CN102901790A - 糖尿病肾病早期诊断的尿液代谢标志物测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了“糖尿病肾病早期诊断的尿液代谢标志物测定方法”的方法。主要是利用基于气相质谱、液相质谱等分析技术和方法，定量测定糖尿病、糖尿病肾病病人尿液中内源性小分子化合物，通过计算和比较病理组与正常组内源性小分子化合物相对浓度差异，用于临床糖尿病肾病的早期诊断。与现有的其它临床诊断指标相比，该方法适应面广、灵敏、取样简便、操作简单、对机体无伤害。更适用于糖尿病肾病早期阶段某些生理生化指标尚不明确时糖尿病肾病的筛查，避免患者不能及时诊断而错过治疗的最佳时期。

Description

糖尿病肾病早期诊断的尿液代谢标志物测定方法

技术领域

本发明涉及糖尿病肾病临床诊断标志物的测定方法，具体涉及采用气相色谱质谱及液相色谱质谱方法检测人尿样中内源性小分子，采用相对定量或绝对定量方法测定糖尿病、糖尿病肾病病人尿液中内源性小分子，与正常人尿液内小分子含量范围进行比较，作为评判依据。

背景技术

长期以来，临床糖尿病肾病的诊断指标及方法主要包括尿白蛋白、血肌酐测定，这些指标在早期变化不明显，易出现假阳性结果。而肾组织活体虽然较为准确，但对人体伤害大，不能作为糖尿病肾病的常规筛查方法。具体不足主要体现在：

1.早期变化不明显临床规定尿白蛋白含量在20mg/L-200mg/L范围内，即属于微量白蛋白尿，超过200mg/L即属于肾脏重度损伤。大量研究表明，许多糖尿病肾病患者早期尿中白蛋白含量并未超标，当尿微量白蛋白超标时，患者肾脏纤维化已达到不可逆程度，从而错过治疗的最佳时段。

2.假阳性采用20mg/L做为临界值时，许多尿白蛋白阴性的健康人也会出现假阳性结果。这些假阳性结果往往是由于测试者体内缺水，尿液浓缩导致的，使得糖尿病肾病的患病率被高估。

3.伤害性由于微量白蛋白尿评判的不确定性，临床上经常将肾活检与之相结合。但活检对机体伤害性大，费用昂贵，病人顺应性差，不利于临床筛选。

总之，目前用于糖尿病肾病诊断的临床指标局限性大，缺乏一种安全可靠快速的测定方法，往往使糖尿病肾病病人错过治疗的最佳时期，造成疾病发展不可逆转的严重后果。

机体内源性小分子物质组是生命活动的基础，机体的功能状态必然反映在体内代谢组(内源性小分子化合物总称)上。研究表明，在疾病状态下机体代谢功能和很多小分子化合物水平明显异常。代谢组学可以对体内所有小分子代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系。利用合适的代谢组学检测工具，可以检测生物样本中数百甚至上千个分子量小于1000的各类小分子化合物。其中GC/TOFMS对很多化合物检测灵敏度高达10^-12mol(绝对检测限)，相对灵敏度达10^-9mol/mL，而HPLC/TOFMS的检测灵敏度则可达到10^-14mol。应用GC/TOFMS和HPLC/TOFMS，可以检测包括氨基酸、糖醇类化合物、脂肪酸类、脂类、小分子有机酸类、核苷和嘌呤化合物、氨类化合物、神经递质等各类内源性小分子代谢物。这类小分子物质是机体进行能量合成代谢分解的基础，当机体环境发生变化时，这些小分子代谢物的含量也随之改变。因此，检测的体内小分子的变化可以综合体现疾病早期体内微环境的变化。目前，没有利用代谢组学检测手段检测尿液中分子预测早期糖尿病肾病发生的报道。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是：利用代谢组学的高通量检测及数据处理方法，鉴定并定量分析尿液中小分子化合物，用于糖尿病肾病早期诊断。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案，步骤包括：

样品采集和处理：采集临床病人尿液和健康人尿液；按照1∶3(尿液-甲醇)加入甲醇沉淀蛋白和提取，离心后取上清液处理后进样测定。

样品分析与测定：用于气相色谱-质谱检测的样品先进行干燥，随后衍生化处理后进样测定。用于液相色谱-质谱检测的样品可直接取离心后上清液处理后进样测定。

数据处理与处理与代谢标志物鉴定：对检测样品进行分析，发现并鉴定在正常组与疾病组之间有显著差异的化合物，采用上述方法进行定量检测。

本发明的有益效果：

1.通过检测糖尿病肾病早期诊断标志物可及时发现糖尿病人肾脏功能的早期异常，争取最佳治疗时机，防止糖尿病肾病出现不可逆转的变化。

2.与临床现有诊断方法相比，本方法测定尿中与代谢相关的分子，测定更加灵敏、特异性强，操作方便、对病人伤害性小，便于实施。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例进行详细的解释，但并不意味着本发明仅限于此。

糖尿病肾病早期诊断的尿液代谢标志物测定方法

1.实验方案和样品采集

30名健康人和90名糖尿病肾病患者(分早期、中期、晚期三个阶段)分别测定其24小时尿微量白蛋白***量，糖化血红蛋白值，血胆固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白等生化指标(表1)，按临床标准将患者划分为糖尿病肾病早期、糖尿病肾病中期、糖尿病肾病晚期三个阶段。对照组和患者在禁食12小时后采血1ml，并收集其12小时尿液标本。血液在37℃水浴静置1h，3500rpm离心后收集上层血清，-80℃保存。尿液加入叠氮化钠抑菌后，3500rpm离心后收集上清液，-80℃保存。

2.样品处理

冷冻尿液在37℃水浴解冻20min，涡旋振荡后，取30μl尿液加入30μl尿素酶溶液(295U/ml)，涡旋振荡3min，37℃水浴温孵1h，再加入180μl含有稳定同位素¹³C标记肉寇酸与氚标记肌醇(D6)的甲醇溶液(2.5μg/ml)涡旋振荡3min，4℃冰箱静置1小时，19600g和4℃离心10min，取60μl上清液于GC小瓶中，减压挥干。向GC小瓶中加入30μl甲氧胺吡啶溶液(10mg/ml)，涡旋振荡3min，室温下静置16h进行肟化。加入30μl三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA(含1％TMCS作为催化剂)，涡旋振荡1min，室温静置1h进行衍生化反应，最后再加入30μl外标甲基肉寇酸酯的庚烷溶液(30μg/ml)，混合后GC-MS检测。

另取50μl尿样加入含有稳定同位素¹³C的内标肉寇酸的甲醇溶液(2.5μg/ml，200μl)甲醇溶液，涡旋振荡3min，12000g和4℃离心15min，取200μl上清液过0.22μm的有机微孔滤膜后转入进样品，进行HPLC-MS检测。

3.GC/TOF-MS测定

仪器：气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOF-MS)检测***(GC：Angilent6890N气相色谱仪，配备Angilent7683B自动进样器和G2614A型100位样品进样盘；TOF-MS：Pegasus III，Leco，USA)。

色谱条件：色谱柱是DB-5石英毛细管柱(10m×0.18mm i.d.，J&W Scientific，USA)，进样量：1μl，采用不分流进样模式；载气：氦气；恒流速度：1ml/min；程序升温模式：70℃保持2.0min，然后以35℃/min线性匀速线性升温至305℃，保持2.0min。

质谱条件：进样口温度：250℃；清洗时间和流速：1min，20ml/min；传输管温度：250℃；离子源温度：200℃；离子源电压和电流：-70eV，3.0mA；MS采用全扫描方式进行数据采集，MS采用全扫描方式进行数据采集；扫描范围：m/z50-800；扫描速度：20spectra/s；检测电压为-1690v。

4.HPLC/TOF-MS测定

仪器：高液相色谱-飞行时间质谱(HPLC/TOF-MS)检测***(HPLC：岛津ProminenceUFLCXR液相色谱仪；TOF-MS：AB SCIEX TripleTOF^TM5600System)。

色谱条件：色谱柱是C-18正相色谱柱(2.1*100mm，1.7μm)，进样量：5μl；恒流速度：500ul/min；流动相：A.水相(0.1％甲酸水)，B.有机相(0.1％甲酸乙腈)；梯度洗脱条件：0-3min10％B；3-10min10％-55％B；10-55min55％-95％B；55-65min95％-55％。

质谱条件：电喷雾离子化源(ESI)，正负离子分别检测。离子源温度：500℃；扫描方式：全扫描；扫描离子范围m/z：100-1500；正负离子模式下毛细管电压分别为：120V，-120V；锥孔电压正负离子模式分别为：30V，-30V。

5.化合物鉴定与数据分析

在上述检测条件下可获得样品的GC-TOF/MS及HPLC-TOF/MS的总离子流图。利用现有化合物谱库如NIST、Wiley、MetabolitePilot^TM对样品中的化合物进行鉴定，获取各鉴定化合物色谱峰峰面积，由内标计算各化合物在样品中相对含量，或由相同同位素内标计算所得化合物的绝对含量。对各个化合物在各组(对照组、糖尿病肾病早期、糖尿病肾病中期、糖尿病肾病晚期)中相对含量进行统计分析，确定在正常组与糖尿病肾病早期有显著性差异的化合物，选择2组间统计差异最大、相对误差最小的化合物，是用于诊断早期糖尿病肾病的代谢标志物。

6.糖尿病肾病早期诊断方法

本研究主要依据尿液中分子含量出现的显著异常变化，确定糖尿病肾病早期诊断标志物。采用适当方法检测后，采用与内标化合物峰面积比较方法得到各诊断标志物相对含量，比较正常组与糖尿病肾病早期组之间差异的显著性。GC-MS测定发现早期糖尿病肾病尿液中牛磺酸、甘氨酸、庚酸、羟基乙酸显著低于对照组，而肌醇、3-羟基丁酸显著高于对照组(表2)。比较时可将正常组数值(内标校正)作为基准对照，平均值设定为1，分别计算对照组、糖尿病肾病早、中、晚期各组的相对值与70％、90％置信区间，作为诊断糖尿病肾病的标准。

在进行糖尿病肾病诊断时，可由正常组样品测定结果得到各个诊断标志物相对含量的正常范围，超出正常范围、落入糖尿病肾病相对含量范围的可以初步诊断为早期糖尿病肾病。还可以通过比较多个诊断标志物含量，对早期糖尿病肾病进行综合评判。另外，也可以选择在早期糖尿病肾病组病人尿液中相对含量出现相反变化趋势的分子，计算其比值(如肌醇/庚酸、肌醇/羟基乙酸、肌醇/牛磺酸)，与正常人群该比值进行比较进行诊断。

LC-MS测定发现早期糖尿病肾病尿液中磷脂酰胆碱(14∶0/2∶0)、磷脂酰胆碱(15∶0/0∶0)、磷脂酰胆碱(O-18∶0/O-2∶1)、磷脂酰胆碱(P-19∶1/0∶0)、磷脂酰胆碱(P-19∶1/0∶1)、磷脂酰甘油(16∶1/16∶1)、磷脂酰甘油(18∶0/0∶0)、磷脂酰甘油(12∶0/13∶0)、溶血性磷脂酰胆碱(22∶2)、溶血性磷脂酰胆碱(P-16∶0)、溶血性磷脂酰乙胺醇(0∶0/20∶2)、C18-OH硫苷脂、C19-OH硫苷脂、C24∶1硫苷脂等均显著高于对照组(表3)。将正常组数值(内标校正)作为基准对照，平均值设定为1，分别计算对照组、糖尿病肾病早、中、晚期各组的相对值与70％、90％置信区间，作为评诊断糖尿病肾病的标准。

6.3与蛋白尿指标变化显著相关的分子

对所检测内源性分子与常规临床检测的尿微量白蛋白(AER)指标进行Pearson相关性分析。如表4所示，发现GC-MS、LC-MS检测化合物中，糖尿病肾病病人尿液中半胱氨酸、2-羟基戊二酸、甘油-2-磷酸、5-羟色氨、正缬氨酸、苯丙氨酸、甘油酸、核糖、肌苷与AER有明显的正相关关系(p＜0.05)；而D-半乳糖酸-1，4-内酯、酪氨酸、缬氨酸、5，5-二甲基乙内酰脲与AER负相关关系(p＜0.05)。这些小分子与现用临床常规指标相关性较强，可能是糖尿病肾病诊断的替代监控标志物。

表4.糖尿病肾病病人尿液中小分子与尿微量白蛋白的Pearson相关分析结果

Claims (8)

1.通过测定尿液中代谢标志物用于糖尿病肾病早期临床诊断的方法，其特征包括以下几个方面：

a)采用人尿液作为样本进行检测；

b)采用甲醇等溶剂对尿中小分子进行提取；

c)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法对尿样进行衍生化；

d)采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOF-MS)、超高液相色谱-飞行时间质谱(UPLC/TOF-MS)进行样本分析；

e)应用SIMCAP-11软件和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)建立数学模型；

f)从多维空间数学模型中提取参数，计算正常组和病理组之间相对距离。

g)利用仪器所检测的信号强度进行相对定量，或者利用标准品进行绝对定量。

2.除权利要求1中尿样作为生物样本外，生物样本还可来源于人的其它体液、组织、细胞等，具体包括全血、血浆、血清、红细胞、尿液、脑脊液、唾液、泪液、汗液、组织匀浆、细胞或细胞培养液。

3.权利1中得到的数据除可用于糖尿病肾病的诊断外，还包括用于诊断其它涉及肾脏损伤的疾病，如急性肾炎、***、慢性肾衰竭等相关疾病。

4.除权利要求1中甲醇沉淀蛋白的方法处理生物样本外，还包括不经过前处理的方法，或过滤/超滤的方法，或固相萃取方法，或经过高速离心和超速离心沉淀；或者生物样本采样其它蛋白沉淀方法，如加入有机溶剂(如乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)、各种酸碱盐沉淀、微波、加热沉淀的方法；或经过有机溶剂进行液-液提取，有机溶剂包括乙酸乙酯、氯仿、***、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、苯、正己烷、环己烷、乙腈等处理的方法。

5.除权利要求1中采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOF-MS)、超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC/TOF-MS)进行样本分析外，还包括其它任何基于紫外检测、荧光检测、红外检测、氧化还原反应、免疫应答、电流变化等各种检测技术(如HPLC)、质谱测定技术(如LC-MS、LC-MS-MS、GC-MS、GC-MS-MS、CE-MS、CE-MS-MS)、核磁共振测定技术和其它代谢组学测定技术的分析方法，以及依据上述技术开发的单独的或者联用方法及试剂盒。

6.权利要求1中所得到的数据可以是绝对定量数据，也可以为相对定量数据、半定量数据，如峰面积、峰高，或采用数学方法对检测分子进行不同数学方式计算得到的数据，通过与健康人群的正常数值/置信区间以及糖尿病肾病早、中、晚期病人异常值/置信区间进行比较，从而对病人是否出现糖尿病肾病进行诊断。

7.除权利要求1中应用SIMCA P-11软件和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)建立数学模型的方法外，还包括其它代谢组学数据处理软件，如SPSS、Matlab、SIMCA-P等各类版本；包括选择除偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)外的其它方法，如正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法-判别分析(0PLS-DA)、主成分分析(PCA)、非线性映射(Nonlinemapping，NLM)、聚类分析(HCA)等方法建立数学模型。

8.权利要求1中的数学模型可以为任意维空间模型，这里的多维空间可以是1、2、3维，也可以是4、5、6甚至更多维空间。其空间距离的计算可以采用各种数学方法。