CN109486875A - 一种生产l-亮氨酸的发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种生产L‑亮氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：将种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8‑37.0℃，通过自动流加2氨水控制培养基pH为7.0‑7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25%‑30%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，发酵结束前6小时停止流加营养液；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，得到L‑亮氨酸发酵液。本发明通过优化发酵培养条件和参数，提高了L‑亮氨酸的产量。

Description

一种生产L-亮氨酸的发酵工艺
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种生产L-亮氨酸的发酵工艺。
背景技术
L-亮氨酸（(2R)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid）化学名称为L-2-氨-4-甲基戊酸，白色结晶或结晶性粉末；无臭，味微苦。在甲酸中易溶，在水中略溶，在乙醇或***中极微溶解。密度为1.038g/cm3，熔点大于300℃。
L-亮氨酸，L-异亮氨酸和L-缬氨酸都是支链氨基酸，它们有助于促进训练后的肌肉恢复。其中L-亮氨酸是最有效的一种支链氨基酸，可以有效防止肌肉损失，因为它能够更快的分解转化为葡萄糖。
目前，L-亮氨酸生产方法主要是发酵法，发酵法生产的L-亮氨酸发酵液经过提取、蒸发浓缩、离心烘干等步骤才能制成成品。申请人之前的专利技术“一种利用顺序式模拟移动床色谱连续提取亮氨酸的方法”，公开了发酵亮氨酸的工艺，包括将谷氨酸棒杆菌种子液与枯草芽孢杆菌种子液按照一定的体积比混合，得到混合种子液，然后转入发酵培养基中培养，温度30℃，PH值7.2，培养时间60小时，得到亮氨酸发酵液；该方法较单一发酵方式相比，提高了发酵产亮氨酸的效率，但是存在混合发酵工艺繁琐，发酵参数难以精确控制等缺陷；中国发明专利“CN104404495A”公开了一种发酵生产L-亮氨酸的方法，该方法通过优化发酵培养基以及发酵参数等，发酵液中亮氨酸产量可达到38g/L，然而，该方法是小型发酵罐中试工艺，扩大发酵培养的效果存在较多不确定性，而且发酵产酸量仍然有待提升。
发明内容
为解决L-亮氨酸发酵和提取工艺存在的问题，本发明提供了一种生产L-亮氨酸的发酵工艺。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种生产L-亮氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：以8-10%的接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8-37.0℃，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25%-30%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内，维持罐内谷氨酸的浓度为30-50mg/L；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.6-0.9g/L，发酵结束前6小时停止流加营养液；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，得到L-亮氨酸发酵液。
进一步地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO4 10g/L，玉米浆10g/L，柠檬酸0.5g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L， MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，VB1 5mg/L，VH 0.1mg/L。
进一步地，所述复合氨基酸溶液的组分包括谷氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
进一步地，所述复合氨基酸溶液的组分为：谷氨酸10g/L，异亮氨酸5/L，缬氨酸5g/L。
进一步地，所述营养液的组分包括葡萄糖、甘油和甜菜碱。
进一步地，所述营养液的组分为：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明通过对亮氨酸代谢途径进行分析，优化了发酵培养步骤；甜菜碱含有三个活性甲基，在L-亮氨酸合成方面有促进作用；甘油提供碳骨架，促进亮氨酸的合成；谷氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸代谢途径会对亮氨酸途径进行分流，通过添加上述氨基酸会对相应的代谢途径产生反馈抑制，从而使得代谢流更多地流向亮氨酸，本研究发现，在发酵初期添加上述氨基酸，对亮氨酸的产量影响并不大，可能是因为发酵初期氨基酸合成途径较为微弱，并不会给带来较大的影响，因此，选择发酵12h进行添加；而前期碳源较为充足，菌株以生物量增加为主，因此，选择在24h进行添加营养液，从而促进亮氨酸的合成；发酵培养基、复合氨基酸溶液以及营养液等多种发酵因素相互协同，提高了亮氨酸的发酵产量，缩短了发酵时间。
附图说明
图1：营养液中甘油浓度对L-亮氨酸产量的影响；
图2：营养液中甜菜碱浓度对L-亮氨酸产量的影响。
具体实施例
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种生产L-亮氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：
发酵培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO4 10g/L，玉米浆10g/L， KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，VB1 5mg/L，VH 0.1mg/L。
复合氨基酸溶液的组分：谷氨酸10g/L，异亮氨酸5/L，缬氨酸5g/L，
营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L；
以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.7033为例，以10%的接种量将种子液（OD600值为9.5）接入发酵培养基中，培养温度36.8℃，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内，维持罐内谷氨酸的浓度为40mg/L；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.8g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，即得L-亮氨酸发酵液。
实施例2
一种生产L-亮氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：
发酵培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO4 10g/L，玉米浆10g/L，柠檬酸0.5g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，VB1 5mg/L，VH0.1mg/L。
复合氨基酸溶液的组分：谷氨酸10g/L，异亮氨酸5/L，缬氨酸5g/L，
营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L；
以8%的接种量将种子液（OD600值为9.5）接入发酵培养基中，培养温度37.0 ℃，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为7.1，通过搅拌和通风控制溶氧在30%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内，维持罐内谷氨酸的浓度为30mg/L；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.7g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，即得亮氨酸发酵液。
实施例3
发酵因素对发酵液中L-亮氨酸产量和菌体生物量的影响。
OD值测定：发酵液稀释一定倍数后，在波长620 nm处用752分光光度计测定。
发酵液中氨基酸含量测定：采用氨基酸分析仪测定。
1、复合氨基酸溶液中氨基酸组分对L-亮氨酸产量和菌体生物量的影响，发酵方式参照实施例1，具体结果见表1：
表1
组别 菌体OD<sub>620nm</sub> L-亮氨酸产量g/100ml
谷氨酸+异亮氨酸+缬氨酸 45.7 4.38
谷氨酸+异亮氨酸 45.3 4.12
异亮氨酸+缬氨酸 45.6 3.99
谷氨酸+缬氨酸 45.8 4.04
结论：各组别菌体生物量没有明显差异，而发酵液中L-亮氨酸产量差异较大，其中，谷氨酸+异亮氨酸+缬氨酸组与异亮氨酸+缬氨酸组进行比较，L-亮氨酸产量提高0.39g/100ml，提高了9.8个百分点，较谷氨酸+异亮氨酸组提高6.3个百分点，较谷氨酸+缬氨酸组提高8.4个百分点。
2、营养液中甘油和甜菜碱对L-亮氨酸产量和菌体生物量的影响，发酵方式参照实施例1，具体结果见表2：
表2
组别 菌体OD<sub>620nm</sub> L-亮氨酸产量g/100ml
甘油+甜菜碱 45.7 4.38
甘油 42.5 3.97
甜菜碱 45.1 4.13
不添加甘油和甜菜碱 41.3 3.81
结论：通过表2可知，甘油对菌体生物量和L-亮氨酸产量均有促进作用，而甜菜碱对菌体生物量没有明显影响，但是能够提高L-亮氨酸产量；与不添加甘油和甜菜碱的组别相比，本发明的菌体生物量提高了10.6个百分点，L-亮氨酸产量提高了14.9个百分点。
3、甘油和甜菜碱添加量对发酵液中L-亮氨酸产量的影响。
1）营养液中甘油浓度对L-亮氨酸产量的影响，设置浓度为0,1,2,3,4,5,6,7,8（g/L），如图1所示，随着甘油浓度的增加，L-亮氨酸产量逐渐增加，当增加到4g/L后，增幅放缓，增加到5g/L后，L-亮氨酸没有明显的增加，考虑到成本，选择甘油浓度为5g/L最为合适。
2）营养液中甜菜碱浓度对L-亮氨酸产量的影响，设置浓度为0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6（g/L），如图2所示，随着甜菜碱浓度的增加，L-亮氨酸产量逐渐增加，当营养液中甜菜碱的浓度增加到1g/L后，发酵液中L-亮氨酸含量没有增加。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种生产L-亮氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：以8-10%的接种量将谷氨酸棒杆菌种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8-37.0℃，通过自动流加氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25%-30%；当发酵至12h时，将复合氨基酸溶液流加进罐内，维持罐内谷氨酸的浓度为30-50mg/L；当发酵至24h时，停止流加复合氨基酸溶液，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.6-0.9g/L，发酵结束前6小时停止流加营养液；发酵过程中，以泡敌消泡，总发酵时间为48h，得到L-亮氨酸发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO4 10g/L，玉米浆10g/L， KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，VB1 5mg/L，VH 0.1mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合氨基酸溶液的组分包括谷氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述复合氨基酸溶液的组分为：谷氨酸10g/L，异亮氨酸5/L，缬氨酸5g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养液的组分包括葡萄糖、甘油和甜菜碱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述营养液的组分为：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。
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