CN112759637A - 一种鳜鱼干扰素基因、干扰素蛋白mIFN及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鳜鱼干扰素基因、干扰素蛋白mIFN及其制备方法与应用，所述鳜鱼干扰素基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，经原核表达得到鳜鱼干扰素蛋白mIFN，本发明制备的鳜鱼干扰素蛋白mIFN可有效降低鳜鱼体内蛙虹彩病毒载量，达到抑制蛙虹彩病毒增值的效果，使鳜鱼发病率和死亡率大大降低，为养殖户减轻了经济的损失，具有良好的应用前景。

Description

一种鳜鱼干扰素基因、干扰素蛋白mIFN及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程基因领域，具体涉及一种鳜鱼干扰素基因、干扰素蛋白mIFN及其制备方法与应用。
背景技术
蛙虹彩病毒是水产养殖业一种危害较为普遍的病毒，虹彩病毒主要感染无脊椎动物和低等脊椎动物，虹彩病毒科(Iridoviridae)的病毒都是正二十面体病毒，直径在120～300nm，大多是单分子线性双链DNA病毒，其基因组大小为l70～200kb。包括5个属，其中蛙病毒属 (Ranavirus)、细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)可以感染脊椎动物，主要感染鱼类、两栖类及爬行类等，而虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属 (Chloriridovirus)感染无脊椎动物。现已陆续从世界各地患病的鱼类、两栖类及爬行类动物中分离、观察到多种虹彩病毒。近年来鳜鱼虹彩病毒在我国多地频发，致死率高，给水产养殖业带来严重的经济损失。
干扰素是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一种低分子糖蛋白。其具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等功能。干扰素处于先天性免疫中心位，免疫调节作用非常强大，在先天性免疫和获得性免疫中均发挥着重要作用。主要通过增加效应细胞数量、激活的信号传导路径以及APC细胞(抗原提呈细胞)等途径来参与免疫调节；具体表现如下：
1)参与细胞凋亡，增加肿瘤细胞MHCⅠ分子的表达促进抗原呈递；
2)参与Th1免疫反应，提高NK细胞杀伤作用、巨噬细胞吞噬作用；
3)介导T细胞的细胞毒性作用等。
重组鱼类I型干扰素主要使用真核表达***或通过体外翻译产生，使得制备重组鱼类I 型干扰素仍然需要较高的生产成本，难以实现规模化生产。
发明内容
本发明的所要解决的第一个技术问题在于：提供一种鳜鱼干扰素基因mIFN。
本发明的所要解决的第二个技术问题在于：提供一种鳜鱼干扰素蛋白mIFN的制备方法。
本发明的所要解决的第三个技术问题在于：提供鳜鱼干扰素编码基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
本发明的所要解决的第四个技术问题在于：上述方法制得的干扰素蛋白。
本发明的所要解决的第五个技术问题在于：提供上述干扰素蛋白mIFN的应用。
为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案为：一种鳜鱼干扰素基因，所述鳜鱼干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案为：一种利用上述鳜鱼干扰素基因制备干扰素蛋白的方法，包括以下步骤：
S1、将上述鳜鱼干扰素基因连接到载体中，得到重组质粒；
S2、将重组质粒转入大肠杆菌，培养后提取重组质粒；
S3、将经步骤S2提取得到的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌，得到重组枯草芽孢杆菌；
S4、诱导步骤S3得到的重组枯草芽孢杆菌表达鳜鱼干扰素基因，即得所述鳜鱼干扰素蛋白mIFN。
进一步地，所述载体选自pHT43。
进一步地，所述大肠杆菌选自大肠杆菌DH5α。
进一步地，所述步骤S2中，大肠杆菌的培养操作具体为将大肠杆菌菌体涂布于含氨苄青霉素的培养基培养。
进一步地，所述步骤S2中，提取重组质粒的操作具体为从经培养后的含氨苄青霉素的培养基中挑取阳性单菌落进行提取操作。
进一步地，所述步骤S3中，转化为电转化。
进一步地，所述步骤S4中，诱导表达采用的诱导剂为IPTG。
进一步地，所述步骤S4中，鳜鱼干扰素蛋白mIFN诱导表达温度为37℃。
为解决上述第三个技术问题，本发明的技术方案为：含有所述的鳜鱼干扰素蛋白mIFN 基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。
进一步地，所述表达载体为pHT43质粒载体。
进一步地，所述宿主菌为大肠杆菌DH5α和/或枯草芽孢杆菌WB800。
为解决上述第四个技术问题，本发明的技术方案为：上述方法制得的鳜鱼干扰素蛋白 mIFN。
为解决上述第五个技术问题，本发明的技术方案为：上述鳜鱼干扰素蛋白mIFN在制备用于蛋白饲料中的应用。
进一步地，所述蛋白饲料用于抑制水产养殖动物中蛙虹彩病毒载量。
进一步地，所述蛙虹彩病毒包括鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、鳜蛙虹彩病毒(MRV)、鳜弹状病毒(SCRV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)。
进一步地，所述水产养殖动物为淡水鱼；优选地，所述淡水鱼为鳜鱼。
进一步地，所述蛋白饲料包括：35％鱼粉、5％肉骨粉、19％豆粕、17％面粉、3％血细胞蛋白粉、7％膨化大豆、2％磷酸二氢钙、1％赖氨酸、1.7％钙、1.3％磷、7％粗灰分、1％鳜鱼干扰素蛋白mIFN。
本发明还提供上述鳜鱼干扰素蛋白mIFN作为水产动物中蛙虹彩病毒抑制剂的应用。
本发明还提供上述鳜鱼干扰素蛋白mIFN在抑制水产动物中蛙虹彩病毒的应用。
本发明还提供一种抑制水产动物蛙虹彩病毒的方法，包括以下步骤：将如上述的鳜鱼干扰素蛋白mIFN通过饲喂进入水产动物体内。
进一步地，上述的鳜鱼干扰素蛋白mIFN制备的蛋白饲料按照16％投喂量添加到水产动物膨化饲料中，加水混匀后制备成软饲料投喂水产动物。
本发明的有益效果在于：本发明方案通过将鳜鱼干扰素mIFN基因定向克隆至质粒(如 pHT43)中构建重组质粒，重组质粒转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞，制备重组菌，获得了高产量，高活性的重组鳜鱼干扰素蛋白mIFN。本发明方案蛋白表达采用枯草芽孢杆菌感受态，高效表达mIFN蛋白，表达产物直接分泌到胞外发酵液中，可操作性强，发酵周期，避免了大肠杆菌表达***复杂的分离纯化步骤，简化生产流程，降低了生产成本。采用发酵得到的鳜鱼干扰素蛋白制得的蛋白饲料，通过口服免疫进入鳜鱼的肠道内，鳜鱼干扰素蛋白mIFN 可有效降低鳜鱼体内蛙虹彩病毒载量，达到抑制蛙虹彩病毒增值的效果，使鳜鱼发病率和死亡率大大降低，为养殖户减轻了经济的损失，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例一的重组大肠杆菌pHT43-mIFN-DH5α的菌液PCR鉴定电泳图，其中M为DNA Marker，1-10代表重组大肠杆菌pHT43-mIFN-DH5α；
图2为本发明实施例一的重组枯草芽孢杆菌鉴定分析图，其中图A为平板抗性筛选图，图B为重组枯草芽孢杆菌pHT43-mIFN-WB800的菌液PCR鉴定电泳图，图A中的1，2和3 代表三个阳性单菌落，图B中的M为DNA Marker，1，2和3代表重组枯草芽孢杆菌 pHT43-mIFN-WB800；
图3为本发明实施例一的重组蛋白的表达的情况，其中，M代表蛋白质Marker，S代表上清，P代表菌体；
图4为本发明实施例二的发酵产物中重组蛋白的表达情况图，其中，M代表蛋白质Marker，-代表诱导前的重组菌pHT43-mIFN-WB800，+代表诱导后的重组菌 pHT43-mIFN-WB800；
图5为本发明实施案例三的软颗粒实物图；
图6为本发明实施案例三的鳜鱼采食投喂饲料图；
图7为本发明实施案例三饲喂4d后死鱼解剖图，其中，A、B为鳜鱼死后形态图，C、D、E、F为鳜鱼死后解剖图；
图8为本发明实施案例三饲喂后6d后死鱼解剖图，其中，A、B为鳜鱼死后形态图，C、D、E、F为鳜鱼死后解剖图；
图9为本发明实施案例三投喂期间鳜鱼的存活数与死亡数记录图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
实施例中使用的主要试剂、原料、仪器及实验手段具体如下(实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料)：
菌株和质粒：
克隆载体pUC57购买于南京金斯瑞生物科技公司；原核表达载体pHT43及枯草芽孢杆菌WB800购自北京毕特博生物技术有限责任公司；大肠杆菌(E.Coli)DH5α，购自南京诺维赞生物科技有限公司。
主要试剂：
细菌培养：胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)购自英国OXOID公司，氨苄青霉素(Amp，100mg/ml)购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
基因克隆：2×TaqMaster Mix购买于南京诺维赞生物科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自美国Sigma公司；引物合成在南京金斯瑞生物科技有限公司；基因测序在英潍捷基(上海)贸易有限公司；质粒DNA小量提取试剂盒购于美国Omega公司。
核酸电泳：Biowest regular AGAROSE G-10(西班牙琼脂糖)购自成都硕研科技有限公司；核酸染料Gold view购自北京索莱宝科技有限公司；DNA marker购于宝生物工程(大连)有限公司；10×loading buffer购于南京诺维赞生物科技有限公司；50×TAE电泳缓冲液(贮存液)购自北京索莱宝科技有限公司；
蛋白表达：限制性内切酶BamHI、SmaI和T4连接酶购于宝生物工程(大连)有限公司；预染的蛋白质marker购自赛默飞世尔科技公司、SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactopyranoside)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Protein Loading Buffer(6X)购自上海碧云天生物技术有限公司；考马斯亮蓝快速染色液购自上海碧云天生物技术有限公司。
主要仪器：
5424R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；
905SS-ULTS型超低温冰箱(德国Thermo公司)；
Milli-Q Advantage A10超纯水仪(美国Milli-Q公司)；
Nandrop2000分光光度计(德国Thermo公司)；
C1000 Thermal Cycler PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)；
琼脂糖核酸电泳仪&水平电泳槽(美国Bio-Rad公司)；
Mini-Protean cell型凝胶成像***(美国Bio-Rad公司)；
Power Pac 100型蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；
TS100倒置生物显微镜(Nikon公司)；
微量加样枪(德国Eppendorf公司)；
AL204型电子天平(上海精密仪表有限公司)；
高压蒸汽灭菌锅(Bio-Rad公司)。
主要试剂配方：
LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，加入ddH2O溶解并定容至1000mL，调节pH值至7.0～7.3，121℃灭菌30min。
LB固体培养基(含Amp)：LB液体培养基中加入2.5％琼脂粉，121℃下灭菌30min，室温冷却至50℃左右，加入终浓度100μg/mL的氨苄青霉素(100mg/mL)，倒平板。
TB培养基：900ml去离子水加入胰蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4ml，摇动容器使溶质完全溶解，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。当溶液冷却至60℃或60℃以下时加入100ml无菌的0.17mol/LKH2PO4，(0.17mol/LKH2PO4溶液的配置方法是：用90ml去离子水溶解2.31gKH2PO4和12.54gK2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100ml，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min)。
1.0％琼脂糖凝胶：1.0g琼脂糖，加入90mL去离子水和10mL1×TAE，微波炉加热融化后制胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：首先进行样品前处理，将蛋白质样品与ProteinLoading Buffer在一个EP管中混合。100℃加热5-10min，取上清点样。再进行分离胶及浓缩胶的制备，将玻璃板、样品梳、垫片用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；将两块洗净的玻璃板之间加入垫片，装好玻璃板，再按如下体积配制10％分离胶5.0ml，混匀：ddH2O2ml；30％Acr-Bis 1.7ml；Gel buffer A 1.25ml；10％APS 0.05ml；TEMED 3ul。向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20min后胶即可聚合。再配制5％浓缩胶3.0ml，混匀：ddH2O 1ml；30％Acr-Bis 0.5ml；Gel buffer B 1.5ml；10％APS 0.03ml；TEMED3μl。将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，***样品梳；装好电泳***，加入电极缓冲液，上样20μl；先80V后120v，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45min；卸下胶板，剥离胶用沸水处理，置于水平摇床，于50rpm脱色5min，重复此操作1次。将处理好的蛋白胶放入考马斯亮蓝快速染色液中，室温染色10-30min；换去离子水，置于50rpm脱色摇床上，每20min更换一次去离子水至完全脱净。
Western blotting：将蛋白样品离心，取上清与菌体，分别与Protein LoadingBuffer混匀后， 100℃加热5-10min，瞬离，取煮沸后的样品上清点样，进行蛋白胶凝胶电泳。电泳结束后，取下蛋白胶进行转印1h，封闭过夜。次日进行一抗、二抗孵育，采用化学发光法进行显色。
实施例一鳜鱼干扰素蛋白mIFN基因原核表达得到鳜鱼干扰素蛋白mIFN
将鳜鱼干扰素蛋白mIFN基因委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成mIFN基因序列，该mIFN基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，具体如下： GGATCCTTAAGTTGCCCCTGTATGGATCATAACCTTAAACAGGAATTTAAAAAAAGCTTT GATTTGTTTGTTAATATGGCAACACATTCAAAACAATCGACTGAAGTTGCGAAATCGATT AAAACGGAGGCTTTTCCGCATGATCTGTACGGCCAACACTCCAAAGACTTTTATGAAGA CAAGCTGGACTGTATCGGACATGTATTTGAGGAAACGGAGGCGTTTTCTAAAGAGGACC ATTCGTCAGCGTCTTTTGAGGAAAAAACAGTGGAGGAGCTTGTCAAAGTGGAAACCCA CCAACTTGACGGTTCTAGAAGCTGTATAAAACATGGCCACAAAAATAAAAATAAAAATC TTCATATGTATTTCAAACGGCTCTTTCTTCATGTTCTAAAAGAAAGCGGCCATTTTTCTGA AGCAAAAGAATTGTTTAGGCAAGATATTTTTGAACAATGTATGAGACTTGACTTTCTTGT TAGTTCGCTTAAACTTACAACAAAACATCACCACCATCATCATTAACCCGGG。
1、重组质粒pHT43-mIFN的构建：
将人工合成pUC57-mIFN基因和市购所得pHT43质粒转化至DH5α后，涂布至含氨苄青霉素的LB平板过夜培养，挑取阳性单菌落于37℃含氨苄的LB液体培养基中摇床过夜培养。
采用质粒提取试剂盒提取DH5α中的pUC57-mIFN及pHT43质粒，将质粒分别进行BamHI和SamI双酶切，双酶切体系如表1所示：
表1质粒的双酶切体系
Figure RE-GDA0002982169630000071
将经双酶切后的质粒和基因进行核酸电泳，采用胶回收试剂盒进行回收，采用分光光度计测定回收后质粒和基因浓度；采用T4连接酶进行连接，连接体系如表2所示，连接转化后，涂布菌体于含氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养。
表2连接反应体系
Figure RE-GDA0002982169630000081
2、菌液PCR和测序鉴定重组质粒pHT43-mIFN，测序引物为：
pHT-seqF：CAATTCCCAATTAAAGGAG(Seq ID No.2)；pHT-seqR：CATTTGTTCCAGGTAAGGT(Seq ID No.3)。
3、重组大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒构建
将鉴定为阳性的重组质粒pHT43-mIFN电转化至枯草芽孢杆菌中(电转化主要参数： 1.2kV、1mm、4.8ms)，转化后，涂布菌体于含氨苄青霉素的LB平板上。挑选阳性菌落过夜培养后，菌液PCR鉴定(结果如图1所示)得到重组大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。对重组大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒进行鉴定，结果如图2所示。
4、鳜鱼干扰素蛋白mIFN诱导表达
将重组枯草芽孢杆菌增菌培养，在OD600为1.5时使用1mM IPTG，37℃诱导重组枯草芽孢杆菌表达18h，得到鳜鱼干扰素蛋白mIFN，通过Western blotting验证分析(结果如图3 所示)。
实验结果：从图1中可以看出，在750bp-1000bp附近有单一特异性条带，空载体PCR扩增得到的250bp左右，与mIFN基因本身528bp，扩增片段总长约778bp，菌液PCR鉴定重组质粒pHT43-mIFN构建成功；从图2中可以看出，挑选含有氯霉素抗性的LB平板初步筛选得到的重组枯草芽孢杆菌pHT43-mIFN-WB800，经核酸电泳进一步验证分析条带与图1 结果相符合，表明pHT43-mIFN-WB800重组穿梭质粒构建成功；从图3中可以看出，鳜鱼干扰素蛋白mIFN可显著表达。
实施例二发酵制备鳜鱼干扰素蛋白mIFN
1、实验步骤：鳜鱼干扰素蛋白mIFN的发酵实验：上罐发酵时，使用LB培养基制备种子液，将制备好的种子液接种至发酵培养基(TB培养基)，加入1mM IPTG诱导表达 18h后，结束发酵；通过SDS-PAGE验证发酵产物中重组蛋白表达(结果如图4所示)。
2、实验结果：图4中可以看出，发酵诱导后的mIFN蛋白条带位置为17-18kda左右与图3 Western blotting结果相符合，表明利用枯草芽孢杆菌表达的重组蛋白高密度发酵较为成功，可进行工艺化培养，为后续蛋白饲料制备提供原材料。
实施例三鳜鱼干扰素蛋白在改善鳜鱼体内肠道环境中的应用
1.实验步骤：蛋白饲料制备：将35％鱼粉、5％肉骨粉、19％豆粕、17％面粉、3％血细胞蛋白粉、7％膨化大豆、2％磷酸二氢钙、1％赖氨酸、1.7％钙、1.3％磷、7％粗灰分、1％鳜鱼干扰素蛋白mIFN(枯草芽孢杆菌表达mIFN蛋白的发酵产物培养基上清(v/v))此处为混匀，粉碎，搅拌，制粒后制备成可饲喂的颗粒蛋白。将上述颗粒蛋白按照16％投喂量添加到鳜鱼膨化饲料中，加水混匀后制备成软饲料进行投喂(如图5、6所示)，鳜鱼的饲料投喂情况如表 3所示。
表3鳜鱼投喂情况记录表
编号 主要参数 要点
1 产品添加量(％) 400g/2.5kg(16％)
2 饲料投喂率 2％
3 投喂次数 1次
4 每日投喂量 1000g
5 投喂周期 1周
在正式试验前，需要取鳜鱼的肝脏、脾脏、肾脏以检测鳜鱼是否携带蛙虹彩病毒。正常的鱼即使带毒但不影响其生理活动及采食情况，但发病的鱼往往出现躺底、采食少甚至闭口现象，解剖后常见体表鱼鳃与鱼鳍充血，肝、肾脏肿大、有出血点，个别还会出现腹水(如图7、8所示)。每日观察鳜鱼的采食情况及生理活动，并记录鳜鱼的存活余死亡数(如图9所示)。饲喂一周后，取正常鱼及发病鱼解剖后取前肝脏、脾脏、肾脏进行核酸检测(如表7所示)。
鳜鱼蛙虹彩病毒荧光PCR的具体步骤如下：
(1)病毒核酸提取(采用Mobio病毒DNA/RNA快速提取试剂盒)：将组织加入中装有液氮的研钵中进行捣碎、匀浆；于3000g，4℃离心15min；转移200ul组织匀浆上清至1.5ml离心管中；加入500μl Buffer RPL至样品中，涡旋混匀1min。(由于样品及裂解液均为粘稠液体，需要充分颠倒三四次后再进行涡旋才可使液体混成均一相，涡旋时应产生涡流现象)；把Viral Extraction Micro Column装在2ml收集管中。转移混合液至柱子中。10，000xg离心10s。(若样品较为复杂，延长时间60s使溶液充分过柱)；弃滤液把柱子装回收集管中。加入500μl Buffer W1A(已用无水乙醇稀释)至柱子中。10，000xg 离心10s；倒弃滤液把柱子装回收集管中。加入500μlBuffer W2R(已用无水乙醇稀释)至柱子中。10，000×g离心10s；倒弃滤液把柱子装回收集管。加入500μl Buffer W2R(已用无水乙醇稀释)至柱子中。10，000×g离心10s；倒弃滤液把柱子套回收集管。13，000×g离心空柱3min甩干柱子；将柱子转移至新的1.5ml离心管。加入60～100μl Nuclease Free Water至柱子的膜中央。13，000×g离心1min。(室温静置2min后离心可提高洗脱效率)；弃去柱子，把DNA/RNA进行下游实验或保存于-80℃待用。
(2)反转录(参照Takara PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书)：将提取的RNA反转录成cDNA。具体如下：去除基因组反应，在冰上配制如表4所述体系：
表4去除基因组反应体系
试剂 用量
5x gDNA Eraser Buffer 2.0μL
gDNA Eraser 1.0μL
Total RNA 7.0μL
将反应物于42℃保温2min，保存于4℃；反转录反应于冰上进行。配制如表5所述反应体系：
表5反转录反应体系
Figure RE-GDA0002982169630000101
Figure RE-GDA0002982169630000111
将反转录反应混合物置于PCR仪上，设置如下程序进行反应：37℃15min，85℃5s。存于4℃。配制如表6所述PCR反应体系(参照Takara TB
Figure RE-GDA0002982169630000112
Premix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)说明书)：
表6荧光PCR反应体系
Figure RE-GDA0002982169630000113
(3)荧光PCR的反应扩增条件为：95℃预变性30s；95℃5s、60℃34s；40个扩增循环；60℃读取荧光。荧光PCR的引物序列如下：MRV-F：5’-TCACCAAGCTGCCGTCTCT-3’(Seq IDNo.4)；MRV-R：5；AAAACTGCTGCTGCCCGAAAGC-3’(Seq ID No.5)。
表7鳜鱼蛙虹彩病毒核酸检测
Figure RE-GDA0002982169630000114
Figure RE-GDA0002982169630000121
荧光PCR判定标准：若CT值≤37，则判定为核酸阳性“+”；若37＜CT值≤40，则判定为可疑，需重新检测，若重新检测结果仍然可疑，则判定为核酸阳性“+”；若无CT值或CT 值＞40，则判定为核酸阴性“-”。(此判定分析由广东海大畜牧兽医研究院有限公司动物疫病检测中心提供)
2.实验结果：从图9中可以看出，饲喂一周期间，鳜鱼的死亡数由高到低，这可能与口服干扰素后调动鱼体机体免疫应激后机体处于一个适应过程，会出先一定量的死亡数，但饲喂一周后的鳜鱼存活率可达到87％；因正常鳜鱼试验前本身带毒，核酸检测时，正常鳜鱼与发病鱼均可检测出鳜蛙虹彩病毒，但正常鳜鱼的蛙虹彩病毒的病毒载量并不高，并不会引起鱼体发病甚至死亡，本发明方案目的主要是监测发病鱼中各个脏器的病毒载量是否存在下调，从表7可以看出，口服鳜鱼干扰素后，鳜蛙虹彩病毒载量明显下调，表明干扰素可能作为防控鱼虹彩病毒的手段之一。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<120> 一种鳜鱼干扰素基因、干扰素蛋白mIFN及其制备方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccttaa gctgccgctg gatggatcat aaatttaagc agcattccga aaacagcctt 60
gatttactcg ataaaatggc aaacaattca accaactcaa ctgaagatgc ggaagtgaaa 120
cacacggcgg ctttcccgaa tgatttgtac agccaagcat ccacagcctc tgctgaagac 180
aagctgggat ttatcggaca ggtacttgag gaaacggccg cgctgtttga agaggatcac 240
tcgtcagcgt catgggagga aaatacagtt gagaactttg tcaatgtggt aacccagcaa 300
gctgacggtt tgagaagctg tatagggagt catggccaca aaaaaaaaaa taaaaagctt 360
catatgtatt tcaagcggct ctctcgtcat gtcctacaag aaatgggcca ttctgcagaa 420
gcatgggaat tgattaggca agagattaaa gaacatttaa tgagagccga ccttcttgtt 480
agttcgctgc tgacaacaaa tcatcaccac catcatcatt aacccggg 528
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caattcccaa ttaaaggag 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catttgttcc aggtaaggt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaccaagct gccgtctct 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaactgctg ctgcccgaaa gc 22

Claims (10)

1.一种鳜鱼干扰素基因，其特征在于：所述鳜鱼干扰素基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.一种鳜鱼干扰素蛋白mIFN的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将如权利要求1所述的鳜鱼干扰素基因连接到载体中，得到重组质粒；
S2、将重组质粒转入大肠杆菌，培养后提取重组质粒；
S3、将经步骤S2提取得到的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌，得到重组枯草芽孢杆菌；
S4、诱导步骤S3得到的重组枯草芽孢杆菌表达鳜鱼干扰素基因，即得所述鳜鱼干扰素蛋白mIFN。
3.如权利要求2所述的鳜鱼干扰素蛋白mIFN的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中，诱导表达采用的诱导剂为IPTG。
4.含有如权利要求1所述的鳜鱼干扰素基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。
5.一种如权利要求2至3中任一所述的方法制得的鳜鱼干扰素蛋白mIFN。
6.如权利要求5所述的鳜鱼干扰素蛋白mIFN在制备用于蛋白饲料中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述蛋白饲料用于抑制水产养殖动物中蛙虹彩病毒载量。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述水产动物为淡水鱼；优选地，所述淡水鱼为鳜鱼。
9.一种如权利要求5所述的鳜鱼干扰素蛋白mIFN作为水产动物中蛙虹彩病毒抑制剂的应用。
10.一种抑制水产动物蛙虹彩病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：将如权利要求5所述的鳜鱼干扰素蛋白mIFN通过饲喂进入水产动物体内。
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