CN110669745B - 一种热稳定性提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其应用 - Google Patents

一种热稳定性提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其应用 Download PDF

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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/25—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶为亲本酶，将第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成亮氨酸Leu，得到双突变体H134L/S136L。H134L/S136L在53℃保温2min后残余酶活提高了45％；保温5min后的残余酶活分别提高了38％；保温7min后残余酶活提高了38％。在58℃保温2min后残余酶活提高了41％，保温5min后的残余酶活提高了32％。这一发现对于制备高热稳定性的工业化玉米赤酶烯酮降解酶具有重要的应用价值。

Description

一种热稳定性提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
玉米赤霉烯酮是一种非甾体类***的霉菌毒素，化学名称为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯。1962年，玉米赤霉烯酮首次在发霉的玉米中被发现，是一种镰刀菌属产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于发霉的玉米、小麦、大麦以及其他的谷物和谷物副产物中，已经成为一种世界范围内的食品和饲料污染物。通常，不合适的储藏条件(10-30℃的温度和40-50％的环境相对湿度)是造成玉米赤霉烯酮产生的主要原因。此外，玉米赤霉烯酮还具有多种有毒的衍生物如：α/β-玉米赤霉烯醇(α/β-Zearalenol,α/β-ZOL)、α/β-玉米赤霉醇(α/β-Zearalanol,α/β-ZAL)、玉米烯酮(Zearalanone,ZAN)等。作为一种外源的***类似物，玉米赤霉烯酮及其衍生物可以竞争性地与***受体结合，对人类和很多养殖动物造成生殖毒性、基因毒性、免疫毒性和致癌性，对人类和牲畜的健康造成极大的危害，也给粮食工业、食品工业、饲料工业和畜牧业造成巨大的经济损失。
近年来，玉米赤霉烯酮在粮食、食品和饲料中的污染程度有增无减，生物毒素的有效脱毒也被科技部列为2019国家重点研发计划之一，因而探索有效且环保的玉米赤霉烯酮脱除方法越来越受到人们的关注。目前玉米赤霉烯酮脱除方法主要可分为物理脱除、化学分解和生物降解三种。其中物理脱除是利用加热、辐照或吸附等方法去除玉米赤霉烯酮，但往往会破坏营养成分并且脱除效率较低；化学分解则是采用酸/碱水解、氨化或者臭氧化等方式对玉米赤霉烯酮脱毒，脱除效率不高并且会造成二次污染，不利于环保和动植物健康。生物降解法是利用微生物菌体对玉米赤霉烯酮的吸附作用或微生物产生的酶对玉米赤霉烯酮的降解作用，具有专一性好、作用条件温和、脱毒效率高、不破坏营养物质和不产生二次污染等优势，是目前研究的热点方向。
目前，玉米赤霉烯酮的降解酶主要包括漆酶(Laccase)，过氧化物酶(Peroxidase)和内酯水解酶(Lactonase)三种。其中，漆酶主要用于降解黄曲霉毒素，用于降解玉米赤霉烯酮时需要氧化还原介质(丁酸甲酯)的存在；过氧化物酶降解玉米赤霉烯酮的机制尚不明确；内酯水解酶是目前最受关注的玉米赤霉烯酮降解酶。在酶学研究中内酯水解酶可以催化玉米赤霉烯酮的内酯环打开，并自发脱羧，形成一个完全无毒的降解产物。
2002年Naoko首次在粉红粘帚菌Clonostachys rosea IFO 7063中发现了一种具有降解玉米赤霉烯酮能力的内酯水解酶，并将其命名为ZHD101。随后多种不同来源的可降解玉米赤霉烯酮的内酯水解酶，如：来自Gliocladium roseum的玉米赤霉烯酮-jjm，来自Gliocladium roseum 31535的Zhly-6，来自Cladophialophora batiana的Cbzhd，来自Rhinocladiella mackenziei CBS 650.93的Zhd518以及来自Neurospora crassa的玉米赤霉烯酮C相继被发现。其中，ZHD101已经在E.coli BL21，P.pastoris GS115以及S.cerevisiae等多种宿主里成功表达，是目前研究最深入的一种内酯水解酶。
然而，目前对玉米赤霉烯酮降解酶的研究集中在酶学性质鉴定以及底物特异性的改造。而作为一种饲用酶，不仅要有较高的活性和广泛的底物特异性，更需要具有高热稳定性以耐受造粒工艺的高温。
发明内容
为了解决上述问题，获得更适合工业应用的玉米赤霉烯酮降解酶，本发明通过定点突变的方法，对来自于Gliocladium roseum MA918的玉米赤霉烯酮降解酶进行分子改造，以期提高其热稳定性获得更符合工业要求的玉米赤霉烯酮降解酶。
本发明的第一个目的是提供一种热稳定性提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体，含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体包括对来源于Gliocladium roseum MA918的玉米赤霉烯酮降解酶野生酶进行突变得到的双突变体酶H134L/S136L，所述突变的方式是将玉米赤霉烯酮降解酶野生酶的第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成亮氨酸Leu，所述玉米赤霉烯酮降解酶野生酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述玉米赤霉烯酮降解酶野生酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在GeneBank的编号为KR363960.1。
本发明的第二个目的是提供编码上述玉米赤霉烯酮降解酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供一种携带上述基因的质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒包括pET-22b(+)。
本发明的第四个目的是提供一种表达上述玉米赤霉烯酮降解酶突变体的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供一种提高玉米赤霉烯酮降解酶热稳定性的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶的第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成亮氨酸Leu。
本发明的第六个目的是提供一种生产玉米赤霉烯酮降解酶的方法，先将上述的细胞接种于LB培养基活化培养，再将活化后的种子液转接于LB培养基发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，先将上述的细胞接种于LB培养基中35-39℃、200-220rpm培养8-14h，后将活化后的种子液以1-10％的接种体积比转接入LB培养基，35-39℃培养3-4h至OD值为0.6～0.8，降温至25～30℃，加入终浓度为0.5mM-1mM的IPTG诱导5-10h。
本发明的第七个目的是提供所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体在谷物或饲料领域的应用。
本发明的第八个目的是表达上述玉米赤霉烯酮降解酶突变体的细胞在谷物或饲料领域的应用。
本发明的第九个目的是上述提高玉米赤霉烯酮降解酶热稳定性的方法在谷物或饲料领域的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶突变体H134L/S136L，与野生酶相比，酶突变体H134L/S136L的最适催化条件没有发生改变，但酶突变体H134L/S136L在53℃保温2min后残余酶活提高了45％；保温5min后的残余酶活提高了38％；保温7min后残余酶活提高了38％。在58℃保温2min后残余酶活提高了41％，保温5min后的残余酶活分别提高了32％。这一发现对于玉米赤霉烯酮降解酶的工业化应用具有重要的价值。
附图说明
图1：53℃下野生酶和突变体酶H134L/S134L的热稳定性比较。
图2：58℃下野生酶和突变体酶H134L/S134L的热稳定性比较。
具体实施方式
玉米赤霉烯酮降解酶酶活测定方法：
反应体系为250μL，包括5μL玉米赤霉烯酮的甲醇溶液(4mg/mL)，5μL酶液(0.5mg/mL)和240μL磷酸缓冲液(50mM,pH 7.0)在38℃条件下反应10min，加入50μL盐酸(1mol/L)和300μL甲醇终止反应。
1U总酶活定义为在pH 7.0，38℃条件下反应，每分钟消耗1μg底物所需要的酶量。使用HPLC检测玉米赤霉烯酮降解酶的合成量，计算酶活。
实施例1玉米赤霉烯酮降解酶突变体的制备
选取不同微生物来源的玉米赤霉烯酮降解酶，分析其热稳定性的差异情况，并对各自的氨基酸序列进行比对；同时，基于已经解析出的晶体结构，分析出处于134位和136位的残基恰好处于连接酶结构中的“帽子”区域与核心催化区域。为此，选择对134位和136位的残基进行不同方式的定点突变。
pET-22b(+)-H134L/S136L突变质粒的构建：
根据Gliocladium roseum MA918来源的编码玉米赤霉烯酮降解酶的基因(登录号：KR363960.1)，合成编码玉米赤霉烯酮降解酶野生酶的基因Glro，并连接至pET-22b(+)的酶切位点Nde I和Xho I之间，获得重组质粒pET-22b(+)-Glro；以pET-22b(+)-Glro质粒为模板，经PCRl、PCR2、PCR3，引入H134L/S136L定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pET-22b(+)-H134L/S136L构建成功。
H134L/S136L突变引物如下所示：(下划线为突变碱基)
上游外侧引物：5’-TTATCCATATGGAGGATGCAAACATGCAT-3’，
下游外侧引物：5’-TATATCTCGAGCCGATAACACACTTCATT-3’，
正向突变引物：5’-TGGACCTTCTTCTTAACACCGC-3’，下划线为突变碱基，
反向突变引物：5’-CAGCGGTGTTAAGAAGAAGGTCCAGTAG-3’，下划线为突变碱基；
PCR 1：反应体系的组成：
以带有玉米赤霉烯酮降解酶目的基因的克隆载体pET-22b(+)-Glro为模版。
10×PCR Buffer 5μL
dNTP(2mmol/L) 4μL
上游外侧引物(10μM) 1μL
反向突变引物(10μM) 1μL
pET-22b(+)–Glro 0.5μL
Taq Plus DNA polymerase(5U/μL) 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 将体系补足50μL
PCR 2：反应体系的组成：
Figure BDA0002247898530000041
PCRl、PCR2扩增条件为：
94℃预变性4min；随后94℃变性1min，56℃退火l min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃保温10min。
PCRl、PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化；
PCR 3：反应体系的组成：
10×PCR Buffer 10μL
dNTP(2mmol/L) 8μL
上游外侧引物(10μM) 1μL
下游外侧引物(10μM) 1μL
PCR1纯化产物 10μL
PCR2纯化产物 10μL
Taq Plus DNA polymerase(5U/μL) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 将体系补足100μL
PCR3扩增条件为：
94℃预变性4min；随后94℃变性1min，56℃退火l min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃保温10min。
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶Nde I和Xho I酶切后连接至载体pET-22b(+)，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有50μg/mL氨节青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨节青霉素的LB液体培养基培养，后提取突变质粒pET-22b(+)-H134L/S136L，将突变质粒pET-22b(+)-H134L/S136L转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
实施例2玉米赤霉烯酮降解酶突变体的表达纯化
将突变质粒pET-22b(+)-H134L/S136L转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB培养基中37℃、200rpm摇瓶培养过夜，后接入LB培养基37℃培养3-4h至OD值为0.6～0.8，降温至28℃，加入IPTG终浓度为0.6mM诱导6h。
发酵液于4℃、l0000 rpm离心20min，获得菌体。加入20mL缓冲液(50mM Tris，200mM NaCl，HCl调节pH至8.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间1s，停止时间2s，共计18min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
准备镍离子亲和层析柱，首先，在室温下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用缓冲液A(500mmol/L NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的缓冲液A的pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用缓冲液B(500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，50mM Tris-HCl，pH 8.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，50mM Tris-HCl，pH 8.0)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，并测定其酶活，获得目的蛋白。纯化后玉米赤霉烯酮G降解酶突变体H134L/S136L达到电泳纯。
实施例3玉米赤霉烯酮降解酶突变体H134L/S136L的热稳定性测定
将野生酶和突变体H134L/S136L在53℃和58℃下分别保温一段时间后测定剩余酶活，53℃和58℃下保温0时刻的初始酶活为100％，具体酶活分别为118U/mg和47U/mg。如图1和图2所示，与野生酶相比，突变体H134L/S136L的最适催化条件没有发生改变，但突变体H134L/S136L在53℃保温2min后残余酶活提高了45％；保温5min后的残余酶活提高了38％；保温7min后残余酶活提高了38％。在58℃保温2min后残余酶活提高了41％，保温5min后的残余酶活提高了32％。
对比例1
以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶为亲本酶，将第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成丙氨酸Ala，得到突变体H134A/S136A，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体H134A/S136A在53和58℃下保温仅5min几乎不具有活力。
对比例2
以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶为亲本酶，将第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser替换成其他非疏水氨基酸，保持其他条件与实施例中一致。结果显示，在53和58℃下保温超过2min几乎丧失所有活力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种热稳定性提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> Gliocladium roseum
<400> 1
atgcgcactc gcagcacaat ctcgaccccg aatggcatca cctggtacta tgagcaggag 60
ggtactggac ccgacgttgt cctcgtcccc gatggcctcg gagaatgcca gatgtttgac 120
agctccgtgt cgcaaattgc tgcccaaggc tttcgggtca ccacgtttga catgcccgga 180
atgtcccggt ctgcgaaggc accacccgag acctacactg aggtcacggc ccagaagctg 240
gcttcctatg tcatctccat cctggatgct cttgacatca agcacgctac tgtctggggc 300
tgcagctcag gagcttccac cgtcgtggcg ctgttgctcg gttaccccga caggatacgc 360
aacgccatgt gccacgaact gccaacaaag ctactggacc acctttcaaa caccgctgtg 420
ctcgaagacg aggaaatctc aaagatcctg gccaatgtaa tgttgaacga cgtgtctgga 480
ggctcggagg cgtggcaagc catgggggac gaggtgcacg cgagactgca caagaactac 540
ccggtttggg ctcgcggata ccctcgcact attcctccct cagctccggt taaggatctg 600
gaggctctgc gtgggaagcc cctggactgg actgtcggcg ctgcgacacc aaccgagtct 660
ttctttgaca acattgttac cgctaccaag gctggtgtca acattgggtt gcttccaggg 720
atgcatttcc cttatgtttc ccacccggac gttttcgcta aatatgttgt ggaaactacg 780
cagaagcatc tttga 795
<210> 2
<211> 264
<212> PRT
<213> Gliocladium roseum
<400> 2
Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr
1 5 10 15
Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly
20 25 30
Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala
35 40 45
Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser
50 55 60
Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Val Ile Ser Ile Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala
85 90 95
Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu
100 105 110
Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro
115 120 125
Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu
130 135 140
Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu
165 170 175
His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro
180 185 190
Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu
195 200 205
Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn
210 215 220
Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly
225 230 235 240
Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val
245 250 255
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260
<210> 3
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工合成
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245 250 255
Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu
260
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ttatccatat ggaggatgca aacatgcat 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tatatctcga gccgataaca cacttcatt 29
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tggaccttct tcttaacacc gc 22
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
cagcggtgtt aagaagaagg tccagtag 28

Claims (10)

1.一种热稳定性提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
2.编码权利要求1所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的质粒。
4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒包括pET-22b(+)。
5.一种表达权利要求1所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体的细胞。
6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌BL21(DE3)。
7.一种提高玉米赤霉烯酮降解酶热稳定性的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQID NO.2所示的玉米赤霉烯酮降解酶的第134位的组氨酸His和136位的丝氨酸Ser同时替换成亮氨酸Leu。
8.一种生产玉米赤霉烯酮降解酶的方法，其特征在于，先将权利要求5或6所述的细胞接种于LB培养基活化培养，再将活化后的种子液转接于LB培养基发酵培养。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，先将权利要求5或6所述的细胞接种于LB培养基中35-39℃、200-220rpm培养8-14h，后将活化后的种子液以1-10％的接种体积比转接入LB培养基，35-39℃培养3-4h至OD值为0.6～0.8，降温至25～30℃，加入终浓度为0.5mM-1mM的IPTG诱导5-10h。
10.权利要求1所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体在谷物或饲料领域的应用。
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