CN111269848B - 赤红球菌jj-3及其在降解丙烯酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株新菌株—赤红球菌(Rhodococcus ruber)JJ‑3及其降解丙烯酸的应用,所述赤红球菌JJ‑3保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,邮政编码:430072,保藏编号:CCTCC NO:M 2019546,保藏日期2019年07月12日;本发明提供了一种具有丙烯酸降解性能的赤红球菌JJ‑3及其降解丙烯酸废水的应用,该菌株在16h内能对初始浓度为1000mg·L‑1的丙烯酸降解率达到100%,该降解菌的发现对工业废水中丙烯酸的高效净化具有重要意义。
Description
(一)技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域,具体涉及一株具有丙烯酸降解能力的新菌株-赤红球菌JJ-3(RhodococcusruberJJ-3)及其应用。
(二)背景技术
丙烯酸是最简单的不饱和羧酸,由一个乙烯基和一个羧基组成,是聚合速度非常快的乙烯类单体。丙烯酸是无色液体,带有特征性刺激性气味,它可与水、醇、醚和氯仿互溶,是由丙烯制备的。丙烯酸是重要的有机合成原料及合成树脂单体,大多数用以制造丙烯酸甲酯、乙酯、丁酯、羟乙酯等丙烯酸酯类。丙烯酸及丙烯酸酯可以均聚及共聚,其聚合物用于合成树脂、合成纤维、高吸水性树脂、建材、涂料等生产过程。丙烯酸是2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的3类致癌物清单之一。
丙烯酸是一种重要的化工原料,广泛应用于油漆、涂料、皮革、纺织、印刷等工业。目前,我国丙烯酸的总产量约120万t,按照每生产1t丙烯酸产生1.2t废水计算,每年我国丙烯酸废水总量在140万t左右。
催化湿式氧化法处理丙烯酸废水具有去除效率高、能耗低、二次污染小的优点,是较为清洁的处理技术,但是,存在运行成本高、控制难度大、重金属催化剂二次污染等问题;超临界水氧化法处理丙烯酸废水具有反应时间短、污染物去除彻底、占地面积小、清洁环保等优势,但是高浓度溶解氧、高温高压带来的设备腐蚀和无机盐沉积是该技术面临的主要问题;纤维吸附法、离子交换纤维法,Fen-ton氧化法、光电子波分解法降解丙烯酸废水均具有反应条件温和、反应速度较快、去除效率较高的特点,但是由于目前深入研究较少,且处理成本较高,尚未能应用到实际工程处理领域。利用生物法处理丙烯酸废水具有能耗低、反应条件温和且效率较高,更加符合国家节能减排及可持续发展的战略,但是国内外对于丙烯酸降解功能菌株的研究还鲜有报道,因此本研究为丙烯酸降解筛选可用菌株,进行丙烯酸生物降解,具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株具有丙烯酸降解性能的赤红球菌及其应用,对丙烯酸废水的处理提供一种新方法。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一株新菌株—赤红球菌(Rhodococcusruber)JJ-3,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M 2019546,保藏日期2019年07月12日,地址:中国,武汉,武汉大学,邮政编码:430072。
本发明所述赤红球菌JJ-3菌株的特征为:菌落呈桔黄色,圆形不透明表面粗糙、干燥,细胞形态为球状,无鞭毛,边缘整齐。它生长最适pH值为7.0,最适温度为35℃,该菌株16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供所述赤红球菌JJ-3在生物降解丙烯酸中的应用。丙烯酸是最简单的不饱和羧酸,由一个乙烯基和一个羧基组成,纯品呈无色澄清状,带有特征性刺激性气味。
进一步,所述的应用为:将赤红球菌JJ-3经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液接种至丙烯酸液体选择培养基中,以丙烯酸为碳源,在20-45℃、140-160rpm条件下培养,实现丙烯酸的降解;所述丙烯酸液体选择培养基的终浓度组成为:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO41000mg·L-1,KH2PO41000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,丙烯酸100-2000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl24mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值5.0-10.0。
进一步,优选所述含菌细胞悬液的OD600值为0.7~1.0,优选0.8。
进一步,所述丙烯酸加入浓度为0.1-2g/L,优选0.1-1g/L,最优选1g/L。
进一步,优选培养pH为7.0,35℃,160rpm。
进一步,优选所述含菌悬液的体积接种量为3%~20%,优选10-15%。
本发明所述含菌悬液按如下步骤制备:
(1)斜面培养:将赤红球菌JJ-3接种至斜面培养基,30℃培养3天,获得菌体斜面;所述斜面培养基终浓度组成为:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO4 1000mg·L-1,KH2PO41000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,蛋白胨400mg·L-1,丙烯酸1000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl24mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值7.0,琼脂18~20g·L-1(优选18g·L-1);
(2)种子培养:从菌体斜面挑取菌落接种至LB培养基,30℃培养18h,获得种子液;所述LB培养基终浓度组成为:NaCl 10g·L-1,酵母浸粉5g·L-1,蛋白胨10g·L-1,溶剂为水,pH值7.0;
(3)发酵培养:将种子液以体积浓度3~20%的接种量接种至发酵培养基,30℃培养,获得发酵培养液即为含菌悬液;所述发酵培养基终浓度组成为:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO41000mg·L-1,KH2PO41000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,丙烯酸1000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl24mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值7.0。
与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了一株具有丙烯酸降解性能的赤红球菌JJ-3及其降解丙烯酸的应用,该菌株在5d内能对初始浓度为1000mg·L-1的丙烯酸降解率达到100%,该降解菌对工业废水中丙烯酸的处理具有重要意义。
(四)附图说明
图1为菌株JJ-3的透射电镜照片。
图2为菌株JJ-3的***发育树图。
图3为不同pH下菌株JJ-3对丙烯酸的降解性能比较。
图4为不同温度下菌株JJ-3对丙烯酸的降解性能比较。
图5为不同接种量下菌株JJ-3对丙烯酸的降解性能比较。
图6为不同初始丙烯酸浓度下菌株JJ-3的降解性能比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:RhodococcusruberJJ-3的分离、纯化及其鉴定
1.RhodococcusruberJJ-3的分离及纯化
RhodococcusruberJJ-3从浙江卫星能源有限公司废水处理池污泥中筛选,具体步骤如下:
丙烯酸液体选择培养基,配制方法如下:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO4 1000mg·L-1,KH2PO4 1000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,丙烯酸1000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl2 4mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值7.0,121℃灭菌20min。
丙烯酸固体选择培养基:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO41000mg·L-1,KH2PO41000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,蛋白胨400mg·L-1,丙烯酸1000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl24mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值7.0,同时加入18g·L-1琼脂,121℃灭菌20min。
取卫星能源公司丙烯酸废水处理池中的污泥,静置24h后,取10mL接种于含100mL无菌水培养瓶中(250mL),30℃,160rpm振荡培养30min,停止震荡后静置2min,取悬浮液5mL接种于含100mL丙烯酸液体选择培养基中,30℃,160rpm振荡培养3d后,取悬浮液5mL接种于含100mL新鲜丙烯酸液体选择培养基中,30℃,160rpm振荡培养3d,重复3次培养后,用无菌水配制成一定浓度的菌液。将所得到的菌液用丙烯酸固体选择培养基经多次平板划线分离纯化,得到单菌落即丙烯酸降解菌株,记为菌株JJ-3。
2.菌株JJ-3的鉴定
a、菌株JJ-3的生理生化特征
菌落颜色为桔黄色,圆形不透明表面粗糙、干燥,无鞭毛,无芽孢。透射电镜下观察该菌体的形态为球状和短杆状(图1所示)。它生长最适pH值为7.0,最适温度为35℃。
b、菌株JJ-3的16S rRNA序列分析
通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定,确定菌株JJ-3为Rhodococcusruber。
具体步骤如下:
采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2,浙江天科生物科技有限公司)提取和纯化菌株JJ-3的DNA,4℃保存。选用细菌的通用引物F27和1492R对纯化的DNA进行PCR扩增,引物序列分别为:
F27:5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’
1492R:5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’
PCR反应体系为(50μL):模板DNA 1.75μL,引物F27和引物R1492各1μL,MgCl2(25mmol·L-1)3μL,Taq酶(5U·μL-1)0.25μL,10×PCR缓冲液5μL,dNTP(2.5mmol·L-1)4μL,重蒸水34μL。
PCR反应程序设定为:先94℃预变性4min;然后94℃变性1min,59℃退火1min,72℃延伸1.5min,循环35个周期;然后72℃延伸10min;最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序(浙江天科),测序结果见序列SEQ ID NO:1所示。
将菌株JJ-3的16S rDNA序列上传到同Genbank中的基因序列进行同源性比较,发现其属于Rhodococcus属,与Rhodococcusruber同源性最高,达到100%,图2为该菌株的***发育树图。为了进一步确定鉴定结果的可靠性,经过生理生化实验,最终确定菌株JJ-3属于Rhodococcusruber,因此,将该菌株JJ-3命名为赤红球菌(Rhodococcusruber)JJ-3,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M 2019546,保藏日期2019年07月12日,地址:中国,武汉,武汉大学,邮政编码:430072。
实施例2赤红球菌JJ-3发酵培养液
(1)斜面培养
将赤红球菌JJ-3接种至斜面培养基,30℃培养3天,获得菌体斜面;所述斜面培养基终浓度组成为:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO41000mg·L-1,KH2PO41000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,蛋白胨400mg·L-1,丙烯酸1000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl24mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值7.0,同时加入18g·L-1琼脂。
(2)种子培养:从菌体斜面挑取菌落接种至LB培养基,30℃培养12h,获得种子液;所述LB培养基终浓度组成为:NaCl 10g·L-1,酵母浸粉5g·L-1,蛋白胨10g·L-1,溶剂为水,pH值7.0;
(3)发酵培养:将种子液以体积浓度5%的接种量接种至发酵培养基,30℃、160rpm培养至OD600为0.8,获得发酵培养液,即为含菌悬液;所述发酵培养基终浓度组成为:NH4Cl540mg·L-1,K2HPO4 1000mg·L-1,KH2PO4 1000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,丙烯酸1000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl2 4mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO44mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值7.0,溶剂为水。
实施例3:RhodococcusruberJJ-3丙烯酸降解性能检测
1.考察不同初始pH条件下赤红球菌JJ-3降解丙烯酸的性能
在不同初始pH下实施赤红球菌JJ-3降解丙烯酸的实验,发现pH=7.0为最佳pH,此时降解率最高,具体实施步骤如下:
以丙烯酸为碳源(加入浓度1000mg·L-1),按体积浓度5%接种量将OD600为0.8的含菌悬液(实施例2方法制备)接种于不同pH值(pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的丙烯酸液体选择培养基(组成同实施例2),35℃,160rpm振荡培养16h,获得培养液,采用高效液相色谱法测定丙烯酸的浓度,即取1.5mL培养液作为样品,先将样品离心,用5mL一次性针筒注射器抽取上清液,再通过孔径为0.22μm的一次性有机针筒过滤器过滤去除剩余微生物,然后滤液用高效液相色谱法测出丙烯酸的浓度。
色谱条件:
结果如图3所示,菌株JJ-3对弱酸的环境适应性相对较差,当pH为7.0时,菌株JJ-3对丙烯酸的降解效果最好,达到98.0%。
2.考察不同温度条件下赤红球菌JJ-3降解丙烯酸的性能
在不同温度下实施赤红球菌JJ-3降解丙烯酸的实验,发现温度为35℃时为最佳温度,此时降解率最高,具体实施步骤如下:
以丙烯酸为碳源(浓度1000mg·L-1),按体积浓度5%接种量将OD600为0.8的含菌悬液(实施例2方法制备)接种于丙烯酸液体选择培养基(pH=7.0,组成同实施例2)分别在25.0、30.0、35.0、40.0、45.0℃),160rpm振荡培养16h,获得培养液,采用高效液相色谱法测定丙烯酸的浓度(同步骤1),
结果如图4所示,菌株JJ-3对低温的环境适应性相对较差,当温度为35.0℃时,菌株JJ-3对丙烯酸的降解效果最好,达到98.7%。
3.考察不同接种量下赤红球菌JJ-3降解丙烯酸的性能
在不同接种量下实施赤红球菌JJ-3降解丙烯酸的实验,结果表明其最佳接种量为15%(v/v),具体实施方案如下:
以丙烯酸为碳源(加入浓度1000mg·L-1),分别按不同体积浓度(3%、5%、8%、10%、15%、20%)的6个接种量梯度,将OD600为0.8的含菌悬液(实施例2方法制备)接种于丙烯酸液体选择培养基(组成同实施例2)中,35℃,160rpm振荡培养16h,获得培养液,采用高效液相色谱法测定丙烯酸的浓度(同步骤1),结果如图5所示,数据表明,当接种量大于3%时,由于刚开始时培养基中营养物质充足,接种量多少直接影响到底物降解,降解率率随着接种量的增加而缓慢上升,当接种量为15%时,降解率达到100%,而随着接种量的继续增加,在降解菌之间形成了对营养物质的竞争关系,因此还原率出现减小的现象。由图可知,菌株JJ-3的最佳接种量为10-15%左右。
4.考察不同初始丙烯酸浓度下赤红球菌JJ-3降解丙烯酸的性能
在不同初始丙烯酸浓度下实施赤红球菌JJ-3的降解实验,结果表明其在丙烯酸浓度100-1000mg·L-1下都能有效降解丙烯酸,具体实施方案如下:
以丙烯酸为碳源,按体积浓度15%接种量将OD600为0.8的含菌悬液(实施例2方法制备)分别接种于初始加入丙烯酸浓度分别为100mg·L-1、200mg·L-1、400mg·L-1、600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1、2000mg·L-1的7个丙烯酸液体选择培养基(组成同实施例2)中,35℃,160rpm振荡培养16h,获得培养液,采用高效液相色谱法测定丙烯酸的浓度(同步骤1),结果如图6所示:在100-1000mg·L-1初始丙烯酸浓度下,赤红球菌JJ-3都能有效降解丙烯酸,降解率为100%。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 赤红球菌JJ-3及其在降解丙烯酸中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1319
<212> DNA
<213> 赤红球菌(Rhodococcus ruber)
<400> 1
tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt gatctgccct gcacttcggg ataagcctgg 60
gaaactgggt ctaataccgg ataggacctc gggatgcatg ttccggggtg gaaaggtttt 120
ccggtgcagg atgggcccgc ggcctatcag cttgttggtg gggtaacggc ccaccaaggc 180
gacgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 240
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga 300
cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagtaccg acgaagcgca 360
agtgacggta ggtacagaag aagcaccggc caactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 420
tagggtgcga gcgttgtccg gaattactgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg 480
tcgtctgtga aaacccgcag ctcaactgcg ggcttgcagg cgatacgggc agacttgagt 540
actgcagggg agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac 600
accggtggcg aaggcgggtc tctgggcagt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggta 660
gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac ggtgggcgct aggtgtgggt 720
ttccttccac gggatccgtg ccgtagctaa cgcattaagc gccccgcctg gggagtacgg 780
ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgtgga 840
ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tgggtttgac atacaccgga ccgccccaga 900
gatggggttt cccttgtggt cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 960
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg tcctgtgttg ccagcacgta 1020
atggtgggga ctcgcaggag actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gacgacgtca 1080
agtcatcatg ccccttatgt ccagggcttc acacatgcta caatggccgg tacagagggc 1140
tgcgataccg cgaggtggag cgaatccctt aaagccggtc tcagttcgga tcggggtctg 1200
caactcgacc ccgtgaagtc ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa 1260
tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacgtcatg aaagtcggta acacccgaa 1319
Claims (8)
1.赤红球菌(Rhodococcus ruber)JJ-3,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M 2019546,保藏日期2019年07月12日,地址:中国,武汉,武汉大学,邮政编码:430072。
2.一种权利要求1所述赤红球菌JJ-3在生物降解丙烯酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述的应用为:将赤红球菌JJ-3经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液接种至丙烯酸液体选择培养基中,以丙烯酸为碳源,在20-45℃、140-160rpm条件下培养,实现丙烯酸降解;所述丙烯酸液体选择培养基的终浓度组成为:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO4 1000mg·L-1,KH2PO4 1000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,丙烯酸100-2000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl2 4mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值5.0-10.0。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述pH为7.0。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述温度为35℃。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述含菌细胞悬液的OD600值为0.7-1.0,含菌悬液体积接种量为3%~20%。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述丙烯酸的初始 浓度为100-1000mg·L-1。
8.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述含菌悬液按如下步骤制备:
(1)斜面培养:将赤红球菌JJ-3接种至斜面培养基,30℃培养3天,获得菌体斜面;所述斜面培养基终浓度组成为:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO4 1000mg·L-1,KH2PO4 1000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,蛋白胨400mg·L-1,丙烯酸1000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl2 4mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值7.0,琼脂18~20g·L-1;
(2)种子培养:从菌体斜面挑取菌落接种至LB培养基,30℃培养18h,获得种子液;所述LB培养基终浓度组成为:NaCl 10g·L-1,酵母浸粉5g·L-1,蛋白胨10g·L-1,溶剂为水,pH值7.0;
(3)发酵培养:将种子液以体积浓度3~20%的接种量接种至发酵培养基,30℃培养,获得发酵培养液即为含菌悬液;所述发酵培养基终浓度组成为:NH4Cl 540mg·L-1,K2HPO41000mg·L-1,KH2PO4 1000mg·L-1,NaCl 500mg·L-1,酵母浸粉200mg·L-1,丙烯酸1000mg·L-1,MgSO4·7H2O 16mg·L-1,CaCl2 4mg·L-1,CuSO4 4mg·L-1,FeSO4 4mg·L-1,MnSO4 4mg·L-1,溶剂为水,pH值7.0。
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