微生物占比。结果表明微生物占比从2.47％提高至54.42％(表2和表3)。

表2：二代测序检测细菌富集效果

表3痰样样本中细菌组成分析

通过我们实验的二代DNA测序结果(痰液对照组测序通量10G，细菌组5G)也表明应用本发明的试剂，能够将痰液宏基因组中细菌基因组占比提高20倍以上，极大低降低测序成本，微生物组成与痰液直接提取全基因组对照相比，没有细菌消失，双方共有菌无明显差异，而新发现的低丰度微生物增加了50多种(单个菌DNA测序reads数占reads数比大于0.01％)，效果显著。

本发明富集微生物采用的是化学处理方法，富集微生物效率更高，对不同粘稠度的痰样本具有更好的适应性。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院北京基因组研究所

<120> 一种痰液微生物的快速提纯试剂及其应用

<130> KHP181113941.9

<141> 2018-07-05

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gyaacgagcg caaccc 16

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

gacgggcggt gtgtaca 17

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

scrggaacgy attcaccg 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atgagacgac cttatgggta c 21

Claims (10)

1.一种痰液微生物的快速提纯试剂，其特征在于，包括液化液、细胞裂解液、核酸外切酶缓冲液；所述细胞裂解液含有胍盐和表面活性剂，所述胍盐在细胞裂解液中的浓度为1～3mol/L。

2.根据权利要求1所述的痰液微生物的快速提纯试剂，其特征在于，所述液化液中含有还原剂和pH值为7.6～8.0的磷酸盐缓冲溶液，所述还原剂为二硫苏糖醇、乙酰半胱氨酸，三(2-羧乙基)膦盐酸盐中的一种，还原剂的浓度为0.05～0.2g/100mL；每毫升核酸外切酶缓冲液中含有1～30单位的核酸外切酶，所述核酸外切酶为recombinant DNase I。

3.根据权利要求2所述的痰液微生物的快速提纯试剂，其特征在于，所述液化液中还含有氯化钠和氯化钾，氯化钠和氯化钾浓度分别为0.5～1.0g/100mL和0～0.05g/100mL。

4.根据权利要求1所述的痰液微生物的快速提纯试剂，其特征在于，所述胍盐在细胞裂解液中的浓度为1～2mol/L。

5.根据权利要求1～4任一项所述的痰液微生物的快速提纯试剂，其特征在于，所述细胞裂解液中含有浓度为1～3mol/L的盐酸胍，所述表面活性剂为Triton-X100，NP40，IGEPAL-CA630中的一种。

6.根据权利要求5所述的痰液微生物的快速提纯试剂，其特征在于，所述表面活性剂为IGEPAL-CA630，在细胞裂解液中的体积浓度为0.01％～1％。

7.根据权利要求5所述的痰液微生物的快速提纯试剂，其特征在于，所述细胞裂解液为1.0～2.0mol/L的盐酸胍和0.03％～0.08％表面活性剂的水溶液。

8.根据权利要求1～4任一项所述的痰液微生物的快速提纯试剂，其特征在于，所述液化液、细胞裂解液、核酸外切酶缓冲液的体积份数分别为1份，1～3份，0.1～0.5份。

9.权利要求1～8任一项所述的痰液微生物的快速提纯试剂在痰液液化、体液内细胞的去除与细菌富集中的应用。

10.应用权利要求1～8任一项所述的快速提纯试剂进行痰液微生物快速提纯的方法，其特征在于，包括操作：

1)将体积为液化液0.8～1.2倍的痰液转移至容器内，加入液化液液化5～20分钟；

2)加入细胞裂解液，室温放置5～30min，离心收集细菌，除去清液，向细菌中加入核酸外切酶缓冲液，30～40℃放置20～40min。