CN109486869B - 一种利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用微生物连续生产1,3‑丙二醇的方法，首先在微氧条件下，以种子培养基进行发酵菌种的培养，获得发酵种子液；然后在发酵培养基中接入发酵种子液，进行厌氧发酵，至发酵液中1,3‑丙二醇浓度大于60g/L，转换至微氧发酵，控制发酵体系pH至偏酸性，静置分层后，抽取上层清液，同时加入补充培养基，并控制发酵体系pH至偏碱性，随后从厌氧发酵开始重复进行，以实现连续发酵。本发明采用的连续发酵模式，能够缩短发酵时间，大幅提高生产效率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用微生物连续化生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术
1,3-丙二醇（1,3-Propanediol，PDO）主要用于生产性能优异的新型聚酯PTT（Polytrimethylene Terephthalate）。由它合成的聚酯具有独特的性质和优异的性能，而且可以使聚酯塑料具有易于自然循环的可生物降解特性。近年来，作为重要的有机合成原料和中间体，因其独特性能以及广泛的用途成为研究开发的热点。
1,3-丙二醇工业生产方法主要有化学法和生物法两大类。生物法是目前研究的热点，根据原料不同可分为葡萄糖一步转化法和甘油转化法。生物法虽然起步较早，但是直到二十世纪八十年代才逐渐引起人们的重视。与化学法相比，微生物转化法具有条件温和、操作简便、选择性好、节省能源、设备投资少和环境良好等特点，是一种生产成本最低、污染最少的方法，符合当今“绿色化工”和“可持续性发展”的要求。
生物法生产1,3-丙二醇，目前存在产物浓度低、生产周期长和转化率低等问题，直接影响生物法生产1,3-丙二醇的规模化应用。解决上述问题，既可以通过生物化工上游技术，利用基因工程等技术手段，对发酵菌种加以改造，以提高菌种的发酵水平、产物的转化能力，也可以在生物发酵阶段，连续、分批补料、反应分离相耦合的培养方式，优化发酵条件，提高发酵水平。
目前生物法生产1,3-丙二醇主要采用批次发酵模式。中国专利CN1348007A公开了一种微生物微氧发酵生产1,3-丙二醇的方法，其所使用的微生物细胞不仅在厌氧条件下，而且在微氧条件下都能将甘油转化为1,3-丙二醇。中国专利CN1434122A公开了一种采用两段双底物集成发酵生产1,3-丙二醇的方法，其二级种子培养是以葡萄糖和甘油为混合双底物，将好氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油厌氧转化集成在同一个发酵罐中进行。中国专利CN1955304A公开了一种微生物利用甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于通过在发酵培养基中或在菌体生长的指数期添加适量的有机中间代谢成分，实现了1,3-丙二醇发酵过程中底物与产物间理想的通量分布，进而实现高效的1,3-丙二醇发酵。上述方法虽然能够起到简化流程、缩短培养周期等优点，但是由于发酵体系中1,3-丙二醇产物浓度较低，针对批次发酵模式所形成的技术方案，并不能显著提高生产效率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法。本发明采用的连续发酵模式，能够缩短发酵时间，大幅提高生产效率。
本发明利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法，包括如下内容：
（1）菌种培养：以种子培养基进行发酵菌种的培养，获得发酵种子液；
（2）连续发酵：a、在发酵培养基中接入发酵种子液；b、进行厌氧发酵，发酵过程中流加甘油；c、至发酵液中1,3-丙二醇浓度大于60g/L，转换至微氧发酵，发酵过程中控制发酵体系pH至偏酸性，静置分层后，抽取上层清液，同时加入新鲜培养基，并控制发酵体系pH至偏碱性，随后重复步骤b、c，以实现连续发酵。
本发明中，步骤（1）所述的发酵菌为能够利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的微生物，主要为兼性厌氧菌，具体如克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）、弗氏柠檬杆菌（Citrobacter freundii）等，优选克雷伯杆菌。
本发明中，步骤（1）将活化的发酵菌液接种至种子培养基中，接种体积比为1%～30%，优选5%～15%；培养温度为20～40℃，优选35～40℃；搅拌转速为100～500rpm，优选200～400rpm。进一步地，优选在微氧条件下培养，所述的微氧条件是在培养过程无气体如氮气等通入的发酵模式。所述的种子培养基为本领域常规使用的培养基，优选种子培养基的配方为：NH4Cl 4.26g/L、KCl 0.2g/L、NaH2PO4·H2O 1.1g/L、Na2SO4 0.23g/L 、MgCl2·6H2O0.2g/L、柠檬酸 0.34g/L、酵母膏 2.0g/L、Vc 0.1g/L、甘油 30g/L。
本发明中，步骤（2）发酵种子液的接种体积比为1%～30%，优选5%～15%。所述的发酵培养基中添加阳离子型生物多糖基聚合物，如氨基多糖聚合物、淀粉基聚合物等，优选分子量为5万～30万的壳聚糖，更优选中密度壳聚糖。阳离子型生物多糖基聚合物的添加质量浓度为0.1%～1.0%，优选0.1%～0.5%。所述的发酵培养基为本领域常规使用的培养基，优选的发酵培养基配方为：NH4Cl 5.35g/L、KCl 0.2g/L、NaH2PO4·H2O 1.38g/L、Na2SO4 0.28g/L、MgCl2·6H2O 0.26g/L、柠檬酸 0.42g/L、酵母膏 1.0g/L、Vc 0.1g/L、甘油 40g/L。
本发明中，步骤（2）发酵过程中采用通入氮气的厌氧发酵模式，氮气通气量为0.1～1.0vvm，优选0.1～0.3vvm；发酵温度为20～40℃，优选为35～40℃；搅拌转速为100～500rpm，优选200～400rpm。
本发明中，步骤（2）发酵过程中流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在20g/L～40g/L。
本发明步骤（2）中，当1,3-丙二醇浓度大于60g/L时，优选60～65g/L时，转换至微氧发酵，即在培养过程无气体通入的发酵模式，微氧发酵条件为：温度为20～40℃，优选35～40℃；搅拌转速为200～600rpm，优选200～400rpm。微氧发酵过程中进行pH控制，使发酵体系pH为5.5～6.5，优选5.8～6.2。微氧发酵0.5-1h后，静置分层。
本发明步骤（2）中，静置分层后，抽取发酵体积50%～80%的上层清液进行分离处理，可以直接进行1,3-丙二醇提取精制，或者待发酵过程结束后收集所有上层清液统一进行分离处理。
本发明步骤（2）中，抽取上层清液后，同时向发酵体系中加入上层清液体积85%～90%的新鲜培养基。新鲜培养基可以采用发酵培养基，优选以下配方的补充培养基：NH4Cl4.26g/L、KCl 0.2g/L、NaH2PO4·H2O 2.07g/L、MgCl2·6H2O 0.26g/L、柠檬酸 0.42g/L、酵母膏 1.5g/L、Vc 0.15g/L、甘油 40g/L。
本发明步骤（2）中，加入新鲜培养基后控制发酵体系pH至偏碱性，采用的试剂为氢氧化钠、氢氧化钾等，使发酵体系pH为7.0～8.0，优选为7.2～7.5。随后维持0.5～2h，进行厌氧发酵，重复多次，以实现连续发酵。
与现有技术相比，本发明方法具体如下有益效果：
（1）在发酵培养基中添加阳离子型生物多糖基聚合物，随着发酵体系中乙酸浓度的增加，能够形成带电高分子聚合体，使发酵菌体形成菌团，在发酵罐中易于与发酵液进行分离。同时结合发酵节点pH的调控，可以迅速实现固液分离，排出发酵清液的同时发酵菌种会以固体形式存在于发酵罐中，从而实现了发酵菌种的重复利用，达到了连续发酵的目的。
（2）针对甘油氧化途径中副产有机酸较多的特征，对发酵过程进行厌氧-微氧-厌氧的重复切换，从而利用其代谢途径诱导形成细胞固定条件，提高生产效率。
（3）新鲜培养基不需要添加阳离子型生物多糖基聚合物，仅需投加一次，即可多次使用，进一步提高生产效率。
（4）本发明方法解决了批次发酵过程中，发酵菌种制备周期长、生产强度低、生产效率差的问题，能够实现连续化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案和效果，但不构成对本发明的限制。
本发明实施例中，以Waters 2695分离***与Waters 2414示差检测器构成液相分析***，其中分离柱选用Aminex HPX-87H有机酸和醇分析柱用于酸类和醇类的分离。以琥珀酸、乳酸、甘油、乙酸、1,3-丙二醇、乙醇标准样品建立标准图谱，反应过程中进行产物分析。
生产效率是指单位时间、单位体积获得的1,3-丙二醇的质量。生产效率Q的计算公
式为：
，其中，为连续发酵后得到的发酵清液体积，L；为发酵罐装液体积，L；为
1,3-丙二醇发酵浓度，g/L；为总发酵时间，即从种子培养开始至全部发酵结束总耗时，h。
本发明实施例中，所用的菌种为已经公开的克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae），来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 0798。
本发明实施例中，种子培养基与发酵培养基的基本组成见表1。
表1 种子培养基及发酵培养基
实施例1
（1） 菌种培养：取活化菌液70mL，与630mL种子培养基混合于1L发酵罐中，进行微氧培养（无氮气通入）；培养条件为：培养温度为 37℃，搅拌转速为200rpm，pH控制在7.0，培养18h后获得发酵种子液。
（2）连续发酵：发酵罐体积选择15L，装液体积为7L。
a、取700mL发酵种子液接入到6.3L发酵培养基中（发酵培养基中加入分子量15万的中密度壳聚糖，加入量为1g/L）。
b、进行厌氧发酵，发酵过程中流加甘油，以维持发酵体系中甘油浓度在40g/L；发酵过程控制培养温度为37℃，pH为7.0，搅拌速度为400rpm，氮气通入量0.2vvm。
c、发酵30h后，经检测1,3-丙二醇浓度为60.98g/L，转换至微氧发酵，发酵温度为37℃，搅拌速度为400rpm，发酵过程中控制体系pH为6.2。微氧发酵1h后，静置分层，抽取上层清液4L，同时加入发酵培养基3.6L，并控制发酵体系pH升高至7.5，0.5h后重复步骤b的厌氧发酵，进入第二个发酵周期。
按步骤（2）连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、18h、18h、18h、18h，总发酵时间为126h。共收集发酵清液22L，经检测产物中1,3-丙二醇浓度为62.5 g/L，生产效率为1.56g/(L·h)。
实施例2
（1） 菌种培养：取活化菌液35mL，与665mL种子培养基混合于1L发酵罐中，进行微氧培养（无氮气通入）；培养条件为：培养温度为 35℃，搅拌转速为100rpm，pH控制在7.0，培养24h后获得发酵种子液。
（2）连续发酵：发酵罐体积选择15L，装液体积为7L。
a、取350mL发酵种子液接入到6.65L发酵培养基中（发酵培养基中加入分子量15万的中密度壳聚糖，加入量为3.5g/L）。
b、进行厌氧发酵，发酵过程中流加甘油，以维持发酵体系中甘油浓度在30g/L；发酵过程控制培养温度为35℃，pH为7.0，搅拌速度为400rpm，氮气通入量0.1vvm。
c、发酵32h后，经检测1,3-丙二醇浓度为61.26g/L，转换至微氧发酵，发酵温度为35℃，搅拌速度为400rpm，发酵过程中控制体系pH为6.0。微氧发酵0.5h后，静置分层，抽取上层清液5L，同时加入发酵培养基4.5L，并控制发酵体系pH升高至7.2，1h后重复步骤b的厌氧发酵，进入第二个发酵周期。
按照步骤（2）连续进行六个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为32h、18h、15h、15h、15h、15h，总发酵时间为141.5h。共收集发酵清液32L，经检测产物中1,3-丙二醇浓度为63.25g/L，生产效率为2.04g/(L·h)。
实施例3
（1） 菌种培养：取活化菌液105mL，与595mL种子培养基混合于1L发酵罐中，进行微氧培养（无氮气通入）；培养条件为：培养温度为 40℃，搅拌转速为300rpm，pH控制在7.0，培养18h后获得发酵种子液。
（2）连续发酵：发酵罐体积选择15L，装液体积为7L。
a、取700mL发酵种子液接入到6.3L发酵培养基中（发酵培养基中加入分子量15万的中密度壳聚糖，加入量为3g/L）。
b、进行厌氧发酵，发酵过程中流加甘油，以维持发酵体系中甘油浓度在35g/L；发酵过程控制培养温度为40℃，pH为7.0，搅拌速度为400rpm，氮气通入量0.3vvm。
c、发酵30h后，经检测1,3-丙二醇浓度为60.92g/L，转换至微氧发酵，发酵温度为40℃，搅拌速度为600rpm，发酵过程中控制体系pH为5.8。微氧发酵0.5h后，静置分层，抽取上层清液5.5L，同时加入发酵培养基4.7L，并控制发酵体系pH升高至7.5，1.5h后重复步骤b的厌氧发酵，进入第二个发酵周期。
按步骤（2）连续进行六个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、18h、18h、15h、15h、15h，总耗时139h。共收集发酵清液34.5L，经检测产物中1,3-丙二醇浓度为62.6g/L，生产效率为2.22g/(L·h)。
实施例4
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：发酵培养基中加入分子量5万的低密度壳聚糖。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、18h、18h、20h、20h，总发酵时间为130h。共收集发酵清液22L，经检测产物中1,3-丙二醇浓度为61.7 g/L，生产效率为1.49g/(L·h)。
实施例5
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：发酵培养基中加入分子量30万的中密度壳聚糖。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、18h、18h、18h、18h，总发酵时间为126h。共收集发酵清液22L，经检测产物中1,3-丙二醇浓度为64.6 g/L，生产效率为1.61g/(L·h)。
实施例6
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：发酵培养基中加入分子量40万的中密度壳聚糖。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、22h、22h、22h、22h，总发酵时间为142h。共收集发酵清液22L，经检测产物中1,3-丙二醇浓度为61.8g/L，生产效率为1.37g/(L·h)。
实施例7
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：发酵培养基中加入季铵烷基淀粉。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、19h、19h、20h、20h，总发酵时间为132h。共收集发酵清液22L，经检测产物中1,3-丙二醇浓度为61.6 g/L，生产效率为1.47g/(L·h)。
实施例8
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：加入的新鲜培养基不采用发酵培养基，而是采用表1所示配方的补充培养基。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、16h、16h、17h、18h，总发酵时间为121h。共收集发酵清液22L，经检测产物中1,3-丙二醇浓度为64.2 g/L，生产效率为1.66g/(L·h)。采用该补充培养基， 有助于缩短发酵延滞期，从而提高生产效率。
比较例 1
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：按照实施例1步骤（1）及步骤（2）中b过程进行五个批次厌氧发酵，共收集发酵清液31L，经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为61.22 g/L，总发酵时间240h，生产效率为1.13g/(L·h)。
比较例2
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：步骤（2）c过程不进行微氧转换，直接加酸将pH调至6.2。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、30h、30h、30h、30h，总发酵时间为170h。共收集发酵清液22L，经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为61.35g/L，生产效率为1.13 g/(L·h)。
比较例3
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：发酵培养基中不添加中密度壳多糖。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、35h、35h、35h、35h，总发酵时间为194h。共收集发酵清液22L，经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为60.25 g/L，生产效率为0.97 g/(L·h)。
比较例4
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：步骤（2）c过程抽取发酵清液，并补加新鲜发酵培养基后不进行pH碱性调节，直接进入下一周期厌氧发酵。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为30h、26h、26h、28h、28h，总发酵时间为160h。共收集发酵清液22L，经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为62.15 g/L，生产效率为1.22 g/(L·h)。
比较例5
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：步骤（2）当1,3-丙二醇浓度为70g/L时转换至微氧发酵。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为36h、30h、30h、30h、30h，总发酵时间为180h。共收集发酵清液22L，经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为71.15 g/L，生产效率为1.24g/(L·h)。
比较例6
生产过程及操作条件同实施例1。不同在于采用：步骤（2）当1,3-丙二醇浓度为50g/L时转换至微氧发酵。连续进行五个发酵周期，各厌氧发酵时间分别为27h、16h、16h、16h、16h，总发酵时间为115h。共收集发酵清液22L，经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为51.13g/L，生产效率为1.39/(L·h)。
Claims (14)
1.一种利用微生物连续生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于包括如下内容：（1）菌种培养：以种子培养基进行发酵菌种的培养，获得发酵种子液；在微氧条件下培养，所述微氧条件是在培养过程无气体通入的发酵模式；所述发酵菌为克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae），保藏编号：CGMCC No. 0798；（2）连续发酵：a、在发酵培养基中接入发酵种子液, 所述的发酵培养基中添加阳离子型生物多糖基聚合物，所述阳离子型生物多糖基聚合物为分子量5万～30万的壳聚糖，添加质量浓度为0.1%～1.0%；b、进行厌氧发酵，发酵过程中流加甘油；c、至发酵液中1,3-丙二醇浓度为60～65g/L时，转换至微氧发酵，发酵过程中控制发酵体系pH为5.8～6.2，静置分层后，抽取上层清液，同时加入新鲜培养基，并控制发酵体系pH至偏碱性，随后重复步骤b、c，以实现连续发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）将活化的发酵菌液接种至种子培养基中，接种体积比为1%～30%，培养温度为20～40℃，搅拌转速为100～500rpm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：接种体积比为5%～15%，培养温度为35～40℃，搅拌转速为200～400rpm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）发酵种子液的接种体积比为1%～30%。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：发酵种子液的接种体积比为5%～15%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述阳离子型生物多糖基聚合物的添加质量浓度为0.1%～0.5%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）发酵过程中采用通入氮气的厌氧发酵模式，氮气通气量为0.1～1.0vvm，发酵温度为20～40℃，搅拌转速为100～500rpm，发酵过程中流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在20g/L～40g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：氮气通气量为0.1～0.3vvm，发酵温度为35～40℃，搅拌转速为200～400rpm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，微氧发酵条件为：温度为20～40℃，搅拌转速为200～600rpm。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：微氧发酵条件为：温度为35～40℃，搅拌转速为200～400rpm。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，静置分层后，抽取发酵体积50%～80%的上层清液进行分离处理；同时向发酵体系中加入上层清液体积85%～90%的新鲜培养基。
12.根据权利要求1或11所述的方法，其特征在于：所述的新鲜培养基加入以下配方的补充培养基：NH4Cl 4.26g/L、KCl 0.2g/L、NaH2PO4·H2O 2.07g/L、MgCl2·6H2O 0.26g/L、柠檬酸 0.42g/L、酵母膏 1.5g/L、Vc 0.15g/L、甘油 40g/L。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）采用氢氧化钠或氢氧化钾，使发酵体系pH为7.0～8.0，随后维持0.5～2h，进行厌氧发酵。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：使发酵体系pH为7.2～7.5。
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