CN108264548B - 鳜鱼伽玛干扰素相关因子及其重组蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了鳜鱼伽玛干扰素相关因子及其重组蛋白和应用，本发明通过设计兼并引物扩增得到IFN‑γrel基因片段，race的方法扩增得到完整基因序列，以IFN‑γrel‑ORF‑F和IFN‑γrel‑ORF‑R为引物，以鳜的头肾和肠混合组织总RNA为模板扩增得到IFN‑γrel基因的完整开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的IFN‑γrel重组的蛋白经初步验证能够诱导免疫相关基因Mx，IRF1，STAT1以及SOCS1的上调表达，可作为鱼类免疫增强剂或者免疫佐剂。

Description

鳜鱼伽玛干扰素相关因子及其重组蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鳜鱼伽玛干扰素相关因子及其重组蛋白和应用。

背景技术

1957年英国科学家Isaacs在利用鸡胚绒毛***研究流感病毒干扰现象时首先发现干扰素(Interferon,IFN)，随后研究发现它是一种在先天性免疫和获得性免疫中起着重要作用的细胞因子，具有抑制细胞***、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。干扰素广泛存在于脊椎动物中。根据基因结构，受体类型以及功能等的不同，将其可以分为I型、II型和III型。目前在鱼类中发现只存在I型和II型干扰素，至今没有III型干扰素的报道。

哺乳动物的II型干扰素只有一个成员，即伽玛干扰素(IFN-γ)，主要由CD4+辅助T淋巴细胞，CD8+细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞产生(Shtrichman et al.,2001)。随后研究发现B细胞，抗原递呈细胞等也可以产生IFN-γ。IFN-γ通过受体介导下游效应基因的表达从而实现其生物学功能，包括抗病毒，抗菌，免疫调节等。已有报道显示硬骨鱼类II型干扰素中有两个成员，即IFN-γ和伽玛干扰素相关因子(IFN-γrel)。近几年在鲤形目(Cypriniformes)，鲑形目(Salmoniformes)以及鲈形目(Perciformes)鱼类中报道了IFN-γ。研究发现鱼类的IFN-γ对于机体抵抗病原感染也具有非常重要的作用。但IFN-γrel似乎是硬骨特有的基因，目前对于此基因的报道还很少，近几年在鲤科鱼以及一些模式鱼类中有IFN-γrel基因的报道，而对于它的功能目前研究还很少。特别是鲈形目中是否存在IFN-γrel基因目前并不清楚。

鲈形目鱼类的一些种类，如我国重要的淡水养殖对象鳜(Siniperca chuatsi)，具有较高的经济价值。随着养殖规模的不断扩大以及养殖环境的变化，鳜的病害频繁发生，给养殖业造成了重大的经济损失，病害问题已严重困扰着鳜养殖的发展。目前在鱼类中报道的免疫增强剂来源包括人工合成、微生物来源及动植物来源。近年来随着鱼类细胞因子研究的深入，生物活性因子类免疫增强剂也受到了极大地关注。

目前未见有关鳜鱼中IFN-γrel基因序列及功能的报道。本发明通过基因克隆方法得到了鳜IFN-γrel，重组的IFN-γrel蛋白能够诱导抗病毒等免疫相关基因的上调表达，参与各种病原诱发的免疫过程。因此其作为免疫增强剂具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了鳜鱼伽玛干扰素相关因子(IFN-γrel)，所述的鳜鱼伽玛干扰素相关因子的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了鳜鱼伽玛干扰素相关因子在制备鳜鱼免疫调节剂中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了含有鳜鱼IFN-γrel的重组表达载体。

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施:

本发明的发明思路为：根据已报道的鲤形目及鲑形目鱼类IFN-γrel基因序列设计简并引物无法扩增获得鳜IFN-γrel基因序列片段，申请人根据已报道的脊椎动物IFN-γ基因座中共线性基因MDM1(Nuclear protein doubleminute 1)及DYRK2(Dual-specificitytyrosine ph osphorylation-regulated kinase 2)，搜索罗非鱼(Oreochromis niloticus)基因组(版本号：Orenil1.0，http://asia.ensembl.org/Oreochromis_niloticus/Info/Index)，并获得包含这个基因的基因座序列，使用GENSCAN软件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行基因预测，通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLAST软件进行同源基因搜索；获得罗非鱼可能的IFN-γrel基因序列。据此序列设计简并引物扩增得到中间片段，测序验证后应用Pri merPremier 5.0软件设计巢式引物，以3′-RACE和5′-RACE为模板，共进行两轮PCR反应，最终才获得扩增鳜IFN-γrel基因完整开放阅读框。

以鳜cDNA为模板，扩增鳜IFN-γrelORF全长的引物如下：

IFN-γrel-ORF-F:ATGTCTTCGTACTGTGGTTC

IFN-γrel-ORF-R:TCATTCAGCAGAAGAGGAGTGGGTG。

扩增出的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2所示氨基酸序列对应的核苷酸序列也为本发明的保护范围。

鳜鱼伽玛干扰素相关因子在制备鳜鱼免疫调节剂中的应用，包括利用本领域的常规方式，合成鳜IFN-γrel蛋白，或是利用原核或真核表达方式制备鳜IFN-γrel重组蛋白，以作为鳜鱼免疫调节剂。

以上所述的方案中，优选的，当利用原核表达时，是将去掉信号肽的鳜IFN-γrelORF***pET28a(+)中，然后转化大肠杆菌，诱导IFN-γrel重组蛋白的表达。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

随着我国鱼类养殖行业的发展，养殖密度不断增大以及养殖环境的变化，鱼类病害频繁发生。鱼类干扰素作为天然的抗病毒制剂，为防治鱼类病害提供了广阔的应用前景。近几年鱼类干扰素相关的专利也陆续出现，大部分主要是I型干扰素以及IFNγ相关的专利，而对于硬骨鱼类特有的IFN-γrel报道的却很少。本发明利用基因共线性以及同源序列搜索设计兼并引物，结合分子生物学方法扩增得到鳜鱼的IFN-γrel基因的ORF序列，并构建原核表达质粒，转化到大肠杆菌中后可大量表达鳜鱼的IFN-γrel基因编码的蛋白，并且此蛋白以可溶的形式表达，通过镍柱纯化可得到大量高纯度高质量的蛋白。本发明中鳜鱼的IFN-γrel重组蛋白能上调鳜鱼头肾白细胞中Mx,STAT1，IRF1和SOCS1等免疫相关基因的表达，为鱼类免疫增强剂的研发提供一定的理论依据，同时IFN-γrel蛋白可作为免疫增强剂应用于水产养殖。

附图说明

图1为IFN-γrel重组蛋白诱导表达及纯化示意图；

其中：泳道1.pET28a(+)-IFN-γrel未诱导；泳道2.pET28a(+)-IFN-γrel诱导；泳道3-8.纯化脱盐后的IFN-γrel蛋白。

图2为不同浓度的IFN-γrel重组蛋白刺激鳜鱼头肾白细胞在不同时间下各免疫因子的转录水平表达情况；

1,5,和10μg/mL的IFN-γrel重组蛋白刺激鳜鱼头肾白细胞，在0h,3h,6h,12h,24h,48h时收集细胞样品，提取RNA检测Mx,IRF1,STAT1,SOCS1及IFN-γ的转录水平表达情况。

具体实施方式

本发明实施例中所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

鳜鱼伽玛干扰素相关因子IFN-γrel ORF全长制备：

1.模板制备

Trizol法提取鳜RNA，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo,K1622)操作步骤反转录获得cDNA模板.用5'-Full RACE Kit制备5′-RACE，用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit制备3′-RACE末端的cDNA.

2.PCR扩增

首先用兼并引物Sc-IFN-γrelDF和Sc-IFN-γrelDR，以cDNA为模板，扩增得到中间片段测序验证，得到SMART cDNA；

扩增中间片段的兼并引物：

TPREL-F1BKB:5>ACRAWCGCATTTTCTCCAGCAT<3

TPREL-F2BKB:5>YAACACCTCCTGCCAGAGA<3

TPREL-R2BKB:5>ACTCAGCCAGAGCTCTCTTCTG<3

TPREL-R1BKB:5>CYWKGWACTCAGCCAGAGCT<3

TPREL-F3BKB:5>TCTACVNNCRCATTTTCTCCA<3

TPREL-R3BKB:5>ATCAVAGAAGCBGCCTGGWAGA<3

TPREL-R4BKB:5>GCCAGAGCYYTYYTCTGA<3。

应用Primer Premier 5.0软件设计巢式引物，以SMART cDNA为模板，RACE共进行两轮PCR反应分别扩增鳜完整ORF序列。具体如下：

3′-RACE:第一轮PCR反应的引物组合为基因特异性外引物IFN-γrel-outF和UPM通用引物，反应条件为：94℃预变性5min后；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸1min，运行7个循环；94℃30s，64℃30s，72℃1min，运行18个循环；最后72℃延伸10min。从第一轮PCR扩增产物中取1μl做为第二轮PCR反应的模板，引物组合为基因特异性内引物IFN-γrel-inF和UPM通用引物，反应条件同上，PCR反应增加为35个循环。

3＇RACE引物：

IFN-γrel-outF:CTCTGGACATCTACACGCGTATC

IFN-γrel-inF:GAAGAGCAAACTGGGCCACC

5′-RACE:第一轮PCR反应的引物组合为基因特异性外引物IFN-γrel-inR和5′RACE outer primer通用引物，反应条件为：94℃预变性5min后；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸1min，运行7个循环；94℃30s，64℃30s，72℃1min，运行18个循环；最后72℃延伸10min。从第一轮PCR扩增产物中取1μl做为第二轮PCR反应的模板，引物组合为基因特异性内引物IFN-γrel-inR和5′RACE inner primer通用引物，反应条件同上，PCR反应增加为35个循环。

5＇RACE引物：

IFN-γrel-inR:GCAGGATGCTGGAGAAGATA

IFN-γrel-outR:CTCCTGCTTGAGCTTCGACAGAT

将上述得到的PCR产物电泳检测，用promega胶回收试剂盒切胶回收之后，连接PMD18T载体，转化到大肠杆菌TOP10中，挑克隆PCR阳性检测之后，送生工生物工程有限公司测序，最后得到完整的ORF序列，其序列为SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示，将该ORF序列保存在PMD18T载体中(命名为PMD18T-IFN-γrel)。

实施例2：

IFN-γrel原核表达质粒的构建及蛋白的纯化

软件预测去掉IFN-γrel信号肽，设计正反向引物以带有EcoRI酶切位点的IFN-γrel-PEX-F为正向引物，带有XhoI酶切位点的IFN-γrel-PEX-R为反向引物，以PMD18T-IFN-γrel为模板扩增得到带有酶切位点的片段。然后用EcoRI和XhoI两种快切酶同时酶切扩增得到的目的片段和pET28a(+)质粒，酶切后IFN-γrel和pET28a(+)质粒用T4连接酶25度连接30min，65度酶失活10min，最后将连接产物转化到DE3表达菌中，经过PCR和测序验证得到阳性的转化子成功的将IFN-γrel构建到pET28a(+)表达载体中，获得的菌株命名pET28a(+)-IFN-γrel。

IFN-γrel原核表达质粒构建引物：

IFN-γrel-PEX-F:5>CCGGAATTC TTTGGGAGTCCTGTCCATTTC(下划线为EcoRI酶切位点)

IFN-γrel-PEX-R:5>CCGCTCGAG TCATTCAGCAGAAGAGGAGTGG(下划线为XhoI酶切位点)

小体积验证pET28a(+)-IFN-γrel可以表达可溶性的蛋白。然后进行大体积诱导纯化蛋白，简述操作为：按照1:100接种pET28a(+)-IFN-γrel于300ml含有氨苄抗生素的TB液体培养基中，37度培养至OD达到0.5-0.6时，加入0.5mM IPTG在16度130rpm诱导15小时，然后4度，6500g，离心10min收集菌体，灭菌PBS洗两次，将上述收集的菌体重悬在20mlbinding buffer中超声破碎(35％功率，约30min)，直到菌液变澄清透光；超声后的菌液12500rpm离心30min，取上清进行Ni-NTA树脂纯化,得到具有活性的重组蛋白，如图1所示。

Ni-NTA纯化过程：将2ml Ni-NTA树脂加到蛋白纯化重力柱中，加入5ml灭菌水清洗树脂中的酒精等物质，然后加入3ml binding buffer溶液平衡纯化柱；将细菌裂解上清液加到纯化柱中，于4度翻转过夜或者2小时；等树脂自然沉降后，流出液相，收集流出液；重新将流出液体上柱，重复过柱一次，并收集流出液备用；依次加入WB-1、WB-2和WB-3进行漂洗(每个溶液重复3次，每次3ml)；然后加入EB溶液(重复5次，每次500μl)，收集洗脱液；然后将含有目的蛋白的洗脱液用PD-10脱盐处理之后，进行SDS-PAGE电泳分析。结果如图1中B，即得到IFN-γrel重组蛋白。

蛋白纯化各种试剂的配方：

binding buffer：0.5M Nacl,20mM Tris.base,5mM咪唑,浓盐酸调pH至7.9

WB-1：0.5M Nacl,20mM Tris.base,20mM咪唑,浓盐酸调pH至7.9

WB-2：0.5M Nacl,60mM Tris.base,5mM咪唑,浓盐酸调pH至7.9

WB-3：0.5M Nacl,20mM Tris.base,100mM咪唑,浓盐酸调pH至7.9

EB：0.5M Nacl,20mM Tris.base,250mM咪唑,浓酸调pH至7.9。

实施例3：

IFN-γrel重组蛋白在制备免疫调节剂中的应用

鳜头肾白细胞的制备：先将15ml离心管壁用牛血清湿润；在离心管中用加入4ml预混好的51％Percoll(2.04ml Percoll原液、0.4ml NaCl、1.54ml灭菌水、800U Heparin)。加液时15ml离心管倾斜，1ml枪头的应紧贴管壁，流速应较慢，防止产生较大的冲力。然后按照同样的方法加4ml预混好的34％Percoll(1.36ml Percoll原液、0.4mlNaCl、2.22ml灭菌水、800U Heparin)。

将在无菌环境中取出的鳜头肾迅速放在预冷的DMEM培养基(含2％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10U/ml Heparin)；在无菌操作台中用剪刀将头肾剪成小块，并用无菌PBS冲洗两次组织块，再用上述培养基冲洗一次，然后将组织块置于细胞筛网上面，筛网放在含有2ml培养基的一次性无菌平皿中；用一次性注射器的内柄末端轻轻按压头肾组织，使细胞通过筛网成为单细胞；用预冷的DMEM培养基冲洗筛网；收集平皿内的细胞悬液，轻轻加入到预装了34％–51％Percoll的离心管中；4℃、400g、离心40min；离心结束后白细胞是在34％和51％Percoll之间，小心收集界面部位的细胞；将收集的细胞用DMEM培养基洗涤3次；取部分细胞在细胞计数板中计数,用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基稀释细胞，制备成5×10⁶/ml的细胞悬液。

将制备好的头肾白细胞接种到24孔板中，每孔2.5×106个细胞。28℃培养3h，待细胞贴壁后，吸去培养基，加入500μl含1,5,and 10μg/mL重组pET28a(+)-IFN-γrel蛋白的DMEM培养基(10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml)，每组三个重复。对照组中加入pET28a(+)空载体重组蛋白。分别于孵育0h,3h,6h,12h,24h和48h后收集细胞。提取总RNA，反转录制备成cDNA。采用荧光定量PCR检测Mx，IRF1，STAT1，SOCS1基因的转录水平表达情况，结果如图2.荧光定量引物见表一。

表一：

图2结果说明：

从图中我们可以发现鳜鱼IFN-γrel重组蛋白刺激头肾白细胞时，Mx,STAT1,IRF1,SOCS1和IFN-γ基因在3h时就被显著的上调。Mx基因是重要的干扰素下游因子，在I型干扰素和II型干扰素诱导的抗病毒作用中起着重要的作用，在高等哺乳动物中Mx具有广谱的抗病毒作用，包括DNA和RNA病毒，在硬骨鱼类中已经有很多关于Mx基因抗病毒功能的研究。鳜鱼的IFN-γrel重组蛋白孵育头肾白细胞能使得Mx基因在3小时就出现显著的上调作用，因此其在鳜鱼抗病毒免疫中起着非常重要的作用。IRF1是很多信号通路(比如JAK-STAT信号通路)中起着关键的作用，它是重要的转录调节因子，在抗病毒免疫中起着非常重要的作用。而IFN-γrel重组蛋白能在3小时使得IRF1出现显著的上调表达。SOCS1是干扰素通路中的负调节因子，使机体处于一种免疫平衡的状态。因此鳜鱼的IFN-γrel重组蛋白作为鱼类的免疫调节制剂具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 鳜鱼伽玛干扰素相关因子及其重组蛋白和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcttcgt actgtggttc agtgtgtcta ctggtcttac tgggagctgt gctggcattt 60

gggagtcctg tccatttcat ctctgagaac ctgagacgaa cccacgggtc catcgcagat 120

gtgctgaagc tgacaaagcc ggcgatcggc agggatcctc tcttcagctc tgtcatcagg 180

agcatcaaca cctcctgcca gagaaaagaa gaactgcagc tgatgaatgt cactctggac 240

atctacacgc gtatcttctc cagcatcctg cagcacaacc agcaccatga caacgccttg 300

accccggctc tgctggccaa cctgcccgcc gccgaaatgg ctcacgtgga gtcgaatctg 360

tcgaagctca agcaggagat ggagacgctg aagagcaaac tgggccacct gaaacacgac 420

aaagaggacg tgctcagcaa gctgagcaaa atagatgtgg acgatcccga ggttcagaaa 480

aaggctctgg ctcagtacaa agagatctac caggcggctt ctgtgattgc cacccgcaga 540

tgtggaccca cccactcctc ttctgctgaa tga 573

<210> 2

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ser Tyr Cys Gly Ser Val Cys Leu Leu Val Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Val Leu Ala Phe Gly Ser Pro Val His Phe Ile Ser Glu Asn Leu Arg

20 25 30

Arg Thr His Gly Ser Ile Ala Asp Val Leu Lys Leu Thr Lys Pro Ala

35 40 45

Ile Gly Arg Asp Pro Leu Phe Ser Ser Val Ile Arg Ser Ile Asn Thr

50 55 60

Ser Cys Gln Arg Lys Glu Glu Leu Gln Leu Met Asn Val Thr Leu Asp

65 70 75 80

Ile Tyr Thr Arg Ile Phe Ser Ser Ile Leu Gln His Asn Gln His His

85 90 95

Asp Asn Ala Leu Thr Pro Ala Leu Leu Ala Asn Leu Pro Ala Ala Glu

100 105 110

Met Ala His Val Glu Ser Asn Leu Ser Lys Leu Lys Gln Glu Met Glu

115 120 125

Thr Leu Lys Ser Lys Leu Gly His Leu Lys His Asp Lys Glu Asp Val

130 135 140

Leu Ser Lys Leu Ser Lys Ile Asp Val Asp Asp Pro Glu Val Gln Lys

145 150 155 160

Lys Ala Leu Ala Gln Tyr Lys Glu Ile Tyr Gln Ala Ala Ser Val Ile

165 170 175

Ala Thr Arg Arg Cys Gly Pro Thr His Ser Ser Ser Ala Glu

180 185 190

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcttcgt actgtggttc 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcattcagca gaagaggagt gggtg 25

Claims (7)

1.鳜伽马干扰素相关因子IFN-γrel蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQID NO.2所示。

2.权利要求1所述蛋白对应的基因。

3.鳜伽马干扰素相关因子IFN-γrel的基因，所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

4.扩增获得鳜伽马干扰素相关因子IFN-γrel基因的引物：IFN-γrel-ORF-F:ATGTCTTCGTACTGTGGTTC；IFN-γrel-ORF-R: TCATTCAGCAGAAGAGGAGTGGGTG。

5.包含有SEQ ID NO.1所示序列的鳜IFN-γrel的重组表达载体。

6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在制备鳜免疫增强剂中的应用。

7.利用权利要求5所述重组表达载体制备的重组鳜干扰素相关因子蛋白在制备鳜免疫增强剂中的应用。

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