CN105132331A - 一株葡糖醋杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株葡糖醋杆菌(Komagataeibacter？nataicola？RZS01)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.10961。该菌株分离自残次水果，分离筛选方法简便易得。该菌株为革兰氏阴性、短杆状的好氧菌，性能稳定。葡糖醋杆菌RZS01为细菌纤维素产生菌，可摇瓶震荡发酵、静态发酵、发酵罐大规模发酵或者三种方法任意两种或三种的组合生产细菌纤维素，纤维素产量高，适于大规模工业生产，可带来显著的经济效益。本发明的葡糖醋杆菌RZS01无毒无致病性，对人畜安全、对环境友好，是细菌纤维素生产的模式生物，具有潜在的应用前景。

Description

一株葡糖醋杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株葡糖醋杆菌及其应用。

背景技术

纤维素是自然界中最丰富的天然高分子材料，天然合成纤维素主要来源于植物的光合作用合成(即植物纤维素)和微生物合成(即微生物纤维素，又称细菌纤维素)。

植物纤维素在工业中应用较为普遍，但其纤维素中掺杂有木质素和半纤维素，需经分离纯化才能使用。而细菌纤维素在结构和性质上都有独特的优越性，如纯度高，拉伸强度高，生物相容性好，且具有三维纳米网络结构，同时具有良好的形态可控制性，较高的生物适应性以及良好的生物可降解性。基于细菌纤维素的优良性能，细菌纤维素商业化的产品已进入食品、造纸、医疗、声学器材、化工等行业。目前在日、美国家细菌纤维素产业已形成年产值上亿的市场，其广阔的应用前景，使细菌纤维素成为当今国内外生物材料研究热点之一。

为实现细菌纤维素的进一步开发应用，满足如生物医学材料、渗透汽化膜、燃料电池、造纸等行业对纤维素不断加大的需求，如何实现细菌纤维素的工业化大规模生产的问题亟待解决。

虽然已有产细菌纤维素菌种专利的报道(中国专利申请201410165908.8，中国专利201310678608.5)，但是相比本发明得到的菌株与其记载的汉氏葡糖醋杆菌除分类地位相距较远。Yasar等人分离获得了GluconacetobacterhanseniiP2A菌株，其在静态培养条件下纤维素产量仅为1.89±0.08g/L，产量低(YasarAndelibNuranDeveciAksoy.Isolationandcharacterizationofanefficientbacterialcelluloseproducerstraininagitatedculture:GluconacetobacterhanseniiP2A[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology,2014,98(3):1065-1075.)。目前分离得到的细菌都应用于实验室发酵培养，用于大规模工业化生产的菌株鲜少报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可用于工业化大规模生产细菌纤维素的葡糖醋杆菌RZS01(KomagataeibacternataicolaRZS01)，该菌株性能稳定，可摇瓶震荡发酵、静态发酵、发酵罐大规模发酵或者三种方法任意两种或三种的组合生产细菌纤维素，利用该菌株生产细菌纤维素的产量均较高。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一株从残次水果中分离得到的细菌纤维素产生菌——葡糖醋杆菌RZS01(KomagataeibacternataicolaRZS01)，该菌株于2015年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10961。

本发明还提供葡糖醋杆菌RZS01的分离方法，具体步骤如下：

残次水果经破碎后，用无菌水浸渍振荡，稀释后，吸取稀释液，移入富集培养基中，30℃静态培养后，无菌条件下取出细菌纤维素膜，研碎后加入无菌生理盐水稀释，制成菌悬液，然后逐级稀释，涂布于分离平板培养基上，30℃培养后挑取单菌落接入斜面，待长好后继续稀释涂布分离，重复数次，直至菌形态均一后挑取单菌落接入斜面，斜面保藏于4℃冰箱。

本发明的葡糖醋杆菌RZS01的形态特征为：菌落呈乳白色、不透明；边缘圆形、***；表面湿润、光滑；粒状、不产色素。该菌为革兰氏阴性好氧菌，不具有运动性，接触酶反应阳性，能氧化葡萄糖为葡萄糖酸盐，不能利用淀粉和乙醇为碳源，不能氧化乙酸，在以铵盐为唯一氮源时细菌不生长，能氧化甘油，生长过程中能产生5-酮葡萄糖酸盐，是细菌纤维素生产菌。

通过测序分析得到葡糖醋杆菌RZS01的16SrDNA序列，全长为1482bp(其序列如SEQIDNo.1所示)，使用BLAST对RZS01菌株的16SrDNA基因和GenBank中已录入的细菌进行同源性比对，分析表明该菌与KomagataeibacternataicolaLMG1536的序列同源性最高，同源性高达99.86％。结合形态、生理生化特征及16SrDNA全序列分析的***发育研究结果，将该菌株命名为葡糖醋杆菌RZS01(KomagataeibacternataicolaRZS01)。

本发明还提供了利用葡糖醋杆菌RZS01生产细菌纤维素的方法。利用葡糖醋杆菌RZS01作为发酵菌株，将该菌株接种于pH值为4.2-6.5，含碳源、氮源、磷酸盐、镁盐、有机酸的无菌培养基中进行发酵培养。

本发明提供的利用葡糖醋杆菌RZS01生产细菌纤维素的方法，其中发酵培养的方式包括：(1)25-35℃恒温静置培养2-10天，取出细菌纤维素膜，提纯；(2)25-35℃摇瓶振荡培养2-10天，取出细菌纤维素膜，提纯；(3)25-35℃发酵罐培养1-8天，分离提纯，获得絮状细菌纤维素；(4)以上三种方法任意两种或三种的组合。

利用葡糖醋杆菌RZS01生产细菌纤维素的具体工艺条件如下：

首先将菌种接种至种子培养基中，25-35℃摇床振荡培养12-48h，转速100-250rpm，按2-20％的接种量接入发酵培养基中。

种子培养基中各组分含量为碳源15-30g/L，氮源4-10g/L，磷酸盐0.5-2.5g/L，镁盐0.1-1.5g/L,pH4.2-6.5。

发酵培养基中各组分含量为碳源15-35g/L，氮源5-20g/L，磷酸盐2.5-4.0g/L，镁盐0.1-2.0g/L，有机酸0.5-3.0g/L，pH4.2-6.5。

碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、糖蜜和淀粉水解液中的一种或几种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉中的一种或几种；磷酸盐为磷酸钠盐和磷酸钾盐；镁盐为硫酸镁；有机酸为醋酸、柠檬酸、乳酸中的一种或几种。

本发明的显著效果：本发明提供的细菌纤维素产生菌株——葡糖醋杆菌RZS01，性能稳定，分离筛选方法简便易得，利用该菌株生产细菌纤维素，产量较高，适于大规模工业生产，可带来显著的经济效益。

生物保藏说明

本发明的微生物分类命名为葡糖醋杆菌RZS01(KomagataeibacternataicolaRZS01)，保藏日期为2015年6月4日，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.10961。

序列表中SEQIDNo.1为KomagataeibacternataicolaRZS01的16SrDNA序列。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

本实施例涉及细菌纤维素生产菌株——葡糖醋杆菌RZS01的分离筛选，菌株分离自残次水果，具体步骤如下：

残次水果经破碎后，用无菌水浸渍振荡20min，制成10倍稀释液，然后吸取稀释液，按稀释液：富集培养基的体积比为1:10的比例移入装有富集培养基的试管中30℃静态培养7天，选择管内液面长有乳白色细菌纤维素膜，用无菌的方法取出1g细菌纤维素膜，无菌研钵研碎后加入9mL无菌生理盐水中制成10^-1菌悬液，然后逐级稀释，涂布于分离平板培养基上，30℃培养5天后挑取长势良好、菌落饱满均匀的单菌落接入斜面，待长好后继续稀释涂布分离，重复数次，并借助光学显微镜观察，直到菌形态均一致后挑取单菌落接入斜面，斜面保藏于4℃冰箱。为筛选得到高产细菌纤维素菌株，挑取斜面上的少量菌苔于干净的载玻片上，然后滴加硫酸-卢哥氏碘液，若菌株显蓝黑色，说明该菌株能生产纤维素，筛选其中产细菌纤维素的菌株。挑取上述过程筛选出来的产细菌纤维素菌于发酵培养基中，筛选出产纤维素最高的菌株，斜面保藏于4℃冰箱。

富集培养基主要成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钠2.7g/L，柠檬酸1.15g/L，硫酸镁0.25g/L，pH6.0。

富集培养基中再加入18g/L琼脂后即为分离平板培养基。

斜面保藏培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钠2.7g/L，柠檬酸1.15g/L，硫酸镁0.25g/L，琼脂18g/L，pH6.0。

实施例2

静态培养生产细菌纤维素：

先将菌种接种至种子培养基中，25℃摇床振荡培养12h，转速100rpm，按2％的接种量接入发酵培养基中，30℃恒温静置培养2天，取出细菌纤维素膜，提纯，干燥后称重，获得的细菌纤维素产量为3.56g/L。

发酵培养基：葡萄糖22g/L，蔗糖12g/L，蛋白胨16g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，醋酸2.4g/L，pH4.2。

实施例3

静态培养生产细菌纤维素：

先将菌种接种至种子培养基中，35℃摇床振荡培养48h，转速250rpm，按20％的接种量接入发酵培养基中，30℃恒温静置培养10天，取出细菌纤维素膜，提纯，干燥后称重，获得的细菌纤维素产量为3.42g/L。

发酵培养基：果糖25g/L，酵母浸粉16g/L，磷酸二氢钠2.9g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，柠檬酸0.4g/L，pH6.5。

实施例4

摇瓶振荡培养生产细菌纤维素：

先将菌种接种至种子培养基中，30℃摇床振荡培养36h，转速160rpm，按8％的接种量接入发酵培养基中，25℃摇瓶振荡培养2天，取出细菌纤维素絮，提纯，干燥后称重，获得的细菌纤维素产量为3.38g/L。

发酵培养基：葡萄糖20g/L，蔗糖9g/L，蛋白胨16g/L，磷酸氢二钠3.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，乳酸0.5g/L，醋酸1.5g/L,pH6.0。

实施例5

摇瓶振荡培养生产细菌纤维素：

先将菌种接种至种子培养基中，30℃摇床振荡培养36h，转速160rpm，按8％的接种量接入发酵培养基中，35℃摇瓶振荡培养10天，取出细菌纤维素絮，提纯，干燥后称重，获得的细菌纤维素产量为3.60g/L。

发酵培养基：葡萄糖25g/L，蔗糖8g/L，玉米浆20g/L，磷酸氢二钠3.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，柠檬酸1.15g/L，醋酸1.5g/L,pH6.0。

实施例6

发酵罐培养生产细菌纤维素：

先将菌种接种至种子培养基中，30℃摇床振荡培养36h，转速160rpm，按8％的接种量接入发酵培养基中，25℃发酵罐培养1天，分离提纯，获得絮状细菌纤维素，干燥后称重，获得的细菌纤维素产量为1.94g/L。

发酵培养基：淀粉水解液30g/L，玉米浆20g/L，磷酸氢二钠3.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，柠檬酸1.15g/L，醋酸1.5g/L，pH5.2。

实施例7

发酵罐培养生产细菌纤维素：

先将菌种接种至种子培养基中，30℃摇床振荡培养36h，转速160rpm，按8％的接种量接入发酵培养基中，35℃发酵罐培养8天，分离提纯，获得絮状细菌纤维素，干燥后称重，获得的细菌纤维素产量为2.98g/L。

发酵培养基：葡萄糖18g/L，蔗糖15g/L，玉米浆19g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.4g/L，柠檬酸1.05g/L，醋酸1.2g/L,pH5.4。

实施例8

动、静态联合培养生产细菌纤维素：

先将菌种接种至种子培养基中，30℃摇床振荡培养36h，转速160rpm，按8％的接种量接入发酵培养基中，30℃摇瓶振荡培养12h后，放入30℃恒温培养箱中进行静态培养6天，取出细菌纤维素膜，提纯，干燥后称重，获得的细菌纤维素产量为3.13g/L。

发酵培养基：葡萄糖20g/L，蔗糖9g/L，玉米浆20g/L，磷酸氢二钠3.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，柠檬酸1.15g/L，醋酸1.5g/L,pH6.0。

实施例9

发酵罐、动静态联合培养生产细菌纤维素：

先将菌种接种至种子培养基中，30℃摇床振荡培养36h，转速160rpm，按8％的接种量接入发酵培养基中，30℃发酵罐培养8h后，将发酵液无菌移至平板中，放入30℃恒温培养箱中进行静态培养6天，取出细菌纤维素膜，提纯，干燥后称重，获得的细菌纤维素产量为3.21g/L。

发酵培养基：葡萄糖22.5g/L，玉米浆20g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，硫酸镁0.30g/L，柠檬酸1.0g/L，醋酸1.15g/L,pH6.0。

实施例10

细菌纤维素高产菌株RZS01的鉴定

1、菌株形态学鉴定

斜面菌苔特征：表面湿润光滑，不易挑取，可成片脱离培养基。

平板菌落特征：乳白色、不透明、边缘圆形、***、表面光滑、湿润、粒状、不产色素，稀释涂布培养3天后直径约0.5mm，易挑取，7天后直径约1.2mm，不易挑取。

菌体形态特征：RZS01细胞呈短杆状、直或稍弯，大小为(0.5～0.7)μm×(1～2.5)μm，单个或成对。

2、生理生化鉴定

基本的生理生化特征鉴定汇总于表1.

表1RZS01菌与醋酸杆菌属和葡糖杆菌属中种的鉴别特征汇总表

。

Claims (8)

1.一株葡糖醋杆菌，其特征在于，所述的葡糖醋杆菌为葡糖醋杆菌RZS01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10961。

2.根据权利要求1所述的葡糖醋杆菌的分离方法，其特征在于，具体步骤如下：残次水果经破碎后，用无菌水浸渍振荡，稀释后，吸取稀释液，移入富集培养基中，30℃静态培养后，无菌条件下取出细菌纤维素膜，研碎后加入无菌生理盐水稀释，制成菌悬液，然后逐级稀释，涂布于分离平板培养基上，30℃培养后挑取单菌落接入斜面，待长好后继续稀释涂布分离，重复数次，直至菌形态均一后挑取单菌落接入斜面，斜面保藏于4℃冰箱。

3.根据权利要求1所述的葡糖醋杆菌在生产细菌纤维素中的应用。

4.根据权利要求3所述的葡糖醋杆菌在生产细菌纤维素中的应用，其特征在于，所述的葡糖醋杆菌生产细菌纤维素的方法如下：利用葡糖醋杆菌RZS01作为发酵菌株，将菌株接种于pH值为4.2-6.5，含碳源、氮源、磷酸盐、镁盐、有机酸的无菌培养基中进行发酵培养。

5.根据权利要求4所述的葡糖醋杆菌在生产细菌纤维素中的应用，其特征在于，所述的发酵培养的方式包括：(1)25-35℃恒温静置培养2-10天，取出细菌纤维素膜，提纯；(2)25-35℃摇瓶振荡培养2-10天，取出细菌纤维素膜，提纯；(3)25-35℃发酵罐培养1-8天，分离提纯，获得絮状细菌纤维素；(4)1、2和3三种方法任意两种或三种的组合。

6.根据权利要求4或5所述的葡糖醋杆菌在生产细菌纤维素中的应用，其特征在于，所述的葡糖醋杆菌生产细菌纤维素的方法为首先将葡糖醋杆菌RZS01菌种接种至种子培养基中，25-35℃摇床振荡培养12-48h，转速100-250rpm，然后按2-20％的接种量接入发酵培养基中进行发酵培养。

7.根据权利要求6所述的葡糖醋杆菌在生产细菌纤维素中的应用，其特征在于，所述的种子培养基中各组分含量为碳源15-30g/L，氮源4-10g/L，磷酸盐0.5-2.5g/L，镁盐0.1-1.5g/L,pH4.2-6.5；发酵培养基中各组分含量为碳源15-35g/L，氮源5-20g/L，磷酸盐2.5-4.0g/L，镁盐0.1-2.0g/L，有机酸0.5-3.0g/L，pH4.2-6.5。

8.根据权利要求7所述的葡糖醋杆菌在生产细菌纤维素中的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、糖蜜和淀粉水解液中的一种或几种；所述的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉中的一种或几种；所述的磷酸盐为磷酸钠盐和磷酸钾盐；所述的镁盐为硫酸镁；所述的有机酸为醋酸、柠檬酸、乳酸中的一种或几种。