CN109468250A - 一种提高金银花蒸馏残液中绿原酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高金银花蒸馏残液中绿原酸含量的方法，属于生物转化领域。本发明方法包括如下步骤：将保藏编号为CCTCC NO：M 2018803的枯草芽孢杆菌hx0210接种到LB培养基中，30℃、150r/min培养16‑18h得到枯草芽孢杆菌hx0210菌液；将枯草芽孢杆菌hx0210菌液、金银花蒸馏残液、LB培养基按体积比4:8:3的比例混合，30℃、150rpm发酵6h。本发明所用的枯草芽孢杆菌hx0210能极大程度的提高发酵培养物中绿原酸的含量；本发明利用了金银花露生产过程中的蒸馏工段排放的高浓度有机废水，减少了污染和资源浪费，提供了产绿原酸的新渠道。

Description

一种提高金银花蒸馏残液中绿原酸含量的方法
技术领域
本发明属于生物转化领域，具体涉及一种提高金银花蒸馏残液中绿原酸含量的方法。
背景技术
金银花(Lonicerae japonica Thunb)是隶属于忍冬科植物的干燥花蕾，是一种应用广泛的“药食同源”的绿色天然产物，并且是我国重要的中药材，可以药食兼用。金银花具有清热解毒、疏风散热和抗菌消炎等作用，因此被称为“国宝一枝花”。金银花中有原儿茶酸、异绿原酸、绿原酸等有机酸类化合物，其中绿原酸为有机酸的代表成分，绿原酸的存在使得金银花具有了消炎、抑菌、清除自由基、抗氧化、抗病毒等能力。
目前，国内外对金银花的研究比比皆是，更多的是从金银花的花和叶方面进行的研究，金银花蒸馏剩余物的利用较少。金银花蒸馏残液为市售金银花露生产过程中的蒸馏工段排放的高浓度有机废水，在工业生产中，金银花蒸馏残渣残液通常直接被废弃，其中含量较高的、具有重要药理作用的有绿原酸、黄酮、皂苷和鞣质等生物活性成分，金银花蒸馏剩余物的直接排放不但造成了资源的浪费、还产生了废水污染。
绿原酸在医用工业、食品、化妆品等行业应用广泛，市面上绿原酸的需求量较大，价格也较昂贵。通过微生物转化利用金银花蒸馏剩余物生产绿原酸，能够在创造更多经济效益的同时减少工业废水的排放。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种提高金银花蒸馏残液中绿原酸含量的方法，以及该方法中所使用到的枯草芽孢杆菌hx0210。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种枯草芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus subtilis hx0210枯草芽孢杆菌hx0210，保藏编号为CCTCC NO：M 2018803，于2018年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)。
所述的枯草芽孢杆菌可用于生产绿原酸；特别是以金银花蒸馏残液为原料生产绿原酸，即生产绿原酸的原料优选包括金银花蒸馏残液。
一种提高金银花蒸馏残液中绿原酸含量的方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌hx0210接种到培养基中进行活化培养，得到枯草芽孢杆菌hx0210菌液。
(2)将枯草芽孢杆菌hx0210菌液、金银花蒸馏残液、培养基混合进行发酵培养。
优选的，步骤(1)中所述的活化培养的条件为30℃、150r/min培养16-18h。
优选的，步骤(2)枯草芽孢杆菌hx0210菌液、金银花蒸馏残液的体积比为1:2；进一步优选的，枯草芽孢杆菌hx0210菌液、金银花蒸馏残液、培养基的体积比为4:8:3。
优选的，步骤(2)中所述的发酵培养的条件为30℃、150rpm发酵6h。
优选的，步骤(1)、(2)中所述的培养基为LB培养基。
优选的，所述的提高金银花蒸馏残液中绿原酸含量的方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌hx0210接种到LB培养基中，30℃、150r/min培养16-18h得到枯草芽孢杆菌hx0210菌液。
(2)将枯草芽孢杆菌hx0210菌液、金银花蒸馏残液、LB培养基按体积比4:8:3的比例混合，30℃、150rpm发酵6h。
本发明相对于现有技术具有如下优点和有益效果：本发明的枯草芽孢杆菌hx0210能极大程度的提高发酵培养物中绿原酸的含量；本发明利用了金银花露生产过程中的蒸馏工段排放的高浓度有机废水，减少了污染和资源浪费，提供了产绿原酸的新渠道。
附图说明
图1是绿原酸标准曲线图。
图2是发酵温度对绿原酸产量影响的结果图。
图3是发酵时间对绿原酸产量影响的结果图。
图4是接种量对绿原酸产量影响的结果图。
图5是转速对绿原酸产量影响的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
将自然存放20天以上的金银花蒸馏残液抽滤，得澄清原液，在超净工作台内，用移液枪吸取1mL的原液移入装有9mL无菌水的试管内，充分摇匀，制得10-1金银花残液稀释液，以同样的方法制取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9金银花蒸馏残液稀释液。配制PDA培养基，在PDA平板分别涂上浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的稀释液后，于37℃培养72h，待其长出菌落，挑选单菌落在新的PDA培养基上划线，直至得到纯化的单菌落。
按照上述过程经过多次筛选，得到一株高产绿原酸的枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌hx0210。
枯草芽孢杆菌hx0210呈圆形，污白色，边缘不完整，中间稍微***，表面粗糙不透明，不易挑起，形成皱醭，油镜下观察呈杆状。
枯草芽孢杆菌hx0210于2018年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，分类命名为Bacillus subtilis hx0210枯草芽孢杆菌hx0210，保藏编号为CCTCC NO：M 2018803。
实施例2绿原酸产量的测定
(1)绿原酸标准曲线的绘制
准确称量6.20mg绿原酸标准品，用RO水定容到100mL容量瓶中，摇匀备用。用移液枪吸取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL的绿原酸标准品溶液于10mL容量瓶内，以不加绿原酸标准品溶液的一组作为空白，以绿原酸标准品溶液浓度(C)作为横坐标、以不同浓度的绿原酸标准品溶液的吸光度(A)作为纵坐标绘制标准曲线，并求出相应的回归方程。
在波长320nm处测定不同浓度的绿原酸标准品的吸光度，结果如表1所示。
表1不同浓度绿原酸标准品的吸光度
标准曲线如图1所示，绿原酸标准曲线方程为A＝58.721C－0.1199，R2＝0.9994。绿原酸标准品浓度在0.0062～0.0310mg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。
(2)样品中绿原酸产量的测定
用移液枪吸取待测样品1mL于100mL容量瓶中，加RO水稀释到刻度，得到待测样品液。以RO水作空白，在绿原酸标准品的最大吸收波长320nm下测定待测样品的吸光度，再由标准曲线计算出待测样品中绿原酸含量，重复三次试验。通过公式(1)计算绿原酸产量：
E＝(C样液·V－C母液·V)·1000(1)
式中：E：绿原酸的产量，μg/mL；C样液：三个平行实验发酵液样品中绿原酸质量浓度，mg/mL；C母液：三个平行样品所对应的未经菌液发酵的混合液中绿原酸质量浓度，mg/mL；V：液体发酵液的体积，mL。
实施例3单因素实验
取金银花蒸馏残液(湖北楚天舒药业有限公司)在高压灭菌锅中121℃条件下高温灭菌20min，用于后续实验。
将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中于转速为150r/min、温度为30℃的摇床培养18h得到活化的枯草芽孢杆菌菌液。
根据溶氧量设定液体发酵液容器为500mL锥形瓶，总发酵体系设定为150mL，包含枯草芽孢杆菌菌液、金银花蒸馏残液和LB培养基，其中LB培养基30mL。按一定接种比(菌液:金银花蒸馏残液，V:V)将发酵体系放入摇床培养，培养结束后取出发酵液，离心取上清测得吸光度，根据绿原酸标准曲线回归方程得出绿原酸浓度，通过绿原酸产量计算公式得出绿原酸的产量。通过单因素试验分别考察枯草芽孢杆菌菌种、发酵温度(℃)、发酵时间(h)、接种量(V:V)和转速(r/min)等因素下各个水平对绿原酸产量的影响。
(1)不同枯草芽孢杆菌菌种对绿原酸产量的影响
分别取枯草芽孢杆菌(市售，CCTCC AB 90008)菌液、枯草芽孢杆菌hx0210菌液，按菌液:金银花蒸馏残液为1:2(V:V)的接种量，将30mL LB培养基、40mL菌液、80mL金银花蒸馏残液加入到500mL锥形瓶中，放入转速为150r/min、温度为30℃的摇床培养6h。6h之后取出发酵混合液，离心取上清并测吸光度，通过计算得出绿原酸产量，平行做3组实验，考察同一条件下两种枯草芽孢杆菌菌种对绿原酸产量的影响。结果如表2所示，经枯草芽孢杆菌hx0210发酵后绿原酸产量远高于枯草芽孢杆菌(市售)。
表2两种枯草芽孢杆菌菌种发酵后的吸光度及绿原酸产量
(2)发酵温度对绿原酸产量的影响
按枯草芽孢杆菌hx0210菌液:金银花蒸馏残液为1:2(V:V)的接种量，将30mL LB培养基、40mL菌液、80mL金银花蒸馏残液加入到500mL锥形瓶中，放入转速为150r/min，温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的摇床中培养6h。6h之后取出发酵混合液，离心取上清并测吸光度，通过计算得出绿原酸产量，平行做3组实验，考察发酵温度对绿原酸产量的影响。结果如表3和图2所示。
表3不同发酵温度下的吸光度及绿原酸产量
当发酵温度小于等于30℃时，随着发酵温度的升高，绿原酸产量增大。当温度达到30℃时，产量最高，温度持续升高到40℃的这段区间，绿原酸的产量呈下降趋势。这可能是因为30℃是枯草芽孢杆菌最适宜的温度，随着温度继续增加，高温分解了产物或不适于枯草芽孢杆菌的生长，使得微生物转化的能力下降。因此，可以看出发酵的最佳温度为30℃。
(3)发酵时间对绿原酸产量的影响
按枯草芽孢杆菌hx0210菌液:金银花蒸馏残液为1:2(V:V)的接种量，将30mL LB培养基、40mL菌液、80mL金银花蒸馏残液加入到500mL锥形瓶中，放入转速为150r/min、温度为30℃的摇床中分别培养4h、6h、8h、10h、24h。之后取出发酵混合液，离心取上清并测吸光度，通过计算得出绿原酸产量，平行做3组实验，考察发酵时间对绿原酸产量的影响。结果如表4和图3所示。
表4不同发酵时间下的吸光度及绿原酸产量
随着发酵时间的增长，绿原酸产量也在不断增高，直到发酵时间为6h时，达到了峰值，后来随着时间的增加，绿原酸的产量都是持续降低。因此，可以看出发酵的最佳时长应为6h。
(3)接种量对绿原酸产量的影响
按枯草芽孢杆菌hx0210菌液:金银花蒸馏残液分别为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4(V:V)的接种量，将30mL LB培养基、120mL枯草芽孢杆菌hx0210菌液与金银花蒸馏残液的混合液加入到500mL锥形瓶中，放入转速为150r/min、温度为30℃的摇床中培养6h。6h之后取出发酵混合液，离心取上清并测吸光度，通过计算得出绿原酸产量，平行做3组实验，考察接种量对出绿原酸产量的影响。结果如表5和图4所示。
表5不同接种量下的吸光度及绿原酸产量
随着接种量比值的减小，绿原酸产量是先增加后减少的趋势，在1:1(V:V)时是最大值，为(79.70±4.77)μg/mL。而后，随着接种量比值的减小，绿原酸的产量越来越低，可能是因为随着接种量比值的减小，枯草芽孢杆菌hx0210菌液较少，不能及时的进行转化，另外，营养物质不够，消耗了产生的绿原酸，所以，绿原酸产量降低。因此，可以看出最佳的接种量为1:1(V:V)。
(5)转速对绿原酸产量的影响
按枯草芽孢杆菌hx0210菌液:金银花蒸馏残液为1:2(V:V)的接种量，将30mL LB培养基、40mL菌液、80mL金银花蒸馏残液加入到500mL锥形瓶中，放入转速分别为0r/min、50r/min、100r/min、150r/min、200r/min，温度为30℃的摇床中培养6h。6h之后取出发酵混合液，离心取上清并测吸光度，通过计算得出绿原酸产量，平行做3组实验，考察转速对出绿原酸产量的影响。结果如表6和图5所示。
表6不同转速下的吸光度及绿原酸产量
随着转速的加大，绿原酸产量也不断增大，直到转速为150rpm时，产量达到峰值，之后，随着转速的增加，绿原酸产量反而下降。因此，可以看出最佳转速为150rpm。
实施例5正交实验
根据单因素实验的结果可知，发酵时间(A)、接种量(B)、发酵温度(C)和转速(D)的最佳值，分别为6h、1:1(V:V)、30℃、150rpm。以枯草芽孢杆菌hx0210作为发酵菌种，根据单因素实验的结果确定各因素的三个水平，在L9(34)水平设计的正交试验设计中进行三水平四因素(表7)的试验。正交试验设计及结果见表8，方差分析结果见表9。
表7正交试验因素与水平
表8正交试验设计及结果与极差分析
表9正交试验结果方差分析
注：“-”表示对结果不显著(P＞0.05)。
由表8的极差分析结果可知，各因素对绿原酸产量的影响次序为：C＞A＞D＞B，即发酵温度＞发酵时间＞摇床转速＞接种量。
表9方差分析也表明各个因素对绿原酸产量的影响次序是C＞A＞D＞B，但各因素的影响均不显著，获得最佳发酵工艺条件为A2B3C1D2，即发酵时间6h，接种量1:2(V:V)，温度25℃，转速150rpm，绿原酸产量为(191.67±39.25)μg/mL。
使用最佳发酵工艺条件平行试验3次，绿原酸的产量为(193.03±47.60)μg/mL，高于表8中绿原酸最高产量(191.67±39.25)μg/mL，表明正交设计所确定的金银花蒸馏残液生物转化的发酵条件为最优。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：分类命名为Bacillus subtilis hx0210枯草芽孢杆菌hx0210，保藏编号为CCTCC NO：M 2018803。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在生产绿原酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：生产绿原酸所用原料包含金银花蒸馏残液。
4.一种提高金银花蒸馏残液中绿原酸含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种到培养基中进行活化培养，得到枯草芽孢杆菌菌液；
(2)将枯草芽孢杆菌菌液、金银花蒸馏残液、培养基混合进行发酵培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的活化培养的条件为30℃、150r/min培养16-18h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中枯草芽孢杆菌hx0210菌液、金银花蒸馏残液的体积比为1:2。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中枯草芽孢杆菌hx0210菌液、金银花蒸馏残液、培养基的体积比为4:8:3。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的发酵培养的条件为30℃、150rpm发酵6h。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)中所述的培养基为LB培养基。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，30℃、150r/min培养16-18h得到枯草芽孢杆菌菌液；
(2)将枯草芽孢杆菌菌液、金银花蒸馏残液、LB培养基按体积比4:8:3的比例混合，30℃、150rpm发酵6h。
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