CN102352382B - 一种两阶段发酵生产苹果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种两阶段发酵生产苹果酸的方法。本发明的技术要点在于种子培养、两阶段发酵方法利用埃希氏菌属大肠埃希氏菌EscherichiacoliJM127（CGMCC No.2300）发酵的过程：有氧发酵阶段提高菌体生物量，再厌氧发酵阶段发酵产苹果酸；其特征在于在有氧阶段添加乙酸盐。对于分子改造后埃希氏菌属大肠埃希氏菌EscherichiacoliJM127耗糖能力下降，限制了产酸能力的问题，采用了发酵调控的手段得以解决，即在有氧阶段补加乙酸盐为唯一碳源进行连续诱导，使其耗糖能力提高，加强了发酵产酸的能力，发酵结束对苹果酸的积累有明显的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种两阶段发酵生产苹果酸的方法，具体的是利用大肠杆菌进行两阶段发酵生产苹果酸，并在其有氧阶段进行添加乙酸盐提高关键酶活和生物量的方法。
背景技术
苹果酸是一种天然的有机酸，具有重要的生理功能，是生物体内三羧酸循环成员之一，又名羟甲基丁二酸、羟基琥珀酸或1-羟基乙烷二羧酸，分子式为C4H6O5，易溶于水，是一种酸性较强的有机酸，有两种对映体，即L-苹果酸和D-苹果酸。由于苹果酸是人体内部循环的重要中间代谢产物，易被人体吸收，因此作为优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、医疗和保健等领域。目前生产苹果酸主要以富马酸或者马来酸为原料，加压水蒸共热形成DL-苹果酸，也可以以糠醛为原料，经双氧水处理，超声作用而成，然而，由于化学法工艺比较复杂，条件要求较高，分离精制难度大，成本高以及污染严重等原因使得苹果酸的生产受到限制。
苹果酸的生物合成法出现于20世纪90年代中期，主要包括酶转化法和微生物发酵法。酶转化法主要是利用高活性富马酸酶的微生物细胞或者富马酸酶，采用固定化酶或细胞反应器，将富马酸转化为L-苹果酸，虽然固定化细胞和固定化酶均有应用，但由于酶的提取技术复杂，收率不高，成本昂贵，也限制了该法的应用。随着能源危机的出现，使得人们研究工作转向利用微生物发酵制备苹果酸的方法。这一时期的用来发酵制备苹果酸的微生物主要为霉菌，尤其是黄曲霉；例如：黄曲霉Asp.flavu，末曲霉Asp.oryzae，寄生曲霉Asp.parasiticus。
现有技术中，Takao等（J.Ferment.Techno,1983,61:643～645）报道了二步法发酵法，即先利用少根根霉（Rhizopus ahirrizus）或华根霉（Rhizopus. Chinensis）把糖质原料转化为富马酸，然后利用膜醭毕赤酵母（Pichamembranaefaciens faciens）、普通变形杆菌（proteus vμLgaris）之一，把富马酸转化为L-苹果酸的研究，但转化率不高；山东食品发酵工程实验室等人（中国食品添加剂, 2003, 3:52～56）多年来致力于直接发酵生产L-苹果酸的研究，并且从土壤中分离筛选、诱变获得一株利用淀粉质原料生产L-苹果酸的高产菌株Aspergillus flavus HA5800，经条件优化，7000 L发酵罐产酸达8.68%，糖酸转化率达83.5%，发酵周期112小时，为L-苹果酸产业化奠定了基础。
生物法生产苹果酸不仅可以有效的利用可再生资源，还能固定二氧化碳，而且能减少对石化原料的依赖，对全球气候也有一定的积极影响。因此，利用微生物发酵生产苹果酸的研究在美国、日本等发达国家正在深入研究。但是针对霉菌生长速度慢、生产强度较低等缺点，寻找另一种高效的生产菌株成为加速生物法替代传统方法的关键。
大肠杆菌基因组信息明确、生长迅速、培养条件简单、安全性好、易于从分子水平进行改造，使得其高效地发酵生产苹果酸成为可能。由于大肠杆菌具备诸多优点，所以利用其发酵生产苹果酸的方法很多，包括优良大肠杆菌的筛选、传统的理化诱变、基因工程、已经分别从分子和发酵手段的两方面调控进行发酵生产苹果酸。Soon Ho Hong等人（Biotechnol Bioeng，2001,74:89～95）报道了一种丁二酸基因工程菌的构建方法，通过敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）和乳酸脱氢酶基因（ldhA），可以有效的减少副产物乙酸、甲酸、乳酸以及乙醇等的生成，使代谢流向目的产物丁二酸。在此基础上，本发明人团队的在先授权专利ZL200810023410.2（发明名称为“新构建的高产苹果酸工程菌及其生产苹果酸的方法”）通过敲除富马酸酶基因（fumB），使得厌氧环境下，苹果酸还原到富马酸的反应被节制，具备了苹果酸积累的能力得到一株新的高产苹果酸菌株Escherichia coli JM127。但是经基因改造后，该菌株代谢的所需的辅酶NAD+的再生会仍然受到了影响，使得菌株的耗糖能力以及几处关键酶活有所降低，一定程度上限制了菌株的产酸能力。如果能够从分子水平或者发酵调控的手段上克服上述的几种的不足，恢复该菌株的耗糖能力，使得苹果酸的积累成为可能，将大大推进利用大肠杆菌生产苹果酸产业的进步和发展。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种利用发酵调控手段克服基因工程菌Escherichia coli JM127存在的不足，实现其发酵过程中苹果酸的一定积累，即采用两阶段发酵生产苹果酸，并在有氧阶段添加乙酸盐进行诱导，恢复基因工程的耗糖能力，提高苹果酸的产量和收率，达到苹果酸积累的目的。
为了实现本发明目的，本发明采用以下技术方案。
一种两阶段发酵生产苹果酸的方法，包括种子培养、两阶段发酵方法利用埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichia coli JM127（CGMCC No. 2300）发酵的过程：有氧发酵阶段提高菌体生物量，再厌氧发酵阶段发酵产苹果酸；其特征在于在有氧阶段添加乙酸盐。
1、种子培养阶段。
根据本领域技术人员的公知常识可知，利用微生物发酵的方法均涉及将菌株细胞进行种子培养，再将种子培养液接种至发酵培养基发酵的过程。而本发明的上述技术方案同样涉及埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichia coli JM127菌株的种子培养步骤，而该种子培养的方法应理解为现有技术中任意可以将埃希氏菌属大肠埃希氏菌株进行种子培养的方法。例如，在本发明的实施方式中，主要涉及的方法如下。
种子培养：按体积比1%接种量将埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichia coli JM127菌株从冻存管接入三角瓶中，当OD600至0.6～0.8时，加入0.5 mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导至OD600为3，培养温度为30～37℃，摇床转速为100～200 rpm，培养时间10～16 h。
进一步地，所述的种子培养基为：LB培养基。具体地为，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L NaCl；121℃灭菌15 min。
2、两阶段发酵方法利用埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichia coli JM127发酵的过程。
（1）有氧发酵阶段提高菌体生物量。
在发酵罐中加入发酵培养基，接种量为体积比3～7%，一次性加入终浓度为10g/L的葡萄糖，温度为30～37℃，当测定葡萄糖浓度低于0.5～1 g/L时，连续补加浓度为500g/L的乙酸钠水溶液，使发酵罐中乙酸盐浓度维持在0.5～0.8 g/L，进行菌体培养，直至OD600为18～20时，停止补加乙酸盐，结束菌体培养。
进一步地，所述的乙酸盐包括但不限于：乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵等。
进一步地，步骤（1）所述的发酵培养基每1 L的配方为：葡萄糖10g分消，柠檬酸 3.0g，Na2HPO4·7H2O 3.0g，KH2PO4 8.0g，(NH4)2HPO4 8.0g， NH4Cl 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl2·2H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CuCl2·2H2O 0.3mg，MnSO4·H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O 1.8mg，H3BO3 0.1mg，Al2(SO4)3·H2O 1.8mg，Na2MoO4·2H2O 0.5mg，Fe(III)citrate 16.1mg，VB1 20.0mg，生物素 2.0mg。
（2）厌氧发酵阶段发酵产苹果酸。
以0.2～0.6 L/min向步骤（1）结束后的发酵罐中通入CO2以保持发酵体系的厌氧环境，补加20 g/L灭过菌的葡萄糖以及18g/L无菌碱式碳酸镁，搅拌转速控制在100～300rpm，进行厌氧发酵，pH控制在6.6～6.8，温度为30～37℃。
本发明的有益效果在于：苹果酸的生产菌株主要以黄曲霉菌、结合糖酵母菌等，然而其次生代谢产物中可能存在对人体及动物有致癌作用的黄曲霉毒素，倍受争议。针对菌株特性，大肠杆菌生长快速、培养条件简单、安全性高、易操作易改造等诸多优点，使得其具有发酵生产苹果酸潜力，因此，利用大肠杆菌发酵生产苹果酸，可以实现苹果酸优质高产工业化生产的方向。对于分子改造后埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichia coli JM127耗糖能力下降，限制了产酸能力的问题，采用了发酵调控的手段得以解决，即在有氧阶段补加乙酸盐为唯一碳源进行连续诱导，使其耗糖能力提高，加强了发酵产酸的能力，发酵结束对苹果酸的积累有明显的作用。
附图说明
图1是Escherichia coli JM127的代谢途径。
图2是Escherichia coli JM127两阶段发酵产酸过程曲线。
具体实施方式
以下的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
本实例说明Escherichia coli JM127（CGMCC No. 2300，本发明人团队在先专利ZL200810023410.2，发明名称为“新构建的高产苹果酸工程菌及其生产苹果酸的方法”）进行添加乙酸盐诱导和不添加乙酸盐两阶段发酵的对比。
大肠杆菌Escherichia coli JM127在缺失了丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）和乳酸脱氢酶基因（ldhA）和富马酸酶（fumB）后，由于辅酶NAD+再生受到影响，使得其耗糖能力受到较大的限制，但在有氧阶段进行乙酸盐的连续诱导，可以得到有效地改善。为了考察乙酸盐的诱导效果，采用两阶段发酵模式进行发酵产酸对比，按1%（v/v）接种量从冻存管接入三角瓶中，37℃，200rpm过夜培养；将种子液分别按1%（v/v）接种量接入分别含有8g/L葡萄糖的发酵培养基（GM）和5g/L乙酸钠的发酵培养基（AM），分别37℃，200rpm培养10h和12h，OD600至3左右；经4℃，4000×g离心10min，用发酵培养基重悬后，浓缩3倍，通入无菌CO2气体170rpm，30℃，进行厌氧发酵12h。
其中，GM的配方为：8g/L葡萄糖，柠檬酸 3.0g，Na2HPO4·7H2O 3.0g，KH2PO4 8.0g，(NH4)2HPO4 8.0g， NH4Cl 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl2·2H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CuCl2·2H2O 0.3mg，MnSO4·H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O 1.8mg，H3BO3 0.1mg，Al2(SO4)3·H2O 1.8mg，Na2MoO4·2H2O 0.5mg，Fe(III)citrate 16.1mg，VB1 20.0mg，生物素 2.0mg。
AM的配方为：5g/L乙酸钠，柠檬酸 3.0g，Na2HPO4·7H2O 3.0g，KH2PO4 8.0g，(NH4)2HPO4 8.0g， NH4Cl 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl2·2H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CuCl2·2H2O 0.3mg，MnSO4·H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O 1.8mg，H3BO3 0.1mg，Al2(SO4)3·H2O 1.8mg，Na2MoO4·2H2O 0.5mg，Fe(III)citrate 16.1mg，VB1 20.0mg，生物素 2.0mg。
发酵结果见表1。
实施例2
本实例说明乙酸钠在Escherichia coli JM127两阶段发酵中，对菌株几处关键酶活的影响。
添加乙酸钠对两阶段发酵产酸得到有效的改善，产酸分布的变化在很大程度上与菌株几处关键酶的酶活关系密切，本实例进一步考察了有氧阶段乙酸钠诱导后，苹果酸脱氢酶（MDH）、异柠檬酸裂解酶（ICL）、苹果酸酶（ME）以及磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PCK）酶活的变化，按1%（v/v）接种量从冻存管接入三角瓶LB培养基中进行种子培养，37℃，200rpm过夜培养；将种子液分别按1%（v/v）接种量接入分别含有8g/L葡萄糖的发酵培养基（GM）和5g/L乙酸钠的发酵培养基（AM），分别37℃，200rpm培养10h和12h，进行胞内关键酶活的检测。如表2。
其中，种子培养基为LB培养基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L NaCl；121℃灭菌15 min
其中，GM的配方为：8g/L葡萄糖，柠檬酸 3.0g，Na2HPO4·7H2O 3.0g，KH2PO4 8.0g，(NH4)2HPO4 8.0g， NH4Cl 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl2·2H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CuCl2·2H2O 0.3mg，MnSO4·H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O 1.8mg，H3BO3 0.1mg，Al2(SO4)3·H2O 1.8mg，Na2MoO4·2H2O 0.5mg，Fe(III)citrate 16.1mg，VB1 20.0mg，生物素 2.0mg。
AM的配方为：5g/L乙酸钠，柠檬酸 3.0g，Na2HPO4·7H2O 3.0g，KH2PO4 8.0g，(NH4)2HPO4 8.0g， NH4Cl 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl2·2H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CuCl2·2H2O 0.3mg，MnSO4·H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O 1.8mg，H3BO3 0.1mg，Al2(SO4)3·H2O 1.8mg，Na2MoO4·2H2O 0.5mg，Fe(III)citrate 16.1mg，VB1 20.0mg，生物素 2.0mg。
注：a代表数据为实测值加上标准偏差；b中：MDH-苹果酸脱氢酶；ICL-异柠檬酸裂解酶；ME-苹果酸酶；PCK磷酸烯醇式丙酮酸激酶。
实施例3
本实例说明了乙酸盐在Escherichia coli JM127两阶段发酵中上罐发酵的效果，在有氧阶段采用利用乙酸钠连续补料进行诱导。
种子培养：按体积比1%接种量将埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichia coli JM127菌株从冻存管接入三角瓶中，当OD600至0.6～0.8时，加入0.5 mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导至OD600为3，培养温度为30～37℃，摇床转速为100～200 rpm，培养时间10～16 h。
所述的种子培养基为：LB培养基。具体地为，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L NaCl；121℃灭菌15 min。
发酵方法：
发酵培养基每1 L的配方为：葡萄糖10g分消，柠檬酸 3.0g，Na2HPO4·7H2O 3.0g，KH2PO4 8.0g，(NH4)2HPO4 8.0g， NH4Cl 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl2·2H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CuCl2·2H2O 0.3mg，MnSO4·H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O 1.8mg，H3BO3 0.1mg，Al2(SO4)3·H2O 1.8mg，Na2MoO4·2H2O 0.5mg，Fe(III)citrate 16.1mg，VB1 20.0mg，生物素 2.0mg。
将一级种子接种至含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为3%（v/v），一次性加入终浓度为10g/L的葡萄糖，温度为37℃，当初糖浓度低至1g/L时，以低流速连续补加500g/L的乙酸钠，使发酵罐中乙酸盐浓度维持在较低浓度，浓度控制在1g/L，进行菌体培养，至OD600为20时，停止补料。
以0.2 L/min向发酵罐中通入CO2以保持发酵体系的厌氧环境，补加20g/L灭过菌的葡萄糖以及18g/L无菌碱式碳酸镁，pH控制在6.6～6.8，搅拌转速控制在100rpm，温度为37℃进行厌氧发酵。每2h取一次样，进行发酵液成分分析。
本发明所采用的有机酸的分析方法为：
高效液相色谱法（HPLC）：HPLC***高效液相色谱仪，watersHPLC2010工作站；色谱柱Prevail organic acid column 250mm×4.6mm；紫外检测波长215nm；流速1ML/min，进量20μL，流动相25mmol/L KH2PO4，pH 2.5；柱温：室温。重蒸水配制不同浓度的有机酸（丁二酸（Fluka）、乙酸（Sigma）、苹果酸（Sigma））标准溶液，根据峰面积与有机酸标准溶液的浓度关系制作标准曲线。发酵样品经离心稀释后根据峰面积计算各有机酸含量。
发酵结果，见图2。
实施例4
本实施例的种子培养方法、发酵培养基和检测方法同实施例3。
发酵方法：
将一级种子接种至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为7%（v/v），一次性加入终浓度为10g/L的葡萄糖，温度为33℃，当初糖浓度低至0.8g/L时，以低流速连续补加400g/L的乙酸钠，使发酵罐中乙酸盐浓度维持在较低浓度，浓度控制在0.8g/L，进行菌体培养，至OD600为18时，停止补料。
以0.4 L/min向发酵罐中通入CO2以保持发酵体系的厌氧环境，补加20g/L灭过菌的葡萄糖以及18g/L无菌碱式碳酸镁，pH控制在6.6～6.8，搅拌转速控制在300rpm，温度为33℃进行厌氧发酵。每2h取一次样，进行发酵液成分分析，发酵结果见表3。
实施例5
本实施例的种子培养方法、发酵培养基和检测方法同实施例3。
发酵方法：
将一级种子接种至含有4L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为5%（v/v），一次性加入终浓度为10g/L的葡萄糖，温度为30℃，当初糖浓度低至0.5g/L时，以低流速连续补加450g/L的乙酸钠，使发酵罐中乙酸盐浓度维持在较低浓度，浓度控制在0.5g/L，进行菌体培养，至OD600为19时，停止补料。
以0.6 L/min向发酵罐中通入CO2以保持发酵体系的厌氧环境，补加20g/L灭过菌的葡萄糖以及18g/L无菌碱式碳酸镁，pH控制在6.6～6.8，搅拌转速控制在180rpm，温度为30℃进行厌氧发酵。每2h取一次样，进行发酵液成分分析。发酵结果见表4。
Claims (3)
1. 一种两阶段发酵生产苹果酸的方法，包括种子培养、两阶段发酵方法利用埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichia coli JM127发酵的过程：有氧发酵阶段提高菌体生物量，再厌氧发酵阶段发酵产苹果酸；
其特征在于在有氧阶段添加乙酸盐；所述的有氧发酵阶段提高菌体生物量的方法是：在发酵罐中加入发酵培养基，接种量为体积比3～7%，一次性加入终浓度为10g/L的葡萄糖，温度为30～37℃，当测定葡萄糖浓度低于1 g/L时，连续补加乙酸盐水溶液，使发酵罐中乙酸盐浓度维持在0.5～1 g/L，进行菌体培养，直至OD600为18～20时，停止补加乙酸盐，结束菌体培养。
2. 根据权利要求1所述的两阶段发酵生产苹果酸的方法，其特征在于所述的乙酸盐包括：乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵。
3. 根据权利要求1所述的两阶段发酵生产苹果酸的方法，其特征在于所述的发酵培养基每1 L的配方为：葡萄糖10g分消，柠檬酸 3.0g，Na2HPO4·7H2O 3.0g，KH2PO4 8.0g，(NH4)2HPO4 8.0g， NH4Cl 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl2·2H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CuCl2·2H2O 0.3mg，MnSO4·H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O 1.8mg，H3BO3 0.1mg，Al2(SO4)3·H2O 1.8mg，Na2MoO4·2H2O 0.5mg，Fe(III)citrate 16.1mg，VB1 20.0mg，生物素 2.0mg。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Ma Jiangfeng Inventor after: Wang Guangming Inventor after: Jiang Min Inventor after: Liang Liya Inventor after: Liu Rongming Inventor after: Zhang Min Inventor before: Jiang Min Inventor before: Wang Guangming Inventor before: Ma Jiangfeng Inventor before: Liang Liya Inventor before: Liu Rongming Inventor before: Zhang Min |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: JIANG MIN WANG GUANGMING MA JIANGFENG LIANG LIYA LIU RONGMING ZHANG MIN TO: MA JIANGFENG WANG GUANGMING JIANG MIN LIANG LIYA LIU RONGMING ZHANG MIN |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130918 Termination date: 20201013 |