CN109456930A - 一株用于快速纯化制备屎肠球菌谷氨酸脱羧酶天然酶纯酶的工程菌及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株用于快速纯化制备屎肠球菌谷氨酸脱羧酶天然酶纯酶的工程菌及纯化方法。本发明提供了用于快速纯化屎肠球菌GAD天然酶的工程菌Escherichia coli（DH5α‑LNSF2），该工程菌于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCC No.60446。使用该工程菌可快速生产屎肠球菌GAD天然酶纯酶，其方法为利用甲壳素亲和吸附CBM‑DnaB‑GAD粗酶液，加入自剪切缓冲液剪切，即可获得屎肠球菌GAD天然酶纯酶。该方法只需一步纯化即可获得屎肠球菌GAD天然酶纯酶，具有快捷、高效、成本低、产率高等优点，在屎肠球菌GAD天然酶纯酶的工业化生产方面具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，更具体地，涉及一株用于快速纯化制备屎肠球菌谷氨酸脱羧酶天然酶纯酶的工程菌及纯化方法。
背景技术
谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)专一地催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)α-羧基发生脱羧作用，在γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)生物合成和手性物质DL-谷氨酸(DL-glutamic acid，DL-Glu)的拆分方面具有重要应用(Brazilian Journal ofMicrobiology,2012,43(4):1230-1241；AminoAcids,2016,48(11):2519-2531；化学与生物工程,2013,30(11):55-56.)。由于乳酸菌具有较好的安全性，便于在发酵食品中应用，乳酸菌GAD受到了极大关注，已发现短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(LWT-Food Sci Technol,2016,67:22-26)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)(Food Microbiol 2005,22:497-504)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)(Braz J Microbiol 2013；44:183-187)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)(J Microbiol Biotechnol2015；25:696-703)、唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius ssp.thermophilus)(食品科学,2011,32(1):162-167)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(湖北农业科学,2010,49(6):1450-1453)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)(食品科学,2018,39(4):90-98)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)(Microbiol Biotechnol Lett,2015,43:300-305)等微生物均具有GAD。
在生物催化领域，酶学性质是工业参数确定的重要依据。粗酶由于杂蛋白质的影响，测定的酶学性质常常会出现较大偏差，致使工业参数出现偏差，催化效率下降。同时由于粗酶中存在其它酶或下游代谢酶，易产生竞争性抑制、产物成分复杂化或酶的转化产物进一步代谢，目的产物积累减少。此外，一些分析用酶也要求用纯酶制剂。因此，酶的纯化在生物催化领域具有重要的地位，酶的纯化工艺是制约酶制剂生产成本的重要因素。
微生物GAD是胞内酶，蛋白成分异常复杂，分离纯化十分困难，采用野生株工业化制备GAD纯酶得率极低，成本高昂。例如，唾液链球菌嗜热亚种GAD的纯化需要经过硫酸铵分级沉淀、等电点沉淀、DEAE-SephadexA-50离子交换层析、HiPrep16/10Phenyl FF疏水层析和Sephadex G-100凝胶层析等5步纯化才能获得电泳纯GAD(Amino Acids,2008,34(3):473-478)；乳酸乳球菌GAD需要硫酸铵分级沉淀、3次DEAE-Sepharose CL-6B层析、Sephacryl S-200凝胶过滤等手段才能获得电泳纯GAD(无锡轻工大学学报，2004,23(3):79-84)。由此可见，野生株GAD天然酶分离纯化难度大、条件要求高、回收率低、纯化倍数不高、纯化成本非常高，现有GAD纯化方法不适用于工业化规模生产。
采用基因工程技术克隆目的酶基因与亲和标签构建融合酶表达载体，转化到大肠杆菌、酵母等表达***中进行表达，然后利用亲和载体纯化融合酶，是一种高效纯化酶的技术。例如，通过将乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的gad基因与PMD19-T simple vector构建表达质粒，在大肠杆菌(E.coli)DH5ɑ中表达对Ni2+-Chelatingsepharose fast flow具有亲和性的融合GAD，只通过一步柱层析即可高效地纯化了重组GAD(食品与生物技术学报,2012,31(3):302-306)。但是，通过这种方法构建的带亲和标签的重组酶，经亲和载体洗脱后仍然带有亲和标签，亲和肽段不能与GAD肽链分离，即获得的纯化酶是带有具亲和肽段的融合酶，并不是天然酶，而且Ni2+-Chelating sepharose fastflow载体昂贵、安全性差，同时由于亲和肽段的影响，融合酶与天然酶在酶学性质上可能存在一定差异，因此，亟需研发能通过特定方法剪切去除亲和标签获取天然酶的新技术。
大多数纤维素酶包含三个结构域：纤维素结合结构域(cellulose-bindingdomain，CBD)、柔性连接区域和催化结构域(J Biol Chem,1992,267:6743-6749；JBacteriol,1993,175:5762-5768；Bioresour Technol,2011,102:2910-2915)。纤维素相对便宜，化学惰性，对大多数蛋白质具有较低非特异性亲和力，在商业上可以以多种不同的形式存在。因此，利用CBD的纤维素结合模块(cellulose-binding module，CBM)可以与纤维素特异和不可逆的结合的特性，可将CBM开发为亲和标签，构建融合蛋白，与纤维素发生亲和吸附制备固定化酶(Int J Mol Sci,2012,13:358-368；Biotechnol Prog,2009,25:68-74；J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35:1455-1463)。该技术目前主要集中在利用构建带CBM亲和标签的融合GAD(即CBM-GAD)而实现GAD的固定化方面。虽然固定化后也实现了融合CBM-GAD与其他蛋白的分离，但如何将GAD与CBM及纤维素分离，尚缺乏可行技术。只有在保留GAD活性的前提下将GAD与CBM有效分离，才能最终实现GAD天然酶的纯化目的，从而获得GAD天然酶纯酶。
不同来源的GAD在结构上存在巨大差异，即使同属微生物，不同菌株的GAD的亚基组成和分子量等方面都具有巨大差异。例如，Escherichia coli GAD含有6个相同的亚基，分子量为53kDa(Biochemistry,1970,9(2):226-232)；肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)GAD与哺乳动物GAD65亚基分子量(54kDa)和序列相似(59％相似，28％一致)(FEMS Microbiol Lett,1995,133(1-2):113-138)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)GAD亚基的测定分子量约为33kDa，动力学性质与E.coli GAD相似(The Journal OfBiologicalChemistry,1991,266(8):5135-5139)；产气荚膜杆菌(Clostridiumperfringens)GAD分子量为290kDa(Biochem J,1970,118:135-141)；短乳杆菌(Lactobacillus brevis)GAD有两个亚基，亚基分子量为60kDa(Biosci Biotech Biochem,1997,61(7):1168-1171)；乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的GAD只有一个亚基，亚基分子量大约为54kDa(Microbiology,1999,145:1375-1380)，然而虽然乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)SYFS1.009的GAD同样也只有一个亚基，但是亚基分子量为65kDa(许建军，博士学位论文，江南大学，2004年2月)，说明即使同种微生物的不同亚种的GAD之间也存在一定差异。因此，现已报道的利用CBM作为亲和标签固定化微生物酶的方法并不一定适合屎肠球菌GAD，需要针对特定微生物的特定酶开展研究，探讨适宜的方法。
由上分析可见，虽然在理论上利用CBM与纤维素特异的、不可逆的结合特性，通过构建和表达带CBM标签的融合蛋白的途径实现CBM-融合蛋白的分离，但是在实践上尚存在诸多不可预判性：
(1)能否克隆到目的菌株的gadB基因？微生物gadB基因存在多样性，是否可以采用同种技术在不同的大肠杆菌表达***中表达？
(2)构建的CBM-GAD融合酶重组载体质粒是否科学可行？
(3)构建的CBM-GAD融合酶重组载体质粒在大肠杆菌表达***中能否高效表达CBM-GAD融合酶？
(4)CBM与GAD融合表达后，CBM是否会改变GAD的折叠结构、酶活力和酶学性质？
(5)利用纤维素与CBM-GAD融合酶亲和吸附后，如何将GAD天然酶与CBM和纤维素剪切分离，以期获取GAD天然酶？在CBM-GAD重组载体质粒构建方面应采取什么方法或措施？
(6)GAD天然酶与CBM和纤维素切离后，是否会发生重新折叠而失活？
由此可见，在技术的研发上仍需要根据具体的微生物GAD情况解决上述的关键问题。
在专利申请CN201710510283.8中，发明人已从泡菜中分离筛选到高GAD活力的Enterococcusfaecium LNSF2野生株，并对该菌株进行了专利菌种保藏，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCC NO.60203。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服野生株GAD天然酶分离纯化难度大、条件要求高、GAD天然酶回收率低、纯化倍数不高和纯化成本非常高以及现有GAD纯化方法不适用于工业化规模生产的问题，提供一株用于快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶的工程菌及纯化方法。
本发明通过以纤维素结合模块基因cbm3、内含肽基因dnaB、Enterococcusfaecium LNSF2的GAD基因gadB和自行构建的pRPOCDN表达载体共同构建能高效表达带纤维素结合模块(CBM)和内含肽(DnaB)的屎肠球菌GAD融合酶(CBM-DnaB-GAD)的工程菌，发酵培养制备CBM-DnaB-GAD，通过CBM与甲壳素(chitin，CHI)进行特异性亲和吸附，形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD不溶性固定化酶，以缓冲液洗涤去除粘附的杂蛋白，即可获得纯甲壳素-CBM-DnaB-GAD固定化酶，再利用DnaB的特性，采用自剪切液处理，将GAD剪切出来，通过过滤将GAD与固态甲壳素-CBM-DnaB分离，最终实现高效纯化，制备出屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
本发明的目的之一是提供一株可用于快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶的工程菌。
本发明的目的之二是提供一种构建上述工程菌的方法。
本发明的目的之三是提供上述工程菌在快速纯化屎肠球菌GAD天然酶或制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶中的应用。
本发明的目的之四是提供利用上述工程菌制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶的快速纯化方法。
本发明上述目的主要通过以下技术方案实现：
本发明以胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3、内含肽DnaB编码序列dnaB、Enterococcusfaecium LNSF2的GAD基因gadB和T7终止子序列重组构建pRPOCDN-efagadB重组质粒，转化E.coli DH5ɑ构建工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)，通过培养和收集已高效表达CBM-DnaB-GAD融合酶的Escherichia coli(DH5α-LNSF2)菌体，在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中于冰水浴下超声波破碎提取CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液，再与滤干的甲壳素混合进行亲和吸附形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD，收集并以磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分洗涤甲壳素-CBM-DnaB-GAD，然后加入自剪切缓冲液进行自剪切反应，滤出液即为屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
本发明中构建的pRPOCDN质粒中的启动子PrpoS(743bp)包含了RpoS转录调控***的5'-非翻译区，这个区域在细菌对胁迫条件的响应中起重要作用；启动子PrpoS不依赖于任何额外添加的诱导剂，能够有效地驱动外源蛋白在对数生长期的表达；使用不依赖于诱导剂的启动子驱动蛋白表达有利于降低成本；CBM是一种有效的蛋白质分离标签，能与甲壳素有特异性的吸附，在本发明中被用于重组蛋白的亲和吸附；DnaB是一种内含肽，可用于亲和标签的切除，从而获取屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
本发明提供了一种构建用于快速纯化屎肠球菌GAD天然酶的工程菌的方法，包括以下步骤：
S11.克隆Enterococcusfaecium LNSF2的GAD基因gadB，构建重组质粒pMD-efagadB；
S12.构建包含胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3、内含肽DnaB编码序列dnaB、T7终止子序列的pRPOCDN表达载体；
S13.以pMD-efagadB为模板扩增gadB基因，以pRPOCDN为模板扩增线性化的载体，构建重组质粒pRPOCDN-efagadB；
S14.将重组质粒pRPOCDN-efagadB转化大肠杆菌的感受态细胞，构建表达CBM-DnaB-GAD融合酶的工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)。
其中，CBM为纤维素结合模块，DnaB为内含肽，GAD为谷氨酸脱羧酶。
进一步地，在一个较佳地实施例中，所述大肠杆菌的感受态细胞为Escherichiacoli DH5ɑ感受态细胞，即以Escherichia coli DH5ɑ作为重组质粒pRPOCDN-efagadB的表达***。
所述工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCC No.60446，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)为：含有由胁迫诱导型启动子PrpoS、CBM编码序列cbm3、内含肽DnaB编码序列dnaB、Enterococcusfaecium LNSF2GAD的基因gadB和T7终止子序列重组构建而成的pRPOCDN-efagadB重组质粒。
所述pRPOCDN-efagadB重组质粒的总长度为5652bp，在gadB基因前***了纤维素结合模块基因cbm3、内含肽基因dnaB，融合基因全长为2409bp，融合酶全长802aa，理论分子量约为90867D；gadB基因自身长度为1401bp，氨基酸数目为466aa，理论分子量约为53710D；所述工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)可高效表达CBM-DnaB-GAD融合酶。
所述屎肠球菌野生株的菌株为Enterococcusfaecium LNSF2，分离筛选自泡菜，已于2017年6月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCC No.60203，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；该菌株作为GAD的基因gadB来源菌株。
作为一种较佳的实施方案，构建用于快速纯化屎肠球菌GAD天然酶的工程菌的方法，包括以下步骤：
S11.Enterococcusfaecium LNSF2的GAD基因gadB克隆：以efa-1、efa-2为引物，从Enterococcusfaecium LNSF2基因组中扩增获取gadB基因，纯化，与pMD19-T SimpleVector连接，构建重组质粒pMD-efagadB，转化，测序；
S12.大肠杆菌表达载体pRPOCDN构建：以pUC57质粒为基础进行构建pRPOCDN质粒，包含胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3、内含肽DnaB编码序列dnaB、T7终止子序列；
S13.重组质粒pRPOCDN-efagadB构建：以pRPOCDN为模板，设计引物Infu-22和Infu-27，扩增制备线性化载体pRPOCDN；设计引物Infu-13和Infu-24，以pMD-efagadB为模板扩增gadB基因，纯化；将线性化载体pRPOCDN与克隆获得的纯gadB基因进行组装成重组质粒pRPOCDN-efagadB；
S14.工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)构建：将重组质粒pRPOCDN-efagadB转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，构建表达CBM-DnaB-GAD融合酶的工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)；
其中，CBM为纤维素结合模块，DnaB为内含肽，GAD为谷氨酸脱羧酶。
相应地，所述工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)在快速纯化屎肠球菌GAD天然酶或制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶中的应用，也在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了使用上述工程菌快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶的方法，包括以下步骤：
S1.在冰水浴的条件下，于缓冲液中破碎Escherichia coli(DH5α-LNSF2)菌体，提取CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液；
S2.CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液与滤干的甲壳素混合并搅拌，发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD；
S3.洗涤甲壳素-CBM-DnaB-GAD，加入自剪切缓冲液剪切，过滤，得到的滤出液即为屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
所述CBM为纤维素结合模块，DnaB为内含肽，GAD为谷氨酸脱羧酶。
优选地，步骤S3所述自剪切缓冲液为含有NaCl和EDTA的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
优选地，步骤S3所述自剪切缓冲液的浓度为0.2～0.3mol/L。
更优选地，步骤S3所述自剪切缓冲液的浓度为0.2mol/L。
优选地，步骤S3所述自剪切缓冲液的pH为5.5～6.5。
更优选地，步骤S3所述自剪切缓冲液的pH为6.5。
优选地，所述NaCl的终浓度为0.4～0.6mol/L。
更优选地，所述NaCl的终浓度为0.5mol/L。
优选地，所述EDTA的终浓度为0.5～3mmol/L。
更优选地，所述EDTA的终浓度为1mmol/L。
优选地，步骤S3所述剪切的温度为20～32℃。
更优选地，步骤S3所述剪切的温度为30℃。
优选地，步骤S3所述剪切的时间为6～15h。
更优选地，步骤S3所述剪切的时间12h。
优选地，步骤S2所述甲壳素为未改性、经浓磷酸改性或经NaOH/尿素混合溶液改性的甲壳素。
更优选地，步骤S2所述甲壳素为经浓磷酸改性的甲壳素。
所述经浓磷酸改性的甲壳素的改性方法为：在甲壳素中边搅拌边缓慢加入冰冷浓磷酸，冰浴，搅拌至透明状，再边搅拌边加入冰水，离心，收集甲壳素沉淀，采用冰水洗涤后再重悬于蒸馏水中，然后用Na2CO3溶液调节pH至6～7，抽滤除去液体，再以蒸馏水充分洗涤甲壳素，即可得到经浓磷酸改性的甲壳素。
所述经NaOH/尿素混合溶液改性甲壳素的改性方法为：将甲壳素与NaOH/尿素混合溶液混合，重复冻融至甲壳素成透明状，边搅拌边加入冰水，离心，收集甲壳素沉淀，用冰水洗涤后重悬于蒸馏水中，然后用HCl溶液调节pH至6～7，抽滤除去液体，再以蒸馏水充分洗涤甲壳素，即可得到经NaOH/尿素混合溶液改性的甲壳素。
优选地，步骤S1所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
更优选地，步骤S1所述缓冲液的浓度为10～100mmol/L。
更进一步优选地，步骤S1所述缓冲液的浓度为20mmol/L。经过磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的浓度对CBM-DnaB-GAD融合酶粗提液提取、以及CBM-DnaB-GAD融合酶与甲壳素亲和吸附能力的影响研究，发现磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浓度为20mmol/L，离子强度低，提取的融合酶对甲壳素的亲和吸附力比采用Tris-HCl缓冲液更优。
更优选地，步骤S1所述缓冲液的pH为8。
优选地，步骤S1所述破碎的方法为：在冰水浴中超声波破碎。
优选地，步骤S2所述CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液体积(mL)与所述滤干的甲壳素质量(g)的比例为4︰1。
利用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液提取和自剪切液缓冲液，成本低、安全性高，克服了Tris-HCl缓冲液的缺点。
另外，作为一种较佳的实施方案，使用上述工程菌快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶的方法，包括以下步骤：
S1.CBM-DnaB-GAD融合酶的表达：将Escherichia coli(DH5α-LNSF2)接入LB培养基中，并置于振荡培养箱中培养，高效表达CBM-DnaB-GAD融合酶；
S2.提取CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液：将用LB培养基发酵的发酵液离心收集菌体，搅拌分散洗涤菌体，再次离心收集菌体，按照湿菌体重量(g)与缓冲液体积(mL)比例为1︰15加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，在冰水浴的条件下超声波破碎细胞，离心，取上清液，即为CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液；
S3.形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD：将甲壳素以水浸泡，离心或过滤去除残余水分，将CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液体积(mL)与滤干的甲壳素质量(g)的比例为4︰1的比例混合，间歇搅拌，使CBM-DnaB-GAD融合酶与甲壳素充分发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD，离心或过滤，收集甲壳素-CBM-DnaB-GAD；
S4.获得屎肠球菌GAD天然酶纯酶：以磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分洗涤甲壳素-CBM-DnaB-GAD，然后加入自剪切缓冲液进行剪切，过滤，得到的滤出液即为屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明构建的Escherichia coli(DH5α-LNSF2)以具高GAD活力的野生株Enterococcusfaecium LNSF2的优良gadB基因为基础，并采用的启动子PrpoS包含RpoS转录调控***的5’-非翻译区，不依赖于任何额外添加的诱导剂，能够有效地驱动外源蛋白在对数生长期的表达，CBM-DnaB-GAD融合酶表达量高，GAD活力强，培养基发酵表达的CBM-DnaB-GAD的GAD活力达到了(6041.82±354.71)IU/L，可显著降低CBM-DnaB-GAD融合酶的生产成本。
(2)本发明所用甲壳素不需要改性也可与CBM-DnaB-GAD融合酶发生特异结合，液体流动性好，克服了纤维素需要改性和应用时液体流动性差的缺陷，简化了纯化工艺；甲壳素与纤维素的化学结构存在较大差异，然而本发明发现CBM可与甲壳素发生特异性结合，亲和力显著强于纤维素。
(3)本发明的工程菌构建设计科学合理，有机结合了CBM对甲壳素的强特异亲和性质和内含肽DnaB的自剪切功能，只需采用甲壳素一步亲和层析即可特异性地分离出CBM-DnaB-GAD，形成不溶性甲壳素-CBM-DnaB-GAD，再在自剪切液作用下进行自剪切切离GAD，GAD天然酶可溶于自剪切液，与不溶性甲壳素-CBM-DnaB进行简单的固液分离，即可获得屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
(4)本发明制备得到的屎肠球菌GAD天然酶纯度达到了电泳纯，且相对分子量与理论分子量基本一致，解决了不能切除CBM-融合酶的CBM标签而获取GAD天然酶的关键技术问题；另外，纯化工艺简单，纯化效率高，成本大大降低，可应用于工业化生产屎肠球菌GAD天然酶纯酶，解决了GAD纯酶生产难、成本高居不下的问题。
附图说明
图1是屎肠球菌GAD天然酶纯化的设计路线示意图；其中，1：甲壳素，2：纤维素结合模块，3：内含肽，4：GAD，5：自剪切。
图2是PCR扩增Enterococcusfaecium LNSF2的GAD基因gadB的电泳图；其中，泳道M为DNA分子量标准Marker，泳道1为PCR扩增获得的Enterococcus faecium LNSF2的GAD基因gadB。
图3是重组质粒pRPOCDN-efagadB的结构示意图。
图4是不同缓冲液对CBM-DnaB-GAD融合酶粗提液提取、以及CBM-DnaB-GAD融合酶与甲壳素亲和吸附能力的影响；其中，PBS表示磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，Tris-HCl表示三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液。
图5是快速纯化制备得到的屎肠球菌GAD天然酶经SDS-PAGE电泳的电泳图谱；其中，泳道1为标准蛋白质分子量，泳道2为CBM-DnaB-GAD粗酶液，泳道3和泳道4为屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
图6是SDS-PAG电泳中标准蛋白质和屎肠球菌GAD天然酶纯酶条带的相对迁移距离与蛋白质分子量的线性关系图；其中，lg Mr表示蛋白质分子量的常用对数，GAD表示屎肠球菌GAD天然酶；y＝-0.0104x+2.0752为线性曲线的线性方程；R2＝0.9929为线性方程的相关性系数。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，所用试剂和材料均为市购。
本发明实施方式的基本路线是：以野生株Enterococcusfaecium LNSF2为GAD基因gadB的供体，将纤维素结合模块基因cbm3、内含肽基因dnaB、gadB基因和自行构建的pRPOCDN表达载体进行重组构建pRPOCDN-efagadB重组质粒，转化E.coli DH5ɑ构建工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)，培养表达CBM-DnaB-GAD融合酶，再用甲壳素对CBM-DnaB-GAD融合酶特异性亲和吸附，然后采用自剪切缓冲液处理，使DnaB发生自剪切而切除GAD，从而获得屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
基于发明实施方式的基本路线，设计的一株用于快速纯化制备屎肠球菌谷氨酸脱羧酶天然酶纯酶的工程菌及纯化方法的发明路线示意图如图1所示。
在发明研究中，经对Enterococcusfaecium GDMCC No.60203的GAD基因gadB进行PCR扩增，获得的gadB电泳图如图2，从图2可见，gadB基因大小约为1.4kb，经测序gadB基因长度为1401bp，其核苷酸序列见SEQ ID NO：7；构建的重组质粒pRPOCDN-efagadB的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，结构示意图如图3所示；以重组质粒pRPOCDN-efagadB转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，构建出可高效表达CBM-DnaB-GAD融合酶的工程菌Escherichiacoli(DH5α-LNSF2)，LB培养基发酵表达的CBM-DnaB-GAD的GAD活力达到了(6041.82±354.71)IU/L。工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)的构建方法详见实施例1。
在发明研究中，经分别采用50mmol/LTris-HCl缓冲液、100mmol/LPBS缓冲液、20mmol/L PBS缓冲液、10mmol/L PBS缓冲液作为CBM-DnaB-GAD融合酶提取液，经与甲壳素亲和吸附、充分洗涤后测定酶活力，结果如图4，图4表明各缓冲液提取的CBM-DnaB-GAD融合酶在一定程度上均能与甲壳素发生亲和吸附，其中20mmol/L PBS缓冲液效果最佳，CBM-DnaB-GAD融合酶与甲壳素亲和吸附量最多，GAD活力最大；以20mmol/LPBS缓冲液提取制备的甲壳素-CBM-DnaB-GAD的活力作为100％，50mmol/LTris-HCl缓冲液、100mmol/L PBS缓冲液和10mmol/LPBS缓冲液作为CBM-DnaB-GAD融合酶提取液制备的甲壳素-CBM-DnaB-GAD的相对酶活分别为(78.07±6.3)％、(86.84±1.82)％和(86.08±7.72)％。
按照下述实施例2～实施例4所述步骤对工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)表达的屎肠球菌GAD天然酶进行纯化制备，经SDS-PAGE电泳检验，结果如图5。从图5可见，纯化前的CBM-DnaB-GAD粗酶液蛋白质种类多，而经过甲壳素亲和纯化和自剪切制备的屎肠球菌GAD天然酶在电泳图谱中只呈现单一条带，结果表明制备的屎肠球菌GAD天然酶纯酶的纯度达到了电泳纯。进一步，采用标准蛋白质和屎肠球菌GAD天然酶纯酶在SDS-PAGE电泳中的相对迁移率与蛋白质相对分子量的对数进行制作标准曲线，结果如图6，根据图6的线性方程和GAD相对迁移率进行计算，GAD相对分子量为55.68kDa，与GAD理论分子量53.71kDa基本一致，结果说明所制备纯酶为屎肠球菌GAD天然酶。
具体实施方式示例如下：
实施例1工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)的构建
S11.将Enterococcusfaecium LNSF2接入PSB或MRS培养基，于37℃静置培养12h，取培养液5mL以8500r/min离心，收集菌体沉淀，弃上清，按照康为世纪细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA，置于-20℃保存备用；设计efa-1和efa-2引物，引物efa-1和efa-2生物序列如表1所示，委托生工生物工程(上海)有限公司合成；以efa-1、efa-2为引物，以Enterococcusfaecium LNSF2基因组DNA为模板，使用全式金TransStart FastPfu DNA聚合酶进行PCR反应；
PCR反应条件为：95℃2min；95℃20s，50℃30s，72℃55s，循环33次；72℃5min；
PCR反应结束后，按100μL体积加入1μL Taq DNAPolymerase，72℃反应30min，PCR产物的电泳结果如图2所示，可以看出，其产物的长度为1401bp，即gadB基因自身长度为1401bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；然后用纯化试剂盒直接纯化gadB基因，将该基因与pMD19-T Simple Vector连接过夜，构建重组质粒pMD-efagadB，转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
S12.设计胁迫诱导型启动子PrpoS、cbm3(源自Clostridium thermocellum的家族3纤维素结合域)编码序列、内含肽DnaB编码序列dnaB、T7终止子序列，委托金斯瑞生物科技有限公司合成；将pUC57质粒先以NdeⅠ/HindⅡ酶切，然后将PrpoS、cbm3、dnaB、T7***pUC57质粒拼接构建大肠杆菌质粒pRPOCDN；其中，pUC57质粒、胁迫诱导型启动子PrpoS、CBM编码序列cbm3、内含肽DnaB编码序列dnaB和T7终止子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8～SEQID NO：12所示。
S13.设计和委托生工生物工程(上海)有限公司合成引物Infu-22和Infu-27，引物Infu-22和Infu-27的核苷酸序列如表1所示，以pRPOCDN为模板，使用全式金TransStartFastPfu DNA聚合酶进行PCR反应；
PCR反应条件为：95℃2min；95℃20s，54℃30s，72℃1min 45s，循环33次，72℃5min；
PCR反应结束后，电泳切胶，用DNA胶回收试剂盒回收线性化载体pRPOCDN，切下DNA条带，回收纯化目的片段；设计和委托生工生物工程(上海)有限公司合成引物Infu-13和Infu-24，引物Infu-13和Infu-24的核苷酸序列如表1所示，以pMD-efagadB为模板扩增gadB基因，电泳切胶，回收纯化gadB基因；纯化后，将gadB基因与线性化载体pRPOCDN用In-Fusion HD Cloning Kit基因克隆试剂盒将其拼接起来，反应体系为In-fusion酶2μL、gadB基因1μL、线性化载体2μL、ddH2O 5μL，总计10μL，离心30s，50℃连接15min，组装成重组质粒pRPOCDN-efagadB，重组质粒pRPOCDN-efagadB的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，结构示意图如图3所示。
S14.将重组质粒pRPOCDN-efagadB转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，构建出可高效表达CBM-DnaB-GAD融合酶的工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)。
表1构建工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF2)所用的引物
步骤S11所述PSB培养基组成为：蛋白胨15g/L、牛肉膏10g/L、蔗糖12.5g/L、乙酸钠6.0g/L、L-谷氨酸一钠10g/L、吐温801.0g/L，pH 6.8～7.0；
步骤S11所述MRS培养基组成为：蛋白胨15g/L、牛肉膏12.5g/L、蔗糖12.5g/L、柠檬酸二铵2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、K2HPO42.0g/L、CaCl22.0g/L、Tween801.0mL/L、pH 6.8～7.0。
实施例2快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶
S1.将实施例1构建得到的Escherichia coli(DH5α-LNSF2)接入LB培养基，于37℃、120r/min振荡培养24h，高效表达CBM-DnaB-GAD融合酶。
S2.将Escherichia coli(DH5α-LNSF2)发酵液于4℃、8500r/m离心10min，收集菌体，加入生理盐水，搅拌分散洗涤菌体，再次离心收集菌体，按照湿菌体重量(g)与缓冲液体积(mL)比例为1︰15加入pH 8.0、20mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，冰水浴中400W超声波破碎细胞(工作5s，冷却5s，全程50min)，将细胞破碎液于8500r/min、4℃离心15min，取上清液，即为CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液。
S3.将甲壳素以水浸泡12h，离心或过滤去除残余水分，将CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液体积(mL)与滤干的甲壳素质量(g)比例为4︰1混合15min，间歇搅拌，使CBM-DnaB-GAD融合酶与甲壳素充分发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD，离心或过滤收集甲壳素-CBM-DnaB-GAD，以甲壳素质量的6倍的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)分5次洗涤甲壳素-CBM-DnaB-GAD，然后加入甲壳素质量的3倍的自剪切缓冲液，30℃、100r/min条件下剪切12h，滤出酶液，即可获得屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
其中，步骤S1所述LB培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，L-谷氨酸一钠10g/L，pH 6.0；分装于规格250mL三角瓶，每瓶120mL，121℃灭菌20min；冷却后临用前，加入240μL 50mg/mL氨苄青霉素，摇匀；
步骤S3所述自剪切缓冲液组成为含有NaCl终浓度为0.5mol/L、EDTA终浓度为1mmol/L的pH 6.5、0.2mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
实施例3快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶
本实施例按照实施例2快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶的过程，步骤S1～S2相同，步骤S3～S4如下：
S3.将甲壳素与甲壳素质量3倍的蒸馏水充分混合制备成甲壳素浆，边搅拌边缓慢加入甲壳素质量50倍的冰冷浓磷酸(>85％)，混合至透明状态，冰浴1h(不时搅动)，再边搅拌边缓慢加入甲壳素质量300倍的冰水(避免甲壳素出现成块)，4℃、8500r/min离心15min，去上清，收集甲壳素沉淀，重复4次，以除去磷酸，在甲壳素沉淀中加入甲壳素质量200倍的蒸馏水，采用2mol/L Na2CO3溶液调节pH至6～7，中和残余的磷酸，搅拌混匀，抽滤除去液体，然后用甲壳素质量300倍的蒸馏水分3次清洗甲壳素，制备出改性甲壳素。
S4.将CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液体积(mL)与滤干的改性甲壳素质量(g)比例为4︰1的比例混合15min，间歇搅拌，使CBM-DnaB-GAD融合酶与甲壳素充分发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD，离心或过滤收集甲壳素-CBM-DnaB-GAD，以甲壳素质量的6倍的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)分5次洗涤甲壳素-CBM-DnaB-GAD，然后加入甲壳素质量的3倍的自剪切缓冲液，30℃、100r/min条件下剪切12h，滤出酶液，即可获得屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
步骤S4所述自剪切缓冲液组成为含有NaCl终浓度为0.5mol/L、EDTA终浓度为1mmol/L的pH 6.5、0.2mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
实施例4快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶
本实施例按照实施例2快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶的过程，步骤S1～S2相同，步骤S3～S4如下：
S3.将甲壳素与甲壳素质量25倍的NaOH/尿素混合溶液混匀，-30℃冷冻4h，室温解冻并快速搅拌，然后再于-30℃冷冻4h，室温解冻并快速搅拌，重复冻融，直至甲壳素溶解成透明状，再边搅拌边缓慢加入甲壳素质量300倍的冰水(避免甲壳素出现成块)，4℃、8500r/min离心15min，去上清，收集甲壳素沉淀，重复洗涤4次，以除去NaOH和尿素，在甲壳素沉淀中加入甲壳素质量200倍的蒸馏水，采用1mol/L HCl溶液调节pH至6～7，中和残余的NaOH，搅拌混匀，抽滤除去液体，然后用甲壳素质量300倍的蒸馏水分3次清洗甲壳素，制备出改性甲壳素。
S4.将CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液体积(mL)与滤干的改性甲壳素质量(g)比例为4︰1混合15min，间歇搅拌，使CBM-DnaB-GAD融合酶与甲壳素充分发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD，离心或过滤收集甲壳素-CBM-DnaB-GAD，以甲壳素质量的6倍的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)分5次洗涤甲壳素-CBM-DnaB-GAD，然后加入甲壳素质量的3倍的自剪切缓冲液，30℃、100r/min条件下剪切12h，滤出酶液，即可获得屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
其中，步骤S4所述自剪切缓冲液组成为含有NaCl终浓度为0.5mol/L、EDTA终浓度为1mmol/L的pH 6.5、0.2mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 岭南师范学院
<120> 一株用于快速纯化制备屎肠球菌谷氨酸脱羧酶天然酶纯酶的工程菌及纯化方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttatacg gaaaagataa tcaag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttagtgagta aagccgtacg ttttc 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaattcctcg agggctcttc cag 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatcccggt tctttacccc aaacc 25
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtttggggta aagaaccggg atccatgtta tacggaaaag ataatcaaga ag 52
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccctcgagg aattcttagt gagtaaagcc gtacgttttc ac 42
<210> 7
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgttatacg gaaaagataa tcaagaagaa aaaaactatt tggaaccaat ttttggctct 60
gcaagtgagg atgttgactt gcctaaatat aagttaaaca aagaatccat tgaaccacga 120
attgcttatc aattagtaca agacgagatg ttggatgaag gaaatgcgcg attaaactta 180
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tgggattttc aattgaaaaa tgttatctca attaattctt caggtcacaa atatggtttg 840
gtatatccag gtgtgggttg ggtcttatgg cgtgaccaac aatacttacc agaagaatta 900
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acgtacggct ttactcacta a 1401
<210> 8
<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1800
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ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1920
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1980
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2040
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2160
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tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2280
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2340
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tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2580
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2640
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700
ccctttcgtc 2710
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<211> 743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccatacgcgc tgaacgttgg tcagaccttg caggtgggta atgcttccgg tacgccaatc 60
actggcggaa atgccattac ccaggccgac gcagcagagc aaggagttgt gatcaagcct 120
gcacaaaatt ccaccgttgc tgttgcgtcg caaccgacaa ttacgtattc tgagtcttcg 180
ggtgaacaga gtgctaacaa aatgttgccg aacaacaagc caactgcgac cacggtcaca 240
gcgcctgtaa cggtaccaac agcaagcaca accgagccga ctgtcagcag tacatcaacc 300
agtacgccta tctccacctg gcgctggccg actgagggca aagtgatcga aacctttggc 360
gcttctgagg ggggcaacaa ggggattgat atcgcaggca gcaaaggaca ggcaattatc 420
gcgaccgcag atggccgcgt tgtttatgct ggtaacgcgc tgcgcggcta cggtaatctg 480
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gtccgggaac aacaagaagt taaggcgggg caaaaaatag cgaccatggg tagcaccgga 600
accagttcaa cacgcttgca ttttgaaatt cgttacaagg ggaaatccgt aaacccgctg 660
cgttatttgc cgcagcgata aatcggcgga accaggcttt tgcttgaatg ttccgtcaag 720
ggatcacggg taggagccac ctt 743
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<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgccggtgt ctggcaacct gaaagtggaa ttttacaaca gcaatccgag cgatacgacc 60
aatagcatca acccgcagtt taaagtgacc aacacgggta gctctgcaat tgatctgtct 120
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tttaccggcg gtacgctgga accgggtgca cacgtccaga tccaaggccg tttcgctaaa 360
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<212> DNA
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<400> 11
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gtattttgta ctggcaaaaa gctagtttat attctaaaaa ctcgactagg tagaactatc 240
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tctttaaaag agcatattgc tctaccccgt aaactagaaa gctcctcttt acaattgtca 360
ccagaaatag aaaagttgtc tcagagtgat atttactggg actccatcgt ttctattacg 420
gagactggag tcgaagaggt ttttgatttg actgtgccag gaccacataa ctttgtcgcg 480
aatgacatca ttgtacacaa cggaagagcc atgggcggcc gc 522
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<212> DNA
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<400> 12
ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg 39
<210> 13
<211> 5652
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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caacggaaga gccatgggcg gccgcatgtt atacggaaaa gataatcaag aagaaaaaaa 1980
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taatgaaaaa ttcatgggaa cttcaacgat cggctcttca gaagcctgca tgctgggtgg 2340
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aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 5580
ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 5640
ggccctttcg tc 5652
Claims (10)
1.一株用于快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶的工程菌，其特征在于，所述工程菌为Escherichia coli（DH5α-LNSF2），该工程菌于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCC No.60446。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为：含有由胁迫诱导型启动子PrpoS、CBM编码序列cbm3、内含肽DnaB编码序列dnaB、Enterococcus faecium LNSF2的GAD基因gadB和T7终止子序列重组构建而成的pRPOCDN-efagadB重组质粒。
3.一种构建权利要求1或2所述工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11. 克隆Enterococcus faecium LNSF2的GAD基因gadB，构建重组质粒pMD-efagadB；
S12. 构建包含胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3、内含肽DnaB编码序列dnaB、T7终止子序列的pRPOCDN表达载体；
S13. 以pMD-efagadB为模板扩增gadB基因，以pRPOCDN为模板扩增线性化的载体，构建重组质粒pRPOCDN -efagadB；
S14. 将重组质粒pRPOCDN-efagadB转化大肠杆菌的感受态细胞，构建表达CBM-DnaB-GAD融合酶的工程菌Escherichia coli（DH5α-LNSF2）；
其中，CBM为纤维素结合模块，DnaB为内含肽，GAD为谷氨酸脱羧酶。
4.权利要求1或2所述工程菌Escherichia coli（DH5α-LNSF2）在制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶中的应用。
5.一种使用权利要求1或2所述工程菌快速纯化制备屎肠球菌GAD天然酶纯酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 在冰水浴的条件下，于缓冲液中破碎Escherichia coli（DH5α-LNSF2）菌体，提取CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液；
S2. 将CBM-DnaB-GAD融合酶粗酶液与滤干的甲壳素混合并搅拌，发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-DnaB-GAD；
S3. 洗涤甲壳素-CBM-DnaB-GAD，加入自剪切缓冲液进行剪切，过滤，得到的滤出液即为屎肠球菌GAD天然酶纯酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2所述甲壳素为未改性、或经浓磷酸改性、或经NaOH/尿素混合溶液改性的甲壳素。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3所述自剪切缓冲液为含有NaCl和EDTA的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，NaCl的终浓度为0.5～0.7 mol/L，EDTA的终浓度为0.5～3 mmol/L。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3所述剪切的温度为20～32 ℃，时间为6～15 h。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3所述自剪切缓冲液的浓度为0.2～0.3 mol/L，pH 5.5～6.5；优选地，步骤S1所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；进一步优选地，步骤S1所述缓冲液的浓度为10～100 mmol/L。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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