CN109486776A - 锰过氧化物酶NfMnP及其编码基因和应用 - Google Patents

锰过氧化物酶NfMnP及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物领域，具体涉及锰过氧化物酶NfMnP及其编码基因和应用。本发明提供了一种来源于木质纤维素降解菌Nematoloma frowardii的锰过氧化物酶NfMnP，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明的锰过氧化物酶能有效的降解不同结构类型的霉菌毒素，作为一种新型的酶制剂，可广泛用于食品和饲料霉菌毒素脱毒领域。

Description

锰过氧化物酶NfMnP及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于农业生物领域，具体涉及锰过氧化物酶NfMnP及其编码基因和应用。
背景技术
霉菌毒素是真菌次级代谢产物，对家畜、家禽和人类的健康有害。常见的霉菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、桔霉素、赭曲霉毒素、伏马菌素、展青霉素和单端孢霉菌毒素，可以分为具环状结构和不具环状结构的两类毒素。大多数霉菌毒素，如黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，属于具环状结构的亚组中，通常通过真菌聚酮途径进行合成。例如，黄曲霉毒素(aflatoxin)B1由黄曲霉(Aspergillus flavus)产生，具有一个核心的香豆素环和两侧的五元碳环和两个并列的二氢呋喃环，其是很强的肝脏致癌物。此外，玉米赤霉烯酮的结构是间二羟基苯甲酸酚内酯，伏马菌素则具有22碳对氨基苯酚线性骨架，侧链为两个丙三酸。
物理吸附(或灭活)以及生物转化是将食物和饲料中的霉菌毒素脱毒的两种主要方式。除此之外，使用微生物，特别是通过微生物产生的酶，进行霉菌毒素的脱毒是一种新兴的手段。现有技术中漆酶、泛解酸内酯水解酶、过氧化物酶以及一些尚不能分类的酶可通过氧化或水解机理降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮。来自于木质纤维素降解菌的锰过氧化物酶(MnP)是一组参与木质素氧化降解的酶。现有技术中公开的少数几个微生物产酶均只能特异性的降解黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等一到两种霉菌毒素，因此，在实际应用中受到极大的限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种锰过氧化物酶NfMnP。
本发明的再一目的在于提供上述锰过氧化物酶NfMnP的编码基因。
本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。
本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。
本发明的再一目的在于提供上述锰过氧化物酶NfMnP的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述锰过氧化物酶NfMnP的应用。
本发明的氧化物酶NfMnP，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1所示：
MAFNFAAILAFVSLAAVTSAAPSGTTCSNGVVVPDAVCCDFVPLASALQSEVLMGDCGEDAHELVRLIFHDAIAISQSMGPSAGGGADGSMLIFPTVEPAFFPNLGIADSVNNLIPFLSQFPTISAGDLVQFAGAVAISNCPGAPQLEFLAGRSNATAPAIDGLIPEPQDDVTKILARFADAGNFTPDEVVALLASHSIARADHVDPTLDAAPFDSTPFDFDTQVFLEVLLKGTGFPGLDNNTGEVSSPLPVTDGTDVGELRLQSDFVLARDERTACAWQSFVNEQQAMADAFKEAVKKLAVLGHSRSDLVDCSAVVPVPKPATGTPATFPASTGPQDLELTCTTVPFPTLSTAPGAQQTLIPHCSDGTMTCNSVQFDGPATNFGGADDS
其中，氧化物酶NfMnP编码390个氨基酸，N端20个氨基酸为其信号肽序列，信号肽序列如SEQ ID No.2所示：
MAFNFAAILAFVSLAAVTSA
因此，成熟的锰过氧化物酶NfMnP的理论分子量为40.2kDa，其氨基酸序列如SEQID No.3所示：
APSGTTCSNGVVVPDAVCCDFVPLASALQSEVLMGDCGEDAHELVRLIFHDAIAISQSMGPSAGGGADGSMLIFPTVEPAFFPNLGIADSVNNLIPFLSQFPTISAGDLVQFAGAVAISNCPGAPQLEFLAGRSNATAPAIDGLIPEPQDDVTKILARFADAGNFTPDEVVALLASHSIARADHVDPTLDAAPFDSTPFDFDTQVFLEVLLKGTGFPGLDNNTGEVSSPLPVTDGTDVGELRLQSDFVLARDERTACAWQSFVNEQQAMADAFKEAVKKLAVLGHSRSDLVDCSAVVPVPKPATGTPATFPASTGPQDLELTCTTVPFPTLSTAPGAQQTLIPHCSDGTMTCNSVQFDGPATNFGGADDS
本发明提供了编码上述锰过氧化物酶NfMnP的基因序列，具体地，NfMnP基因的基因组序列如SEQ ID No.4所示：
atggctttcaactttgctgcaatcctcgcctttgtctcactcgccgccgtgacgagtgctgccccgagcgggaccacctgttccaatggtgtagtcgttcctgacgcagtgtgctgcgacttcgtcccagtaaggcattctgctcctgtctttttatgcagcacactgaatcgtcgtacgaaatagcttgcatctgcccttcagagcgaggtcctcatgggcgactgtggtgaagacggtaggccaagttcctgtcatcctatccctgaaccgctgtctcacttgctctccagcgcacgagctcgtccgtcttattttccgtaagtctggctcgtcaatcgtctccggtattgtattgacactatgttagacgatgccattgccatctcccaaagcatgggtccctcagcgtaagtgaaaactctcgttaaaattggtttgtgctgatttgactcggcctacagtggtggcggagccgacggctcgatgctcatcttccctacggtcgaaccggcgttcttcccgaaccttggtatcgccgacagcgtcaacaacttgatccccttcctctcacaattccccacgatttctgctggtgatcttgttcagttcgcaggcgccgtcgcgatcagcaactgccccgtaagcagctacagcgctcggtcttctactgaaccgatgctgacacgaattgtgcatacagggcgcccctcaactggagttccttgccggacgttccaacgcgaccgctcctgccatcgacggcctcatccccgagccccaggacgatgtcaccaagattcttgcgcgctttgcggatgctggcaacttcacccctgacgaagtcgttgctctcctggcttcgcacagtatcgcccgtgctgatcacgtcgacccgacgcttgacgccgcgcccttcgactccgtgagtggtgcctattgcccgcccctctttcaccggctgacttcatctaccatcccacagacgccgttcgacttcgacacccaggtcttccttgaggtgctgctcaagggcaccggcttccccggcctggacaacaacaccggcgaggtctcctccccgctccccgtcaccgatggcaccgatgtcggcgagctgcgcctccagtccgacttcgtgcttgcccgcgacgagcgcaccgcctgcgcctggcagagcttcgtcaacgaacagcaggcgatggctgatgcgttcaaggaggcagtcaagaagctcgccgtgctcggccacagccgcagcgacctcgtcgactgctccgcggtcgtccctgtccccaagcccgcgactggcacgcccgccacgttccccgcttcgacgggcccgcaggacctcgagctcacgtgcacgaccgtgccgttccccacgctgtctactgcccgtaagtctcgctgttttctctcatctatgatctgcaccgttgctaatcgcccactcttcatcacagccggcgcccagcagactctgatcccgcactgctccgacggcaccatgacttgcaactccgtgcagttcgacggccccgccaccaacttcggtggtgcagacgactcgtag
锰过氧化物酶NfMnP编码基因序列全长1576bp。其中，信号肽的碱基序如SEQ IDNo.5所示：
atggctttcaactttgctgcaatcctcgcctttgtctcactcgccgccgtgacgagtgct
成熟的锰过氧化物酶NfMnP的cDNA序列如SEQ ID No.6所示：
gccccgagcgggaccacctgttccaatggtgtagtcgttcctgacgcagtgtgctgcgacttcgtcccagtaaggcattctgctcctgtctttttatgcagcacactgaatcgtcgtacgaaatagcttgcatctgcccttcagagcgaggtcctcatgggcgactgtggtgaagacggtaggccaagttcctgtcatcctatccctgaaccgctgtctcacttgctctccagcgcacgagctcgtccgtcttattttccgtaagtctggctcgtcaatcgtctccggtattgtattgacactatgttagacgatgccattgccatctcccaaagcatgggtccctcagcgtaagtgaaaactctcgttaaaattggtttgtgctgatttgactcggcctacagtggtggcggagccgacggctcgatgctcatcttccctacggtcgaaccggcgttcttcccgaaccttggtatcgccgacagcgtcaacaacttgatccccttcctctcacaattccccacgatttctgctggtgatcttgttcagttcgcaggcgccgtcgcgatcagcaactgccccgtaagcagctacagcgctcggtcttctactgaaccgatgctgacacgaattgtgcatacagggcgcccctcaactggagttccttgccggacgttccaacgcgaccgctcctgccatcgacggcctcatccccgagccccaggacgatgtcaccaagattcttgcgcgctttgcggatgctggcaacttcacccctgacgaagtcgttgctctcctggcttcgcacagtatcgcccgtgctgatcacgtcgacccgacgcttgacgccgcgcccttcgactccgtgagtggtgcctattgcccgcccctctttcaccggctgacttcatctaccatcccacagacgccgttcgacttcgacacccaggtcttccttgaggtgctgctcaagggcaccggcttccccggcctggacaacaacaccggcgaggtctcctccccgctccccgtcaccgatggcaccgatgtcggcgagctgcgcctccagtccgacttcgtgcttgcccgcgacgagcgcaccgcctgcgcctggcagagcttcgtcaacgaacagcaggcgatggctgatgcgttcaaggaggcagtcaagaagctcgccgtgctcggccacagccgcagcgacctcgtcgactgctccgcggtcgtccctgtccccaagcccgcgactggcacgcccgccacgttccccgcttcgacgggcccgcaggacctcgagctcacgtgcacgaccgtgccgttccccacgctgtctactgcccgtaagtctcgctgttttctctcatctatgatctgcaccgttgctaatcgcccactcttcatcacagccggcgcccagcagactctgatcccgcactgctccgacggcaccatgacttgcaactccgtgcagttcgacggccccgccaccaacttcggtggtgcagacgactcgtag
本发明还提供了包含上述锰过氧化物酶基因NfMnP的重组载体，优选为pColdI-NfMnP。将本发明的锰过氧化物酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的锰过氧化物酶基因NfMnP***到质粒pCold I上的NdeI-BamHI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于CSPA启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pCold I-NfMnP。
本发明还提供了包含上述锰过氧化物酶基因NfMnP的重组菌株，优选为重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/NfMnP。
本发明还提供了一种制备锰过氧化物酶NfMnP的方法，包括以下步骤：
(1)用含有上述锰过氧化物酶基因NfMnP的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导重组锰过氧化物酶表达；
(3)分离和纯化锰过氧化物酶NfMnP。
本发明还提供锰过氧化物酶NfMnP的应用，尤其在霉菌毒素脱毒方面，本发明的锰过氧化物酶NfMnP可降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素及伏马菌素B1。
附图说明
图1显示重组锰过氧化物酶NfMnP对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马菌素B1的降解率；
图2显示重组锰过氧化物酶NfMnP降解黄曲霉毒素B1的HPLC分析结果；
图3显示重组锰过氧化物酶NfMnP降解玉米赤霉烯酮的HPLC分析结果；
图4显示重组锰过氧化物酶NfMnP降解呕吐毒素的HPLC分析结果；
图5显示重组锰过氧化物酶NfMnP降解伏马菌素B1的HPLC分析结果。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、基因及载体：大肠杆菌表达载体pCold I、菌株BL21(DE3)；
2、酶类及其它生化试剂：内切酶、重组酶、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马菌素B1；
3、培养基：大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。
实施例1锰过氧化物酶NfMnP编码基因的克隆
本发明的目的基因来源于木质纤维素降解菌Nematoloma frowardii。
设计引物：
NfMnP-F:5'-CATATCGAAGGTAGGCATATGGCCCCGAGCGGGACCACCTG-3'；
NfMnP-R:5'-GACAAGCTTGAATTCGGATCCCGAGTCGTCTGCACCACCGA-3'
以带有目的基因的质粒为模板进行PCR扩增。在1％琼脂糖凝胶上电泳，切胶得到目的片段，将该片段回收后与NdeI-BamHI双酶切的pCold I载体通过同源重组的方法相连，转化TransI克隆宿主，测序，得到NfMnP编码基因。
实施例2制备重组锰过氧化物酶NfMnP
将获得的含有锰过氧化物酶基因NfMnP的重组大肠杆菌表达质粒pCold I-NfMnP转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/NfMnP。
取含有重组质粒的BL21(DE3)/NfMnP菌株，接种于50mL LB培养液中，37℃220rpm振荡培养12h后，按2％比例转接于300mL LB培养基中，37℃220rpm振荡培养约2h(OD590≈0.5)。冰水浴处理后于10℃220rpm培养30分钟后加入60μL浓度1M的诱导剂IPTG，于10℃220rpm继续培养6h。之后9h培养过程中每小时加入33μL浓度1M的CaCl2，330μL浓度10g/L的Hemin(Hemin溶于0.1M NaOH中)。10℃220rpm继续培养10h后离心收集菌体。采取超声法法裂解菌体，利用镍柱进行亲和层析纯化获得单一的NfMnP蛋白。
实施例3重组锰过氧化物酶NfMnP对黄曲霉毒素B1的降解效果
将黄曲霉毒素B1溶解到二甲基亚砜中配制成50mg/L的母液，按如下反应体系：70μL丙二酸缓冲液(0.2M，pH 5.0)，20μL黄曲霉毒素B1溶液(50mg/L)，5μL硫酸锰(40mM)，100μL锰过氧化酶(1000U/L)，5μL过氧化氢(4mM)。以未加入锰过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，48h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱(HPLC)分析黄曲霉毒素B1的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析***，色谱分离柱为Zorbax SB-C18(4.6×250mm,5μm)，流动相A(0.06％TFA的水)，流动相B(0.05％TFA的乙腈)；梯度洗脱条件0％B洗脱4分钟，0％-100％B洗脱15分钟，100％B洗脱6分钟；检测波长365nm。
结果如图1、图2所示，部分黄曲霉毒素已被降解，降解率为56.6％。
实施例4重组锰过氧化物酶NfMnP对玉米赤霉烯酮的降解效果
将玉米赤霉烯酮溶解到二甲基亚砜中配制成50mg/L的母液，按如下反应体系：70μL丙二酸缓冲液(0.2M，pH 5.0)，20μL玉米赤霉烯酮溶液(50mg/L)，5μL硫酸锰(40mM)，100μL锰过氧化酶(1000U/L)，5μL过氧化氢(4mM)。以未加入锰过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，48h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱(HPLC)分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析***，色谱分离柱为Zorbax SB-C18(4.6×250mm,5μm)，流动相A(0.06％TFA的水)，流动相B(0.05％TFA的乙腈)；梯度洗脱条件0％B洗脱4分钟，0％-100％B洗脱15分钟，100％B洗脱6分钟；检测波长316nm。
结果如图1、图3所示，部分玉米赤霉烯酮已被降解，降解率为39.6％。
实施例5重组锰过氧化物酶NfMnP对呕吐毒素的降解效果
将呕吐毒素溶解到甲醇中配制成100mg/L的母液，按如下反应体系：70μL丙二酸缓冲液(0.2M，pH 5.0)，20μL呕吐毒素溶液(100mg/L)，5μL硫酸锰(40mM)，100μL锰过氧化酶(1000U/L)，5μL过氧化氢(4mM)。以未加入锰过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，48h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱(HPLC)分析呕吐毒素的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析***，色谱分离柱为Zorbax SB-C18(4.6×250mm,5μm)，流动相A(水)，流动相B(甲醇)；梯度洗脱条件20％B洗脱20分钟，20％-100％B洗脱1分钟，100％B洗脱6分钟；检测波长220nm。
结果如图1、图4所示，部分呕吐毒素已被降解，降解率为28％。
实施例6重组锰过氧化物酶NfMnP对伏马菌素B1的降解效果
将伏马菌素B1溶解到DMSO中配制成100mg/L的母液，按如下反应体系：70μL丙二酸缓冲液(0.2M，pH 5.0)，20μL伏马菌素B1溶液(100mg/L)，5μL硫酸锰(40mM)，100μL锰过氧化酶(1000U/L)，5μL过氧化氢(4mM)。以未加入锰过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，48h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱(HPLC)-质谱(MS)联用分析伏马菌素B1的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析***，色谱分离柱为Zorbax SB-C18(4.6X 250,5um)，流动相A(0.1％甲酸的水)，流动相B(乙腈:甲醇1:1)；梯度洗脱条件30％-100％B梯度洗脱10分钟，30％B洗脱18分钟，100％B洗脱2分钟；质谱为SCIEX Triple TOF分析***，质谱条件为CE：35V±15V，Ion source gas：50，TEM 500℃，ISVF 5500V，sean：m/z 100-1000(目标物721)。
结果如图1、图5所示，部分伏马菌素已被降解，降解率为16.7％。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 锰过氧化物酶NfMnP及其编码基因和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 390
<212> PRT
<213> 木质纤维素降解菌(Nematoloma frowardii)
<400> 1
Met Ala Phe Asn Phe Ala Ala Ile Leu Ala Phe Val Ser Leu Ala Ala
1 5 10 15
Val Thr Ser Ala Ala Pro Ser Gly Thr Thr Cys Ser Asn Gly Val Val
20 25 30
Val Pro Asp Ala Val Cys Cys Asp Phe Val Pro Leu Ala Ser Ala Leu
35 40 45
Gln Ser Glu Val Leu Met Gly Asp Cys Gly Glu Asp Ala His Glu Leu
50 55 60
Val Arg Leu Ile Phe His Asp Ala Ile Ala Ile Ser Gln Ser Met Gly
65 70 75 80
Pro Ser Ala Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Met Leu Ile Phe Pro Thr
85 90 95
Val Glu Pro Ala Phe Phe Pro Asn Leu Gly Ile Ala Asp Ser Val Asn
100 105 110
Asn Leu Ile Pro Phe Leu Ser Gln Phe Pro Thr Ile Ser Ala Gly Asp
115 120 125
Leu Val Gln Phe Ala Gly Ala Val Ala Ile Ser Asn Cys Pro Gly Ala
130 135 140
Pro Gln Leu Glu Phe Leu Ala Gly Arg Ser Asn Ala Thr Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ile Asp Gly Leu Ile Pro Glu Pro Gln Asp Asp Val Thr Lys Ile Leu
165 170 175
Ala Arg Phe Ala Asp Ala Gly Asn Phe Thr Pro Asp Glu Val Val Ala
180 185 190
Leu Leu Ala Ser His Ser Ile Ala Arg Ala Asp His Val Asp Pro Thr
195 200 205
Leu Asp Ala Ala Pro Phe Asp Ser Thr Pro Phe Asp Phe Asp Thr Gln
210 215 220
Val Phe Leu Glu Val Leu Leu Lys Gly Thr Gly Phe Pro Gly Leu Asp
225 230 235 240
Asn Asn Thr Gly Glu Val Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Asp Gly Thr
245 250 255
Asp Val Gly Glu Leu Arg Leu Gln Ser Asp Phe Val Leu Ala Arg Asp
260 265 270
Glu Arg Thr Ala Cys Ala Trp Gln Ser Phe Val Asn Glu Gln Gln Ala
275 280 285
Met Ala Asp Ala Phe Lys Glu Ala Val Lys Lys Leu Ala Val Leu Gly
290 295 300
His Ser Arg Ser Asp Leu Val Asp Cys Ser Ala Val Val Pro Val Pro
305 310 315 320
Lys Pro Ala Thr Gly Thr Pro Ala Thr Phe Pro Ala Ser Thr Gly Pro
325 330 335
Gln Asp Leu Glu Leu Thr Cys Thr Thr Val Pro Phe Pro Thr Leu Ser
340 345 350
Thr Ala Pro Gly Ala Gln Gln Thr Leu Ile Pro His Cys Ser Asp Gly
355 360 365
Thr Met Thr Cys Asn Ser Val Gln Phe Asp Gly Pro Ala Thr Asn Phe
370 375 380
Gly Gly Ala Asp Asp Ser
385 390
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 木质纤维素降解菌(Nematoloma frowardii)
<400> 2
Met Ala Phe Asn Phe Ala Ala Ile Leu Ala Phe Val Ser Leu Ala Ala
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 木质纤维素降解菌(Nematoloma frowardii)
<400> 3
Ala Pro Ser Gly Thr Thr Cys Ser Asn Gly Val Val Val Pro Asp Ala
1 5 10 15
Val Cys Cys Asp Phe Val Pro Leu Ala Ser Ala Leu Gln Ser Glu Val
20 25 30
Leu Met Gly Asp Cys Gly Glu Asp Ala His Glu Leu Val Arg Leu Ile
35 40 45
Phe His Asp Ala Ile Ala Ile Ser Gln Ser Met Gly Pro Ser Ala Gly
50 55 60
Gly Gly Ala Asp Gly Ser Met Leu Ile Phe Pro Thr Val Glu Pro Ala
65 70 75 80
Phe Phe Pro Asn Leu Gly Ile Ala Asp Ser Val Asn Asn Leu Ile Pro
85 90 95
Phe Leu Ser Gln Phe Pro Thr Ile Ser Ala Gly Asp Leu Val Gln Phe
100 105 110
Ala Gly Ala Val Ala Ile Ser Asn Cys Pro Gly Ala Pro Gln Leu Glu
115 120 125
Phe Leu Ala Gly Arg Ser Asn Ala Thr Ala Pro Ala Ile Asp Gly Leu
130 135 140
Ile Pro Glu Pro Gln Asp Asp Val Thr Lys Ile Leu Ala Arg Phe Ala
145 150 155 160
Asp Ala Gly Asn Phe Thr Pro Asp Glu Val Val Ala Leu Leu Ala Ser
165 170 175
His Ser Ile Ala Arg Ala Asp His Val Asp Pro Thr Leu Asp Ala Ala
180 185 190
Pro Phe Asp Ser Thr Pro Phe Asp Phe Asp Thr Gln Val Phe Leu Glu
195 200 205
Val Leu Leu Lys Gly Thr Gly Phe Pro Gly Leu Asp Asn Asn Thr Gly
210 215 220
Glu Val Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Asp Gly Thr Asp Val Gly Glu
225 230 235 240
Leu Arg Leu Gln Ser Asp Phe Val Leu Ala Arg Asp Glu Arg Thr Ala
245 250 255
Cys Ala Trp Gln Ser Phe Val Asn Glu Gln Gln Ala Met Ala Asp Ala
260 265 270
Phe Lys Glu Ala Val Lys Lys Leu Ala Val Leu Gly His Ser Arg Ser
275 280 285
Asp Leu Val Asp Cys Ser Ala Val Val Pro Val Pro Lys Pro Ala Thr
290 295 300
Gly Thr Pro Ala Thr Phe Pro Ala Ser Thr Gly Pro Gln Asp Leu Glu
305 310 315 320
Leu Thr Cys Thr Thr Val Pro Phe Pro Thr Leu Ser Thr Ala Pro Gly
325 330 335
Ala Gln Gln Thr Leu Ile Pro His Cys Ser Asp Gly Thr Met Thr Cys
340 345 350
Asn Ser Val Gln Phe Asp Gly Pro Ala Thr Asn Phe Gly Gly Ala Asp
355 360 365
Asp Ser
370
<210> 4
<211> 1576
<212> DNA
<213> 木质纤维素降解菌(Nematoloma frowardii)
<400> 4
atggctttca actttgctgc aatcctcgcc tttgtctcac tcgccgccgt gacgagtgct 60
gccccgagcg ggaccacctg ttccaatggt gtagtcgttc ctgacgcagt gtgctgcgac 120
ttcgtcccag taaggcattc tgctcctgtc tttttatgca gcacactgaa tcgtcgtacg 180
aaatagcttg catctgccct tcagagcgag gtcctcatgg gcgactgtgg tgaagacggt 240
aggccaagtt cctgtcatcc tatccctgaa ccgctgtctc acttgctctc cagcgcacga 300
gctcgtccgt cttattttcc gtaagtctgg ctcgtcaatc gtctccggta ttgtattgac 360
actatgttag acgatgccat tgccatctcc caaagcatgg gtccctcagc gtaagtgaaa 420
actctcgtta aaattggttt gtgctgattt gactcggcct acagtggtgg cggagccgac 480
ggctcgatgc tcatcttccc tacggtcgaa ccggcgttct tcccgaacct tggtatcgcc 540
gacagcgtca acaacttgat ccccttcctc tcacaattcc ccacgatttc tgctggtgat 600
cttgttcagt tcgcaggcgc cgtcgcgatc agcaactgcc ccgtaagcag ctacagcgct 660
cggtcttcta ctgaaccgat gctgacacga attgtgcata cagggcgccc ctcaactgga 720
gttccttgcc ggacgttcca acgcgaccgc tcctgccatc gacggcctca tccccgagcc 780
ccaggacgat gtcaccaaga ttcttgcgcg ctttgcggat gctggcaact tcacccctga 840
cgaagtcgtt gctctcctgg cttcgcacag tatcgcccgt gctgatcacg tcgacccgac 900
gcttgacgcc gcgcccttcg actccgtgag tggtgcctat tgcccgcccc tctttcaccg 960
gctgacttca tctaccatcc cacagacgcc gttcgacttc gacacccagg tcttccttga 1020
ggtgctgctc aagggcaccg gcttccccgg cctggacaac aacaccggcg aggtctcctc 1080
cccgctcccc gtcaccgatg gcaccgatgt cggcgagctg cgcctccagt ccgacttcgt 1140
gcttgcccgc gacgagcgca ccgcctgcgc ctggcagagc ttcgtcaacg aacagcaggc 1200
gatggctgat gcgttcaagg aggcagtcaa gaagctcgcc gtgctcggcc acagccgcag 1260
cgacctcgtc gactgctccg cggtcgtccc tgtccccaag cccgcgactg gcacgcccgc 1320
cacgttcccc gcttcgacgg gcccgcagga cctcgagctc acgtgcacga ccgtgccgtt 1380
ccccacgctg tctactgccc gtaagtctcg ctgttttctc tcatctatga tctgcaccgt 1440
tgctaatcgc ccactcttca tcacagccgg cgcccagcag actctgatcc cgcactgctc 1500
cgacggcacc atgacttgca actccgtgca gttcgacggc cccgccacca acttcggtgg 1560
tgcagacgac tcgtag 1576
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 木质纤维素降解菌(Nematoloma frowardii)
<400> 5
atggctttca actttgctgc aatcctcgcc tttgtctcac tcgccgccgt gacgagtgct 60
<210> 6
<211> 1516
<212> DNA
<213> 木质纤维素降解菌(Nematoloma frowardii)
<400> 6
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aaatagcttg catctgccct tcagagcgag gtcctcatgg gcgactgtgg tgaagacggt 180
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gctcgtccgt cttattttcc gtaagtctgg ctcgtcaatc gtctccggta ttgtattgac 300
actatgttag acgatgccat tgccatctcc caaagcatgg gtccctcagc gtaagtgaaa 360
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ggctcgatgc tcatcttccc tacggtcgaa ccggcgttct tcccgaacct tggtatcgcc 480
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cgacggcacc atgacttgca actccgtgca gttcgacggc cccgccacca acttcggtgg 1500
tgcagacgac tcgtag 1516

Claims (8)

1.锰过氧化物酶NfMnP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。
2.锰过氧化物酶NfMnP基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的锰过氧化物酶NfMnP。
3.根据权利要求2所述的锰过氧化物酶NfMnP基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.4或SEQ ID No.6所示。
4.包含权利要求2所述的锰过氧化物酶NfMnP基因的重组表达载体。
5.包含权利要求2所述的锰过氧化物酶NfMnP基因的重组菌株。
6.制备权利要求1所述的锰过氧化物酶NfMnP的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)用包含编码锰过氧化物酶NfMnP基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)培养所述重组菌株，诱导锰过氧化物酶NfMnP表达；
(3)分离纯化所述锰过氧化物酶NfMnP。
7.权利要求1所述的锰过氧化物酶NfMnP的应用。
8.权利要求1所述的锰过氧化物酶NfMnP在霉菌毒素脱毒方面的应用。
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