CN109517775B - 大黄鱼IFNc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大黄鱼IFNc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用，本发明通过分子生物学手段，将大黄鱼干扰素c（IFNc基因）克隆后连接至大肠杆菌表达载体中，通过转化，诱导表达，获得重组表达产物，具体包括以下步骤：基因克隆、重组表达载体的构建、转化入大肠杆菌、IPTG诱导及表达产物的纯化等步骤。所获得的表达产物可诱导大黄鱼外周血白细胞表达抗病毒蛋白基因如Mx1、PKR和ISG15。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大黄鱼IFNc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用。
背景技术
干扰素（Interferon，IFN）是一类能诱导脊椎动物细胞抗病毒状态，并在抗病毒防御中起重要作用的诱导性多基因家族细胞因子（Robertsen B. The interferon systemof teleost fish [J]. Fish Shellfish Immunol, 2006, 20(2): 172-191）。硬骨鱼类作为低等脊椎动物也拥有相对完善的干扰素***。鱼类IFN分为Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN两大类，其中I型IFN因其专一性地协调宿主抗病毒免疫而受到更多的关注（Zhang YB, Gui JF.Molecular regulation of interferon antiviral response in fish [J]. Dev CompImmunol, 2012, 38(2): 193-202.）。根据成熟肽中半胱氨酸的数量及分布，鱼类Ⅰ型IFN分为group Ⅰ IFN（成熟肽含2个保守的半胱氨酸）和group Ⅱ IFN（成熟肽含4个保守的半胱氨酸）。Group I IFN包括IFNa、IFNd、IFNe和IFNh 4个亚组，group II IFN包括IFNb、IFNc和IFNf 3个亚组 (Ding Y, Ao J, Huang X, Chen X. Identification of two subgroupsof type I IFNs in perciforme fish large yellow croaker Larimichthys croceaprovides novel insights into function and regulation of fish type I IFNs [J].Front Immunol, 2016, 7:343.)。
最近的研究结果表明，除IFNd与IFNh外（group I IFN），鲈形目鱼如大西洋白姑鱼、鳜鱼等，还存在一种group II IFN, IFNc（Milne DJ, Campoverde C, Andree KB,Chen X, Zou J, Secombes CJ. The discovery and comparative expression analysisof three distinct type I interferons in the perciform fish, meagre(Argyrosomus regius) [J]. Dev Comp Immunol, 2018, 84:123-132. Laghari ZA,Chen SN, Li L, Huang B, Gan Z, Zhou Y, Huo HJ, Hou J, Nie P. Functional,signalling and transcriptional differences of three distinct type I IFNs in aperciform fish, the mandarin fish Siniperca chuatsi. Dev Comp Immunol. 2018,84:94-108）。IFNc在各检测组织中呈组成型表达，在病毒或其类似物poly I:C诱导刺激后其表达量显著上调。大西洋白姑鱼IFNc可诱导自身及干扰素调节因子3和7的表达，并表现出明显地降低病毒滴度的作用（Milne DJ, Campoverde C, Andree KB, Chen X, Zou J,Secombes CJ. The discovery and comparative expression analysis of threedistinct type I interferons in the perciform fish, meagre (Argyrosomus regius) [J]. Dev Comp Immunol, 2018, 84:123-132.）。
发明内容
本发明的目的之一在于提供可高效表达大黄鱼IFNc基因的大肠杆菌工程菌。
本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼IFNc基因的大肠杆菌表达产物及其制备方法。
本发明的目的之三在于提供大黄鱼IFNc重组蛋白的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种大黄鱼IFNc基因的大肠杆菌工程菌，所述工程菌为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-43.1a-IFNc，已于2018年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018697；中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。
一种大黄鱼IFNc基因大肠杆菌工程菌，重组表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因。
大黄鱼IFNc基因大肠杆菌的表达产物，制备方法包括以下步骤：
（1）利用正向引物IFNc-F和反向引物IFNc-R，采用PCR技术扩增出编码第28位至第189位氨基酸的大黄鱼IFNc成熟肽基因片段；
（2）将步骤（1）得到的大黄鱼IFNc成熟肽基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-43.1a，得到含大黄鱼IFNc基因片段的重组表达载体pET-43.1a-IFNc；
（3）将重组表达载体pET-43.1a-IFNc转化大肠杆菌BL21菌株，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定后，获得含有大黄鱼IFNc基因片段的大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌；同时，表达载体pET-43.1a转化大肠杆菌BL21菌株，获得的大肠杆菌BL21/pET-43.1a作为对照菌株；
（4）大肠杆菌pET-43.1a-IFNc工程菌在LB培养基中经终浓度0.1 mM IPTG诱导、16ºC 振荡培养12小时，将培养物离心收集菌体，利用Buffer A重悬后，超声破碎，分别收集菌体裂解液上清和沉淀，经聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE 分析后表明大黄鱼IFNc重组蛋白为可溶性表达；
（5）利用镍离子金属螯合亲和层析介质柱纯化该重组蛋白：离心收集大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌培养物中菌体，用冰预冷的PBS溶液洗涤三次，然后用BufferA重悬菌体，置于冰水混合物中超声破碎15分钟，离心收集上清后上柱，4 ºC结合30分钟。分别用预冷的Buffer B和Buffer C（洗柱，最后用Buffer D洗脱，获得大黄鱼IFNc重组蛋白，纯化后的大黄鱼IFNc重组蛋白分别经Buffer 1、Buffer 2、Buffer 3进行3步透析，并最终透析至pH7.4的PBS缓冲液中。
所述Buffer A包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.5% v/vTriton X-100和30 mM咪唑，pH7.4；所述Buffer B包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.5% v/v Triton X-100、60 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer C包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、60 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer D包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、500 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer 1包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer 2包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、100 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer 3包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 7.4。
本发明的优点在于：
本发明获得的大黄鱼IFNc基因的大肠杆菌表达产物为分子量约73 kDa的大黄鱼IFNc重组蛋白，该大黄鱼IFNc重组蛋白在终浓度为10 ng/mL时，不仅在大黄鱼外周血细胞及头肾细胞中显著诱导自身及大黄鱼IFNd、IFNh的表达，还显著上调抗病毒基因Mx1、PKR及ISG15的表达。并且，该大黄鱼IFNc重组蛋白可明显地抑制石斑鱼虹彩病毒SGIV基因复制、抑制SGIV感染后的石斑鱼脾脏细胞的致病变效应，显示出良好的抗病毒效果，对于我国水产动物病毒病的防治具有广阔的应用价值和市场前景。
附图说明
图1为纯化的大黄鱼IFNc重组蛋白的SDS-PAGE分析，其中M泳道为蛋白质分子量标准；1 泳道为纯化的大黄鱼IFNc重组蛋白；箭头所指的是大黄鱼IFNc重组蛋白;2 泳道是纯化的Nus重组蛋白；kD（kilodalton)代表千道尔顿
图2 为大黄鱼IFNc重组蛋白对大黄鱼外周血白细胞中抗病毒蛋白基因表达的调节作用；10 ng/mL的大黄鱼IFNc重组蛋白处理大黄鱼外周血白细胞2、4和8小时后，收集处理细胞并利用Real-time PCR检测其中抗病毒蛋白Mx1、PKR和ISG15的基因表达水平，对照蛋白为10 ng/mL的Nus重组蛋白；上述基因的相对表达水平利用大黄鱼β-actin为内参标准化，其倍数变化为大黄鱼IFNc重组蛋白处理组中基因相对表达水平相对于Nus重组蛋白处理组中基因相对表达水平的倍数。
图3 为大黄鱼IFNc在石斑鱼脾脏细胞中抗石斑鱼虹彩病毒的功能；取10 ng/mL的大黄鱼IFNc重组蛋白预处理石斑鱼脾脏细胞2小时后，接种石斑鱼虹彩病毒；感染后24小时，显微镜观察石斑鱼脾脏细胞的形态学变化；同时，于感染后12、24和48小时收集细胞培养物，并利用Real-time PCR检测石斑鱼虹彩病毒基因MCP、VP19、VP136和ICP18在石斑鱼脾脏细胞中的表达水平；对照蛋白为10 ng/mL的Nus重组蛋白；上述基因的相对表达水平利用石斑鱼β-actin为内参标准化，其倍数变化为大黄鱼IFNc重组蛋白处理组中基因相对表达水平相对于Nus重组蛋白处理组中基因相对表达水平的倍数。每组实验重复三次，星号代表统计分析具有显著差异，* P < 0.05，** P< 0.01。
具体实施方式
实施例1一种大黄鱼IFNc基因cDNA的获得
利用其他鱼类的IFNc序列及大黄鱼基因组(JRPU00000000)，经过序列比对后预测得到大黄鱼IFNc基因序列。根据预测的大黄鱼IFNc基因编码序列设计引物，用该引物进行聚合酶链反应得到大黄鱼IFNc基因的编码区序列。该序列全长570个核苷酸，编码一个由189个氨基酸组成的蛋白质。
所述大黄鱼IFNc基因cDNA序列如SEQ ID NO .1所示；其中，所述cDNA编码的第1-27位氨基酸为预测的大黄鱼IFNc信号肽。
实施例2一种大黄鱼IFNc基因cDNA的获得
1. 含大黄鱼IFNc基因的重组表达载体BL21/pET-43.1a-IFNc的构建
（1）大黄鱼IFNc成熟肽基因片段的PCR扩增：合成带有限制性核酸内切酶EcoR I位点的正向引物IFNc-F: GGAATTCTGTCAGCTGGAAGGAGATC 和带有Hind III位点的反向引物IFNc-R: CCCAAGCTTTTAGTGGACACCTCTCC；使用TAKARA公司的PrimeSTAR® HS DNAPolymerase按照说明书进行PCR扩增，PCR体系为：
PCR程序如下：
PCR扩增产物进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：电压120伏，时间15分钟。使用凝胶成像仪观察，可见一条大小为570个核苷酸的条带，与预期相符，然后用Omega公司胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
（2）酶切反应：回收的PCR扩增产物和大肠杆菌原核表达载体pET-43.1a分别进行限制性核酸内切酶EcoR I和HindIII双酶切，酶切反应体系：
酶切条件：37 ºC反应3小时。酶切产物使用Omega公司胶回收试剂盒进行回收。
（3）连接反应：使用TAKARA公司T4 DNA连接酶连接双酶切后的PCR扩增产物和pET-43.1a载体，连接体系如下：
反应条件：16 ºC反应4小时。
（4）连接产物转化Invitrogen公司大肠杆菌E.coliTOP10感受态细胞，经菌落PCR筛选阳性克隆，扩大培养后，使用Omega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒，并测序验证，从而获得了含大黄鱼IFNc基因片段的重组表达载体pET-43.1a-IFNc。
2.大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌的构建
将含有大黄鱼IFNc基因片段的重组表达质粒pET-43.1a-IFNc转化大肠杆菌BL21感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 ºC静置培养16小时，长出单菌落，得到含有大黄鱼IFNc基因的大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌。
培养基配方：
LB液体培养基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母抽提物和10 g/L氯化钠。
LB平板：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母抽提物、10 g/L氯化钠和15 g/L琼脂粉。
实施例3大黄鱼IFNc基因在大肠杆菌中表达及其表达产物纯化
1. 大黄鱼IFNc重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析
将上述构建的大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌，挑取单菌落接种至5 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ºC，180转/分钟过夜振荡培养。第二天按体积比1:100比例接种于100 mL含终浓度100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的中，37 ºC，180转/分钟振荡培养。待培养物OD600至0.4~ 0.5时，加入终浓度为0.1 mM的IPTG诱导蛋白表达，37℃继续振荡培养4小时，将培养物离心，收集菌体。
用10 mL Buffer A重悬收集的菌体，超声破碎10分钟，再将裂解液在4 ºC，12000转/分钟，离心20分钟，收集裂解液上清，并用10 mL Buffer A重悬裂解液沉淀。菌体裂解液、菌体裂解液上清，菌体裂解液沉淀各取50 μL，并加入等体积蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮10分钟，然后进行浓度为15%（w/v）的SDS-PAGE电泳。结果显示，对照菌株BL21/pET-43.1a的菌体裂解液中出现了一条约73 kDa左右的蛋白条带，为空载体pET-43.1a所表达的重组蛋白Nus。而在大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌的菌体裂解液中则出现了一条约100kDa左右的蛋白条带，说明了大黄鱼IFNc重组蛋白在大肠杆菌中得到了表达。同时发现大黄鱼IFNc重组蛋白主要存在于菌体裂解液上清中中，说明大黄鱼IFNc重组蛋白在大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌中主要为可溶性表达。基于此，后续采用可溶性蛋白纯化方法对大黄鱼IFNc重组蛋白进行纯化。
Buffer A：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.5%v/v Triton X-100和30 mM咪唑，pH 7.4
2. 亲和层析法纯化大黄鱼IFNc重组蛋白
参照Invitrogen公司镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)推荐的方法进行重组蛋白的纯化：首先4 ºC ，5000转/分钟离心10分钟收集100 mL IPTG诱导后的大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌菌体，用l0m LBuffer A重悬菌体，超声破碎15分钟 , 然后4ºC，12000转/分钟，离心l 0分钟收集菌体裂解液上清。
先用l mL镍离子金属螯合亲和层析介质装柱，用5倍柱体积双蒸水洗柱，再加入5倍柱体积Buffer A平衡层析柱，液体流净后，将上述步骤中收集的上清上柱，4 ºC 孵育30分钟。用10 mL Buffer B和Buffer C洗柱，按照顺序分别洗5次，洗去未结合的杂蛋白。再用1mL Buffer C洗脱目的蛋白，重复收集5次。同时，通过相同的方法纯化Nus重组蛋白。
Buffer B：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.5% Triton X-100和60 mM咪唑，pH7.4。
Buffer C：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和60 mM咪唑，pH 7.4。
Buffer D：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl和500 mM咪唑，pH 7.4。
3. 大黄鱼IFNc重组蛋白透析
纯化后的大黄鱼IFNc重组蛋白分别经Buffer 1、Buffer 2、Buffer 3进行3步透析，并最终透析至PBS（pH7.4）中，每步不低于4小时。透析后，4 ºC，12000转/分钟离心30分钟去除沉淀，同时通过相同的方法透析Nus重组蛋白。取少量进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示得到了纯度较高的大黄鱼IFNc重组蛋白及Nus重组蛋白（图1），剩余的保存于-70 ºC备用。
Buffer 1：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 7.4。
Buffer 2：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、100 mM咪唑，pH 7.4。
Buffer 3：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 7.4。
实施例4大黄鱼IFNc重组蛋白对大黄鱼抗病毒蛋白诱导活性分析
（1） 将大黄鱼外周血白细胞以1×106个/mL的细胞密度接种于6孔细胞培养板，每孔2 mL Leibovitz's L15培养基（Gibico公司），于25 ºC生化培养箱过夜培养。
（2） 细胞培养基中加入大黄鱼IFNc重组蛋白至终浓度为10 ng/mL，分别于处理后2、4和8小时收集细胞培养物，使用微量RNA提取试剂盒（SV total RNA Isolation System，Promega公司）提取细胞总RNA，并按照逆转录酶M-MLV（RNaseH−，Takara公司）说明书进行反转录PCR。同时，设置Nus重组蛋白处理的细胞为阴性对照组。
（3） 通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测抗病毒蛋白基因如Mx1、PKR和ISG15在大黄鱼外周血白细胞中的表达水平。Real-time PCR于Mastercycler ep gradientrealplex4荧光定量PCR仪（Eppendorf公司）进行反应，条件如下：95 ºC预变性30 s；95 ºC变性5 s，58 ºC退火15 s，72 ºC延伸15 s并获取荧光，40个循环。以β-actin作为内参基因。各基因引物如表1所示。实验结果采用2-ΔΔCT法进行分析。
结果显示，在大黄鱼IFNc重组蛋白处理后，大黄鱼抗病毒蛋白Mx1、PKR和ISG15的基因表达水平在大黄鱼外周血细胞中被显著上调，并于诱导后4小时达到高峰，分别为对照组的17.3倍，5.4倍和7.5倍（图2）。
表1实时荧光定量PCR各基因引物表
实施例5大黄鱼IFNc重组蛋白的抗病毒活性分析
（1）将石斑鱼脾脏细胞以1×106个/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板，每孔2mL Leibovitz's L15培养基（Gibico公司），于28 ºC生化培养箱培养18小时。
（2）细胞培养基中加入大黄鱼IFNc重组蛋白至终浓度为10 ng/mL，静置孵育。2小时后，以感染复数为2的比例接种石斑鱼虹彩病毒。感染后24小时，显微镜观察石斑鱼脾脏细胞的细胞致病变效应。设置Nus重组蛋白处理的细胞为阴性对照组。
（3）同时，于感染后12、24和48小时收集细胞培养物，使用微量RNA提取试剂盒（SVtotal RNA Isolation System，Promega公司）提取细胞总RNA，并按照逆转录酶M-MLV（RNaseH−，Takara公司）说明书进行反转录PCR。设置Nus重组蛋白处理的细胞为阴性对照组。
（4）通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测石斑鱼虹彩病毒基因MCP、VP19、VP136、和ICP18在石斑鱼脾脏细胞中的表达水平。Real-time PCR于Mastercycler epgradient realplex4荧光定量PCR仪（Eppendorf公司）进行反应，条件如下：95 ºC预变性30s；95 ºC变性5 s，58 ºC退火15 s，72 ºC延伸15 s并获取荧光，40个循环。以石斑鱼β-actin作为内参基因。其倍数变化为大黄鱼IFNc重组蛋白处理组中基因相对表达水平相对于Nus重组蛋白处理组中基因相对表达水平的倍数。每组实验重复三次，星号代表统计分析具有显著差异，* P < 0.05，** P< 0.01。各基因引物如表2所示。实验结果采用2-ΔΔCT法进行分析。
表2实时荧光定量PCR各基因引物表
显微镜观查结果显示，大黄鱼IFNc重组蛋白可保护接种石斑鱼虹彩病毒的石斑鱼脾脏细胞。表现为Nus重组蛋白对照组大多数细胞已皱缩变圆，并出现明显地细胞空斑。而大黄鱼IFNc重组蛋白组细胞形态较为完整，无明显空斑（图3A）。Real-time PCR结果显示在大黄鱼IFNc重组蛋白处理后，石斑鱼虹彩病毒基因MCP、VP19、VP136、和ICP18的基因表达水平在石斑鱼脾脏细胞中被显著抑制（图3B）。表明大黄鱼IFNc重组蛋白具有明显的抗病毒功能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 大黄鱼IFNc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用
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<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gatgctgccg tgtgaactg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcacatcctt ggtggtgttg 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atcggatcta cgtggttgg 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccgtcgtcgg tgtctattc 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tacgagctgc ctgacggaca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ggctgtgatc tccttctgca 20
Claims (3)
1.一种表达大黄鱼IFNc基因的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-43.1a-IFNc，已于2018年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018697。
2.一种如权利要求1所述的大黄鱼IFNc基因大肠杆菌的表达产物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
（1）利用正向引物IFNc-F和反向引物IFNc-R，采用PCR技术扩增出编码第28位至第189位氨基酸的大黄鱼IFNc成熟肽基因片段；
（2）将步骤（1）得到的大黄鱼IFNc成熟肽基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-43.1a，得到含大黄鱼IFNc基因片段的重组表达载体pET-43.1a-IFNc；
（3）将重组表达载体pET-43.1a-IFNc转化大肠杆菌BL21菌株，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定后，获得含有大黄鱼IFNc基因片段的大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌；同时，表达载体pET-43.1a转化大肠杆菌BL21菌株，获得的大肠杆菌BL21/pET-43.1a作为对照菌株；
（4）大肠杆菌pET-43.1a-IFNc工程菌在LB培养基中经终浓度0.1 mM IPTG诱导、16 ºC振荡培养12小时，将培养物离心收集菌体，利用Buffer A重悬后，超声破碎，分别收集菌体裂解液上清和沉淀，经聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE 分析后表明大黄鱼IFNc重组蛋白为可溶性表达；
（5）利用镍离子金属螯合亲和层析介质柱纯化该重组蛋白：离心收集大肠杆菌BL21/pET-43.1a-IFNc工程菌培养物中菌体，用冰预冷的PBS溶液洗涤三次，然后用Buffer A重悬菌体，置于冰水混合物中超声破碎15分钟，离心收集上清后上柱，4 ºC结合30分钟；
分别用预冷的Buffer B和Buffer C洗柱，最后用Buffer D洗脱，获得大黄鱼IFNc重组蛋白，纯化后的大黄鱼IFNc重组蛋白分别经Buffer 1、Buffer 2、Buffer 3进行3步透析，并最终透析至pH7.4的PBS缓冲液中；
步骤（1）所述编码第28位至第189位氨基酸的大黄鱼IFNc成熟肽基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1的第82位至第567位；
所述Buffer A包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.5%v/vTriton X-100和30 mM咪唑，pH7.4；所述Buffer B包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.5% v/v Triton X-100、60 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer C包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、60 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer D包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、500 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer 1包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer 2包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、100 mM咪唑，pH 7.4；所述Buffer 3包括以下终浓度的试剂：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 7.4。
3.一种如权利要求2所述的大黄鱼IFNc基因大肠杆菌的表达产物在抑制石斑鱼虹彩病毒中的应用。
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Application publication date: 20190326 Assignee: Fuzhou Elite Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: FUJIAN AGRICULTURE AND FORESTRY University Contract record no.: X2021350000002 Denomination of invention: Preparation and application of E.coli Expression Product of ifnc gene of Pseudosciaena crocea Granted publication date: 20210226 License type: Common License Record date: 20210624 |
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