CN109507337A - 一种基于血尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的新方法 - Google Patents
一种基于血尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的新方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于血尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于,具体步骤如下所示:S1、1:1的选取试验组和对照组;S2、定期收集待测样本;S3、处理S2所述的样本,进行UPLC‑Q‑TOF/MS分离分析;S4、对S3获得的UPLC‑Q‑TOF/MS图谱数据进行代谢轮廓分析,获得数据集;S5、根据S4获得的数据集构建PLS‑DA模型;S6、根据S5构件的模型的S‑PLOT载荷图和VIP分值,筛选出能够区分空白组和甘地胶囊给药组的代谢标志物;S7、采用IPA分析方法对S6筛选得到的代谢标志物进行富集分析,将各代谢标志物根据富集效率进行排序。通过该方法能够预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病的药理机制。
Description
技术领域
本发明涉及代谢组学领域,特别涉及一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法。
背景技术
代谢组学是***生物学研究领域的一个重要分支,其通过对病理生理因素或基因修饰造成的生物化学变化及代谢轮廓分析,为复杂机制的阐释提供海量信息,这与中药复方制剂成分多、药理机制繁杂的特点不谋而合,因此可用于中药复方制剂药理学研究。目前,代谢组学研究方法已广泛应用于各类代谢性疾病的病理机制和药物作用机制的研究。核磁共振(NMR)、气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)技术是三种常用于代谢组学分析的现代分析技术。
糖尿病肾病患者微血管病变的发生率较高,血压是肾功能损害的独立危险因素,若高血压患者同时患有糖尿病,其糖尿病肾病发生率将显著提高,临床表现为持续性蛋白尿,患者将进入肾衰竭阶段,死亡率会显著增加。目前,市场上针对糖尿病肾病治疗的中西药非常少。院内制剂甘地胶囊经过多年的临床验证,具有显著降低蛋白尿的作用,在院内长期用于糖尿病肾病等微血管病变的治疗。前期临床试验数据表明,甘地胶囊可以显著减少糖尿病肾病患者的24h尿微量白蛋白***,延缓糖尿病肾病的进展,保护和改善肾脏功能,从而提高患者的生命质量,且患者在服用甘地胶囊2个疗程(4个月)后有明显改善。然而,甘地胶囊治疗糖尿病肾病的分子机制仍然不甚清楚。故而,一种能够明确该药物作用机制的方法急待研究。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷,提供一种能够明确甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者的机制。
本发明提供的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于,具体步骤如下所示:
S1、1:1的选取试验组和对照组;
该试验组指服用甘地胶囊的病患;
该对照组指未服用甘地胶囊的病患。
S2、定期收集待测样本;
两组的病患均采用同样的检测周期进行样本的收集。
S3、处理S2上述的样本,进行UPLC-Q-TOF/MS分离分析;
S4、对S3获得的UPLC-Q-TOF/MS图谱数据进行代谢轮廓分析,获得数据集;
该代谢轮廓分析指在特定代谢过程中对结构相似或性质相关的预设代谢物采用针对性的分析技术进行定量测定,如:某一类结构相似、性质相关的化合物等。
S5、根据S4获得的数据集构建OPLS-DA模型(采用使用分析软件SIMCA-P11.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)等方式)构建偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型;
S6、根据S5构建的模型中S-PLOT载荷图和计算VIP分值,同时获得相应的P值,以VIP值大于1.0且P值小于0.05为条件,筛选出能够区分空白组和甘地胶囊给药组的代谢标志物。该步骤可采用分析软件SIMCA-P11.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)来实现。
S7、采用IPA分析方法对S6筛选得到的代谢标志物进行富集分析,将各代谢标志物根据富集效率进行排序。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即、上述代谢轮廓分析具体步骤为:采用峰过滤技术,只保留相同的保留时间内丰度最强的若干离子片段,删除其它片段。
或者上述代谢轮廓分析具体步骤为:
S4-1.对数据进行非线性校正和归一化,保留那些在QC样品中RSD小于X%(X%可以自定义,如30%)的变量;
该数据在进行S4-1之前,还可使用软件Masshunter内置的数据分析模块将仪器专用格式的LC-MS数据转换为mzData格式;
S4-2.将每个样品的LC-MS数据被标准化为每个样品的所有峰面积之和,获得一个新的数据集。该步骤可通过将数据导入MATLAB 7.0软件(The MathWorks,Inc.)等来实现。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即上述OPLS-DA模型的多元统计性能参数为R2X=0.599,R2Y=0.921,Q2=0.745。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即、上述待测样本为血样、尿样。根据检测对象的差异还可以为其他样本。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即、上述处理S2样本的方法为:将甲醇和乙腈的混合液添加到样本中,混合均匀后离心分离,取出上清液待测。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即、上述甲醇与血样或尿样的体积比为4-8:1。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即、上述UPLC-Q-TOF/MS分离分析的参数如下所示:
色谱的流动相的组成为:B:0.1%甲酸乙腈,梯度洗脱设置如下:0-2min:3%B,2-11min:3%-15%B,11-16min:15%-30%B,16-18min:30%-95%B,18-19.5min:95%B,19.5-20min:95%-3%B;之后平衡4min;流速400μL/min,进样量4μL;;
飞行质谱采用ESI源,参数设置为正离子模式;
毛细管电压:3500V;干燥气体流速:11L/min;喷雾气压:45psig;干燥气温度:350℃;碎裂电压:120V;质量范围:m/z 50-1000;MS/MS二级质谱分析时碰撞能量设定为10-30eV。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即、运用Student's T-test统计分析(如:采用SPSS软件等进行计算)方法,判断差异代谢物是否具有统计学意义。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即、上述代谢产物主要为脂质类代谢物和氨基酸类代谢物。
进一步地,本发明涉及的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,还具有这样的特点:即、能够将其应用于研究其他药物的治疗机制。
本发明的作用与效果:
糖尿病肾病是一种典型的代谢性疾病,其发生和发展与能量代谢、糖代谢、氨基酸代谢以及脂类代谢关系密切。因此,将基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学技术应用于甘地胶囊临床治疗患者的血清和尿液样本的代谢轮廓分析,是揭示甘地胶囊治疗糖尿病肾病药效机制的有效手段。同时,采集血清样本和尿液样本,进行整合的代谢组学分析,将更加全面的表征甘地胶囊在人体内调控代谢通路的轨迹和效能。
在本研究中,我们采用UPLC-Q-TOF/MS技术分析甘地胶囊给药组和对照组病人血清和尿液的代谢轮廓变化,然后采用多元统计分析方法偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)来筛选甘地胶囊治疗6个月后代谢标志物发生的变化。本研究作为首次甘地胶囊的临床代谢组学研究,我们发现了甘地胶囊代谢水平的影响,并在代谢通路层面对它的作用机制做出了初步的阐述,为预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病的药理机制提供新的方法。
附图说明
图1、典型的病人血清UPLC-Q-TOF/MS总离子流色谱图;
其中:(A)为空白组(B)为甘地胶囊给药6个月组。
图2、典型的病人尿液UPLC-Q-TOF/MS总离子流色谱图;
其中:(A)为空白组(B)为甘地胶囊给药6个月组。
图3、基于UHPLC-Q-TOF/MS数据的空白组(浅色)和甘地胶囊6个月给药组(深黑色)血清样本的OPLS-DA得分图(A)和S-plot图(B)。
图4、基于UHPLC-Q-TOF/MS数据的空白组(浅色)和甘地胶囊6个月给药组(深黑色)的尿液样本OPLS-DA得分图(A)和S-plot图(B)。
图5、血清和尿液生物标志物的代谢通路IPA分析结果图。
图6、甘地胶囊干预糖尿病肾病的代谢通路分析图。
具体实施方式
本实施例采用如下方法进行:
(一)数据采集
本实施例以糖尿病肾病患者为受试对象,并将其随机分为试验组与对照组,每组30人。
其中试验组:糖尿病肾病患者加服甘地胶囊,每日3次,每次3粒,连续使用6个月。
对照组:糖尿病肾病患者加服药渣胶囊,每日3次,每次3粒,连续使用6个月。
每2月采集一次患者24h尿以及血样。血液和尿液样品经样品前处理后,使用Acquity UPLC BEH C18 column(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,)色谱柱进行色谱分析。流动相的组成为:B:0.1%甲酸乙腈,梯度洗脱设置如下:0-2min:3%B,2-11min:3%-15%B,11-16min:15%-30%B,16-18min:30%-95%B,18-19.5min:95%B,19.5-20min:95%-3%;之后平衡4min;流速400μL/min,进样量4μL;。数据采集使用Agilent 6530Accurate-MassQ-TOFMS串联四极杆-飞行时间质谱仪,采用ESI源,参数设置为正离子模式。毛细管电压:3500V;干燥气体流速:11L/min;喷雾气压:45psig;干燥气温度:350℃;碎裂电压:120V;质量范围:m/z 50-1000。MS/MS二级质谱分析时碰撞能量设定为10-30eV。
(二)数据采集和处理
通过MassHunter软件将与LC-MS数据转换成NetCDF和mzData格式。在MATLAB7.0软件中使用课题组内部的峰过滤技术,即只保留相同的保留时间内丰度最强的离子片段,删除其它片段。接下来,用XCMS软件对数据进一步的处理。XCMS软件主要功能是对数据进行非线性校正和归一化。参数设置如下:半最大全宽度(FWHM)=10,带宽(bw)=10和信噪比(snthresh)=5,其他参数均为默认值。采用代谢组学公认的80%规则,保留那些在QC样品中RSD小于30%的变量,把这些数据导入MATLAB 7.0软件,根据总峰面积进行归一化校正。最后,将处理完成后的数据整合,获得一个新的数据集,并进行多元统计分析。
采用如上的方法,将选定的空白组和甘地胶囊给药后6个月患者的血清和尿液样本进行代谢轮廓分析。典型的空白组和给药6个月组的血清UPLC-Q-TOF/MS图谱如图1所示、尿液UPLC-Q-TOF/MS图谱如图2所示。筛选后的数据集具有较高的峰容量,其中,血清数据集含有579个峰,尿液的数据集则含有998个峰。
(三)代谢组学数据分析
偏最小二乘判别分析(Partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)是一种有监督的多元统计方法,采用SIMCA-P软件13.0版本进行分析,为了减少单位误差,数据会先经过log变换。通过分析OPLS-DA模型的Loading图和得分图,结合重要性参数VIP值大于1.0且P值小于0.05为条件,,筛选出两组之间区分能力最强的潜在代谢标志物。
评价模型质量主要采用以下三个参数(R2X,R2Y和Q2Y),通过默认的leave-one-out过程来计算。R2X和R2Y是用于评价拟合优度的,Q2Y是用来评估模型可预测性的。
为了获得可以将两组区分的特征性离子,本实施例中用UPLC-Q-TOF/MS采用如上之方法,根据采集的数据构建了OPLS-DA模型。如图3所示,多元统计性能参数为R2X=0.599,R2Y=0.921,Q2=0.745,表明两个模型都具备高度有效的预测能力。空白组和甘地胶囊给药6个月组数据集构建的OPLS-DA模型的分类特异性也达到了100%,敏感性达到了100%。
根据OPLS-DA模型的S-plot载荷图(图3及图4所示)以及VIP的分值,筛选出能够区分空白组和甘地胶囊给药组的代谢标志物。在UPLC-Q-TOF/MS血清和尿液的数据中分别找到18个和20个代谢生物标志物,其中血清中的潜在代谢生物标志物主要是长链脂肪酸等脂质代谢物,还包含嘌呤、肌酐,尿液中的潜在代谢生物标志物主要是氨基酸、有机酸、嘌呤和鞘氨醇等。
(四)统计分析
采用SPSS软件,运用Student’s T-test统计分析方法,比较不同处理组之间的差异代谢物是否具有统计学意义。当P值小于0.05时,则认为差异具有显著性。
采用如上统计方法,将代谢物的相对离子强度导入到SPSS软件进行t检验分析,结果表明所有差异代谢物的P值均小于0.05,证明用本方法鉴定差异代谢生物标志物的准确性。
(五)代谢通路富集分析(IPA)
IPA(Ingenuity Pathway Analysis)是一种基于算法的大规模生物通路分析软件。一方面可以搜索基因、蛋白、药物等方面的相关信息,并构建其相互作用网络模型;另一方面还可以分析来源于基因组、micro-RNA、SNP、芯片、代谢组、蛋白组等的实验数据。本实施例采用IPA分析方法对前期OPLS-DA模型筛选得到的代谢生物标志物进行富集分析,如图5所示。其中圆圈的大小和颜色深浅是判断该通路富集率的主要指标,主要由通路的可信度(-LogP)和影响度(Impact)组成,如下表所示,富集效率最高的通路是嘌呤代谢途径,排在第二的是甘油磷脂代谢途径,其它还有各类氨基酸代谢途径。由此可见,嘌呤、甘油磷脂和苯丙氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺代谢,是甘地胶囊发挥治疗糖尿病肾病药效作用,调控机体代谢水平的关键途径。
(六)代谢通路相互作用图构建
本实施例在研究甘地胶囊给药组与对照组之间的代谢生物标志物差异中,发现了38个潜在代谢生物标志物。这些标志物的变化与相应代谢通路的关系密切,包括了脂类代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、苯丙氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺代谢等。为了挖掘这些标志性代谢物之间的关系,通过搜索KEGG PATHWAY数据库,构建代谢通路相互作用图如图6所示。通过代谢生物标志物变化的可视化,可以更好地归纳、总结甘地胶囊给药组在代谢水平的通路改变。
本实施例的作用和效果:
本实施例通过结合UPLC-Q-TOF/MS数据与多元统计分析方法(OPLS-DA),构建了甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制研究的代谢组学方法。通过此方法研究,我们发现了39种血清和(或)尿液的代谢标志物,这些标志物的变化与相应代谢通路的关系密切,包括了脂类代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、苯丙氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺代谢等。
糖尿病引发的慢性炎症可通过多种途径导致肾损伤,导致机体出现明显的氧化应激,并产生大量ROS,ROS可损害血管壁导致血管炎症。此外,CRP也能直接诱导内皮细胞产生血浆纤溶酶原激活物抑制物-1(Pal-1)mRNA和Pal-1蛋白的表达,并使其活性增加,加重了肾脏损害。通过合成黏附分子及单核细胞趋化蛋白-1,促进白细胞合成释放超氧化物和蛋白水解酶,引起肾脏组织损伤,在临床上表现为蛋白尿和脂质代谢紊乱。
磷脂类代谢紊乱是糖尿病肾病的发病的关键因素,磷脂是生物膜的主要结构组成部分,它含有多种脂肪酸成分,如磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰亚胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(sphingom-yelin,SM)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)。除了此结构作用外,PC参与血管中乳化中性脂肪和胆固醇沉积的过程,可改善智力,激活细胞。此外,它们的新陈代谢与许多疾病密切相关,如阿尔茨海默氏症、肥胖和癌症等。由于这些重要的生物功能,PC在许多领域得到了越来越多的关注。大量研究表明,脂质代谢紊乱与II型糖尿病和糖尿病肾病直接相关。在一些疾病模型中,PC分子已成为II型糖尿病和糖尿病肾病具有重要调节或调节表达作用的生物标志物。
本实施例通过代谢组学的方法,发现甘地胶囊给药组与对照组相比,血清中磷脂类代谢物的水平显著降低,涉及到LysoPC(18:2(9Z,12Z))、PC(0:0/18:0)、LysoPE(20:0/0:0)等长链饱和或不饱和磷脂类成分。根据OPLS-DA趋势图和潜在生物标志物的浓度变化,表明在糖尿病肾病患者中发生了异常的磷脂代谢。可能机制包含索比醇途径、氧化应激、蛋白激酶C(PKC)三条途径在糖尿病的葡萄糖高浓度环境下被激活。而磷脂的活化(PLA2)与PKC的活化有关。磷脂酶是人体中重要的酶,可以催化磷脂的分解,生成游离脂肪酸。因此,活化的PLA2将加速磷脂的分解。在我们的实验中获得的PC和LPC代谢水平提高结果与这个机制是一致的。随着糖尿病肾病的发展,PLA2被激活,所以PC的浓度降低了。PC在磷酸酶催化下失去一个脂肪酸链,在PC分解的时候,PC的浓度增加了。异常的磷化肌醇(PI)代谢是一种下降趋势,这一现象可能与山梨醇途径(SP)的激活有关。在甘地胶囊的干预下,LysoPC(18:2(9Z,12Z))、PC(0:0/18:0)、LysoPE(20:0/0:0)、PI(22:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(18:2(2E,4E)/0:0)等磷脂类成分的相对含量显著降低,这提示我们,甘地胶囊能通过干预磷脂代谢,抑制磷脂的分解和代谢,对糖尿病肾病的发展起到调节作用。许多研究表明LysoPC含量的改变与细胞凋亡的生理变化相关,包括线粒体功能障碍和氧化应激。然而,具体的机制还不清楚,仍需要进一步研究甘地胶囊和LysoPC变化之间的关系。
此外,本实施例的结果显示,与对照组相比,甘地胶囊给药组中尿酸、次黄嘌呤和嘌呤等代谢物的水平显著降低。尿酸是由嘌呤代谢产生的,因此我们的研究结果表明,黄嘌呤氧化酶的激活与微蛋白尿的形成密切相关。在糖尿病肾病患者中,嘌呤代谢与蛋白尿密切相关,这表明在病程发展过程中,嘌呤代谢出现紊乱现象。尿酸、马尿酸、次黄嘌呤都是从嘌呤代谢中生成的产物,两种关键的嘌呤分解代谢(黄嘌呤和次黄嘌呤)是由黄嘌呤氧化酶(XO),以及活性氧作用生成的。本结果表明,甘地胶囊治疗后的病人尿液中尿酸、次黄嘌呤和嘌呤等代谢物的水平显著降低,说明黄嘌呤氧化酶的激活得到显著抑制,嘌呤代谢紊乱也趋向于平缓。
氨基酸代谢也是IPA分析重点指出的关键性代谢生物标志物,涉及苯丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和脯氨酸等代谢通路。最近研究中表明,包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸在内的支链氨基酸(BCAA)和酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸被认为是糖尿病血清和尿液样本的强预测因子和生物标志物。同样,血清亮氨酸含量或尿液代谢物BCAA和芳香族氨基酸在糖尿病肾病患者中也发生了显著性变化。因此,氨基酸代谢物的改变很大程度上对破坏肾脏过滤状态有显著影响,这与糖尿病肾病肾脏组织病变的发生具有重要联系。
由此,得出甘地胶囊主要影响糖尿病肾病患者氨基酸代谢、脂质代谢及嘌呤代谢的结果,与临床实践中甘地胶囊可改善蛋白尿相符合,也与以往的研究符合。
综上,本实施例采用UPLC-Q-TOF/MS代谢组学的方法研究了甘地胶囊给药组和对照组病人血清和尿液的代谢轮廓变化,并采用多元统计分析方法偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)筛选了甘地胶囊治疗6个月后患者血清和尿液代谢标志物发生的变化。结果表明,UPLC-MS血清数据集含有579个峰,尿液的数据集则含有998个峰。数据的统计性能参数为R2X=0.599,R2Y=0.921,Q2=0.745,这些参数表明这两个模型都具有高度的有效预测能力。我们在UPLC-Q-TOF/MS血清和尿液的数据中筛选到潜在生物标志物,其中血清中的潜在代谢生物标志物主要是长链脂肪酸等脂质代谢物,还包含嘌呤、肌酐等,尿液中的潜在代谢生物标志物主要是氨基酸、有机酸、嘌呤和鞘氨醇等。采用IPA分析方法对关键代谢通路进行富集。富集效率最高的通路是嘌呤代谢途径,排在第二的是磷脂代谢途径,其它还有各类氨基酸代谢途径。由此可见,嘌呤、甘油磷脂和苯丙氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺代谢,是甘地胶囊发挥治疗糖尿病肾病药效作用,调控机体代谢水平的关键途径。
本实施例,利用服用甘地胶囊后血尿中的代谢标志物变化,成功预测了其在改善嘌呤代谢、磷脂代谢、氨基酸代谢方面的作用。而这与甘地胶囊临床研究的结果是一致的,即降低了24h尿微量白蛋白。本实施例也为预测其他中药复方制剂的药理机制提供了可行的方法。
Claims (10)
1.一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于,具体步骤如下所示:
S1、1:1的选取试验组和对照组;
S2、定期收集待测样本;
S3、处理S2所述的样本,进行UPLC-Q-TOF/MS分离分析;
S4、对S3获得的UPLC-Q-TOF/MS图谱数据进行代谢轮廓分析,获得数据集;
S5、根据S4获得的数据集构建OPLS-DA模型;
S6、根据S5构件的模型的S-PLOT载荷图和VIP分值,同时获得相应的P值,以VIP值大于1.0且P值小于0.05为条件,筛选出能够区分空白组和甘地胶囊给药组的代谢标志物;
S7、采用IPA分析方法对S6筛选得到的代谢标志物进行富集分析,将各代谢标志物根据富集效率进行排序。
2.如权利要求1所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
所述代谢轮廓分析指采用峰过滤技术,只保留相同的保留时间内丰度最强的若干离子片段,删除其它片段。
3.如权利要求1所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
所述代谢轮廓分析的步骤如下所示:
S4-1.对数据进行非线性校正和归一化,保留那些在QC样品中RSD小于X%的变量;
S4-2.将每个样品的LC-MS数据被标准化为每个样品的所有峰面积之和,获得一个新的数据集。
4.如权利要求1所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
所述OPLS-DA模型的多元统计性能参数为R2X=0.599,R2Y=0.921,Q2=0.745。
5.如权利要求1所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
所述处理S2样本的方法为:将甲醇和乙腈的混合液添加到样本中,混合均匀后离心分离,取出上清液待测。
6.如权利要求5所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
所述甲醇和乙腈的混合液与样本的体积比为4-8:1。
7.如权利要求1所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
所述UPLC-Q-TOF/MS分离分析的参数如下所示:
色谱的流动相的组成为:B:0.1%甲酸乙腈,梯度洗脱设置如下:0-2min:3%B,2-11min:3%-15%B,11-16min:15%-30%B,16-18min:30%-95%B,18-19.5min:95%B,19.5-20min:95%-3%;之后平衡4min;流速400μL/min,进样量4μL;
飞行质谱采用ESI源,参数设置为正离子模式;
毛细管电压:3500V;干燥气体流速:11L/min;喷雾气压:45psig;干燥气温度:350℃;碎裂电压:120V;质量范围:m/z 50-1000;MS/MS二级质谱分析时碰撞能量设定为10-30eV。
8.如权利要求1-7任一所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
运用Student's T-test统计分析方法,判断差异代谢物是否具有统计学意义。
9.如权利要求1所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
所述代谢产物主要为脂质类代谢物和氨基酸类代谢物。
10.如权利要求1-7任一所述的一种基于血/尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的方法,其特征在于:
能够将其应用于检测其他药物的治疗机制。
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