CN111020001A - 一种新型唾液保存液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种新型唾液保存液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111020001A CN111020001A CN201911399480.2A CN201911399480A CN111020001A CN 111020001 A CN111020001 A CN 111020001A CN 201911399480 A CN201911399480 A CN 201911399480A CN 111020001 A CN111020001 A CN 111020001A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- saliva
- preservation solution
- novel
- sample
- preserving fluid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 title claims abstract description 146
- 239000012530 fluid Substances 0.000 title claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims abstract description 40
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- OPGYRRGJRBEUFK-UHFFFAOYSA-L disodium;diacetate Chemical compound [Na+].[Na+].CC([O-])=O.CC([O-])=O OPGYRRGJRBEUFK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000017454 sodium diacetate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000004283 Sodium sorbate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims abstract description 5
- LROWVYNUWKVTCU-STWYSWDKSA-M sodium sorbate Chemical compound [Na+].C\C=C\C=C\C([O-])=O LROWVYNUWKVTCU-STWYSWDKSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 235000019250 sodium sorbate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 208000035049 Blood-Borne Infections Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- -1 tissue Substances 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种新型唾液保存液，包括如下组分：EDTA 1‑10mmol/L、Tris‑HCl 1‑50mmol/L、氯化钠10‑100mmol/L、山梨酸钠0.1‑3％(w/v)、双乙酸钠0.1‑3％(w/v)、proclin300 0.01‑0.1％(v/v)、TWEEN20 0.1‑1％(v/v)、NP40 0.1‑1％(w/v)、SDS 0.1‑2％(w/v)；本发明的唾液保存液保存唾液样本，可以有效抑制核酸酶的活性，防止微生物的污染、保证DNA的片段完整性和纯度，同时简化预处理步骤，且适用于无离心机和低温环境下使用能够保证样本在各地之间的运输的稳定性，适用于分子流行病学大规模人群调查研究。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种新型唾液保存液的组合物及其制备和生产使用方法，适用于唾液收集后的运输和储存，后续仅用于体外检测。
背景技术
随着社会的进步，核酸DNA在基因检测、疾病检测与治疗、法医鉴定等领域运用越来越广泛。通常人类遗传基因分析的样本DNA，来源是血液、组织、体液。用于PCR扩增及检测的核酸DNA普遍来自血液样本。血样的采集需要依靠专业技能才能完成并且对人体造成一定的创伤。血样保存时间过长等因素造成血凝块，也会造成提取不便，无创、简便、快速的检查诊断方法受到研究人员的普遍关注。
与血液样本相比，唾液采集安全方便，无创伤，无血源性疾病传播的危险，患者无痛苦于接受，因而能最大限度地扩大基因研究的取样范围，特别适合分子流行病学大规模人群调查。
由于唾液中微生物种类多以及脂质、多糖、黏蛋白等杂质的存在，随着样本保存时间的增加，通常会生长大量的微生物造成人类遗传基因的占比减少以及降解。另一方面，不适当的保存液会造成DNA的降解及下游检测抑制。
通常市面上的唾液保存液需要离心收集唾液细胞再加裂解液裂解细胞，需要借助于离心机且预处理繁琐。本发明中的唾液保存液预先喷涂于采集管底部并烘干，收集到的唾液样本在运输途中裂解，简化预处理步骤，且适用于无离心机和低温环境下，能够保证样本在各地之间的运输的稳定性。
发明内容
本发明利用唾液保存液保存唾液样本，在运输过程中裂解细胞，抑制微生物的污染，保护基因组DNA的完整性。
本发明采用以下技术方案：EDTA 1-10mmol/L、Tris-HCl 1-50mmol/L、氯化钠 10-100mmol/L、山梨酸钠0.1-3％(w/v)、双乙酸钠0.1-3％(w/v)、proclin 300 0.01-0.1％(v/v)、 TWEEN 20 0.1-1％(v/v)、NP40 0.1-1％(w/v)、SDS 0.1-2％(w/v)，体系pH范围在7-8之间。
上述唾液保存制备方法，具体包括以下步骤：
(1)取上述所述配比的原料；
(2)将步骤(1)中称取的EDTA、Tris-HCl、SDS分别配制成溶液后保存；其中pH为6-8.5 的Tris-HCl缓冲液。
(3)根据预配制的唾液保存用的总体积，结合体系中各组分的含量要求，选用相应体积的 EDTA溶液、PH为6-8.5的Tris-HCl缓冲液、SDS的储存水溶液，加入相应量的山梨酸钠、双乙酸钠、氯化钠、TWEEN 20、NP40、proclin300，补加无菌水至预配制的唾液保存总体积，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述唾液保存液,保存液的保存温度为15-25℃。
按上述方案，步骤(3)中的体系pH值在需要时可通过加入HCl或者NaOH调节PH至范围在7-8之间，其中HCl或者NaOH的加入量很少，对体系中各组分浓度的影响可忽略不计。
上述唾液保存生产使用方法，具体包括以下步骤：
本发明的唾液保存液在生产中，预先用药剂定量喷雾机(浏阳市宏远精工机械科技，型号HY100BCA-T)定量加唾液保存液高压喷雾保存在唾液采集管底部，加样结束后快速用PTC 洁净无尘烘干机(PTC洁净无尘烘干机，HY100DG-T2)室温(15-25℃)高压烘干，液态的唾液保存液转变成固态的唾液保存剂富集在唾液采集管底部。
本发明的唾液保存液的使用方法是：将1.5-2.5ml唾液与唾液保存液混合，常温保存。
本发明的唾液保存液中EDTA螯合样本中的Mg2+、Ca2+等二价阳离子，抑制了核酸酶的活性，保证了基因组DNA片段的完整性；SDS和TWEEN20裂解细胞膜，有效裂解蛋白质、脂质等杂质；Tris-HCl缓冲液保证DNA稳定的弱碱性环境；更主要的proclin 300，具有极其良好的广谱抗菌体系，有效抑菌，更好的防止了微生物的污染，从而达到较好的保存唾液样本的要求。
本发明的唾液保存液保护基因组DNA的完整性，抑制了细菌的滋长，简化预处理步骤且满足各种复杂的PCR实验。
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
本发明的唾液保存液保存唾液样本，成本较低，配制方便，可以有效抑制核酸酶的活性，防止微生物的污染、保证DNA的片段完整性，同时简化预处理步骤，且适用于无离心机和低温环境下使用能够保证样本在各地之间的运输的稳定性，适用于分子流行病学大规模人群调查研究。固态的唾液保存剂相比液态唾液保存液更有利于使用人员健康安全，有效防止孩童误食。
相关唾液保存及基因组DNA抽提结果表明，本发明的唾液保存液室温条件下可有效保存 3个月以上。
附图说明
图1是本发明唾液保存液保存唾液样本0天(1-5)和30天(6-10)后的DNA凝胶成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
实施例1：
唾液保存液的组分及含量：EDTA 10mmol/L、Tris-HCl 20mmol/L、氯化钠100mmol/L、双乙酸钠1％(w/v)、proclin300 0.01％(v/v)、TWEEN20 1％(w/v)、SDS 1％(w/v)，体系pH值8。
制备方法如下：
(1)分别配制0.1mol/L EDTA、pH为8的Tris-HCl缓冲液、20％SDS(w/v)的储存水溶液，室温保存；
(2)根据预配制的唾液保存用的总体积，结合体系中各组分的含量要求，按照以下比例进行混合：0.1mol/L EDTA水溶液10ml；0.1mol/L Tris-HCl(PH＝8)缓冲液20ml；20％SDS(w/v)水溶液5ml；TWEEN 20 1ml；proclin300 0.1ml；加入的1g双乙酸钠、0.58g 氯化钠，补加无菌水至100ml，微孔滤膜过滤除菌，15-25℃保存备用。
唾液保存液的生产使用方法：
预先用药剂定量喷雾机(浏阳市宏远精工机械科技，型号HY100BCA-T)定量加200ul 唾液保存液高压(0.3Mpa)喷雾保存在唾液采集管底部，加样结束后快速用PTC洁净无尘烘干机(PTC洁净无尘烘干机，HY100DG-T2)室温(15-25℃)高压烘干。
唾液保存液的保存效果试验，具体方法：
唾液采集前，受试者提前30分钟充分漱口，至采集前勿进食、饮水/饮料、吸烟、嚼口香糖，刷牙或涂抹唇膏。唾液采集时用牙齿轻轻剐蹭舌头和两腮各10次，注意力度适中。然后少量多次吐出唾液至采集漏斗中，沿内壁流入采集管，使唾液液面(非泡沫)约至2ml采集线处。当唾液量较少时，可用舌头抵住上颚或用舌头在口腔内转动以促进唾液分泌。将采集漏斗旋开，换用采集管盖拧紧。将采集管上下颠倒5次，使样本和底部药剂混匀。
实施例2
(1)实施例1生产的本发明的唾液样本保存液进行稳定性检测实验，收集得到2.5ml唾液，颠倒混匀，共收集5个受试者的唾液样本，备用。
(2)将保存在唾液保存液中的唾液样本在室温条件下放置0天、7天、14天、21天、30天后，取450ul唾液样本，用南京申友核酸提取纯化试剂盒(磁珠法)-Ⅰ型，提取唾液样本的基因组DNA，DNA总体积80ul。取放置0天和30天的唾液DNA样本3ul加样于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，用DL15000Marker标记，具体见图1(样本1-5是放置0天唾液样本 DNA，6-10是放置30天的唾液样本DNA)；取2ul唾液DNA用Qubit检测其浓度(单位是 ng/ul)，具体见表1；取2ul唾液DNA用NanoDrop检测其纯度，具体见表2。表1的数据显示，唾液样本在室温条件下放置0天、7天、14天、21天、30天的唾液样本的浓度变化程度很小，表明本发明的唾液保存液有效保护基因组DNA，同时图1的电泳图表明本发明的唾液保存液有效抑制基因组的降解，此结果与表1结果一致。其中样本1-5的A260/280均在 1.7-2.0之间，A260/230均在1.0以上，表明提取的唾液DNA纯度较好。
表1用Qubit检测0天、7天、14天、21天、30天唾液样本1-5的DNA浓度(单位ng/ul)
| 样本序号 | 0天 | 7天 | 14天 | 21天 | 1个月 |
| 样本1 | 52 | 49 | 45 | 44.7 | 46 |
| 样本2 | 122 | 100 | 104 | 98 | 86 |
| 样本3 | 63 | 70 | 54 | 60 | 55 |
| 样本4 | 88 | 78 | 64 | 70 | 60 |
| 样本5 | 139 | 120 | 109 | 100 | 95 |
表2用NanoDrop检测0天、7天、14天、21天、30天唾液样本1-5的DNA纯度
(3)将步骤(2)中的唾液DNA样本进行PCR扩增，具体方法为：
微生物16SrRNA扩增，扩增引物和荧光探针如下：
16SrRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’(SEQ ID N0：1)
16SrRNA-R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID N0：2)
16SrRNA-P：5’-CAGCACCTGTGTCCYRGT-3’(SEQ ID N0：3)
RnaseP扩增，扩增引物和荧光探针如下：
RnaseP-F：5’-CGCCGTAAACGATGATTG-3’(SEQ ID N0：4)
RnaseP-R：5’-CTGGGAACTGCCWTTGTG-3’(SEQ ID N0：5)
RnaseP-P：5’-AATCCCCAACAACCAGTTGA-3’(SEQ ID N0：6)
荧光定量检测：将步骤(2)中的唾液DNA样本为模板，将16SrRNA基因和RnaseP基因的F和R 的引物及相对应的P探针按照扩增的反应体系(见表3)至于一个PCR管中，同时用(Roche LightCycler 480)实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增。PCR反应体系为(Takara)的预混试剂，引物各4uM，探针各2uM，PCR扩增程序如下：95℃3min；94℃30s，60℃40s，循环45次；4℃冷却，实时荧光定量CT值的结果，如表4。RnaseP起峰处的循环数随着唾液样本保存时间的增加基本不增加，16SrRNA的CT值随着唾液样本保存时间的增加而略有减少，唾液中的微生物数量略有增加，表明本发明的唾液保存液可以有效防止微生物的污染，保护唾液基因组DNA，总体保存效果较好。
表3扩增的反应体系
| gDNA | 2ul |
| 10*buffer | 2ul |
| TaqHS | 0.2ul |
| 16SrRNA-F | 0.1 |
| 16SrRNA-R | 0.1 |
| P | 0.05 |
| RnaseP-F | 0.1 |
| RnaseP-R | 0.1 |
| P | 0.05 |
| dUTP | 0.2 |
| UDG | 0.01 |
| ddH<sub>2</sub>O | 15 |
表40天、7天、14天、21天、30天唾液样本1-5的实时荧光定量CT值
实施例3
实施例1生产的本发明的唾液保存液与BIOG Elite唾液保存液进行检测，步骤如下：
(1)取10份受试者唾液样本，震荡混匀均匀分为2份，将上述唾液保存用组合物保存2ml唾液样本，同时按照说明书用40ul BIOG Elite唾液保存液保存2ml唾液样本，保存的唾液样本分别于室温下放置14天后，取450ul唾液样本利用核酸提取纯化试剂盒(磁珠法)抽提得到样本基因组DNA，本发明的唾液样本编号为1-10，BIOG Elite唾液保存液样本的编号为11-20。
(2)用Qubit检测其浓度，具体见表5，表明本发明的唾液保存液保存唾液样本抽提得到的DNA浓度更高；
表5本发明产品保存唾液样本(1-10)和对照产品保存唾液样本(11-20)的浓度检测表(ng/μl)
| 样本序号 | 本发明产品检测浓度 | 样本序号 | 对照产品检测浓度 |
| 1 | 57.2 | 11 | 22 |
| 2 | 50 | 12 | 24.9 |
| 3 | 47 | 13 | 20.3 |
| 4 | 28.4 | 14 | 14.4 |
| 5 | 23.8 | 15 | 15.7 |
| 6 | 30.28 | 16 | 18.4 |
| 7 | 16.21 | 17 | 15.3 |
| 8 | 23.61 | 18 | 10.33 |
| 9 | 18.31 | 19 | 15.37 |
| 10 | 45.2 | 20 | 27 |
(3)用NanoDrop检测其纯度，其中，本发明的唾液样本编号为1-10，BIOG Elite唾液保存液样本的编号为11-20，具体见表6。本发明唾液保存液抽提得到的DNA产物，OD260/OD280在1.7-2.0，OD260/OD230在1.5-2.0。对照唾液保存液抽提得到的DNA产物，OD260/OD280在1.5-2.0， OD260/OD230在1.0-2.0。本发明唾液保存液保存的唾液样本抽提产物纯度更高。
表6本发明产品保存唾液样本(1-10)和对照产品保存唾液样本(11-20)的纯度检测对比表
| 样本序号 | A260/280 | A260/230 | 样本序号 | A260/280 | A260/230 |
| 1 | 1.77 | 1.58 | 11 | 1.68 | 0.98 |
| 2 | 1.85 | 2.01 | 12 | 1.72 | 1.56 |
| 3 | 1.69 | 1.72 | 13 | 1.54 | 1.65 |
| 4 | 1.8 | 1.69 | 14 | 1.70 | 1.62 |
| 5 | 1.84 | 1.9 | 15 | 1.74 | 1.80 |
| 6 | 1.84 | 1.53 | 16 | 1.75 | 1.43 |
| 7 | 1.83 | 1.95 | 17 | 1.76 | 1.83 |
| 8 | 1.8 | 1.63 | 18 | 1.82 | 1.20 |
| 9 | 1.83 | 1.61 | 19 | 1.75 | 1.52 |
| 10 | 1.76 | 1.55 | 20 | 1.70 | 1.33 |
(4)将得到的唾液DNA样本进行RNasep和微生物16SrRNA扩增荧光定量扩增，其中，本发明的唾液样本编号为1-10，BIOG Elite唾液保存液样本的编号为11-20，Ct值具体见表7：
表7本发明产品保存唾液样本(1-10)和对照产品保存唾液样本(11-20)的Ct值对比表
本产品保存唾液样本的CtRNasep的循环数均低于对照产品，表明本产品保存的唾液样本提取的唾液DNA中人类基因组DNA数量更多，说明本产品可以有效地保护唾液基因组DNA，防止降解。本产品保存唾液样本的Ct16S的CT值略高于对照产品且唾液样本总DNA明显高于对照产品，表明本产品保存的唾液样本提取的唾液DNA中微生物基因组DNA占总DNA比例更少，表明对照产品中唾液中的微生物数量更多，表明本发明的唾液保存液可以有效防止微生物的污染，总体保存效果较好。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 申友基因组研究院（南京）有限公司
<120> 一种新型唾液保存液及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcacctgt gtccyrgt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgccgtaaac gatgattg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgggaactg ccwttgtg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatccccaac aaccagttga 20
Claims (9)
1.一种新型唾液保存液，其特征在于，包括如下组分：EDTA 1-10mmol/L、Tris-HCl
1-50mmol/L、氯化钠10-100mmol/L、山梨酸钠0.1-3％(w/v)、双乙酸钠0.1-3％(w/v)、proclin300 0.01-0.1％(v/v)、TWEEN20 0.1-1％(v/v)、NP40 0.1-1％(w/v)、SDS 0.1-2％(w/v)。
2.根据权利要求1所述的一种新型唾液保存液，其特征在于：唾液保存液的pH为7-8。
3.权利要求1-2任意一项所述唾液保存液的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取权利要求1-2任意一项所述配比的原料；
(2)将步骤(1)中称取的EDTA、Tris-HCl、SDS分别配制成溶液；
(3)将EDTA溶液、Tris-HCl缓冲液、SDS溶液混合后，再加入山梨酸钠、双乙酸钠、氯化钠、TWEEN20、NP40、proclin300，补加无菌水至配制唾液保存液的总体积，灭菌后保存，得到所述唾液保存液。
4.根据权利要求3所述的一种新型唾液保存液的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中Tris-HCl缓冲液的pH为6-8.5。
5.根据权利要求3所述的一种新型唾液保存液的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中灭菌的条件为：采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌。
6.根据权利要求3所述的一种新型唾液保存液的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中保存的温度为15-25℃。
7.根据权利要求3所述的一种新型唾液保存液的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，对配制的唾液保存液pH进行调节，步骤如下：当需要对配制唾液的pH值进行调节时，加入酸碱调节剂，并调节pH为7-8。
8.根据权利要求7所述的一种新型唾液保存液的制备方法，其特征在于：所述酸碱调节剂为盐酸或氢氧化钠。
9.一种用于权利要求1-8制备的新型唾液保存液的生产使用方法，其特征在于，步骤如下：用药剂定量喷雾机将权利要1或3所述的唾液保存液保存在唾液采集管底部，加样结束后用烘干机高压烘干，将液态的唾液保存液转变成固态的唾液保存剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911399480.2A CN111020001A (zh) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | 一种新型唾液保存液及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911399480.2A CN111020001A (zh) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | 一种新型唾液保存液及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111020001A true CN111020001A (zh) | 2020-04-17 |
Family
ID=70196085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911399480.2A Pending CN111020001A (zh) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | 一种新型唾液保存液及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111020001A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111518797A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-08-11 | 上海安五生物科技有限公司 | 一种常温保护液及其配制方法与应用 |
| CN111778239A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-16 | 福建百斯特基因检测有限公司 | 一种兽用采样液组合物及采样方法 |
| CN112438253A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-05 | 武汉吉诺百客医学科技有限公司 | 一种唾液保存液及其制备方法 |
| CN113575573A (zh) * | 2021-09-07 | 2021-11-02 | 易普森生物科技(深圳)有限公司 | 一种用于痰液样本的保存液及其应用 |
| CN114467919A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-05-13 | 力因精准医疗产品（上海）有限公司 | 一种唾液保存液及使用方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105368812A (zh) * | 2014-08-19 | 2016-03-02 | 深圳华大基因股份有限公司 | 一种唾液保存液及其制备方法和用途 |
| US20180235206A1 (en) * | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Oasis Diagnostics Corporation | Compositions and methods for stabilizing dna in saliva samples |
-
2019
- 2019-12-30 CN CN201911399480.2A patent/CN111020001A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105368812A (zh) * | 2014-08-19 | 2016-03-02 | 深圳华大基因股份有限公司 | 一种唾液保存液及其制备方法和用途 |
| US20180235206A1 (en) * | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Oasis Diagnostics Corporation | Compositions and methods for stabilizing dna in saliva samples |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111518797A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-08-11 | 上海安五生物科技有限公司 | 一种常温保护液及其配制方法与应用 |
| CN111778239A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-16 | 福建百斯特基因检测有限公司 | 一种兽用采样液组合物及采样方法 |
| CN111778239B (zh) * | 2020-07-14 | 2022-08-05 | 福建省辉腾生物科技有限公司 | 一种兽用采样液组合物及采样方法 |
| CN112438253A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-05 | 武汉吉诺百客医学科技有限公司 | 一种唾液保存液及其制备方法 |
| CN113575573A (zh) * | 2021-09-07 | 2021-11-02 | 易普森生物科技(深圳)有限公司 | 一种用于痰液样本的保存液及其应用 |
| CN114467919A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-05-13 | 力因精准医疗产品（上海）有限公司 | 一种唾液保存液及使用方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111020001A (zh) | 一种新型唾液保存液及其制备方法和应用 | |
| EP0851937B1 (de) | Verfahren zur reinigung, stabilisierung oder isolierung von nukleinsäuren aus biologischen materialien | |
| CN105961375A (zh) | 一种唾液保存液及其制备方法和用途 | |
| CN105368812B (zh) | 一种唾液保存液及其制备方法和用途 | |
| CN113430173B (zh) | 一株宽裂解谱、耐高温沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN110093320B (zh) | 猪塞内卡病毒gd-sva-2018株及其应用 | |
| CN111996233A (zh) | 一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法及应用 | |
| CN113583966A (zh) | 一株烈性沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN110740740A (zh) | 含有活体微生物的组合物及其制备方法 | |
| CN107236820B (zh) | 一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法 | |
| CN109294952A (zh) | 一种肠菌组合物的制备方法 | |
| CN105779346A (zh) | 一种产细菌素的屎肠球菌及其应用 | |
| CN111607550A (zh) | 一种表达荧光素酶的高产酒克雷伯菌及其用途 | |
| CN109090033A (zh) | 粪便移植实验仔猪模型的构建方法 | |
| CN116355788A (zh) | 一株凝结魏茨曼氏菌gbw0011及其在制备口腔抑菌剂中的应用 | |
| CN113322242B (zh) | 一株多重耐药性大肠杆菌噬菌体及其应用 | |
| CN109593754A (zh) | 一种唾液dna保存液及其制备方法和用途 | |
| CN113637723A (zh) | 一种粪便样本核酸保存液及其制备方法 | |
| CN1861802A (zh) | 一种多重pcr反应试剂盒及其检测方法 | |
| CN113456678A (zh) | 一种基于微生物活性益生菌的中药发酵液生产工艺 | |
| CN111154904A (zh) | 坏死杆菌白细胞毒素基因pcr诊断试剂盒及其建立方法 | |
| CN111280341A (zh) | 一种防治家禽坏死性肠炎的复合酶制剂及复合饲料 | |
| CN110964684A (zh) | 表达荧光素酶的产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌及其用途 | |
| Kuibagarov et al. | Moraxella species diversity in infectious bovine keratoconjunctivitis in Nothern Kazakhstan | |
| CN112646785B (zh) | 一株耐高温烈性变形杆菌噬菌体rdp-sa-20018及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200417 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |