CN110684754B - 一种真菌毒素zen降解酶突变体及其应用 - Google Patents
一种真菌毒素zen降解酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种真菌毒素ZEN降解酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明公开了来源于Gliocladium roseum MA918的玉米赤霉烯酮降解酶(简称ZENG酶)作为亲本，利用基因突变技术，第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成苯丙氨酸Phe，得到双突变体H134F/S136F。最适催化条件下，酶在53℃保温2min后残余酶活提高了36％；保温5min后的残余酶活提高了33％；保温7min后残余酶活提高了12％。在58℃保温2min后残余酶活提高了34％，保温5min后的残余酶活提高了13％。
Description
技术领域
本发明涉及一种真菌毒素ZEN降解酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)又称F-2毒素，是一种由禾谷镰刀真菌、黄色镰刀真菌以及克地镰刀真菌等多种镰刀霉菌产生并释放到土壤环境中的真菌类毒素。ZEN的化学结构由Urry在1966年用核磁共振、经典化学和质谱等技术确定，并被命名为：6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯。ZEN在世界各地的谷物及其副产品中污染广泛，给种植业和养殖业带来巨大损失，也对食品安全构成严重威胁。
目前，ZEN的降解方法可分为三类，即物理法、化学法和生物法。
物理法主要包括人工剔除、水洗、脱壳、高温、压煮、吸附剂吸附等。对于轻度ZEN污染的谷物可以采用剔除、水洗等手段部分清除ZEN；由于ZEN的热稳定性较好，在120℃条件下加热4h也不分解，所以热处理和压煮等方式主要对产生ZEN的真菌起杀灭作用，对ZEN的破坏作用较小，而且高温破坏了食品和饲料的营养价值，影响食品的口感；吸附法主要是利用疏水作用来达到清除食物中真菌毒素的目的，常用的吸附剂包括酵母细胞壁、活性炭、蒙脱石特别是改性蒙脱石、高岭土和消胆胺等，但吸附剂在吸附毒素的同时，也会结合饲料中如氨基酸和维生素等一些重要的营养物质，影响粮食中的营养物质，降低产品品质，而且毒素也不能被完全降解，因此会对环境造成严重影响。
化学法的降解原理是氧化降解，ZEN的化学结构在O3，H2O2等作用下发生改变，最后变成无毒的ZEN副产物。但化学法工作量较大，并且操作时间较长，氧化降解ZEN的同时也会对饲料中的营养成分产生破坏作用，因此仍需改进。
生物法的原理是利用微生物菌体吸附和微生物自身或其产生的酶类降解ZEN，使其成为无毒的产物。特别是后者，具有降解ZEN能力的关键酶基因正是目前生物方法研究的重点。目前玉米赤霉烯酮的生物降解技术研究仍然有很多不完善的地方，例如关于酶类降解转化ZEN的原理研究不够深入，同时ZEN降解菌功能易衰退以及不稳定等问题层出不穷，有待改进。
因此，提供一种行之有效的生物降解ZEN的方法，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种热稳定性提高的真菌毒素ZEN降解酶突变体，其氨基酸序列是：
(a)如SEQ ID NO.4所示；
(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有ZEN降解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明的目的之一是提供编码上述真菌毒素ZEN降解酶突变体的基因。
进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的目的之一是提供含上述基因的质粒，所述质粒包括但不限于pET系列质粒。
进一步地，所述质粒包括pET-22b(+)。
本发明的目的之一是提供表达上述真菌毒素ZEN降解酶突变体的大肠杆菌。
进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的目的之一是提供一种提高ZEN降解酶热稳定性的方法，是将氨基酸序列如SEQID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶亲本酶的第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成苯丙氨酸Phe。编码所述玉米赤霉烯酮降解酶亲本酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，在GeneBank的编号为KR363960.1
本发明的目的之一是提供一种降解ZEN的方法，是以ZEN为底物，添加含上述真菌毒素ZEN降解酶突变体的粗酶液或全细胞。
进一步地，真菌毒素ZEN降解酶突变体的添加量为1-10000U/g底物。
本发明的目的之一是提供上述ZEN降解酶突变体在农产品领域的应用。
本发明的目的之一是提供上述ZEN降解酶突变体在饲料领域的应用。
本发明的有益效果：本发明提供一种ZENG的突变体酶H134F/S136F，其最适催化条件没有发生改变，与亲本酶ZENG相比，所述ZENG的突变体酶H134F/S136F的最适催化条件没有发生改变，但在53℃保温2min后残余酶活提高了36％；保温5min后的残余酶活提高了33％；保温7min后残余酶活提高了12％。在58℃保温2min后残余酶活提高了34％，保温5min后的残余酶活分别提高了13％。这一发现对于ZEN降解内酯水解酶的工业化应用具有重要的价值。
附图说明
图1：53℃下亲本酶和突变体酶H134F/S136F的热稳定性比较。
图2：58℃下亲本酶和突变体酶H134F/S136F的热稳定性比较。
具体实施方式
(一)ZEN降解酶的酶活测定方法
反应体系为250μL，包括5μL ZEN的甲醇溶液(4mg/mL)，5μL酶液(0.5mg/mL)和240μL磷酸缓冲液(50mM,pH 7.0)在38℃条件下反应10min，加入50μL盐酸(1mol/L)和300μL甲醇终止反应。
1U总酶活定义为在pH 7.0，38℃条件下反应，每分钟消耗1μg底物所需要的酶量。
(二)蛋白纯化方法
准备镍离子亲和层析柱，首先，在室温下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用缓冲液A(500mmol/L NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的缓冲液A的pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用缓冲液B(500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，50mM Tris-HCl，pH 8.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，50mM Tris-HCl，pH 8.0)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，并测定其酶活，获得目的蛋白。
实施例1：ZENG酶突变体的制备方法
选取不同微生物来源的ZENG降解酶，分析其热稳定性的差异情况，并对各自的氨基酸序列进行比对；同时，基于已经解析出的晶体结构，分析出处于134位和136位的残基恰好处于连接酶结构中的“帽子”区域与核心催化区域。为此，选择对134位和136位的残基进行不同方式的定点突变。
pET-22b(+)-H134F/S136F突变质粒的构建：
根据Gliocladium roseum MA 918来源的编码玉米赤霉烯酮降解酶的基因(登录号：KR363960.1)，合成ZEN降解内酯水解酶的基因，并连接至pET-22b(+)的酶切位点Nde I和Xho I之间，获得重组质粒pET22b(+)-ZENG。以pET-22b(+)-ZENG质粒为模板，经PCRl，PCR2，PCR3，引入H134F/S136F定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pET-22b(+)-H134F/S136F构建成功。
H134F/S136F突变引物如下所示：(下划线为突变碱基)
游外侧引物：5’-TTATCCATATGGAGGATGCAAACATGCAT-3’，
下游外侧引物：5’-TATATCTCGAGCCGATAACACACTTCATT-3’，
正向突变引物：5’-TGGACTTTCTTTTTAA CACCGC-3’，下划线为突变碱基，
反向突变引物：5’-CAGCGGTGTTAAAAAGAAAGTCCAGTAG-3’，下划线为突变碱基。
PCR 1：反应体系的组成：
以带有玉米赤霉烯酮降解酶目的基因的克隆载体pET22b(+)-ZENG为模版。
PCR 2：反应体系的组成：
| 10×PCR Buffer | 5μL |
| dNTP(2mmol/L) | 4μL |
| 下游外侧引物(10μM) | 1μL |
| 正向突变引物(10μM) | 1μL |
| pET22b(+)-ZENG | 0.5μL |
| Taq Plus DNA polymerase(5U/μL) | 0.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 将体系补足50μL |
PCRl、PCR2扩增条件为：
94℃预变性4min；随后94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃保温10min。
PCRl、PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化；
PCR 3：反应体系的组成：
| 10×PCR Buffer | 10μL |
| dNTP(2mmol/L) | 8μL |
| 上游外侧引物(10μM) | 1μL |
| 下游外侧引物(10μM) | 1μL |
| PCR1纯化产物 | 10μL |
| PCR2纯化产物 | 10μL |
| Taq Plus DNA polymerase(5U/μL) | 1μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 将体系补足100μL |
PCR3扩增条件为：
94℃预变性4min；随后94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃保温10min。
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶Nde I和Xho I酶切后连接至载体pET-22b(+)，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有50μg/mL氨节青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨节青霉素的LB液体培养基培养，后提取突变质粒pET-22b(+)-H134F/S136F，突变质粒经测序鉴定为正确的突变。
实施例2：突变体酶H134F/S136F的表达纯化方法
将测序验证后的突变质粒pET-22b(+)-H134F/S136F转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB培养基中37℃、200rpm摇瓶培养过夜，后接入LB培养基37℃培养3-4h至OD值为0.6～0.8，降温至28℃，加入IPTG终浓度为0.6mM诱导6h。
发酵液于4℃、l0000rpm离心20min，取菌体。加入20mL缓冲液(50mM Tris，200mMNaCl，HCl调节pH至8.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间1s，停止时间2s，共计18min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。纯化后ZENG的突变体酶H134F/S136F达到电泳纯。
实施例3：突变体酶H134F/S136F的热稳定性测定。
将亲本酶和突变体酶H134F/S136F在53℃和58℃下分别保温一段时间后测定剩余酶活，53℃和58℃下保温0时刻的初始酶活为100％，具体酶活分别为69U/mg和29U/mg。与亲本酶ZENG相比，所述ZENG的突变体酶H134F/S136F的最适催化条件没有发生改变，但酶在53℃保温2min后残余酶活提高了36％；保温5min后的残余酶活提高了33％；保温7min后残余酶活提高了12％。在58℃保温2min后残余酶活提高了34％，保温5min后的残余酶活提高了13％(见图1和图2)。
对比例1
以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶为亲本酶，将第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成丙氨酸Ala，得到突变体H134A/S136A，其余同实施例中一致。结果显示，突变体H134A/S136A在53和58℃下保温仅5min几乎不具有活力。
对比例2
以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶为亲本酶，将第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser替换成其他非疏水氨基酸，保持其他条件与实施例中一致。结果显示，在53和58℃下保温超过2min几乎丧失所有活力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种真菌毒素ZEN降解酶突变体及其应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> Gliocladium roseum
<400> 1
atgcgcactc gcagcacaat ctcgaccccg aatggcatca cctggtacta tgagcaggag 60
ggtactggac ccgacgttgt cctcgtcccc gatggcctcg gagaatgcca gatgtttgac 120
agctccgtgt cgcaaattgc tgcccaaggc tttcgggtca ccacgtttga catgcccgga 180
atgtcccggt ctgcgaaggc accacccgag acctacactg aggtcacggc ccagaagctg 240
gcttcctatg tcatctccat cctggatgct cttgacatca agcacgctac tgtctggggc 300
tgcagctcag gagcttccac cgtcgtggcg ctgttgctcg gttaccccga caggatacgc 360
aacgccatgt gccacgaact gccaacaaag ctactggacc acctttcaaa caccgctgtg 420
ctcgaagacg aggaaatctc aaagatcctg gccaatgtaa tgttgaacga cgtgtctgga 480
ggctcggagg cgtggcaagc catgggggac gaggtgcacg cgagactgca caagaactac 540
ccggtttggg ctcgcggata ccctcgcact attcctccct cagctccggt taaggatctg 600
gaggctctgc gtgggaagcc cctggactgg actgtcggcg ctgcgacacc aaccgagtct 660
ttctttgaca acattgttac cgctaccaag gctggtgtca acattgggtt gcttccaggg 720
atgcatttcc cttatgtttc ccacccggac gttttcgcta aatatgttgt ggaaactacg 780
cagaagcatc tttga 795
<210> 2
<211> 264
<212> PRT
<213> Gliocladium roseum
<400> 2
Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr
1 5 10 15
Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly
20 25 30
Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala
35 40 45
Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser
50 55 60
Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Val Ile Ser Ile Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala
85 90 95
Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu
100 105 110
Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro
115 120 125
Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu
130 135 140
Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu
165 170 175
His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro
180 185 190
Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu
195 200 205
Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn
210 215 220
Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly
225 230 235 240
Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val
245 250 255
Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu
260
<210> 3
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工合成
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cagcggtgtt aaaaagaaag tccagtag 28
Claims (10)
1.一种热稳定性提高的真菌毒素ZEN降解酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
2.编码权利要求1所述真菌毒素ZEN降解酶突变体的基因。
3.含权利要求2所述基因的质粒。
4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒包括但不限于pET系列质粒。
5.表达权利要求1所述真菌毒素ZEN降解酶突变体的细胞。
6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。
7.一种提高ZEN降解酶热稳定性的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶的第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成苯丙氨酸Phe。
8.一种降解ZEN的方法，其特征在于，是以ZEN为底物，添加含权利要求1所述真菌毒素ZEN降解酶突变体的粗酶液或全细胞。
9.权利要求1所述ZEN降解酶突变体在农产品领域的应用。
10.权利要求1所述ZEN降解酶突变体在饲料领域的应用。
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| CN113308449B (zh) * | 2021-06-24 | 2022-09-27 | 江南大学 | 热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体s162p及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110684754A (zh) | 2020-01-14 |
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