CN112961049B - 一种光学右旋3-羟基丁酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化合物制备技术领域，公开了一种光学右旋3‑羟基丁酸的制备方法。该制备方法包括以下步骤：(1)以糖类物质为发酵底物，加入培养基和嗜盐性细菌，形成发酵混合物，发酵，得到发酵液；(2)将发酵液进行离心分离，嗜盐性细菌破壁，提纯，得到含聚‑β‑羟丁酸的物质；(3)将含聚‑β‑羟丁酸的物质、酸和醇混合，加热，搅拌，反应，然后降温，调pH至中性或酸性，过滤，取滤液；(4)将滤液进行浓缩，除去醇，向浓缩后的滤液中加入酸，加热水解，得到光学右旋3‑羟基丁酸；嗜盐性细菌的生物保藏信息为CGCCNo.16437 2018.09.06。该制备方法制得的光学右旋3‑羟基丁酸产物中不含光学左旋3‑羟基丁酸。
Description
技术领域
本发明属于化合物制备技术领域，特别涉及一种光学右旋3-羟基丁酸的制备方法。
背景技术
大量科研数据表明，右旋3-羟基丁酸(D3HB，CAS：625-72-9)具有多种用途。右旋3-羟基丁酸可被用于体重控制、运动补充剂，及各种功能性食品/饮品，也可以被用于促进多种细胞生长及抑制炎症反应，并用于某些疾病治疗。通常人体内能量供应降低时，体内脂肪酸分解，酮体会自然产生。在饥饿或运动时，通过外源性右旋3-羟基丁酸补充体内酮体，可以额外提供能量，不会让体力透支，增加饥饿耐受力。也可以保持或改善肌肉组成，改善认知功能和运动表现。右旋3-羟基丁酸能够调节运动时人体内的乳酸波动，缓解运动疲劳，也能促进肌肉蛋白生成，目前在欧美已被用于各种高强度训练和运动。右旋3-羟基丁酸还具有抗骨质疏松的作用，可抑制破骨细胞异常活化，减少骨丢失，促进钙离子内流，可以有效促进胚胎成骨前体细胞的增殖、分化及矿化。右旋3-羟基丁酸还具有抑制炎症，减少肿瘤发生的作用，右旋3-羟基丁酸还具有与免疫细胞中的炎性小体相互作用，减少炎症细胞因子的产生，从而减少炎症。右旋3-羟基丁酸还具有促进细胞生长的作用，可以促进多种细胞生长，包括上皮、内皮、成骨、中性粒、成纤维细胞等。右旋3-羟基丁酸还具有预防及治疗慢性综合征的作用，用于预防或治疗肌肉损伤、疲劳、肌肉疲劳和肌痛性脑病等慢性综合征，且能改善神经变性、自由基毒性，缺氧或高血糖(D3HB有效调节血糖波动的作用)等亚健康问题。右旋3-羟基丁酸还具有改善认知功能的作用，增加脑磷酸化势能和ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)水解的ΔG′(吉布斯自由能)来提高大脑代谢效率(将氧的使用效率提高28％)，增加脑源性神经营养因子(BDNF)水平及安非他明反应性转录物(CART)的水平。右旋3-羟基丁酸被证明可显著改善阿尔兹海默症和帕金森症。
现有相关技术中，光学右旋3-羟基丁酸的制备过程中往往伴随光学左旋3-羟基丁酸(L3HB)的产生，光学左旋3-羟基丁酸作为杂质引入，会减低光学右旋3-羟基丁酸的功效。
因此，提供一种高纯度的光学右旋3-羟基丁酸的制备方法，是十分有必要的。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种光学右旋3-羟基丁酸的制备方法，所述制备方法制得的光学右旋3-羟基丁酸中不含光学左旋3-羟基丁酸，即制得纯度为100％的光学右旋3-羟基丁酸，这将对光学右旋3-羟基丁酸在食品或生物医药中的应用起到积极的推进作用。
本发明提供一种光学右旋3-羟基丁酸的制备方法。
具体的，一种光学右旋3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)以糖类物质为发酵底物，加入培养基和嗜盐性细菌，形成发酵混合物，发酵，得到发酵液；
(2)将步骤(1)制得的所述发酵液进行离心分离，嗜盐性细菌破壁，提纯，得到含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质；
(3)将步骤(2)制得的所述含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质、酸、醇混合，加热，搅拌，反应，然后降温，调pH至中性或酸性，过滤，取滤液；
(4)将步骤(3)制得的所述滤液进行浓缩，除去醇，向浓缩后的滤液中加入酸，加热水解，得到所述光学右旋3-羟基丁酸；
所述嗜盐性细菌的生物保藏信息为CGCCNo.16437 2018.09.06(参见专利2018114685727)。
优选的，步骤(1)中，所述糖类物质选自葡萄糖、甘露糖、果糖或半乳糖中的至少一种；进一步优选的，所述所述糖类物质为葡萄糖。
优选的，步骤(1)中，在所述发酵混合物中，所述糖类物质的浓度为3-50g/L；进一步优选的，所述糖类物质的浓度为5-25g/L。
优选的，步骤(1)中，所述嗜盐性细菌在发酵混合物中的浓度为0.01g/L-150g/L。用OD600(光密度)值衡量嗜盐性细菌在发酵混合物中的浓度，则OD600值为0.2-700。
优选的，步骤(1)中，所述培养基为常规市售的培养基，所述培养基包含有机氮和微量元素；进一步优选的，所述有机氮为酵母提取物。
优选的，步骤(1)中，所述培养基的组成为：玉米浆干粉5-22g/L、酵母粉5-22g/L、蛋白胨5-22g/L、MgSO4 0.01-1g/L、尿素0.5-8g/L、KH2PO4 0.5-15g/L、NaCl 0-50g/L。
优选的，步骤(1)中，所述发酵的时间大于24小时；进一步优选的，所述发酵的时间为36-60小时；更优选的，发酵的过程中，当嗜盐性细菌的浓度连续2-3小时维持不变，则停止发酵。
优选的，步骤(1)中，所述发酵的温度为15-39℃；进一步优选的，所述发酵的温度为33-38℃。
优选的，步骤(1)中，所述发酵的过程中，向发酵混合物中加入糖类物质，维持发酵混合物中糖类物质的浓度为5-30g/L。
优选的，向发酵混合物中加入的糖类物质的浓度为500-900g/L；进一步优选的，向发酵混合物中加入的糖类物质的浓度为600-800g/L。
优选的，步骤(2)中，所述发酵液进行离心分离后，还包括洗涤的过程。
优选的，步骤(2)中，所述提纯是分离并提取嗜盐性细菌的细胞内的PHB。
优选的，步骤(2)中，所述提纯后，还包括浓缩、干燥过程。
优选的，步骤(2)中，所述含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质为粉末状。
优选的，步骤(2)中，所述含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质中，聚-β-羟丁酸的质量浓度大于90％；进一步优选的，聚-β-羟丁酸的质量浓度大于95％。
步骤(2)中，所述含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质不含光学左旋3-羟基丁酸单体。聚-β-羟丁酸(PHB)是光学右旋3-羟基丁酸(D3HB)的高分子聚合物。
优选的，步骤(3)中，所述含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质、酸、醇的质量比为1：(0.1-1.2)：(2-8)；进一步优选的，含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质、酸、醇的质量比为1：(0.4-0.6)：(3-6)。
优选的，步骤(3)中，所述酸为盐酸；进一步优选的，所述盐酸的质量浓度为20-45％；更优选的，所述盐酸的质量浓度为30-40％。
优选的，步骤(3)中，所述醇为乙醇。
优选的，步骤(3)中，所述反应的温度为75-85℃；进一步优选的，所述反应的温度为78-82℃。
优选的，步骤(3)中，所述反应的时间为36-180小时；进一步优选的，所述反应的时间为48-72小时。
优选的，步骤(3)中，所述反应是在含冷凝回流器的反应釜中进行。
优选的，步骤(3)中，所述降温是降至室温，例如降至5-35℃。
优选的，步骤(3)中，所述调pH至6.0-7.0；进一步优选的，所述调pH至6.5-7.0。
优选的，步骤(3)中，所述调pH的过程中用碳酸氢钙、碳酸氢钠或碳酸氢钾中的至少一种。
优选的，步骤(4)中，将步骤(3)制得的所述滤液进行浓缩，除去醇的过程是在38-45℃，真空度为-0.06MPa至-0.10MPa的条件下进行蒸馏。蒸馏得到的醇可回收利用。
优选的，步骤(4)中，加入酸，调节pH至0.5-3；进一步优选的，加入酸，调节pH至1-2。
优选的，步骤(4)中，所述加热水解的温度为95-105℃；进一步优选的，所述加热水解的温度为98-100℃。
优选的，步骤(4)中，所述加热水解的时间为24-96小时；进一步优选的，所述加热水解的时间为40-60小时。
优选的，步骤(4)中，加热水解后，加入碱调节pH值到2-4，进一步优选，加入碱调节pH值到2.5-3.5。
步骤(4)中得到的右旋3-羟基丁酸成溶液状态，且该溶液中不含光学左旋3-羟基丁酸。
优选的，步骤(4)中，加热水解后，进行浓缩，得到含所述光学右旋3-羟基丁酸的溶液；所述含所述光学右旋3-羟基丁酸的溶液中光学右旋3-羟基丁酸的质量浓度为40-90％。
一种光学右旋3-羟基丁酸，由上述制备方法制得，且所述光学右旋3-羟基丁酸中不含光学左旋3-羟基丁酸。
上述光学右旋3-羟基丁酸在制备食品或生物医药中的应用。
嗜盐性细菌在制备光学右旋3-羟基丁酸中的应用；所述嗜盐性细菌的生物保藏信息为CGCCNo.16437 2018.09.06。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明所述制备方法采用嗜盐性细菌进行发酵，得到的含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质中不含光学左旋3-羟基丁酸单体或光学左旋3-羟基丁酸的衍生物，这对制备纯的光学右旋3-羟基丁酸十分重要。
(2)步骤(3)和步骤(4)两次加入酸，进行反应的过程有利于制备纯的光学右旋3-羟基丁酸。
(3)本发明所述制备方法制得的光学右旋3-羟基丁酸产物中不含光学左旋3-羟基丁酸。
(4)本发明所述制备方法制备的光学右旋3-羟基丁酸具有良好的生物相容性，可以被人体内全部消化，吸收和降解，可广泛应用于食品或生物医学领域。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
以下所用培养基的组成为：玉米浆干粉5-22g/L、酵母粉5-22g/L、蛋白胨5-22g/L、MgSO4 0.01-1g/L、尿素0.5-8g/L、KH2PO4 0.5-15g/L、NaCl 0-50g/L。
实施例1：光学右旋3-羟基丁酸的制备
一种光学右旋3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)以葡萄糖为发酵底物，加入培养基和嗜盐性细菌，形成发酵混合物(嗜盐性细菌在发酵混合物中的OD600值为0.2)，葡萄糖的浓度为10g/L，发酵，发酵的过程中，发酵的温度为20℃，当嗜盐性细菌的浓度连续2小时维持不变，则停止发酵(此时嗜盐性细菌在发酵混合物中的OD600值约为700)，得到发酵液；嗜盐性细菌的生物保藏信息为CGCCNo.164372018.09.06(参见专利2018114685727)；
(2)将步骤(1)制得的发酵液进行离心分离，洗涤，嗜盐性细菌破壁，提纯，浓缩、干燥，得到含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质；含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质中，聚-β-羟丁酸的质量浓度大于90％，含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质不含光学左旋3-羟基丁酸单体；
(3)将100公斤步骤(2)制得的含聚-β-羟丁酸(PHB)的物质、140公斤的盐酸(质量浓度为37％)、400公斤的无水乙醇在带有冷凝回流器的反应釜中混合，加热至80℃，搅拌，反应，反应的温度为80℃，反应的时间为40小时，然后降温至20℃，用碳酸氢钙调pH至6.8，过滤，取滤液；
(4)将步骤(3)制得的滤液进行在40℃，真空度为-0.08MPa的浓缩罐里进行浓缩、蒸馏，蒸馏得到的醇可回收利用，向浓缩后的滤液中加入盐酸(质量浓度为37％)至pH为1，加热水解，加热水解的温度为100℃，加热水解的时间为30小时，然后加入碳酸氢钠调节pH值到3.0，再浓缩，得到含光学右旋3-羟基丁酸的溶液；溶液中光学右旋3-羟基丁酸的质量浓度为50％，含光学右旋3-羟基丁酸的溶液中不含光学左旋3-羟基丁酸。
对比例1
与实施例1的区别在于，对比例1在步骤(3)中不加入盐酸，则无法制得含光学右旋3-羟基丁酸的溶液。
对比例2
与实施例1的区别在于，对比例2在步骤(4)中不加入盐酸，则最终制得的溶液中光学右旋3-羟基丁酸的质量浓度低于10％。
产品效果测试
实施例1制得的含光学右旋3-羟基丁酸的溶液的纯度、外观、气味、味道、pH值以及杂质含量如表1所示。
表1
从表1可以看出，本发明的制备方法制得的含光学右旋3-羟基丁酸的溶液中不含光学左旋3-羟基丁酸，这有利于含光学右旋3-羟基丁酸的溶液在食品或生物医药领域的应用。
另外，需要指出的是，在本发明所记载的技术方案内，参照实施例1改变pH，各物质用量，发酵的温度和时间，反应的温度和时间，制得的含光学右旋3-羟基丁酸的溶液中都不含含光学左旋3-羟基丁酸，如果想获得固态的光学右旋3-羟基丁酸，则只需进一步干燥浓缩即可。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制本发明的技术方案，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，在不偏离本发明权利要求书所限定的范围内，都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.一种光学左旋3-羟基丁酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以糖类物质为发酵底物，加入培养基和嗜盐性细菌，形成发酵混合物，发酵，得到发酵液；
(2)将所述发酵液进行离心分离，嗜盐性细菌破壁，提纯，得到含聚-β-羟丁酸的物质；
(3)将所述含聚-β-羟丁酸的物质、酸和醇混合，加热，搅拌，反应，然后降温，调pH至中性或酸性，过滤，取滤液；
(4)将所述滤液进行浓缩，除去醇，向浓缩后的滤液中加入酸，调节pH至0.5-3，加热水解，得到所述光学左旋3-羟基丁酸；
所述嗜盐性细菌的生物保藏信息为CGCCNo.16437 2018.09.06；
步骤(3)中，所述含聚-β-羟丁酸的物质、酸、醇的质量比为1：(0.1-1.2)：(2-8)；
步骤(3)中，所述反应的温度为75-85℃；所述反应的时间为36-180小时；
步骤(4)中，所述加热水解的温度为95-105℃；所述加热水解的时间为24-96小时。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述糖类物质选自葡萄糖、甘露糖、果糖或半乳糖中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵的时间大于24小时；所述发酵的温度为15-39℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含聚-β-羟丁酸的物质中，聚-β-羟丁酸的质量浓度大于90％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酸为盐酸；所述盐酸的质量浓度为20-45％。
6.嗜盐性细菌在制备光学左旋3-羟基丁酸中的应用；所述嗜盐性细菌的生物保藏信息为CGCCNo.16437 2018.09.06。
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