CN113121672A - 猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用 - Google Patents

猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113121672A
CN113121672A CN202110426900.2A CN202110426900A CN113121672A CN 113121672 A CN113121672 A CN 113121672A CN 202110426900 A CN202110426900 A CN 202110426900A CN 113121672 A CN113121672 A CN 113121672A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gamma
sumo
feifn
protein
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110426900.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113121672B (zh
Inventor
魏衍全
张勇
成述儒
武小椿
任丽君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gansu Agricultural University
Original Assignee
Gansu Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gansu Agricultural University filed Critical Gansu Agricultural University
Priority to CN202110426900.2A priority Critical patent/CN113121672B/zh
Publication of CN113121672A publication Critical patent/CN113121672A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113121672B publication Critical patent/CN113121672B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用，属于生物基因工程领域。该方法包括的步骤有：⑴FeIFN‑γ蛋白的信号肽序列和理化性质分析；⑵原核表达质粒pET28a‑SUMO‑FeIFN‑γ的构建；⑶含重组质粒的BL21细菌的诱导表达与重组蛋白的可溶性分析；⑷SUMO‑FeIFN‑γ融合蛋白最佳表达条件的筛选；⑸SUMO‑FeIFN‑γ融合蛋白的大量表达和纯化；⑹SUMO‑FeIFN‑γ融合蛋白的酶切和纯化。本发明克隆不包含信号肽的成熟蛋白基因序列，构建了原核表达质粒，并转化BL21感受态细胞进行表达和纯化，使用了带有SUMO助溶标签的pET28a‑SUMO表达载体，从而实现了目的蛋白的可溶性表达，外源蛋白的可溶性表达水平高，具备很高的生物学活性，纯化步骤简便，为后期抗病毒药物的开发奠定了基础。

Description

猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，特别涉及猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用。
背景技术
干扰素(interferon，IFN)是一种由机体免疫细胞产生，在诱生剂作用于活细胞后，细胞分泌的一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性的糖蛋白。根据干扰素的来源、生物学性质及活性，将干扰素分Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素主要起抗病毒和抗肿瘤作用，包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ和IFN-ζ，Ⅱ型干扰素中仅有IFN-γ亚型，在抗胞内病原体的宿主防御中起关键作用。1992年，日本东丽株式会社的Nakamura等人首次分离到了猫干扰素基因，将其归类为ω型干扰素，有研究表明IFN-ω对于猫白血病毒(FLV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)共感染的猫以及细小病毒具有明显治疗效果，之后在此基础上证明了IFN-ω对FIV的复制有抑制作用且存在剂量依赖性。由于猫IFN的抗病毒能力相当广泛且具有显著效果，因此研究猫IFN的抗病毒机制和治疗有关猫病毒病的实践中具有重要意义。IFN-γ作为一种新型干扰素，在抗病毒和抗肿瘤方面发挥较强的作用，1995年鸡IFN-γ基因被首次成功克隆，随后成功表达出重组鹅、家兔、猪、牛等动物的IFN-γ并将其用于临床治疗，但有关猫的IFN-γ研究却鲜少被报道。
近年来，人们生活水平迅速提高，带动了养宠业蓬勃发展，与猫有关的疾病特别是病毒性疾病逐年增多。干扰素作为机体重要的防疫***成员能够对抗病毒感染，而体外表达的干扰素与天然干扰素具有高度相似的生物学活性。所以，体外表达的猫干扰素有望增强宠物猫的免疫力，降低患病率和死亡率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用，该方法制备得到的猫干扰素γ具有良好的生物活性，能够用于治疗猫病毒感染性疾病。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法，包括以下步骤：
(1)FeIFN-γ蛋白的信号肽序列和理化性质分析
通过SignalP-4.0Server和Expasy在线服务器分别预测、分析两种蛋白的信号肽段和理化性质；
(2)原核表达质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的构建
根据GenBank收录的FeIFN-γ的序列，舍弃掉信号肽后设计PCR引物，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，并分别通过引物引入BamH I和HindⅢ酶切位点，进行PCR扩增，然后将PCR产物经双酶切后回收目的基因片段，同时双酶切、回收pET28a-SUMO载体片段，经T4DNA连接酶连接后，转入DH-5α感受态细胞，提取质粒经PCR和双酶切验证后测序，测序正确后命名为pET28a-SUMO-FeIFN-γ；
(3)含重组质粒的BL21细菌的诱导表达与重组蛋白的可溶性分析
将重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ转入BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，接种于含有卡那霉素抗性的LB培养液中过夜培养，次日以1:100转接入新的含卡那霉素抗性的LB培养液中，于37℃、220r/min摇床震荡培养2h，待菌液OD600值达到0.6～0.8，取1mL菌液作为对照，剩余菌液加入IPTG诱导剂，终浓度为1mmol/L，在16℃、220r/min摇床培养10h后以8000rpm离心10min收集菌体，弃去上清后的菌体沉淀加入结合缓冲液，用移液器多次吹打使菌体重悬并加入PMSF，终浓度为1mmol/L，重悬后的菌液超声破碎，全程置于冰上操作，超声3s，停顿4s，功率220W，以菌液变得清澈透亮为准，超声结束后将菌液以10000rpm离心10min，收集上清、沉淀制备样品，用SDS-PAGE电泳检测分析蛋白的表达水平及水溶性情况；
(4)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白最佳表达条件的筛选
在培养瓶中以1：100加入菌液和含卡那霉素抗性的LB培养液，于37℃、220r/min摇床震荡培养，当菌液OD600值到0.6～0.8时，将各培养瓶分别按IP TG浓度梯度、诱导温度梯度及时间梯度进行条件筛选，用SDS-PAGE电泳检测；所述IPTG浓度梯度为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mm ol/L，诱导温度梯度为37℃、30℃、22℃、16℃，时间梯度3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h；
(5)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的大量表达和纯化
在确定最佳表达条件后扩大培养，将诱导、超声后的上清用0.45μm孔径的滤膜过滤后进行纯化，取Ni亲和层析柱用蒸馏水清洗，并用结合缓冲液平衡多次，然后将滤液加入层析柱后置于室温结合2h，以0.5～1mL/min的流速收集流穿液；将层析柱的液体用洗涤缓冲液以1mL/min的流速清洗Ni柱，以8～10倍柱体积的用量去除杂蛋白；最后用5～10倍柱体积的洗脱缓冲液以0.5～1mL/min的流速洗脱层析柱上的蛋白，收集的样品均要置于冰上，最后用SDS-PAGE电泳检测；
(6)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切和纯化
将Sumo蛋白酶以1：10比例加入融合蛋白液，4℃条件下酶切，分别收集3h、6h、9h、12h不同时间点的酶切产物，使用30ku截留柱和10ku截留柱对酶切后的蛋白脱盐、浓缩和进一步纯化，SDS-PAGE电泳检测，用Bradford测定法测定目的蛋白浓度。
进一步的，所述结合缓冲液为含50mM Na2HPO4、300mM NaCl、10mM咪唑的pH8.0的溶液。
进一步的，所述SUMO-FeIFN-γ融合蛋白诱导表达的最佳条件为IPTG浓度0.8mmol/L、温度16℃、时间9h。
进一步的，步骤(6)中，使用30ku截留柱和10ku截留柱时，首先将酶切后的蛋白和交换Buffer混匀，在30ku截留柱中加入3mL蛋白，使用水平离心机4℃、3000r/min离心10min，再将3mL交换Buffer加入截留柱，浓缩到200～500μL，重复多次后收集每次的流穿液，然后将流穿液依次加入到10ku的截留柱中，每次3mL，直至将上述流穿液全部加完，最后截留剩余体积500μL，即为去掉SUMO标签的目的蛋白；所述交换Buffer为50mM Na2HPO4、300mM NaCl、pH8.0的溶液，且经0.22μm超滤膜超滤处理。
本发明还提供了一种猫干扰素γ，其是采用上述方法制备得到的。
本发明还提供了上述猫干扰素γ在制备治疗猫细小病毒感染疾病药物方面的应用。
本发明的有益技术效果是：
(1)本发明的方法克隆不包含信号肽的成熟蛋白基因序列，构建了原核表达质粒，并转化BL21感受态细胞进行表达和纯化；由于大肠杆菌表达***具有表达水平高、操作简便、容易培养和控制等优点，但表达过程中目的蛋白易形成包涵体，而非天然构象的功能蛋白需要重新折叠复性才能获得其原有的生物活性，所以有必要表达能够直接折叠正确的可溶性蛋白，本发明中使用了带有SUMO助溶标签的pET28a-SUMO表达载体，从而实现了目的蛋白的可溶性表达，该表达载体是将pET28a进行改造使其在N端His标签后融合一个SUMO标签，可以提高外源蛋白的可溶性表达水平，促进其正确折叠且具备生物学活性，使纯化步骤更为简便。
(2)本发明还对SUMO-FeIFN-γ融合蛋白诱导表达条件进行优化，当诱导表达条件为IPTG终浓度0.8mmol/L、温度16℃、时间9h时，表达量最高，通过降低诱导温度和控制IPTG浓度、选择合适的载体和表达宿主菌、优化融合标签等方法提高融合蛋白的可溶性表达。
(3)本发明实现了SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的可溶性表达，经镍柱纯化后用SUMO蛋白酶在4℃条件下酶切6h去除SUMO标签，再经过两次截留柱纯化后得到不含标签的FeIFN-γ，为后期抗病毒药物的开发奠定了基础。
附图说明
图1为本发明一实施例的FeIFN-γ蛋白的信号肽分析图；
图2为本发明一实施例的FeIFN-γ基因的PCR扩增产物电泳分析图，其中，M表示DNA标准DL5000，1表示FeIFN-γ阴性对照；2表示FeIFN-γ基因；
图3为本发明一实施例的pET28a-SUMO-FeIFN-γ双酶切反应结果，其中，M表示DNA标准DL5000，1表示重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ，2表示pET28a-SUMO-FeIFN-γ双酶切产物；
图4为本发明一实施例的pET28a-SUMO-FeIFN-γ诱导表达产物SDS-PAGE分析图，其中，M表示蛋白分子质量标准，1-4分别表示重组菌诱导前产物、重组菌诱导后产物、重组菌诱导产物上清和重组菌诱导产物沉淀；
图5为本发明一实施例的pET28a-SUMO-FeIFN-γ在不同IPTG浓度下诱导表达产物的SDS-PAGE电泳分析图，其中，M表示蛋白分子质量标准，1-9分别表示0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L的IPTG浓度诱导的重组菌产物；
图6为本发明一实施例的pET28a-SUMO-FeIFN-γ在不同温度下诱导表达产物的SDS-PAGE分析图，其中，M表示蛋白分子质量标准，1-9分别表示37℃、30℃、22℃、16℃温度下诱导的重组菌产物；
图7为本发明一实施例的pET28a-SUMO-FeIFN-γ在不同时间下诱导表达产物的SDS-PAGE电泳分析图，其中，M表示蛋白分子质量标准，1-9分别表示3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h不同时间点诱导的重组菌产物；
图8为本发明一实施例的SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的纯化结果，其中，M表示蛋白分子质量标准，1-3表示纯化后的SUMO-FeIFN-γ蛋白；
图9为本发明一实施例的SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切分析结果，其中，M表示蛋白分子质量标准，1表示SUMO蛋白酶，2-5分别表示酶切SUMO-FeIFN-γ融合蛋白3h、6h、9h、12h，6表示SUMO-FeIFN-γ融合蛋白酶切之前；
图10为本发明一实施例的SUMO-FeIFN-γ融合蛋白酶切后纯化结果，其中，M表示蛋白分子质量标准，1-5表示SUMO-FeIFN-γ融合蛋白浓缩后30ku截留柱截留液、酶切SUMO-FeIFN-γ融合蛋白6h、SUMO-FeIFN-γ融合蛋白30ku截留柱截留液、SUMO-FeIFN-γ融合蛋白30ku截留柱流穿液、FeIFN-γ蛋白10ku截留柱截留液。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
具体实施例1
1、材料和试剂
1.1菌株、质粒和主要试剂
感受态细胞DH5α、BL21购自北京擎科生物科技有限公司；T4 DNA连接酶、IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、卡那霉素均购自TaKaRa公司；限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ购自New England BioLabs公司；PMSF(苯甲基磺酰氟)、SUMO蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司；Ni-NTA纯化柱、蛋白浓缩柱、截留柱购自Merck公司。
2、猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法
2.1 FeIFN-γ蛋白的信号肽序列和理化性质分析
通过SignalP-4.0Server和Expasy在线服务器分别预测、分析两种蛋白的信号肽段和理化性质，其中，
SignalP-4.0Server网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，Expasy网址：https://web.expasy.org/protparam/。
2.2原核表达质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的构建
根据GenBank收录的FeIFN-γ(GenBank No.NM_001009873.1)的序列，舍弃掉信号肽后设计PCR引物，FeIFN-γ上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ IDNo.2所示，并分别通过引物引入BamH I和HindⅢ酶切位点，PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性25s，56℃退火25s，72℃延伸35s，共32个循环；72℃延伸10min，接着将PCR扩增产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后回收目的基因片段，同时双酶切、回收pET28a-SUMO载体片段，经T4 DNA连接酶连接后，转入DH-5α感受态细胞，提取质粒经PCR和双酶切验证后送于测序，测序正确后命名为pET28a-SUMO-FeIFN-γ。
2.3含重组质粒的BL21细菌的诱导表达与重组蛋白的可溶性分析
将重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ转入BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，接种于含有卡那霉素抗性的LB培养液中过夜培养，次日以1:100转接入新的含卡那霉素抗性的LB培养液中，于37℃、220r/min摇床震荡培养2h，待菌液OD600值达到0.6～0.8，取1mL菌液作为对照，剩余菌液加入IPTG诱导剂，终浓度为1mmol/L，在16℃、220r/min摇床培养10h后以8000rpm离心10min收集菌体，弃去上清后的菌体沉淀加入结合缓冲液，用移液器多次吹打使菌体重悬并加入PMSF，终浓度为1mmol/L，重悬后的菌液超声破碎，全程置于冰上操作，超声3s，停顿4s，功率220W，以菌液变得清澈透亮为准，超声结束后将菌液以10000rpm离心10min，收集上清、沉淀制备样品，用SDS-PAGE电泳检测分析蛋白的表达水平及水溶性情况。
2.4 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白最佳表达条件的筛选
在培养瓶中以1：100加入菌液和含K+的LB培养液，于37℃、220r/min摇床震荡培养，当菌液OD600值到0.6～0.8时，将各培养瓶分别按IPTG浓度梯度0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L，诱导温度37℃、30℃、22℃、16℃，时间梯度3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h进行条件筛选，用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达水平。
2.5 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的大量表达和纯化
在确定最佳表达条件后扩大培养，将诱导、超声后的上清用0.45μm孔径的滤膜过滤后进行纯化，将Ni亲和层析柱用蒸馏水清洗，并用结合缓冲液平衡多次，然后将滤液加入层析柱后置于室温结合2h，以0.5～1mL/min的流速收集流穿液；将层析柱的液体用洗涤缓冲液以1mL/min的流速清洗Ni柱，以8～10倍柱体积的用量去除杂蛋白；最后用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液以0.5～1mL/min的流速洗脱层析柱上的蛋白，收集的样品均要置于冰上，最后用SDS-PAGE电泳检测上述收集的样品。
2.6 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切和纯化
将Sumo蛋白酶以1：10比例加入融合蛋白液，4℃条件下酶切，分别收集不同时间点3h、6h、9h、12h的酶切产物，使用30ku截留柱和10ku截留柱对两种酶切后的蛋白脱盐、浓缩和纯化；首先将酶切后的蛋白和交换Buffer混匀，在30ku截留柱中加入3mL蛋白，使用水平离心机4℃、3000r/min离心10min，再将3mL交换Buffer加入截留柱，浓缩到200～500μL，重复多次后收集每次的流穿液，然后将流穿液依次加入到10ku的截留柱中，每次3mL，直至将上述流穿液全部加完，最后截留剩余体积为500μL，即为去掉SUMO标签的目的蛋白，SDS-PAGE电泳检测，用Bradford测定法测定目的蛋白浓度；所述交换Buffer为含50mM Na2HPO4、300mM NaCl的pH8.0溶液，且经0.22μm超滤膜超滤处理。
3、结果与分析
3.1 FeIFN-γ蛋白信号肽分析
通过SignalP-4.0Server在线服务器分析了FeIFN-γ蛋白的信号肽，参阅图1。
结果显示：FeIFN-γ蛋白的信号肽序列是前20位氨基酸，属于分泌性蛋白，第20位氨基酸和第21位氨基酸为信号肽的切割位点。
3.2 FeIFN-γ蛋白理化性质预测分析
用Protparam在线服务器分析FeIFN-γ蛋白的理化性质。
结果表明：FeIFN-γ蛋白含有167个氨基酸，分子量为19.6ku，去除信号肽为17.3ku，等电点是9.1，总体亲水性平均值是-0.483。
3.3 PCR扩增结果
用1％琼脂糖凝胶电泳检测FeIFN-γ基因的PCR扩增产物，参阅图2。
结果显示：得到特异性目标条带大小约为435bp，结果与预期相符。
3.4重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的双酶切鉴定
经BamHⅠ/HindⅢ双酶切2h后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，参阅图3。
结果显示：重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ在大约5633bp和435bp处分别出现一条条带，结果与预期相符。
3.5重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的诱导表达与可溶性分析结果
将构建好的pET28a-SUMO-FeIFN-γ重组质粒转入BL21感受态细胞中诱导表达，将菌体超声裂解，超声时长20min时菌液变得清澈透亮，分别取蛋白上清和沉淀制样，用SDS-PAGE电泳检测，参阅图4。
结果显示：重组菌经诱导后出现了明显表达条带，大小约为34ku，且上清中的条带明显多于沉淀，说明融合蛋白以可溶性形式在大肠杆菌中得到了表达。
3.6 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的诱导表达条件优化结果
为了优化融合蛋白表达条件，设置不同的诱导剂浓度、诱导时间及温度的试验分组，分别诱导之后收集菌体制样，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达水平，参阅图5-7。
结果表明：在IPTG终浓度为0.8mmol/L时，融合蛋白获得较高表达量；使用最佳浓度的IPTG时，16℃诱导融合蛋白时的表达量明显高于其他温度时的表达水平；同样在16℃诱导下，融合蛋白表达量在9h时表达量达到最高，之后随着时间的递增都没有明显增多，所以表明其表达量最优的条件为:IPTG0.8mmol/L，16℃诱导9h。
3.7 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的纯化结果
以最佳表达条件大量表达SUMO-FeIFN-γ融合蛋白，将诱导表达后的菌体离心、重悬、冰浴超声破碎，收集上清液，通过镍柱纯化蛋白，经SDS-PAGE检测，参阅图8。
结果表明：洗脱得到的融合蛋白在34ku处出现清晰的单一条带。
3.8 SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切分析和纯化结果
用SUMO蛋白酶切割纯化后的融合蛋白，参阅图9-10。
结果表明：在4℃酶切6h后，去标签蛋白的量随着时间延长无明显增多，所以选择酶切6h即可，酶切后纯化出的蛋白即为去除SUMO标签的FeIFN-γ蛋白，用SDS-PAGE检测表明获得了纯度较高且杂蛋白较少的目的蛋白，去除SUMO标签后蛋白条带大小约为17ku，与预期结果相符。利用Bradford测定法以BSA作为标准蛋白测得FeIFN-γ蛋白含量为0.85mg/mL。
具体实施例2猫干扰素γ抗病毒活性、安全性及临床应用
1.抗病毒活性测定
以猫细小病毒为模式病毒，采用微量细胞病变抑制法测定本发明得到的猫干扰素γ的抗病毒活性。
将猫肾细胞F81接种于96孔细胞板，置于37℃、5％CO2培养箱培养至细胞单层，分别加入2倍倍比稀释的猫干扰素γ作用12h，然后每孔加入100TCID50的病毒液，同时设置阴性对照组以及已知猫干扰素ω2阳性对照组，24h后观察细胞病变情况，结果见表1。
表1重组猫干扰素γ抗病毒活性结果
Figure BDA0003029928070000101
Figure BDA0003029928070000111
注：(+)表示无细胞病变(即有抗病毒活性)，(-)表示有细胞病变(即无抗病毒活性)。
结果表明：本发明的猫干扰素γ具有良好的抗病毒活性，有效抗猫细小病毒浓度为1.20mg/mL，稍低于已知猫ω2干扰素(0.80mg/mL)，在抗猫细小病毒活性方面显示了良好的应用潜力。
2.安全性实验
取40只6个月到1岁龄的猫，雌雄各半，每只静脉注射1.5mg/kg猫干扰素γ。
统计结果：27只猫出现轻微嗜睡，8-12小时后症状消失，31只猫体温略有升高，但在正常范围之内，体液中电解质指标未见异常。
3.临床试用效果
取人工感染的猫细小病毒的猫30只，分为给药组和对照组，每组15只，给药组每天静脉滴注1.5mg/kg的猫干扰素γ，对照组只注射生理盐水安慰剂，连续注射三天。
结果表明：猫干扰素γ可以有效地治疗猫细小病毒感染，发病猫病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热症状消失。

Claims (6)

1.一种猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)FeIFN-γ蛋白的信号肽序列和理化性质分析
通过SignalP-4.0Server和Expasy在线服务器分别预测、分析两种蛋白的信号肽段和理化性质；
(2)原核表达质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的构建
根据GenBank收录的FeIFN-γ的序列，舍弃掉信号肽后设计PCR引物，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，并分别通过引物引入BamH I和HindⅢ酶切位点，进行PCR扩增，然后将PCR产物经双酶切后回收目的基因片段，同时双酶切、回收pET28a-SUMO载体片段，经T4DNA连接酶连接后，转入DH-5α感受态细胞，提取质粒经PCR和双酶切验证后测序，测序正确后命名为pET28a-SUMO-FeIFN-γ；
(3)含重组质粒的BL21细菌的诱导表达与重组蛋白的可溶性分析
将重组质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ转入BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，接种于含有卡那霉素抗性的LB培养液中过夜培养，次日以1:100转接入新的含卡那霉素抗性的LB培养液中，于37℃、220r/min摇床震荡培养2h，待菌液OD600值达到0.6～0.8，取1mL菌液作为对照，剩余菌液加入IPTG诱导剂，终浓度为1mmol/L，在16℃、220r/min摇床培养10h后以8000rpm离心10min收集菌体，弃去上清后的菌体沉淀加入结合缓冲液，用移液器多次吹打菌体重悬并加入PMSF，终浓度为1mmol/L，重悬后的菌液超声破碎，全程置于冰上操作，超声3s，停顿4s，功率220W，以菌液变得清澈透亮为准，超声结束后将菌液以10000rpm离心10min，收集上清、沉淀制备样品，用SDS-PAGE电泳检测分析蛋白的表达水平及水溶性情况；
(4)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白最佳表达条件的筛选
在培养瓶中以1：100加入菌液和含卡那霉素抗性的LB培养液，于37℃、220r/min摇床震荡培养，当菌液OD600值到0.6～0.8时，将各培养瓶分别按IPTG浓度梯度、诱导温度梯度及时间梯度进行条件筛选，用SDS-PAGE电泳检测SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的表达水平；
(5)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的大量表达和纯化
在确定最佳表达条件后扩大培养，将诱导、超声后的上清用滤膜过滤进行纯化，取Ni亲和层析柱用蒸馏水清洗，并用结合缓冲液平衡多次，然后将滤液加入层析柱后置于室温结合2h，以0.5～1mL/min的流速收集流穿液；将层析柱的液体用洗涤缓冲液以1mL/min的流速清洗Ni柱，以8-10倍柱体积的用量去除杂蛋白；最后用5～10倍柱体积的洗脱缓冲液以0.5～1mL/min的流速洗脱层析柱上的蛋白，收集的样品均要置于冰上，最后用SDS-PAGE电泳检测；
(6)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切和纯化
将Sumo蛋白酶以1：10比例加入洗脱的融合蛋白液，4℃条件下酶切，分别收集不同时间段的酶切产物，使用30ku截留柱和10ku截留柱对酶切后的蛋白脱盐、浓缩和进一步的纯化，SDS-PAGE电泳检测，用Bradford测定法测定目的蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法，其特征在于：所述结合缓冲液为含50mM Na2HPO4、300mM NaCl、10mM咪唑的pH 8.0的溶液。
3.根据权利要求1所述猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法，其特征在于：所述SUMO-FeIFN-γ融合蛋白诱导表达的条件为IPTG浓度0.8mmol/L、温度16℃、时间9h。
4.根据权利要求1所述猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法，其特征在于：步骤(6)中，使用30ku截留柱和10ku截留柱时，首先将酶切后的蛋白和交换Buffer混匀，在30ku截留柱中加入3mL蛋白，使用水平离心机4℃、3000r/min离心10min，再将3mL交换Buffer加入截留柱，浓缩到200～500μL，重复多次后收集每次的流穿液，然后将流穿液依次加入到10ku的截留柱中，每次3mL，直至将上述流穿液全部加完，最后截留剩余体积500μL，即为去掉SUMO标签的目的蛋白；所述交换Buffer为50mM Na2HPO4、300mM NaCl、pH8.0的溶液，且经0.22μm超滤膜超滤处理。
5.一种猫干扰素γ，其特征在于是采用权利要求1-4任一项所述重组猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法制备得到的。
6.一种如权利要求5所述的猫干扰素γ在制备治疗猫细小病毒感染疾病药物方面的应用。
CN202110426900.2A 2021-04-20 2021-04-20 猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用 Active CN113121672B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110426900.2A CN113121672B (zh) 2021-04-20 2021-04-20 猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110426900.2A CN113121672B (zh) 2021-04-20 2021-04-20 猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113121672A true CN113121672A (zh) 2021-07-16
CN113121672B CN113121672B (zh) 2023-01-03

Family

ID=76778496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110426900.2A Active CN113121672B (zh) 2021-04-20 2021-04-20 猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113121672B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115322978A (zh) * 2022-04-24 2022-11-11 上海健启生物科技有限公司 一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004096264A1 (ja) * 1997-10-30 2004-11-11 Tsunesuke Kajimoto ネコ白血病ウイルス感染症の治療方法
CN1730491A (zh) * 2005-08-09 2006-02-08 中国科学院微生物研究所 猫ω干扰素及其编码基因与应用
CN102580079A (zh) * 2012-03-30 2012-07-18 河南农业大学 猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法
CN104220052A (zh) * 2012-02-24 2014-12-17 阿拉塔纳医疗有限公司 用于治疗细小病毒感染的化合物
CN107569516A (zh) * 2017-08-16 2018-01-12 北京京蒙细胞生物科技股份有限公司 一种控制猫瘟热的药物及其制备方法和应用
CN109206502A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 东北农业大学 一种猫干扰素ω及其制备方法和在抗病毒中的应用
CN110951757A (zh) * 2019-11-25 2020-04-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种南非2型***病毒vp3基因的原核可溶性表达方法
CN111087452A (zh) * 2019-12-18 2020-05-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004096264A1 (ja) * 1997-10-30 2004-11-11 Tsunesuke Kajimoto ネコ白血病ウイルス感染症の治療方法
CN1730491A (zh) * 2005-08-09 2006-02-08 中国科学院微生物研究所 猫ω干扰素及其编码基因与应用
CN104220052A (zh) * 2012-02-24 2014-12-17 阿拉塔纳医疗有限公司 用于治疗细小病毒感染的化合物
CN102580079A (zh) * 2012-03-30 2012-07-18 河南农业大学 猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法
CN107569516A (zh) * 2017-08-16 2018-01-12 北京京蒙细胞生物科技股份有限公司 一种控制猫瘟热的药物及其制备方法和应用
CN109206502A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 东北农业大学 一种猫干扰素ω及其制备方法和在抗病毒中的应用
CN110951757A (zh) * 2019-11-25 2020-04-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种南非2型***病毒vp3基因的原核可溶性表达方法
CN111087452A (zh) * 2019-12-18 2020-05-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. MOCHIZUKI: "Inhibitory effects of recombinant feline interferon on the replication of feline enteropathogenic viruses in vitro", 《VETERINARY MICROBIOLOGY》 *
NCBI: "Felis catus interferon gamma (IFNG), mRNA", 《NCBI》 *
任丽君: "猫ω干扰素和γ干扰素的可溶性原核表达及纯化", 《动物医学进展》 *
任丽君: "猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性原核表达、纯化及安全性初步评价", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》 *
曲萍: "猫干扰素omega基因的可溶性表达及其重组蛋白纯化方法和活性的研究", 《万方数据知识服务平台》 *
韩阳: "犬干扰素-γ 的可溶表达及其产物的活性鉴定", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115322978A (zh) * 2022-04-24 2022-11-11 上海健启生物科技有限公司 一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113121672B (zh) 2023-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106674354B (zh) 一种鸡干扰素IFN-λ与IFN-α的融合蛋白
CN106399321A (zh) 一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺
CN110982822B (zh) 一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用
CN113121672B (zh) 猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用
CN111304181A (zh) 一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用
CN105647945A (zh) 一种串联鸭α、γ干扰素基因及其制备方法和应用
CN108314718A (zh) 一种家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体、其编码基因及其表达和应用
CN107936107B (zh) 长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白、制备方法及应用
CN110845594A (zh) 可增强长牡蛎免疫应答的重组血清淀粉样蛋白a及制备方法
CN112402598A (zh) 针对鸭疫里默氏杆菌感染引起的通用型亚单位疫苗
CN103215274B (zh) 斜带石斑鱼干扰素IFNγ2及其制备方法和应用
CN108864273B (zh) 一种模拟人源性抗菌肽及其制备方法
CN108840934B (zh) 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法
CN108912222B (zh) 一种重组犬干扰素CaIFN-λ及其应用
CN114539426A (zh) 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法
CN113667005A (zh) 太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用
CN109776653B (zh) 一种人血清白蛋白黏附肽及其应用
CN109517775B (zh) 大黄鱼IFNc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用
CN106399322A (zh) 一种鸡β干扰素优化基因及重组鸡β干扰素的生产工艺
CN102174553A (zh) 一种松鼠葡萄球菌脱皮毒素c蛋白的制备方法
CN110129329A (zh) 一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法
CN114044816B (zh) 重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME-N、制备方法及其应用
CN103789321A (zh) 一种重组人胸腺肽α1的制备方法
CN108359679A (zh) 含有人巨细胞病毒ul147基因的重组质粒、基因工程菌及其应用
CN102964443A (zh) 一种重组鸡γ干扰素重组载体构建及其生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant