CN114668699A - 一种金银花发酵原浆的制备方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵技术领域,尤其涉及一种金银花发酵原浆的制备方法及其在化妆品中的应用,所述制备方法为:将金银花粉与去离子水按比例混合后高压灭菌处理得到金银花发酵初始体系,然后与发酵菌液混合进行发酵,经高压灭菌、离心后得到发酵原浆。本发明采用枯草芽孢杆菌对金银花进行发酵,制得的金银花发酵原浆具有清除DPPH自由基的活性成分,还抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性成分,表现出较好的抗氧化作用和美白作用。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域,尤其涉及一种金银花发酵原浆的制备方法及其在化妆品中的应用。
背景技术
金银花为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花。干花味甘微苦,性微寒无毒,具有生津止渴、清热解毒、抗菌消炎等功效。现有技术中研究发现其具有明显的抑菌作用,对革兰氏阳性菌抑菌率可达53.86%,对革兰氏阴性菌的抑制率可达36.14%。现有技术中还发现金银花对藤黄微球菌具有很好的抗菌效果。金银花中目前鉴定出的黄酮类化合物主要包括木犀草素、忍冬苷、木犀草素-7-O-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-0-D-半乳糖苷、槲皮素-3-0-D-葡萄糖苷、金丝桃苷和5-羟基-3,4,7-三甲基黄酮等。金银花中的有机酸类成分至今已被分离出了40多种,有机酸类成分是金银花清热解毒的关键成分,主要以绿原酸为主。此外还有一些三萜类化合物,包括冬灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙和木通皂苷D。挥发油类成分有芳樟醇、亚油酸甲酯、苯甲醇、丁香油酚等醇类酯类物质。
传统提取工艺包括醇提、水提、超声、微波提取等,存在能耗大、效率低、纯度低、引入杂质等局限性,使植物的功效成分尚未完全提取利用。使用微生物发酵工艺,可以使植物原料中的活性成分有效地保留下来,起到富集的作用,让原料功效成分得到更好的利用。这是因为微生物中含有某种酶类,可以将植物原料的细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解,从而使植物细胞破裂、细胞间隙增加并减小有效成分从胞内向提取介质中扩散的传质阻力,可大大提高功效成分的提取率。同时微生物依靠强大的物质转化能力及生成代谢能力也会代谢产生新的活性成分,增强了传统植物提取成分的功效。植物原料通过微生物发酵后获得的发酵液可以作为化妆品直接应用,是化妆品技术发展的重大创新,这也符合现代化妆品天然、绿色的发展方向。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题,本发明提供了一种金银花发酵原浆的制备方法及其在化妆品中的应用,本发明采用枯草芽孢杆菌对金银花进行发酵,制得的金银花发酵原浆具有清除DPPH自由基的活性成分,从而对皮肤具有抗氧化作用。同时,本发明制得的金银花发酵原浆具有抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性成分,表现出较好的美白作用。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种金银花发酵原浆的制备方法,将金银花粉与去离子水按比例混合后高压灭菌处理得到金银花发酵初始体系,然后与发酵菌液混合进行发酵,经高压灭菌、离心,即得到所述发酵原浆。
进一步地,所述金银花粉为金银花50-70℃烘4-6小时后,粉碎后过50-100目筛而成。
进一步地,所述高压灭菌条件为110-121℃,20-30分钟。
进一步地,所述金银花发酵初始体系中金银花粉:去离子水的比例为5-20g:100g。
进一步地,所述发酵菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌种保藏信息为,保藏单位名称:中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC),保藏单位地址:北京市朝阳区酒仙桥24号院6号楼,保藏日期:2008年11月17号,保藏编号:CICC23659,分类命名:枯草芽孢杆菌斯氏亚种,该菌种为现有技术中已有菌种。
进一步地,所述发酵菌是以菌液的形态添加到金银花发酵初始体系中,接种菌浓度为105-108CFU/mL。
进一步地,所述发酵菌液与所述金银花发酵初始体系的比例关系为5-15mL:100g。
进一步地,所述发酵步骤中,温度为30-45℃,发酵时间为40-70小时,转速为100-200r/min。
进一步地,所述离心步骤中,转速为6000-12000r/min,离心半径为6-12cm,离心时间为10-40分钟。
进一步地,所述金银花发酵原浆的pH值为4.50-6.50。
进一步地,所述发酵菌事先进行预处理,所述预处理工艺包括:
菌种活化:将发酵菌的单菌落接种到营养液体培养基中,在30-45℃的培养箱中培养10-30小时;
菌种纯化:将活化的菌种在营养琼脂平板上划线接种,从而获取单菌落;
菌种扩培:将待用菌种的单菌落接种到营养液体培养基中,在30-45℃的培养箱中培养,至OD值达到0.5-1.0时,即为合适的接种浓度105-108CFU/mL。
本发明提供的金银花发酵原浆具有抗氧化和美白的效果。
本发明的另一目的是提供一种金银花发酵原浆在化妆品中的应用,所述化妆品中包括上述的金银花发酵原浆。
有益效果
本发明公开了一种金银花发酵原浆的制备方法及其在化妆品中的应用,,本发明至少具有以下优点:
本发明采用枯草芽孢杆菌对金银花发酵初始体系进行发酵,保留了植物中的功效成分及其活性,避免了传统提取方法造成的活性成分流失现象。
本发明所提供的金银花发酵原浆具有清除DPPH自由基的效果,表现出良好的抗氧化作用。
本发明所提供的金银花发酵原浆中富含具有抵制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性物质,从而对皮肤具有良好的美白作用。
本发明方法中发酵完成后,发酵原浆中不添加香精等对化学成分,确保产品对人体的安全性,斑贴试验无不良反应、不给肌肤造成任何副作用。
附图说明
图1:不同浓度Trolox对DPPH的清除率标准曲线图;
图2:不同浓度曲酸对酪氨酸酶的抑制率标准曲线图。
具体实施方式
以下,将详细地描述本发明。在进行描述之前,应当理解的是,在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义,而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上,根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此,这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例,并非意图限制本发明的范围,从而应当理解的是,在不偏离本发明的精神和范围的情况下,可以由其获得其他等价方式或改进方式。
以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举,并不对本发明构成任何限制,本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明,以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。
实施例1
一种金银花发酵原浆制备方法,包括以下步骤:
1、发酵菌首先进行预处理,所述预处理工艺包括:
(1)菌种活化:将发酵菌单菌落接种到营养液体培养基中,在37℃的培养箱中培养16小时;所使用的培养基符合行业标准YY/T 1187-2010。
(2)菌种纯化:将活化的菌种在营养琼脂平板上划线接种,从而获取单菌落;所使用的培养基符合行业标准YY/T 1239-2010。
(3)菌种扩培:将待用菌种的单菌落接种到营养液体培养基中,在37℃的培养箱中培养,至OD值达到0.5-1.0时,即为合适的接种浓度105-108CFU/mL。所使用的培养基符合行业标准YY/T 1187-2010。
2、将金银花65℃烘5小时后,粉碎后过100目筛得到金银花粉;金银花粉和去离子水按照5g:100g比例混合均匀后进行121℃、30min高压灭菌处理得到金银花发酵初始体系。
3、将经过纯化扩培的发酵菌(浓度为105-108CFU/m1)菌液5mL接种到100g的金银花发酵初始体系中,在37℃培养箱中进行培养50小时后,把所得发酵液进行121℃、30min高压灭菌,使菌失活;将灭菌后的发酵液用8层滤布过滤掉残渣,滤液在10000r/min、离心半径为9cm的条件下离心30min,收集上清液,即为本发明提供的金银花发酵原浆。
该实施例制备所得的金银花发酵原浆的外观为粘稠液体、颜色为浅黄色至棕色。pH值4.50-6.50,粘度50-400cP,可溶性固含物含量1.0-5.0%,菌落总数小于50CFU/mL,无致病菌检出,符合化妆品质量管理相关要求。
实施例2
一种金银花发酵原浆制备方法,包括以下步骤:
1、发酵菌首先进行预处理,所述预处理工艺包括:
(1)菌种活化:将发酵菌单菌落接种到营养液体培养基中,在30℃的培养箱中培养30小时;所使用的培养基符合行业标准YY/T 1187-2010。
(2)菌种纯化:将活化的菌种在营养琼脂平板上划线接种,从而获取单菌落;所使用的培养基符合行业标准YY/T 1239-2010。
(3)菌种扩培:将待用菌种的单菌落接种到营养液体培养基中,在30℃的培养箱中培养,至OD值达到0.5-1.0时,即为合适的接种浓度105-108CFU/mL。所使用的培养基符合行业标准YY/T 1187-2010。
2、将金银花50℃烘6小时后,粉碎后过100目筛得到金银花粉;金银花粉和去离子水按照15g:100g比例混合均匀后进行115℃、25min高压灭菌处理得到金银花发酵初始体系。
3、将经过纯化扩培的发酵菌(浓度为105-108CFU/m1)菌液10mL接种到100g的金银花发酵初始体系中,在30℃培养箱中进行培养70小时后,把所得发酵液进行115℃、25min高压灭菌,使菌失活;将灭菌后的发酵液用8层滤布过滤掉残渣,滤液在12000r/min、离心半径为12cm的条件下离心40min,收集上清液,即为本发明提供的金银花发酵原浆。
实施例3
一种金银花发酵原浆制备方法,包括以下步骤:
1、发酵菌首先进行预处理,所述预处理工艺包括:
(1)菌种活化:将发酵菌单菌落接种到营养液体培养基中,在45℃的培养箱中培养10小时;所使用的培养基符合行业标准YY/T 1187-2010。
(2)菌种纯化:将活化的菌种在营养琼脂平板上划线接种,从而获取单菌落;所使用的培养基符合行业标准YY/T 1239-2010。
(3)菌种扩培:将待用菌种的单菌落接种到营养液体培养基中,在45℃的培养箱中培养,至OD值达到0.5-1.0时,即为合适的接种浓度105-108CFU/mL。所使用的培养基符合行业标准YY/T 1187-2010。
2、将金银花70℃烘4小时后,粉碎后过50目筛得到金银花粉;金银花粉和去离子水按照20g:100g比例混合均匀后进行110℃、20min高压灭菌处理得到金银花发酵初始体系。
3、将经过纯化扩培的发酵菌(浓度为105-108CFU/m1)菌液15mL接种到100g的金银花发酵初始体系中,在45℃培养箱中进行培养40小时后,把所得发酵液进行110℃、20min高压灭菌,使菌失活;将灭菌后的发酵液用8层滤布过滤掉残渣,滤液在6000r/min、离心半径为6cm的条件下离心10min,收集上清液,即为本发明提供的金银花发酵原浆。
实施例4
实施例1得到的金银花发酵原浆的抗氧化功效测试
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(简称DPPH)是一种稳定的长寿命自由基,其乙醇溶液呈深紫色,在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时,由于与其单电子配对而使DPPH乙醇溶液光吸收减弱。DPPH乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系,由此可评价试验样品清除自由基的能力,即抗氧化活性的大小。
参照表1,使用10mL试管设立样品管(T)、样品本底(T0)、DPPH管(C)和溶剂本底(C0),每一样品的每个受试浓度的样品管(T)需设立3支平行管,同时DPPH管(C)也需设立3支平行管。
表1. DPPH自由基清除试验样品测试加液表
测试步骤如下:
(1)在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入1mL相同浓度的样品溶液。金银花发酵原浆的测试样本稀释40倍后进行测试。
(2)在所有试管中(T、T0、C、C0)补充去离子水,补足3mL,混匀。
(3)在样品管(T)和DPPH管(C)中加入DPPH乙醇溶液1mL,样品本底(T0)和溶剂本底(C0)用95%乙醇代替,轻轻摇匀,室温下静置5分钟。
(4)将各支反应溶液移入1cm比色皿中,在517nm处测定吸光值。
(5)阳性对照:使用95%乙醇溶液溶解标准品Trolox(水溶性维E)至0.010mg/mL、0.015mg/mL、0.020mg/mL、0.025mg/mL、0.030mg/mL。
(6)计算DPPH自由基清除率:
表2. 金银花发酵原浆对DPPH清除率结果
由表2可知,金银花发酵原浆对DPPH自由基的清除作用明显,且与发酵初始体系相比,清除作用提高约7%。浓度2.5%的发酵原浆可清除57.49%的自由基,优于0.02mg/mL的Trolox的清除效果,表现出较强的抗氧化性。根据Trolox的浓度与抑制率标准曲线及回归公式(图1),得出金银花发酵原浆中Trolox的当量为1.084 mg/mL。
实施例5
实施例1得到的金银花发酵原浆的美白功效测试
在皮肤黑色素生物合成中,酪氨酸酶是关键酶,作用于多巴,形成多巴醌,后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在pH6.8的磷酸溶液中,可催化多巴转化成多巴醌,在分光光度计475nm处可测定吸光值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的原料可以减少多巴转化成多巴醌,从而降低吸光值,根据吸光值的变化,评估原料对酪氨酸酶活性的抑制作用。
参照表3,使用10mL试管设立样品管(T)、样品本底(T0)、酶反应管(C)和溶剂本底(C0),每一样品的每个受试浓度的样品管(T)需设立3支平行管,同时酶反应管(C)也需设立3支平行管。
表3. 酪氨酸酶抑制试验样品测试加液表
测试步骤如下:
(1)在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入1mL相同浓度的样品溶液,酶反应管(C)和溶剂本底(C0)则分别加入1mL pH6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
(2)在样品管(T)和酶反应管(C)中各加入0.5mL酪氨酸酶溶液,样品本底(T0)与溶剂本底(C)以0.5mL pH6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液代替,将样品和酪氨酸酶充分混匀,置37℃水浴槽孵育10分钟。
(3)依次在各管中加入2mL的左旋多巴溶液,控制每管反应时间为5分钟,即刻将各管反应溶液移入比色皿中,在475nm处测定吸光值。
(4)阳性对照:使用pH6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解曲酸至100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL。
(5)计算酪氨酸酶抑制率:
表4. 金银花发酵原浆对酪氨酸酶抑制率结果
由表4可知,金银花发酵原浆对酪氨酸酶的抑制作用明显,且与发酵初始体系相比,抑制作用提高约10%。发酵原浆可抑制46.37%的酪氨酸酶,与12.5μg/mL的曲酸效果相当,表现出较好的美白效果。根据曲酸的浓度与抑制率标准曲线及回归公式(图2),得出金银花发酵原浆中曲酸的当量为13.52 μg/mL。
实施例6
实施例1得到的金银花发酵原浆的安全性测试
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1中获得的金银花发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验,旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象
按《化妆品安全技术规范2015》规定的受试者入选标准选择30名参加试验的人员。
2、试验方法
选用面积不超过50mm2、深度约1mm的合格斑试器材。试验处理:将0.025mL金银花发酵原浆放入斑试器小室内,将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的前臂曲侧,用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上,持续24h。每个测试均设置空白对照处理,在对照斑试器孔内不放置任何物质,其他过程同测试组处理。
分别于去除受试物斑试器后30min(待压痕消失后)、24h和48h按表1标准观察皮肤反应,并记录观察结果。
皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应程度分级标准如下:
“—”=阴性反应;
“±”=可疑反应,仅有微弱红斑;
“+”=弱阳性反应(红斑反应);红斑、浸润、水肿、可有丘疹;
“++”=强阳性反应(疱疹反应);红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹;反
应可超出受试区;
“+++”=极强阳性反应(融合性疱疹反应);明显红斑、严重浸润、水肿、
融合性疱疹;反应超出受试区。
人体斑贴试验判断标准为:30例受试者中出现“±”不良反应的人数多于5例,或“+”不良反应的人数多于2例,或出现任何1例“++”或“+++”以上皮肤不良反应时,则判定受试物对人体有不良反应,反之,则视为对人体无不良反应。
表5. 实施例1获得的金银花发酵原浆的斑贴试验结果
从表5中可以看出:实施例1得到的金银花发酵原浆均未产生不良反应,说明本发明提供的金银花发酵原浆具有安全性,不会给人体带来不良反应。
实施例7
金银花发酵原浆在化妆品(润肤乳)中的应用
一种金银花发酵原浆润肤乳,包括如下重量份的组分:
A相:二甲基硅油2份、鲸蜡醇3份、山嵛醇1份、辛酸癸酸三甘油酯3份、甘油硬脂酸2份、山嵛醇聚醚-20 2份;
B相:去离子水75份、1,3-丁二醇2份、甘油4份、黄原胶0.1、卡波姆U10 0.05份、EDTA二钠0.05份、实施例1得到的金银花发酵原浆5份;
C相:戊二醇0.3份、对羟基苯乙酮0.5份、香精0.2份。
加工工艺如下:
将A组分各原料分别加入到容器A中,升温至80-85℃,均质搅拌至体系内无不溶物;
将B相各组分加入到容器B中,加热至90℃,均质搅拌至体系内无不溶物;
将A相混合物加入到B容器中均质5分钟;
均质后,搅拌降温至45℃后,加入C相各组分;
降温至室温,灌装得到产品。
实施例8
金银花发酵原浆在化妆品(润肤乳)中的应用
一种金银花发酵原浆润肤乳,包括如下重量份的组分:
A相:二甲基硅油3份、鲸蜡醇2份、山嵛醇2份、辛酸癸酸三甘油酯3份、甘油硬脂酸2份、山嵛醇聚醚-20 1份;
B相:去离子水65份、1,3-丁二醇3份、甘油3份、黄原胶0.1、卡波姆U10 0.05份、EDTA二钠0.05份、实施例2得到的金银花发酵原浆15份;
C相:戊二醇0.3份、对羟基苯乙酮0.5份、香精0.2份。
加工工艺如下:
将A组分各原料分别加入到容器A中,升温至80-85℃,均质搅拌至体系内无不溶物;
将B相各组分加入到容器B中,加热至90℃,均质搅拌至体系内无不溶物;
将A相混合物加入到B容器中均质5分钟;
均质后,搅拌降温至45℃后,加入C相各组分;
降温至室温,灌装得到产品。
实施例9
金银花发酵原浆在化妆品(润肤乳)中的应用
一种金银花发酵原浆润肤乳,包括如下重量份的组分:
A相:二甲基硅油3份、鲸蜡醇3份、山嵛醇2份、辛酸癸酸三甘油酯2份、甘油硬脂酸1份、山嵛醇聚醚-20 2份;
B相:去离子水55份、1,3-丁二醇2份、甘油4份、黄原胶0.1、卡波姆U10 0.05份、EDTA二钠0.05份、实施例3得到的金银花发酵原浆25份;
C相:戊二醇0.3份、对羟基苯乙酮0.5份、香精0.2份。
加工工艺如下:
将A组分各原料分别加入到容器A中,升温至80-85℃,均质搅拌至体系内无不溶物;
将B相各组分加入到容器B中,加热至90℃,均质搅拌至体系内无不溶物;
将A相混合物加入到B容器中均质5分钟;
均质后,搅拌降温至45℃后,加入C相各组分;
降温至室温,灌装得到产品。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将金银花粉与去离子水按比例混合,然后高压灭菌处理,得到金银花发酵初始体系;
(2)步骤(1)所得金银花发酵初始体系与发酵菌液混合,进行发酵;
(3)发酵完成后,经高压灭菌、过滤,滤液离心,收集上清液,即得到所述发酵原浆。
2.根据权利要求1所述的金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述金银花粉为金银花50-70℃烘4-6小时后,粉碎后过50-100目筛而成。
3.根据权利要求1所述的金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述高压灭菌条件为110-121℃、20-30分钟。
4.根据权利要求1所述的金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述金银花发酵初始体系中金银花粉:去离子水的比例为5-20g:100g。
5.根据权利要求1所述的金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述发酵菌为枯草芽孢杆菌,该菌种保藏信息为,保藏单位名称:中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏单位地址:北京市朝阳区酒仙桥24号院6号楼,保藏日期:2008年11月17号,保藏编号:CICC23659,分类命名:枯草芽孢杆菌斯氏亚种。
6.根据权利要求1所述的金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述发酵菌是以菌液的形态添加到金银花发酵初始体系中,接种菌浓度为105-108CFU/mL。
7.根据权利要求6所述的金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述发酵菌液与所述金银花发酵初始体系的比例关系为5-15mL:100g;所述发酵步骤中,温度为30-45℃,发酵时间为40-70小时,转速为100-200r/min。
8.根据权利要求1所述的金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述离心步骤中,转速为6000-12000r/min,离心半径为6-12cm,离心时间为10-40分钟;所述金银花发酵原浆的pH值为4.50-6.50。
9.根据权利要求1所述的金银花发酵原浆的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述发酵菌事先进行预处理,所述预处理工艺包括:
菌种活化:将发酵菌的单菌落接种到营养液体培养基中,在30-45℃的培养箱中培养10-30小时;
菌种纯化:将活化的菌种在营养琼脂平板上划线接种,从而获取单菌落;
菌种扩培:将待用菌种的单菌落接种到营养液体培养基中,在30-45℃的培养箱中培养,至OD值达到0.5-1.0时,即为合适的接种浓度105-108CFU/mL。
10.一种金银花发酵原浆在化妆品中的应用,其特征在于,所述化妆品中包括金银花发酵原浆,所述金银花发酵原浆根据权利要求1-9任一所述的制备方法制备得到。
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