KR20170077238A - Rna-유도 엔도뉴클레아제의 세포 내로의 펩티드 매개성 전달 - Google Patents

Rna-유도 엔도뉴클레아제의 세포 내로의 펩티드 매개성 전달 Download PDF

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Abstract

RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 이때, RGEN 단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결된 것인 조성물이 개시된다. 이러한 RGEN 단백질-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있다. 특정 구현예에서 RGEN 단백질-CPP 복합체의 RGEN 단백질 성분은 적합한 RNA 성분과 결합하여 특이적인 DNA 표적화를 할 수 있는 RGEN을 제공할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 CPP를 포함하는 조성물뿐만 아니라, RGEN 단백질을 미생물 세포 내로 전달하는 방법에 더하여, RGEN으로 DNA를 표적화하는 방법도 추가로 개시된다.

Description

RNA-유도 엔도뉴클레아제의 세포 내로의 펩티드 매개성 전달{PEPTIDE-MEDIATED DELIVERY OF RNA-GUIDED ENDONUCLEASE INTO CELLS}
본 출원은 전체가 참조로써 본원에 포함되는, 2014년 11월 6일 제출된 미국 가출원 번호 62/075999의 이익을 주장한다.
본 발명은 분자 생물학 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 세포 침투성 펩티드를 이용한 RNA-유도 엔도뉴클레아제의 단백질 성분들의 세포 내로의 전달에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 서열 목록의 공식 사본은 2015년 10월 13일 작성되고 크기가 384 킬로바이트이며 본 명세서와 동시에 제출된, 파일명 20151013_CL6273PCT_SequenceListing_ST25.txt의 ASCII 형식의 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되었다. 이러한 ASCII 형식의 서류에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다.
유기체 내에서 유전자의 기능을 이해하는 한 가지 방법은 이의 발현을 억제하는 것이다. 유전자 발현의 억제는, 예를 들어, 유전자의 "녹아웃"을 유발하는 유전자의 DNA 서열을 중단시키거나 결실시켜 달성될 수 있다 (Austin et al., Nat. Genetics 36:921-924). 유전자 녹아웃은 대부분 박테리아에서 포유동물까지의 다양한 유기체 전반에 걸쳐 적용할 수 있는 기법인 상동 재조합(HR)을 통해 수행되어 왔다. 유전자 기능을 연구하기 위한 또 다른 방법은 유전자 "녹인(knock-in)"을 통한 것일 수 있으며, 이것도 대개 HR에 의해서 수행된다. 유전자 표적화(녹아웃 또는 녹인)를 위한 HR은 표적 부위("공여 DNA")와 상동성을 갖는, 외인성으로 공급된 DNA의 존재를 사용할 수 있다.
표적화된 DNA 부위가 이중 가닥 절단을 함유하는 경우, 유전자 표적화를 위한 HR이 증진되는 것으로 밝혀진 바 있다(Rudin et al., Genetics 122:519-534; Smih et al., Nucl . Acids Res. 23:5012-5019). 따라서, HR-매개성 DNA 표적화를 촉진하기 위해 이중 가닥 절단을 도입하기 위한 전략이 개발되어 왔다. 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제는 공여 DNA가 존재하는 경우 특정 부위에서 HR의 수준을 향상시키는 특정 DNA 부위를 절단하도록 유전자 조작되어 왔다(Bibikova et al., Science 300:764; Bibikova et al., Mol . Cell. Biol . 21:289-297). 유사하게, 인공 메가뉴클레아제(호밍(homing) 엔도뉴클레아제) 및 전사 활성인자-유사 이펙터 (TALE) 뉴클레아제도 HR-매개성 DNA 표적화에 사용하기 위해 개발되어 왔다(Epinat et al., Nucleic Acids Res. 31: 2952-2962; Miller et al., Nat. Biotech. 29:143-148).
크리스퍼(CRISPR; 규칙적으로 사이 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열) DNA 절단 시스템을 암호화하는 유전자좌는 약 40%의 박테리아 게놈과 대부분의 고세균 게놈에서만 발견되어 왔다(Horvath 및 Barrangou, Science 327:167-170; Karginov 및 Hannon, Mol . Cell 37:7-19). 특히, II형 CRIPSR 시스템의 크리스퍼-결합(Cas) RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)인 Cas9는 공여 DNA로 HR을 자극하는 부위 특이적 DNA 가닥 절단을 도입하기 위한 수단으로서 개발되어 왔다(2013년 8월 22일 제출된, 미국 가출원 번호 61/868,706). Cas9의 RNA 성분의 서열은 Cas9가 (i) RNA 성분의 일부에 상보적인 서열 및 (ii) 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 함유하는 DNA를 인식하고 절단하도록 설계될 수 있다.
고유 Cas9/RNA 복합체는 크리스퍼 RNA(crRNA)와 트랜스-활성화 크리스퍼 RNA(tracrRNA)의 두 가지의 RNA 서열을 포함한다. crRNA는 5'에서 3' 방향으로, 표적 DNA 부위, 및 crRNA가 유래된 크리스퍼 유전자좌의 반복 영역에 의해 암호화되는 서열의 일부에 상보적인 특유의 서열을 함유한다. tracrRNA는 5'에서 3' 방향으로 crRNA의 반복 영역과 어닐링하는 서열 및 스템 루프(stem loop)를 함유하는 부분을 함유한다. 최근 연구는 tracrRNA에 연결된 crRNA를 5'에서 3' 방향으로 함유하는 키메라 서열인 가이드 RNA(gRNA)의 개발로 이어졌다(2013년 8월 22일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/868,706).
세포에서 Cas9-매개성 DNA 표적화를 수행하기 위한 단백질 및 RNA 성분들은 재조합 DNA 발현 전략을 통하여 일부 연구에서 제공된 바 있다. 예를 들어, 핵산 기반의 발현 시스템을 이용하는 세포에서 Cas9 단백질이 발현된 바 있다. 특정 세포 유형에서 gRNA와 같은 RNA 성분들을 발현하는 방법은, 정확하게 한정되고, 개질되지 않은 5'- 및 3'-말단을 갖는 RNA의 전사를 가능하게 하는 RNA 폴리머라제 III(Pol III) 프로모터를 사용하는 것을 포함하고 있었다(DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 41: 4336-4343; Ma et al., Mol . Ther . Nucleic Acids 3:e161). 이러한 단백질 및 RNA 발현 기법은 옥수수와 대두(2013년 8월 22일 제출된 미국 가출원 번호 61/868,706) 뿐만 아니라 인간, 마우스, 제브라피쉬, 트리코데르마(Trichoderma) 및 사카로마이세스 세레비시아를 비롯한 여러 상이한 종의 세포에서 적용되어 왔다.
이러한 진전에도 불구하고, Cas9-매개성 DNA 표적화를 매개하기 위하여, 미생물 세포와 같은 세포 내에 단백질 및 RNA 성분들을 제공하는 기타 수단은 관심의 대상이 된다.
일 구현예에서, 본 발명은 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 이때, 이러한 단백질 성분 및 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결되어 있으며, 이러한 RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는 것인, 조성물에 관한 것이다.
제2의 구현예에서, RGEN의 이러한 단백질 성분은 미생물 세포의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 성분과 결합되며, 이때, 이러한 RGEN은 표적 부위 서열에 결합할 수 있고, 선택적으로 이러한 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있다. 제3의 구현예에서, 이러한 RNA 성분은 트랜스-활성화 크리스퍼 RNA(tracrRNA)에 작동 가능하게 연결된 크리스퍼 RNA(crRNA)를 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 제4의 구현예에서, 이러한 RGEN은 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있다.
제5의 구현예에서, 이러한 RGEN은 크리스퍼-결합(Cas) 단백질-9(Cas9) 아미노산 서열을 포함한다.
제6의 구현예에서, 이러한 RGEN 단백질 성분과 CPP는 공유적으로 연결된다.
제7의 구현예에서, 이러한 RGEN 단백질 성분과 CPP는 비 공유적으로 연결된다.
제8의 구현예에서, CPP는 양이온성 또는 양친매성이다.
제9의 구현예에서, CPP는 (i) 엡스타인 바 바이러스 제브라(Zebra) 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 CPP, (ii) 6개 이상의 인접한 아르기닌 잔기를 가진 CPP, (iii) 트랜스포탄-10(TP10) CPP, 또는 (iv) 혈관 내피 카데린 단백질로부터의 CPP를 포함한다.
제10의 구현예에서, RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있다.
제11의 구현예는 본원에 개시된 조성물을 포함하는 미생물 세포에 관한 것이다.
제12의 구현예는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분을 미생물 세포 내로 전달하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 미생물 세포를 RGEN 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 이때, 이러한 RGEN 단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결된다. 이러한 접촉 단계의 결과로 RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로질러, 미생물 세포 내로 들어갈 수 있다.
제13의 구현예에서는, 이러한 방법과 관련하여, (i) 이러한 조성물이 RGEN의 단백질 성분과 결합된 적어도 하나의 RNA 성분을 더 포함하거나, (ii) 미생물 세포가 이러한 RNA 성분을 포함하는데, 이때, 이러한 RNA 성분은 RGEN 단백질-CPP 복합체가 미생물 세포로 들어간 후에 RGEN의 단백질 성분과 결합하며; 이때, (i) 또는 (ii)에서의 RNA 성분은 미생물 세포 내의 염색체 또는 에피솜의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 이때, 이러한 RGEN은 이러한 표적 부위 서열과 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있다. 제14의 구현예에서는, 이러한 RGEN은 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있다. 제15의 구현예에서, 이러한 미생물 세포는 표적 부위 서열의 서열 또는 표적 부위 서열 근처의 서열과 상동인 적어도 하나의 서열을 포함하는 공여 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는데, 이때, 이러한 공여 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 서열에서 또는 표적 부위 서열 근처에서 상동 재조합에 의해 통합된다.
제16의 구현예는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것으로, 이때, 선택적으로, 이러한 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된다.
제17의 구현예는 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 (a) RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 이때, 선택적으로, 이러한 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결되는 것인 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 것; (b) 이러한 폴리뉴클레오티드 서열로부터 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 발현시켜, RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 생산하는 것으로, 이때, 이러한 발현은 선택적으로 미생물 세포에서 이루어지는 것; 및 (c) 선택적으로, (b) 단계에서 생산된 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 분리하는 것을 포함한다.
제18의 구현예는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 이때, 이러한 단백질 성분 및 CPP는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되는 것인 조성물로, 이때, 이러한 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는 것인 조성물에 관한 것이다.
제19의 구현예는 미생물 세포의 게놈에서 표적 부위를 변경하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 가이드 폴리뉴클레오티드, 세포 침투성 펩티드(CPP) 및 Cas 엔도뉴클레아제를 미생물 세포에 제공하는 것을 포함하며, 이때, 가이드 폴리뉴클레오티드, Cas 엔도뉴클레아제 및 CPP는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되며, 이때, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있다.
도 1: pZUFCas9 플라스미드(서열 번호 6)는 서열 번호 5에 기재된 야로위아 코돈 최적화된 Cas9 발현 카세트를 함유한다. 복제 기점(ARS 18, f1 ori, ColE1)은 십자 무늬로 표현되어 있고, 선택 가능한 마커(Ura3, Amp)는 회색으로 표현되어 있다. 실시예 1 참조.
도 2a: 대장균에서 이종 기원의 단백질을 발현하기 위한 pBAD/HisB 플라스미드(서열 번호 10). pBAD 프로모터는 흰색으로 표현되어 있다. 복제 기점은 십자 무늬로 표현되어 있다. 실시예 1 참조.
도 2b: 대장균에서 Cas9-NLS(도면상에는 "Cas9")를 발현하기 위한 pRF48 플라스미드(서열 번호 11). 복제 기점은 십자 무늬로 표현되어 있다. 실시예 1 참조.
도 3a: 대장균에서 6xHis-제브라 CPP-Cas9-NLS 융합체를 발현하기 위한 pRF144 플라스미드(서열 번호 20). 복제 기점은 십자 무늬로 표현되어 있다. 실시예 1 참조.
도 3b: 대장균에서 6xHis-PolyR CPP-Cas9-NLS 융합체를 발현하기 위한 pRF145 플라스미드(서열 번호 21). 복제 기점은 십자 무늬로 표현되어 있다. 실시예 1 참조.
도 3c: 대장균에서 6xHis-TP10 CPP-Cas9-NLS 융합체를 발현하기 위한 pRF146 플라스미드(서열 번호 22). 복제 기점은 십자 무늬로 표현되어 있다. 실시예 1 참조.
도 3d: 대장균에서 6xHis-pVEC CPP-Cas9-NLS 융합체를 발현하기 위한 pRF162 플라스미드(서열 번호 23). 복제 기점은 십자 무늬로 표현되어 있다. 실시예 1 참조.
도 4: 6xHis-제브라-Cas9-NLS의 정제 분획의 SDS-PAGE 분리. 용해물, 세척액, 용리 분획 및 분자량 표준이 표시되어 있다. 실시예 1 참조.
도 5: 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 같은 단일 가이드 폴리뉴클레오티드의 구조적 모형. 가변 표적화(VT) 도메인은 회색으로 표현되어 있다. Cas9 엔도뉴클레아제 인식(CER) 도메인은 검은색으로 도시하였다.
도 6: 플라스미드 pRF46(서열 번호 30)으로부터 유래된 주형에서의 off (Can1-1 유전자좌를 표적으로 하는) RGR sgRNA의 시험관 내 전사. 2, 4, 6 및 18시간 동안 배양했던 시험관 내 전사 반응은 비슷한 수준의 sgRNA를 생성하였다. 또한, 리보자임 자가촉매성 절단 생성물이 생성되었다. 실시예 2 참조.
도 7: Can1-1 표적부위에 대해 특이적인 sgRNA와 복합체를 이룬 제브라 CPP-Cas9를 이용한 시험관 내 절단 분석법. 이러한 Can1-1 표적 부위를 함유하는 DNA 폴리뉴클레오티드(982 bp)를 각 반응에 포함시켰다. 각 반응물을 1.2% 겔 상에서 전기영동적으로 분해하였다. "표적만", "sgRNA만", "제브라-Cas9만", 및 "제브라-Cas9만(2xFT)" (FT, 냉동-해동) 반응들은 표적 폴리뉴클레오티드를 절단하지 않았다. "제브라-Cas9/sgRNA", "제브라-Cas9/sgRNA(2xFT)", 및 "Cas9/sgRNA"(야생형 Cas9) 반응들은 그에 따른 절단 생성물로 표시된 바와 같이 소정의 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드를 절단하였다. 실시예 3 참조.
도 8: (sgRNA와 결합되지 않은) 제브라 CPP-Cas9 및 이의 야로위아 리폴리티카 세포와의 접촉 후의 제브라 CPP-Cas9/gRNA 복합체의 게놈 표적화 효율성 측정. 단독으로 사용된 제브라-Cas9의 최종 농도는 5 μM이었으나, sgRNA 복합체에서는 상이한 최종 농도(1~5 μM)의 제브라 CPP-Cas9이 사용되었다. 돌연변이 빈도는 카나바닌을 함유하는 배지로 옮겼을 때 카나바닌에 대한 저항성으로 점수를 매긴 (제브라 CPP-Cas9 또는 제브라 CPP-Cas9/gRNA와 세포를 접촉시킨 후 비 선택적인 배지에서 성장시킨) 효모 콜로니의 비율로서 보고하였다. 실시예 4 참조.
도 9: CPP-dsRED 정제의 PAGE 겔 분석의 예. 심플리 블루 염색약으로 염색한 12.5% PAGE 겔. 1번 레인: 분자량 표준물질, 2번 레인: 정제된 세포 추출물 tp10-dsREDexpress, 3번 레인: 비드 처리 후 정제된 세포 추출물 tp10-dsREDexpress, 4번 레인: 최종 단백질 용액 tp10-dsREDexpress, 5번 레인: 정제된 세포 추출물 MPG-dsREDexpress, 3번 레인: 비드 처리 후 정제된 세포 추출물 MPG-dsREDexpress, 4번 레인: 최종 단백질 용액 MPG-dsREDexpress.
핵산 및 단백질 서열 번호의 요약
설명 핵산
서열 번호		 단백질
서열 번호
스트렙토코커스 피오제네스 Cas9; Y. 리폴리티카에서 발현에 대해 코돈 최적화된 오픈 리딩 프레임 1
(4107개의 염기)
C 말단 링커 및 SV40 NLS("Cas9-NLS")를 포함하는 스트렙토코커스 피오제네스 Cas9; Y. 리폴리티카에서 발현에 대해 코돈 최적화된 오픈 리딩 프레임 2
(4140개의 염기)		 3
(1379개의 aa)
Y. 리폴리티카 FBA1 프로모터. 4
(543개의 염기)
Cas9-NLS 발현 카세트(FBA1 프로모터 및 Cas9-NLS 오픈 리딩 프레임). 5
(4683개의 염기)
pZUFCas9 플라스미드. 6
(10706개의 염기)
Cas9-NLS 정방향 PCR 프라이머. 7
(35개의 염기)
Cas9-NLS 역방향 PCR 프라이머. 8
(31개의 염기)
EcoRI-Cas9-NLS-HinDIII PCR 생성물 9
(4166개의 염기)
pBAD/HisB 플라스미드 10
(4092개의 염기)
pRF48 플라스미드 11
(8237개의 염기)
엡스타인 바 바이러스 제브라 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 제브라 세포 침투성 펩티드 (CPP) 12
(54개의 aa)
뮤린 내피 카데린 단백질로부터의 pVEC CPP 13
(18개의 aa)
뉴로펩티드 갈라닌 단백질로부터의 TP10 CPP 14
(21개의 aa)
폴리-아르기닌(PolyR) CPP 15
(17개의 aa)
NcoI-6xHis-제브라 CPP-EcoRI 16
(194개의 염기)
NcoI-6xHis-pVEC CPP-EcoRI 17
(86개의 염기)
NcoI-6xHis-TP10 CPP-EcoRI 18
(95개의 염기)
NcoI-6xHis-PolyR CPP-EcoRI 19
(83개의 염기)
제브라 CPP-Cas9 융합 단백질을 암호화하는 pRF144 플라스미드 20
(8294개의 염기)
PolyR CPP-Cas9 융합 단백질을 암호화하는 pRF145 플라스미드 21
(8183개의 염기)
TP10 CPP-Cas9 융합 단백질을 암호화하는 pRF146 플라스미드 22
(8195개의 염기)
pVEC CPP-Cas9 융합 단백질을 암호화하는 pRF162 플라스미드 23
(8186개의 염기)
gRNA의 Cas9 엔도뉴클레아제 인식(CER) 도메인 24
(80개의 염기)
Y. 리폴리티카 Can1-1 표적 부위, 또는 대안적으로, gRNA의 Can1-1 가변 표적 도메인을 암호화하는 DNA 25
(20개의 염기)
망치머리(HH) 리보자임. 26
(43개의 염기)
HDV 리보자임. 27
(68개의 염기)
HH-sgRNA-HDV(RGR) 예비-sgRNA 발현 카세트, 또는 대안적으로, (Can1-1 유전자좌 표적화를 위한) "RGR" 발현 카세트 28
(211개의 염기)
T7 RNA 폴리머라제 프로모터 29
(20개의 염기)
pRF46 플라스미드 30
(2875개의 염기)
T7 정방향 프라이머 31
(20개의 염기)
gRNArev1 역방향 프라이머 32
(20개의 염기)
IV-업 프라이머 33
(21개의 염기)
IV-다운 프라이머 34
(20개의 염기)
Can1 절단 분석 DNA 서열 35
(982개의 염기)
RNA 루프 형성 서열(GAAA). 36
(4개의 염기)
RNA 루프 형성 서열(CAAA). 37
(4개의 염기)
RNA 루프 형성 서열(AAAG). 38
(4개의 염기)
제브라 CPP-Cas9-NLS 융합 단백질 39
(1434개의 aa)
PolyR CPP-Cas9-NLS 융합 단백질 40
(1397개의 aa)
TP10 CPP-Cas9-NLS 융합 단백질 41
(1401개의 aa)
pVEC CPP-Cas9-NLS 융합 단백질 42
(1398개의 aa)
Cas9 표적 부위의 예: PAM 서열. 43
(23개의 염기)
PAM 서열 NGG. 44
(3개의 염기)
PAM 서열 NNAGAA. 45
(6개의 염기)
PAM 서열 NNAGAAW. 46
(7개의 염기)
PAM 서열 NGGNG. 47
(5개의 염기)
PAM 서열 NNNNGATT. 48
(8개의 염기)
PAM 서열 NAAAAC. 49
(6개의 염기)
PAM 서열 NG. 50
(2개의 염기)
TracrRNA 메이트 서열 예 1. 51
(22개의 염기)
TracrRNA 메이트 서열 예 2. 52
(15개의 염기)
TracrRNA 메이트 서열 예 3. 53
(12개의 염기)
TracrRNA 메이트 서열 예 4. 54
(13개의 염기)
TracrRNA 실시예 1. 55
(60개의 염기)
TracrRNA 실시예 2. 56
(45개의 염기)
TracrRNA 실시예 3. 57
(32개의 염기)
TracrRNA 실시예 4. 58
(85개의 염기)
TracrRNA 실시예 5. 59
(77개의 염기)
TracrRNA 실시예 6. 60
(65개의 염기)
gRNA 실시예 1. 61
(131개의 염기)
gRNA 실시예 2. 62
(117개의 염기)
gRNA 실시예 3. 63
(104개의 염기)
gRNA 실시예 4. 64
(99개의 염기)
gRNA 실시예 5. 65
(81개의 염기)
gRNA 실시예 6. 66
(68개의 염기)
gRNA 실시예 7. 67
(100개의 염기)
Tat 유래 (GRKKRRQRRR) 68
(10개의 aa)
Tat 유래 CPP (RKKRRQRRR) 69
(9개의 aa)
Tat 유래 CPP (RKKRRQRR) 70
(8개의 aa)
페네트라틴 CPP (RQIKIWFQNRRMKWKK) 71
(16개의 aa)
폴리아르기닌 CPP (THRLPRRRRRR) 72
(11개의 aa)
폴리아르기닌 CPP (GGRRARRRRRR) 73
(11개의 aa)
뮤린 내피 카데린 단백질로부터의 pVEC CPP(짧은 버전) 74
(17개의 aa)
(KFF)3K를 포함하는 CPP 75
(10개의 aa)
MAP 펩티드 CPP 76
(18개의 aa)
CPP (RRQRRTSKLMKR) 77
(12개의 aa)
CPP (KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA) 78
(33개의 aa)
프롤린이 풍부한 CPP 반복 VHLPPP 79
(6개의 aa)
프롤린이 풍부한 CPP 반복 VHRPPP 80
(6개의 aa)
MPG 펩티드 CPP 81
(27개의 aa)
Pep-1 펩티드 CPP 82
(21개의 aa)
hCT CPP 실시예 1 83
(24개의 aa)
hCT CPP 실시예 2 84
(18개의 aa)
his 태그가 붙은 dsRED 85
대장균 코돈 최적화된 dsRED 86
pBAD/HisB 87
pRF161 88
TAT 89
TLM 90
MPG1 91
pep1 92
CFFKDEL 93
his-TAT 대장균 최적화 94
his-TLM 대장균 최적화 95
his-MPG1 대장균 최적화 96
his-pep1 대장균 최적화 97
his-CFFKDEL 대장균 최적화 98
pRF224 99
pRF214 100
pRF213 101
pRF217 102
pRF216 103
올리고 36 104
His-제브라 PCR 105
His-tp10 PCR 106
His-pVEC PCR 107
pRF144 108
pRF162 109
pRF146 110
올리고 153 111
pRF186 112
pRF192 113
pRF190 114
his-CFFKDEL-Cas9 115
His-MPG1-Cas9 116
pRF48 117
pRF243 118
pRF238 119
galK 유전자 120
galE 유전자 121
galT 유전자 122
CER 도메인 l 123
DNA PCR을 암호화하는 CER 124
pRF291 125
CER 정방향 126
일반 역방향 127
일반 정방향 T7 프라이머 128
galK2-1 정방향 프라이머 129
galK2-1 역방향 프라이머 130
galK2-1 sgRNA 시험관 내 전사 주형 131
T7 프로모터 132
galK2-1 가변 표적화 도메인을 암호화하는 DNA 133
galK2-1 표적 부위 134
galK2-1 sgRNA 135
his-MPG1-dsREDexpress; 136
pVEC-dsREDexpress 137
CFFKDEL-dsREDexpress 138
TLM-dsREDexpress 139
제브라-dsREDexpress 140
pep1-dsREDexpress 141
tp10-dsREDexpress 142
제브라-Cas9 143
pVEC-Cas9 144
모든 인용된 특허 및 비 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "발명" 또는 "개시된 발명"은 제한적인 것으로 의도된 것이 아니며, 청구범위에서 정의되거나 본원에 기재된 발명들 중 임의의 것에 일반적으로 적용된다. 이들 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원의 용어 "세포"는 임의의 유형의 세포, 예컨대, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 지칭한다. 진핵 세포는 핵 및 기타 막으로 둘러싸인 구조물(세포 기관)이 있지만, 원핵 세포는 핵이 없다. 특정 구현예에서의 세포는 포유류 세포 또는 비 포유류 세포일 수 있다. 비 포유류 세포는 진핵 또는 원핵일 수 있다. 예를 들어, 본원의 비 포유류 세포는 미생물 세포 또는 비 포유류의 다세포 유기체, 예컨대, 식물, 곤충, 선충, 조류 종, 양서류, 파충류, 또는 어류의 세포를 지칭할 수 있다.
본원의 미생물 세포는 예를 들어, 곰팡이 세포(예컨대, 효모 세포), 원핵 세포, 원생 세포(예컨대, 조류 세포), 유글레나 세포, 스트라메노필(stramenopile) 세포, 또는 난균 세포를 지칭할 수 있다. 본원의 원핵 세포는 예를 들어, 박테리아 세포 또는 고세균 세포를 지칭할 수 있다. 곰팡이 세포(예컨대, 효모 세포), 원생 세포(예컨대, 조류 세포), 유글레나 세포, 스트라메노필 세포 및 난균 세포는 진핵 미생물 세포의 예를 나타낸다. 진핵 미생물 세포는 핵 및 기타 막으로 둘러싸인 구조물(세포 기관)이 있으나, 원핵 세포는 핵이 없다.
본원의 용어 "효모"는 주로 단세포 형태로 존재하는 곰팡이 종을 지칭한다. 효모는 대안적으로 "효모 세포"로 지칭될 수 있다. 본원에서 효모는 예를 들어, 통상적인 효모 또는 비 통상적인 효모로 특징지어질 수 있다.
본원의 용어 "통상적인 효모"("모델 효모")는 일반적으로 사카로마이세스 또는 스키조사카로마이세스 효모 종을 지칭한다. 특정 구현예에서 통상적인 효모는 비 상동 말단 결합(non-homologous end-joining, NHEJ)에 의해 매개되는 수복 공정보다 상동 재조합(HR) DNA 수복 공정을 선호하는 효모이다.
본원의 용어 "비 통상적인 효모"는 사카로마이세스 또는 스키조사카로마이세스 효모 종이 아닌 임의의 효모를 지칭한다. 비 통상적인 효모는, 본원에 참조로 포함되는 Non-Conventional Yeasts in Genetics, Biochemistry and Biotechnology: Practical Protocols (K. Wolf, K.D. Breunig, G. Barth, Eds., Springer-Verlag, Berlin, Germany, 2003) 및 Spencer et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:147-156)에 기술되어 있다. 특정 구현예에서 비 통상적인 효모는 추가적으로 (또는 대안적으로) HR에 의해 매개되는 수복 공정보다 NHEJ DNA 수복 공정을 선호하는 효모일 수 있다. 이러한 맥락에서(HR보다 NHEJ를 선호) 비 통상적인 효모의 정의는 본원에 참조로 포함되는 Chen et al. (PLoS ONE 8:e57952)에 더 개시되어 있다. 본원에서 바람직한 비 통상적인 효모는 야로위아 속(예를 들어, 야로위아 리폴리티카)의 것들이다.
본원의 용어 "식물"은 전체 식물, 이의 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자 및 자손을 지칭한다. 식물 세포는 제한 없이, 종자로부터의 세포, 현탁액 배양물, 배아, 분열부, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 어린 싹, 배우체, 포자체, 화분 및 미포자를 포함한다. 식물 부분은 뿌리, 줄기, 어린 싹, 잎, 화분, 종자, 종양 조직 및 다양한 형태의 세포 및 배양물(예컨대, 단일 세포, 원형체, 배아 및 캘러스 조직)을 비제한적으로 포함하는 분화 및 미분화 조직을 포함한다. 식물 조직은 식물일 수 있거나, 식물 기관, 조직, 또는 세포 배양물일 수 있다. 용어 "식물 기관"은 형태학적 및 기능적으로 구별되는 식물의 부분을 구성하는 식물 조직 또는 조직들의 집합을 지칭한다. 용어 "게놈"은 유기체 또는 바이러스의 각각의 세포 또는 세포 기관에 존재하는 유전 물질(유전자 및 비 암호화 서열)의 전체 보체; 및/또는 한쪽 부모로부터 (반수체) 단위로서 유전된 완전한 염색체 세트를 지칭한다. "자손"은 식물의 임의의 후속 세대를 포함한다.
형질전환 식물은 예를 들어, 그 게놈 내에 형질전환 단계에 의해 도입된 이종 기원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물을 포함한다. 이러한 이종 기원의 폴리뉴클레오티드는 게놈 내에 안정적으로 통합될 수 있어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 대대로 전달된다. 이러한 이종 기원의 폴리뉴클레오티드는 게놈 단독 내로 또는 재조합 DNA 구조물의 일부로 통합될 수 있다. 또한, 형질전환 식물은 그 게놈 내에 둘 이상의 이종 기원의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 각각의 이종 기원의 폴리뉴클레오티드는 이러한 형질전환 식물에 상이한 속성을 부여할 수 있다. 이종 기원의 폴리뉴클레오티드는 외래종으로부터 기원하는 서열, 또는 동일 종으로부터라면 그 고유한 형태로부터 실질적으로 변경될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 형질전환 식물 물질은 임의의 세포, 세포주, 캘러스, 조직, 식물 부분 또는 식물, 처음에 그렇게 변경된 형질전환체뿐만 아니라 초기의 형질전환체로부터 유성 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것들을 포함하는, 이종 기원의 핵산의 존재에 의해 변경된 유전형을 포함할 수 있다. 종래의 식물 육종법, 외래 폴리뉴클레오티드의 삽입을 초래하지 않는 본원에 기술된 게놈 편집 절차, 또는 자연적으로 발생하는 사건, 예컨대, 무작위 타화 수정, 비 재조합 바이러스 감염, 비 재조합 박테리아 형질변형, 비 재조합 전위, 또는 자연 돌연변이에 의한 식물 게놈의 (염색체의 또는 염색체 외의) 변경은 형질전환체로 간주되지 않는다.
가임 식물은 생존 가능한 웅성 및 자성 배우자를 생산하는 식물이며, 자가 수정한다. 이러한 자가 수정 식물은 임의의 기타 배우자 식물 및 그 안에 함유된 유전 물질의 기여 없이 자손 식물을 생산할 수 있다. 웅성 불임 식물은 생존 가능하거나 그렇지 않으면 수정할 수 있는 웅성 배우자를 생산하지 않는 식물을 포함한다. 자성 불임 식물은 생존 가능하거나 그렇지 않으면 수정할 수 있는 자성 배우자를 생산하지 않는 식물을 포함한다. 웅성 불임 및 자성 불임 식물은 각각 자성 가임 및 웅성 가임일 수 있음은 인식되어 있다. 또한, 웅성 가임(그러나 자성 불임) 식물은 자성 가임 식물과 교배될 때 생존 가능한 자손을 생산할 수 있고, 자성 가임(그러나 웅성 불임) 식물은 웅성 가임 식물과 교배될 때 생존 가능한 자손을 생산할 수 있음이 인식되어 있다.
본원의 용어 "RNA-유도 엔도뉴클레아제"(RGEN)는 적어도 하나의 크리스퍼 (규칙적으로 사이 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열)-결합(Cas) 단백질 및 적어도 하나의 RNA 성분을 포함하는 복합체를 지칭한다. 용어 "RGEN의 단백질 성분"과 "RGEN 단백질 성분"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, RGEN의 엔도뉴클레아제 성분이거나 이의 일부분을 형성하는 Cas 단백질을 지칭한다. 특정 구현예에서 단백질 성분은 완전한 엔도뉴클레아제(예컨대, Cas9)일 수 있다. 이러한 단백질 성분은 대안적으로 RGEN의 "엔도뉴클레아제 성분"이라 지칭될 수 있다. 본원에서 RGEN은 적어도 하나의 RNA 성분과의 결합을 고려할 때 전형적으로 특이적인 DNA 표적화 활성을 가진다.
간략하게, RGEN의 RNA 성분은 표적 부위 서열의 DNA 서열에 상보적인 서열을 함유한다. 이러한 상보성에 기초하여, RGEN은 특정 DNA 표적 부위 서열을 특이적으로 인식하여 절단할 수 있다. 본원에서 RGEN은 4개의 알려진 크리스퍼 시스템(Horvath 및 Barrangou, Science 327:167-170), 예컨대 I형, II형 또는 III형 크리스퍼 시스템 중 어느 하나의 Cas 단백질(들) 및 적합한 RNA 성분(들)을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예의 RGEN은 Cas9 엔도뉴클레아제(크리스퍼 II 시스템) 및 적어도 하나의 RNA 성분(예를 들어, crRNA 및 tracrRNA, 또는 gRNA)을 포함한다.
용어 "크리스퍼"(규칙적으로 사이 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열)는, 예를 들어, 박테리아 및 고세균 세포에 의해 외래 DNA를 파괴하는데 사용되는 유형 I, II 또는 III의 DNA 절단 시스템의 인자를 암호화하는 특정 유전자좌를 지칭한다(Horvath 및 Barrangou, Science 327:167-170). 크리스퍼 시스템의 성분들은 본원에서 세포 내에서 DNA를 표적화하기 위해 이종의 방식으로 이용된다.
용어 "II형 크리스퍼 시스템" 및 "II형 크리스퍼-Cas 시스템"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 RNA 성분과 복합체를 이룬 Cas9 엔도뉴클레아제를 이용하는 DNA 절단 시스템을 지칭한다. 예를 들어, Cas9는 크리스퍼 RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 크리스퍼 RNA(tracrRNA)와 복합체일 수 있다. 또 다른 예에서, Cas9는 가이드 RNA와 복합체일 수 있다. 따라서, crRNA, tracrRNA 및 가이드 RNA는 본원에서 RNA 성분들의 비제한적인 예이다.
본원에서 용어 크리스퍼-결합("Cas") 엔도뉴클레아제는 Cas 유전자에 의해 암호화되는 Cas 단백질을 지칭한다. 적합한 RNA 성분과 복합체인 경우, Cas 엔도뉴클레아제는 특정 구현예에서 특정 DNA 표적 서열의 전부 또는 일부를 절단할 수 있다. 예를 들어, 특정 DNA 표적 서열에 단일 또는 이중 가닥 절단을 도입할 수 있거나; 대안적으로 특정 DNA 표적 서열의 한 가닥 또는 두 가닥을 절단할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. Cas 엔도뉴클레아제는 표적 서열에서 DNA 이중 가닥을 풀 수 있고, Cas와 복합체인 crRNA 또는 가이드 RNA에 의한 표적 서열의 인식에 의해 매개되는 바와 같이, 적어도 하나의 DNA 가닥을 절단한다. Cas 엔도뉴클레아제에 의한 이러한 표적 서열의 인식 및 절단은 전형적으로 정확한 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)가 DNA 표적 서열의 3' 말단에 위치하거나 인접한 경우 발생한다. 대안적으로, 본원에서 Cas 단백질은 DNA 절단 또는 닉킹(nicking) 활성이 부족할 수 있지만, 적합한 RNA 성분과 복합체를 형성한 경우 여전히 DNA 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 바람직한 Cas 단백질은 Cas9이다.
임의의 유도 엔도뉴클레아제가 본원에 개시된 방법에 이용될 수 있다. 이러한 엔도뉴클레아제로는 Cas9 및 Cpf1 엔도뉴클레아제를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 현재까지 특정 PAM 서열들을 인식할 수 있고(예를 들어, 2015년 5월 15일 제출된 미국 특허 출원 62/162377 및 2015년 5월 15일 제출된 미국 특허 출원 62/162353 및 Zetsche B et al. 2015. Cell 163, 1013 참조) 소정의 위치에서 표적 DNA를 절단할 수 있는 여러 엔도뉴클레아제가 기술된 바 있다. 유도 Cas 시스템을 활용하는 본원에 기술된 방법 및 구현예를 기초로, 이제는 임의의 유도 엔도뉴클레아제 시스템을 활용할 수 있도록 이들 방법을 조정할 수 있음은 이해된다.
본원에서 "Cas9" (이전에 Cas5, Csn1 또는 Csx12로 지칭됨)는 DNA 표적 서열의 전부 또는 일부를 특이적으로 인식하고 절단하기 위해, crRNA 및 tracrRNA와, 또는 가이드 RNA와 복합체를 형성하는 II형 크리스퍼 시스템의 Cas 엔도뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 단백질은 RuvC 뉴클레아제 도메인 및 HNH(H-N-H) 뉴클레아제 도메인을 포함하며, 이들 각각은 표적 서열에서 단일 DNA 가닥을 절단한다 (두 도메인의 협동 작용은 DNA 이중 가닥 절단을 유도하는 반면, 하나의 도메인의 활성은 닉(nick)을 유도한다). 일반적으로, RuvC 도메인은 서브도메인 I, II 및 III을 포함하며, 여기서 도메인 I은 Cas9의 N 말단 근처에 위치하고, 서브도메인 II 및 III은 HNH 도메인에 플랭킹한 단백질의 중간에 위치한다(Hsu et al, Cell 157:1262-1278). "Apo-Cas9"는 RNA 성분과 복합체가 형성되지 않은 Cas9를 지칭한다. Apo-Cas9는 DNA와 결합할 수 있지만, 비 특이적 방식으로 결합하여, DNA를 절단할 수 없다(Sternberg et al., Nature 507:62-67).
본원에서 용어 "RNA 성분"은 DNA 표적 서열의 가닥에 상보적인 리보핵산 서열을 함유하는 RGEN의 RNA 성분을 지칭한다. 본원에서 이러한 상보적인 서열은 "가이드 서열" 또는 "가변 표적화 도메인" 서열로 지칭된다(도 5). 본원에서 적절한 RNA 성분의 예는 cRNA 및 가이드 RNA를 포함한다. 특정 구현예에서의 RNA 성분들(예컨대, 가이드 RNA 단독, crRNA + tracrRNA)은 RGEN을 특이적인 DNA 표적화에 적합하게 만들 수 있다.
본원에서 용어 "크리스퍼 RNA"(crRNA)는 하나 이상의 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)과 복합체를 형성할 수 있어, 복합체에 DNA 결합 특이성을 제공하는 RNA 서열을 지칭한다. crRNA는 DNA 표적 서열의 가닥에 상보적인 "가이드 서열" ("가변 표적화 도메인" [VT])을 함유하기 때문에 DNA 결합 특이성을 제공하다. crRNA는 crRNA가 유래된 크리스퍼 유전자좌의 반복 영역에 의해 암호화되는 "반복 서열" ("tracr RNA 메이트 서열")을 추가로 포함한다. crRNA의 반복 서열은 tracrRNA의 5'-말단에서 서열에 어닐링할 수 있다. 고유 크리스퍼 시스템의 crRNA는 크리스퍼 유전자좌로부터 전사된 "예비-crRNA"로부터 유래된다. 예비-crRNA는 스페이서 영역과 반복 영역을 포함하고, 스페이서 영역은 DNA 표적 부위 서열에 상보적인 특유의 서열을 함유한다. 고유 시스템의 예비-crRNA는 다수의 상이한 crRNA로 가공되며, 각각은 반복 서열의 일부와 함께 가이드 서열을 갖는다. 크리스퍼 시스템은, 예를 들어, DNA 표적화 특이성을 위해 crRNA를 이용한다.
본원에서 용어 "트랜스-활성화 크리스퍼 RNA"(tracrRNA)는 II형 크리스퍼 시스템에서 사용되며, 5'에서 3' 방향으로 (i) 크리스퍼 II형 crRNA의 반복 영역과 어닐링하는 서열 및 (ii) 스템 루프를 함유하는 부분을 함유하는 비 암호화 RNA를 지칭한다(Deltcheva et al., Nature 471:602-607).
용어 "가이드 RNA"(gRNA) 및 "단일 가이드 RNA"(sgRNA)는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 gRNA는 tracrRNA에 작동 가능하게 연결된 crRNA를 함유하는 키메라 서열을 지칭할 수 있다. 대안적으로, gRNA는, 예를 들어 crRNA와 tracrRNA의 합성 융합체를 지칭할 수 있다. gRNA는 또한 가이드 서열(가변 표적화 도메인) 다음에 Cas 엔도뉴클레아제 인식(CER) 도메인을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. CER 도메인은 tracrRNA 메이트 서열 다음에 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다.
"크리스퍼 DNA"(crDNA)는 선택적으로 RNA 성분 대신에 이용될 수 있다. crDNA는 본원에 개시된 바와 같이 crRNA의 서열에 상응하는 DNA 서열을 갖는다. crDNA는 crDNA/tracrRNA 복합체에서 tracrRNA와 함께 이용될 수 있으며, crDNA/tracrRNA 복합체는 결국 RGEN 단백질 성분과 결합될 수 있다. 미국 출원번호 61/953,090은 crDNA 및 RGEN 매개성 DNA 표적화에 있어서 이의 이용 방법을 개시하고 있다. 따라서, crRNA에 관한 본원에서의 임의의 개시 내용은 crDNA를 이용하는 것에 간단히 적용할 수 있다고 예상된다. 따라서, crDNA를 도입하는 본원의 구현예에서, "RNA-유도 엔도뉴클레아제"(RGEN)는 그 대신으로 적어도 하나의 Cas 단백질 및 적어도 하나의 crDNA를 포함하는 복합체로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "가이드 폴리뉴클레오티드"는 Cas 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있고, 이러한 Cas 엔도뉴클레아제가 DNA 표적 부위를 인식하고 선택적으로 절단할 수 있게 하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 분자 또는 이중 분자일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다. 선택적으로, 이러한 가이드 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 뉴클레오티드, 포스포디에스테르 결합 또는 연결 변형, 예컨대 고정 핵산(LNA), 5-메틸 dC, 2,6-디아미노퓨린, 2'-플루오로 A, 2'-플루오로 U, 2'-O-메틸 RNA, 포스포로티오에이트 결합, 콜레스테롤 분자에 대한 연결, 폴리에틸렌 글리콜 분자에 대한 연결, 스페이서 18(헥사에틸렌 글리콜 사슬) 분자에 대한 연결, 또는 고리화를 초래하는 5'에서 3'으로의 공유 연결을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 단독으로 리보핵산을 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드는 "가이드 RNA"라고도 지칭된다.
가이드 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 (가변 표적화 도메인 또는 VT 도메인으로 지칭되는) 제1 뉴클레오티드 서열 도메인 및 Cas 엔도뉴클레아제 폴리펩티드와 상호 작용하는 (Cas 엔도뉴클레아제 인식 도메인 또는 CER 도메인으로 지칭되는) 제2 뉴클레오티드 서열 도메인을 포함하는 (이중 가이드 폴리뉴클레오티드라 지칭되기도 하는) 이중 분자일 수 있다. 이중 분자 가이드 폴리뉴클레오티드의 CER 도메인은 상보성 영역을 따라 혼성화된 두 개의 별도의 분자들을 포함한다. 이러한 두 개의 별도의 분자들은 RNA, DNA, 및/또는 RNA-DNA- 조합 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, CER 도메인에 연결된 VT 도메인을 포함하는 이중 가이드 폴리뉴클레오티드의 제1 분자("cr뉴클레오티드")는 (연속된 DNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) "crDNA" 또는 (연속된 RNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) "crRNA", 또는 (DNA와 RNA 뉴클레오티드의 조합으로 구성되는 경우) "crDNA-RNA"라 지칭된다. 일부 구현예에서, CER 도메인을 포함하는 이중 가이드 폴리뉴클레오티드의 제2 분자는 (연속된 RNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) "tracrRNA" 또는 (연속된 DNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) "tracrDNA" 또는 (DNA와 RNA 뉴클레오티드의 조합으로 구성되는 경우) "tracrDNA-RNA"라 지칭된다.
또한, 이러한 가이드 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 (가변 표적화 도메인 또는 VT 도메인으로 지칭되는) 제1 뉴클레오티드 서열 도메인 및 Cas 엔도뉴클레아제 폴리펩티드와 상호 작용하는 (Cas 엔도뉴클레아제 인식 도메인 또는 CER 도메인으로 지칭되는) 제2 뉴클레오티드 도메인을 포함하는 단일 분자일 수 있다. "도메인"은 RNA, DNA, 및/또는 RNA-DAN-조합 서열일 수 있는 뉴클레오티드들이 연속되어 있는 것을 의미한다. 단일 가이드 폴리뉴클레오티드의 VT 도메인 및/또는 CER 도메인은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 RNA-DNA-조합 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 (CER 도메인을 포함하는) tracr뉴클레오티드에 연결된 (CER 도메인에 연결된 VT 도메인을 포함하는) cr뉴클레오티드를 포함하며, 이때, 이러한 연결은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 RNA-DNA 조합 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. cr뉴클레오티드 및 tracr뉴클레오티드로부터의 서열들로 구성되는 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 (연속된 RNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) "단일 가이드 RNA" 또는 (연속된 DNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) "단일 가이드 DNA" 또는 (RNA와 DNA 뉴클레오티드의 조합으로 구성되는 경우) "단일 가이드 RNA-DNA"라 지칭될 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서 가이드 폴리뉴클레오티드와 II형 Cas 엔도뉴클레아제는 서로 복합체("가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체" 라 지칭되거나 "가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템"이라고도 지칭됨)를 형성할 수 있는데, 이때, 이러한 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 Cas 엔도뉴클레아제가 세포(예컨대, 식물 세포)의 게놈 표적 부위를 표적화하도록 유도할 수 있으며, 선택적으로 Cas 엔도뉴클레아제가 게놈 표적 부위 내로 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단을 도입할 수 있게 할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 적어도 하나의 CPP에 연결될 수 있는데, 이때, 이러한 복합체는 세포(예컨대, 식물 세포)의 표적 부위와 결합할 수 있고, 선택적으로 세포(예컨대, 식물 세포)의 표적 부위에 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단을 생성할 수 있다.
용어 "가변 표적화 도메인" 또는 "VT 도메인"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이중 가닥 DNA 표적 부위의 한 가닥(뉴클레오티드 서열)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 제1 뉴클레오티드 서열 도메인(VT 도메인)과 표적 서열 사이의 백분율 보완성은 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 가변 표적 도메인의 길이는 적어도 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 가변 표적화 도메인은 연속된 12개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 가변 표적화 도메인은 DNA 서열, RNA 서열, 변형된 DNA 서열, 변형된 RNA 서열(예컨대, 본원에 기술된 변형 참조), 또는 이의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.
용어 가이드 폴리뉴클레오티드의 "Cas 엔도뉴클레아제 인식 도메인" 또는 "CER 도메인"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, Cas 엔도뉴클레아제 폴리펩티드와 상호작용하는 뉴클레오티드 서열(예컨대, 가이드 폴리뉴클레오티드의 제2 뉴클레오티드 서열 도메인)에 관한 것이다. CER 도메인은 DNA 서열, RNA 서열, 변형된 DNA 서열, 변형된 RNA 서열(예컨대, 본원에 기술된 변형 참조), 또는 이의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.
용어 "표적 부위", "표적 서열", "표적 DNA", "DNA 표적 서열", "표적 유전자좌", "프로토스페이서" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 표적 부위 서열은 본원의 RGEN이 인식하고, 결합하며, 선택적으로는 닉을 형성하거나 절단하는, 세포의 게놈 내의 염색체, 에피솜 또는 임의의 기타 DNA 분자 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 표적 부위는 (i) 세포 내의 내인성/고유 부위이거나, (ii) 세포에 대해 이종성이어서 게놈에서 자연적으로 발생하지 않거나, (iii) 고유하게 발생하는 위치와 비교하여 이종성인 게놈 위치에서 발견될 수 있다.
본원에서 표적 부위 서열은 길이가 적어도 13개 뉴클레오티드이고, 가이드 서열과 혼성화될 수 있고, (특정 구현예에서, 적합한 PAM이 표적 서열에 인접한 경우) 표적 서열에 Cas 단백질 또는 Cas 단백질 복합체의 서열-특이적 결합을 유도할 수 있도록 (crRNA 또는 gRNA의) 가이드 서열에 대해 충분한 상보성을 갖는 가닥을 갖는다. (엔도뉴클레오리틱(endonucleolytic) 또는 닉킹 Cas와 적용 가능한) 절단/닉 부위는 표적 서열 내에 있을 수 있거나(예를 들어, Cas9를 사용), 절단/닉 부위는 표적 서열 외부에 있을 수 있다(예를 들어, FokI 효소로부터 유래된 것과 같은 이종 엔도뉴클레아제 도메인에 융합된 Cas9를 사용). 표적 부위 서열은 절단 또는 닉킹 활성이 결여된 RGEN에 의해 결합될 수도 있다.
본원에서 "인공 표적 부위" 또는 "인공 표적 서열"은 세포의 게놈에 도입된 표적 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서 인공 표적 서열은 세포의 게놈 내의 고유 표적 서열과 서열이 동일할 수 있지만, 게놈의 상이한 위치(이종 위치)에 위치할 수 있거나, 세포의 게놈 내의 동일한 위치에 위치하는 경우 고유 표적 서열과 상이할 수 있다.
본원에서 "에피솜"은 세포의 염색체와 별도로 세포에 자율적으로 존재할 수 있는 (복제할 수 있고 딸 세포로 전달할 수 있는) DNA 분자를 지칭한다. 에피솜 DNA는 세포에 고유하거나 이종성일 수 있다. 본원에서 고유 에피솜의 예로 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 및 엽록체 DNA를 들 수 있다. 본원에서 이종 에피솜의 예로 플라스미드 및 효모 인공 염색체(YAC)를 들 수 있다.
본원에서 "프로토스페이서 인접 모티프"(PAM)는 본원에서의 RGEN에 의해 인식되는 짧은 서열을 지칭한다. 본원의 PAM의 서열과 길이는 사용되는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질 복합체에 따라 다를 수 있지만, 전형적으로는, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 뉴클레오티드 길이이다.
용어 "5'-캡"과 "7-메틸구아닐레이트(m7G) 캡"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 7-메틸구아닐레이트 잔기는 진핵생물에서 RNA 폴리머라제 II(Pol II)에 의해 전사된 RNA의 5' 말단 상에 위치한다. 본원의 캡핑된 RNA는 5'-캡이 있으나, 캡핑되지 않은 RNA는 이러한 캡이 없다.
용어 "캡핑되지 않은", "5'-캡이 없는" 등은 본원에서 5'-캡이 없으며, 선택적으로, 5'-캡 대신 예를 들어 5'-하이드록실기가 있는 RNA를 지칭하는 데 상호교환적으로 사용된다. 캡핑되지 않은 RNA는 5'-캡핑된 RNA가 핵외수송(nuclear export)의 대상이기 때문에 전사 후 핵에 더 잘 축적될 수 있다.
용어 "리보자임", "리보핵산 효소" 및 "자가 절단 리보자임"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 리보자임은 특정 부위에서, 특히, 리보자임 서열에 대해 시스 부위에서 RNA를 절단(즉, 자가 촉매적 또는 자가 절단)할 수 있는 2차, 3차, 및/또는 4차 구조(들)를 형성하는 하나 이상의 RNA 서열을 지칭한다. 리보자임 핵산 분해 활성의 일반적인 성질은 기술된 바 있다(예를 들어, Lilley, Biochem . Soc. Trans. 39:641-646). 본원에서 "망치머리 리보자임"(HHR)은 촉매 작용에 관여하는 3개의 염기쌍 형성된 스템 및 고도로 보존된, 비 상보적 뉴클레오티드의 코어로 구성되는 작은 촉매 RNA 모티프를 포함할 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 Pley et al. (Nature 372:68-74) 및 Hammann et al. (RNA 18:871-885)은 망치머리 리보자임 구조와 활성을 개시하고 있다. 본원에서 망치머리 리보자임은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 Scott et al. (Cell 81:991-1002)에 개시된 바와 같은 "최소 망치머리" 서열을 포함할 수 있다.
용어 "표적화", "유전자 표적화", "DNA 표적화", "편집", "유전자 편집" 및 "DNA 편집"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 DNA 표적화는 세포의 염색체 또는 에피솜에서와 같은 특정 DNA 서열에서의 삽입-결실, 녹아웃 또는 녹인의 특이적 도입일 수 있다. 일반적으로, DNA 표적화는 본원에서 적합한 RNA 성분과 결합된 Cas 단백질을 사용하여 세포의 특정 DNA 서열에서 하나 또는 두 가닥을 절단함으로써 수행될 수 있다. 이러한 DNA 절단은, 이중 가닥 절단(DSB)의 경우 표적 부위에서 삽입-결실을 형성할 수 있는 NHEJ 공정을 유도할 수 있다. 또한, 절단이 단일-가닥 절단(SSB)인지 DSB인지에 관계없이, DNA 닉 또는 절단 부위에 적합한 공여 DNA 폴리뉴클레오티드가 제공되는 경우 HR 공정은 유도될 수 있다. 이러한 HR 공정은 공여 DNA 폴리뉴클레오티드의 서열에 따라 표적 부위에서 녹아웃 또는 녹인을 도입하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본원에서 DNA 표적화는 본원의 Cas/RNA 성분 복합체와 표적 DNA 서열의 특정 결합을 지칭할 수 있으며, 여기서 Cas 단백질은 (Cas 단백질의 엔도뉴클레오리틱 도메인의 상태에 따라) DNA 가닥을 절단하거나 절단하지 않는다.
본원에서 용어 "삽입-결실"은 염색체 또는 에피솜 내의 표적 DNA 서열에서의 뉴클레오티드 염기 또는 염기들의 삽입 또는 결실을 지칭한다. 이러한 삽입 또는 결실은, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 염기일 수 있다. 특정 구현예에서, 삽입-결실은 훨씬 더 클 수 있고, 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 염기일 수 있다. 삽입-결실이 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF) 내에 도입되는 경우, 종종 이러한 삽입-결실은 프레임시프트 돌연변이를 생성하여 이러한 ORF에 의해 암호화되는 단백질의 야생형 발현을 방해한다.
용어 "녹아웃", "유전자 녹아웃" 및 "유전적 녹아웃"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 녹아웃은 Cas 단백질로 표적화함으로써 부분적으로 또는 완전히 작동하지 않게 된 본원에서의 세포의 DNA 서열을 나타내며, 녹아웃 이전의 이러한 DNA 서열은, 예를 들어, 아미노산 서열을 암호화할 수 있었거나 조절 기능 (예를 들어, 프로모터)을 가졌을 수 있다. 녹아웃은 (Cas 매개성 절단에 의해 유발된 NHEJ에 의한) 삽입-결실에 의해 또는, 표적화 부위에서, 그 옆에서, 또는 그 부근에서 서열의 기능을 감소시키거나 완전히 파괴하는, (적절한 공여 DNA 폴리뉴클레오티드도 사용되는 경우, Cas 매개성 절단 또는 닉킹에 의해 유발된 HR에 의한) 서열의 특이적 제거에 의해 생성될 수 있다. 본원에서 녹아웃된 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 대안적으로, 예를 들어, 부분적으로 또는 완전히 파괴되거나 하향조절되는 것을 특징으로 할 수 있다.
용어 "녹인", "유전자 녹인" 및 "유전적 녹인"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 녹인은 (적절한 공여 DNA 폴리뉴클레오티드도 사용되는 경우, Cas 매개성 절단 또는 닉킹에 의해 유발된 HR에 의한) Cas 단백질을 사용한 표적화에 의해 세포의 특정 DNA 서열에서 DNA 서열을 대체하거나 삽입하는 것을 나타낸다. 녹인의 예는 유전자의 암호화 영역에 이종 아미노산 암호화 서열의 특이적 삽입, 또는 유전자좌에 전사 조절 요소의 특이적 삽입이다.
용어 "공여 폴리뉴클레오티드", "공여 DNA", "표적화 폴리뉴클레오티드" 및 "표적화 DNA"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 공여 폴리뉴클레오티드는 DNA 표적 부위(예를 들어, 본원의 Cas 단백질에 의해 특이적으로 표적화된 서열)에 있거나 그 부근에 있는 서열에 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 적합한 공여 폴리뉴클레오티드는 표적 부위가 SSB 또는 DSB를 함유하는 경우 DNA 표적 부위와 함께 HR을 거칠 수 있다(예컨대, 적절한 RNA 성분과 결합된 본원의 특정 Cas 단백질을 이용하여 도입될 수 있다). 본원에서 공여 폴리뉴클레오티드 내의 "상동성 서열"은 예를 들어, 표적 부위 또는 그 부근의 서열과 100% 동일성, 또는 표적 부위 또는 그 부근의 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는, 예를 들어, 적어도 약 25개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
특정 구현예에서, 공여 DNA 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 서열과 이종성인 서열(또는 염기 쌍)에 의해 분리된 2개의 상동성 서열을 가질 수 있다. 이러한 공여 폴리뉴클레오티드의 이들 2개의 상동성 서열은 이종 서열에 플랭킹된 "상동성 암(arm)"으로 지칭될 수 있다. 2개의 상동성 암을 갖는 공여 폴리뉴클레오티드와 표적 부위 사이의 HR은 전형적으로 표적 부위의 서열을 공여 폴리뉴클레오티드의 이종 서열로 대체시킨다(공여 폴리뉴클레오티드의 상동성 암에 상동성인 DNA 서열들 사이에 위치한 표적 부위 서열은 공여 폴리뉴클레오티드의 이종 서열에 의해 대체된다). 2개의 상동성 암을 갖는 공여 폴리뉴클레오티드에서, 이러한 암은 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다(즉, 공여 폴리뉴클레오티드의 이종 서열은 길이가 적어도 1개의 뉴클레오티드일 수 있다). 본원의 세포에서 수행될 수 있는 다양한 HR 절차가, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 DNA Recombination: Methods and Protocols: 1st Edition (H. Tsubouchi, Ed., Springer-Verlag, New York, 2011)에 개시되어 있다.
용어 "세포 침투성 펩티드"(CPP) 및 "단백질 형질도입 도메인"(PTD)은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. CPP는 분자 화물, 특히, 본원의 하나 이상의 RGEN 단백질 성분(예컨대, Cas9 단백질)의 세포 흡수를 촉진할 수 있는, 전형적으로 길이가 약 5~60개 아미노산 잔기인 펩티드를 지칭한다. 이러한 단백질 화물은 공유 또는 비 공유 연결을 통해 하나 이상의 CPP들과 결합될 수 있다. 또한, 특정 구현예에서 CPP는 지질 이중층, 마이셀, 세포막, 세포 기관 막, 소포막, 또는 세포벽 중 하나 이상을 가로질러/통해 분자 화물의 이동 또는 횡단을 촉진할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 본원의 CPP는 특정 구현예에서 양이온성, 양친매성, 또는 소수성일 수 있다. 본원에 유용한 CPP의 예 및 CPP 일반에 대한 추가적인 기술은 Schmidt et al. (FEBS Lett. 584:1806-1813), Holm et al. (Nature Protocols 1:1001-1005), Yandek et al. (Biophys. J. 92:2434-2444), Morris et al. (Nat. Biotechnol. 19:1173-1176), 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0068797에 기술되어 있으며, 이들 전부는 본원에 참조로 포함된다.
본원의 "양이온성" 또는 "다중양이온성" CPP는 높은 상대 빈도(적어도 60%)의 양으로 하전된 아미노산, 예컨대, 라이신(K), 아르기닌(R) 및/또는 히스티딘(H)을 갖는 CPP를 지칭한다.
본원의 "양친매성" 또는 "양친성" CPP는 극성/하전된 잔기와 비극성, 소수성 잔기가 번갈아 나타나는 패턴을 함유하는 아미노산 서열을 가진 CPP를 지칭한다. 양친성 CPP는 대안적으로 친수성 및 친유성 모두를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원의 "소수성" 또는 "친유성" CPP는 대부분 또는 오로지 낮은 순전하 및/또는 소수성 아미노산기를 갖는 비극성 잔기를 함유한다.
용어 "공유적으로 연결된", "공유적으로 부착된", "공유적으로 결합된", "공유적 연결", "공유적 상호작용" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원의 공유적 연결은 예를 들어, 펩티드 결합(들) 또는 화학적 가교(들)을 통해서일 수 있다. 공유적 연결은 예를 들어 직접적일 수 있는데, 여기서 RGEN 단백질 성분과 CPP의 직접적인 사이에는 (직접적으로 연결하는) 공유적 연결이 있다(예컨대, RGEN 단백질 성분의 한 원자와 CPP의 한 원자 사이에 [전자를 공유하는] 화학적 결합이 있다). 공유적 연결은 대안적으로는 예를 들어 간접적일 수 있는데, 여기서 RGEN 단백질 성분과 CPP는 적어도 하나의 매개 인자를 통해 서로에 연결된다. 이러한 매개 인자, 또는 그 자신들이 함께 공유적으로 연결되는 매개 인자들의 집단은 RGEN 단백질 성분 및 CPP에 공유적으로 연결된다. 따라서, 매개 인자 또는 이의 집단은 RGEN 단백질 성분과 CPP 사이의 다리가 된다는 것을 특징으로 할 수 있다.
용어 "융합 단백질", "단백질 융합체", "키메라 단백질" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원의 융합 단백질은 단일 폴리펩티드 내에 함께 연결된 적어도 두 개의 상이한 (이종의) 아미노산 서열들을 함유한다. 융합 단백질은 전형적으로, 상이한 아미노산 서열들을 암호화하는 DNA 서열들이 함께 연결되어 상이한 아미노산 서열들을 함유하는 단일 단백질을 암호화하는 유전자 조작 절차에 의해 생산된다. 본원의 융합 단백질의 예로는 RGEN 단백질-CPP 융합체(하나 이상의 CPP 아미노산 서열에 융합된 RGEN 단백질 아미노산 서열)를 들 수 있다.
용어 "비 공유적으로 연결된", "비 공유적으로 부착된", "비 공유적으로 결합된", "비 공유적 연결", "비 공유적 상호작용" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원의 비 공유적 연결은 전자들이 공유되지 않는 원자들 사이의 상호작용을 지칭한다. 이러한 유형의 상호작용은 공유적 연결보다 약하다. 소수성 상호작용은 RGEN 단백질 성분과 하나 이상의 CPP 사이에 발생할 수 있는 비 공유적 연결의 예를 나타낸다. 본원에 적용될 수 있는 비 공유적 연결의 기타 예로는 정전기적 힘(예컨대, 이온 결합, 수소 결합)과 반 데르 발스 힘(런던 분산력)을 들 수 있다.
본원에 사용된 "RGEN 단백질-CPP 복합체"는 RGEN의 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP 사이의 복합체를 지칭하며, 여기서, RGEN과 CPP는 공유적 또는 비 공유적 연결을 통해 상호작용한다. 이러한 복합체에서 RGEN과 CPP 성분들은 모두 전형적으로 본원에 개시된 그들 각각의 활성/기능의 전부 또는 일부(예컨대, 적어도 50%)를 보유한다. 예를 들어, RGEN 단백질 성분이 Cas9인 구현예에서, Cas9-CPP 복합체의 Cas9는 적합한 RNA 성분(예컨대, gRNA)과 결합할 수 있고, Cas9-CPP 복합체를 세포 내의 DNA 표적 부위로 표적화할 수 있다.
용어 "가로지르다", "이동하다", "건너다", "넘다" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "세포막", "원형질 막" 및 "세포질 막"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 세포의 내부를 그 외부로부터 분리하는 생물학적 막을 지칭한다. 세포막은 전형적으로 인지질 이중층과 그 안에 내장된 단백질을 포함한다. 몇몇 기타 기능 중에서도, 세포막은 세포 외 구조물, 예컨대, 세포벽 또는 당질층 구조물을 위한 부착 표면으로 작용할 수 있다. 세포막 지질 이중층에 관한 상세한 정보는 본원에 참조로 포함된 Molecular Biology of the Cell. 4th Edition (B. Alberts et al., Eds., Garland Science, New York, 2002)에 제공되어 있다.
본원의 용어 "세포벽"은 일부 유형의 비 포유류 세포(예컨대, 박테리아, 식물, 조류, 효모와 같은 균류)를 둘러싸는 단단하고 유연한 (그러나 때때로 꽤 견고한) 층을 지칭한다. 세포벽은 세포막 외부에 위치하며, 세포에 구조적 뒷받침과 보호를 제공한다. 특정 구현예에서 세포벽의 주요 기능은 세포 삼투압을 유지하는 것을 돕는 것이다. 균류 세포(예컨대, 효모 세포)의 세포벽은 일반적으로 키틴을 포함하고, 조류 세포의 세포벽은 일반적으로 당단백질 및 다당류를 포함한다. 식물 세포벽은 일반적으로 더 적은 양의 기타 성분들(예컨대, 페놀성 에스테르, 구조적 단백질)과 함께 주로 다당류를 포함한다. "1차 세포벽" 및/또는 "2차 세포벽"은 식물 세포벽을 특징짓는 데 이용될 수 있는데, 여기서 2차 세포벽은 1차 세포벽 내부에 위치한다. 리그닌은 2차 세포벽의 주요 성분이다. 박테리아 세포벽은 일반적으로 주요 성분으로 펩티도글리칸을 포함한다. 박테리아에서와 같은 특정 양태에서, 세포벽은 그 외층에 당질층을 더 포함할 수 있는데, 당질층은 일반적으로 다당류의 코팅이다.
본원의 용어 "류신 지퍼 도메인"은 대략 35개 잔기에서 7개 잔기마다 류신 잔기가 존재하는 것을 특징으로 하는 이합체화 도메인을 지칭한다. 류신 지퍼 도메인은 알파 헬리컬 이중 나선으로 서로 결합된 이합체를 형성한다. 이중 나선은 한 바퀴당 3.5개 잔기가 있으며, 이는 매 일곱번째 잔기가 나선 축에 대해 동등한 위치를 차지함을 의미한다. 이중 나선 내부에서의 류신의 규칙적 배열은 소수성 및 반 데르 발스 상호작용에 의해 구조를 안정화한다.
용어 "부피 기준 백분율", "부피 백분율", "vol %" 및 "v/v %"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용액 중의 용질의 부피 기준 백분율은 식: [(용질의 부피)/(용액의 부피)] × 100%를 이용하여 결정할 수 있다.
용어 "중량 기준 백분율", "중량 백분율(wt%)" 및 "중량-중량 백분율(% w/w)"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중량 기준 백분율은 재료가 조성물, 혼합물 또는 용액 중에 포함될 때 질량을 기준으로 한 재료의 백분율을 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 뉴클레오티드 서열 등을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 합성, 비 천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 선택적으로 함유하는 단일- 또는 이중-가닥인 DNA 또는 RNA의 중합체일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 또는 이의 혼합물의 하나 이상의 세그먼트로 이루어질 수 있다. 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드)는 다음과 같이 단일 문자 표기로 지칭될 수 있다: (각각 RNA 또는 DNA에 있어서) 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트는 "A", (각각 RNA 또는 DNA에 있어서) 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트는 "C", (각각 RNA 또는 DNA에 있어서) 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트는 "G", (RNA에 있어서) 유리딜레이트는 "U", (DNA에 있어서) 데옥시티미딜레이트는 "T", 퓨린(A 또는 G)은 "R", 피리미딘(C 또는 T)은 "Y", G 또는 T는 "K", A 또는 C 또는 T는 "H", 이노신은 "I", A 또는 T는 "W" 및 임의의 뉴클레오티드는 "N"(예를 들어, DNA 서열을 지칭하는 경우 N은 A, C, T 또는 G일 수 있고; RNA 서열을 지칭하는 경우 N은 A, C, U 또는 G일 수 있다). 본원에 개시된 임의의 RNA 서열(예를 들어, crRNA, tracrRNA, gRNA)은 적합한 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단리된"은 이의 천연 공급원으로부터 완전히 또는 부분적으로 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 일부 경우에, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자는 더 큰 조성물, 완충액 시스템 또는 시약 믹스의 일부이다. 예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자는 이종 방식으로 세포 또는 유기체 내에 포함될 수 있다. RGEN의 단백질 성분 및 세포 침투성 펩티드를 포함하는 본원의 조성물은 단리된 조성물로 간주될 수 있다. 이들 조성물은 이종 성분들을 함유하면, 자연계에서는 발생하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는 암호화 영역으로부터 RNA(RNA는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열로부터 전사됨)를 발현하는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하며, RNA는 (단백질을 암호화하는) 메신저 RNA 또는 비-단백질-암호화 RNA (예를 들어, 본원의 crRNA, tracrRNA 또는 gRNA)일 수 있다. 유전자는 암호화 영역만을 지칭할 수 있거나, 암호화 영역(예를 들어, 프로모터, 5'-비해독 영역, 3'-전사 종결자 영역)의 상류 및/또는 하류의 조절 서열을 포함할 수 있다. 단백질을 암호화하는 암호화 영역은 본원에서 대안적으로 "오픈 리딩 프레임"(ORF)으로 지칭될 수 있다. "고유" 또는 "내인성"인 유전자는 자연계에서 그 자체의 조절 서열을 가진 채 발견된 유전자를 지칭하며, 이러한 유전자는 숙주 세포의 게놈에서 이의 자연적 위치에 위치한다. "키메라" 유전자는 자연계에서 함께 발견되지 않는 조절 서열 및 암호화 서열을 포함하는, 고유 유전자가 아닌 임의의 유전자를 지칭한다(즉, 조절 영역과 암호화 영역이 서로 이종성이다). 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열과 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되었지만, 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 암호화 서열을 포함할 수 있다. "외래" 또는 "이종" 유전자는 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 지칭한다. 외래/이종 유전자는 비 천연 유기체에 삽입된 천연 유전자, 천연 숙주 내의 새로운 위치로 도입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 특정 구현예에서 폴리뉴클레오티드 서열은 이종성이다. "이식유전자"는 유전자 전달 절차(예컨대, 형질전환)에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다. "코돈-최적화된" 오픈 리딩 프레임은 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도를 모방하도록 설계된 코돈 사용 빈도를 나타낸다.
"돌연변이된 유전자"는 인간 개입을 통해 변경된 유전자이다. 이러한 "돌연변이된 유전자"는 적어도 하나의 뉴클레오티드 삽입, 결실, 또는 치환에 의해 상응하는 비 돌연변이된 유전자의 서열과 상이한 서열을 갖는다. 본 개시의 특정 구현예에서, 돌연변이된 유전자는 본원에 개시된 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 이용하여 만들어진 변경을 포함한다. 돌연변이된 식물은 적어도 하나의 돌연변이된 유전자를 포함하는 식물이다.
본원의 세포 또는 유기체에 포함된 "비 천연" 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 이러한 세포 또는 유기체의 천연 (자연적인) 상대로 발생하지 않는다.
본원에 사용된 "조절 서열"은 유전자의 전사 개시 부위(예를 들어, 프로모터), 5' 비해독 영역 및 3' 비 암호화 영역의 상류에 위치하며, 전사, 프로세싱 또는 안정성, 또는 유전자로부터 전사된 RNA의 번역에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원의 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 사일런서, 5' 비해독 선도 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위, 스템-루프 구조 및 유전자 발현의 조절에 관여하는 기타 요소를 포함할 수 있다. 본원의 하나 이상의 조절 요소는 본원의 암호화 영역에 대해 이종성일 수 있다.
본원에 사용된 "프로모터"는 유전자로부터의 RNA의 전사를 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 프로모터 서열은 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 있다. 프로모터는 고유 유전자로부터 그 전체가 유래될 수도 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래된 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 모든 환경하의 대부분의 경우에 세포에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "항시성 프로모터(constitutive promoter)"라 지칭된다. 본원의 하나 이상의 프로모터는 본원의 암호화 영역에 대해 이종성일 수 있다.
본원에 사용된 "강력한 프로모터"는 단위 시간당 상대적으로 많은 수의 생산 개시를 이끌 수 있는 프로모터를 지칭하고/지칭하거나, 세포 내 유전자의 평균 전사 수준보다 더 높은 수준의 유전자 전사를 유도하는 프로모터이다.
식물 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 식물 프로모터에 대한 보고서는 Potenza et al., (2004) In Vitro Cell Dev Biol 40:1-22 참조. 항시성 프로모터로는 예를 들어, Rsyn7 프로모터의 코어 프로모터 및 WO99/43838 및 미국 특허번호 6072050에 개시된 기타 항시성 프로모터; 코어 CaMV 35S 프로모터 (Odell et al., (1985) Nature 313:810-2); 쌀 액틴(McElroy et al., (1990) Plant Cell 2:163-71); 유비퀴틴(Christensen et al., (1989) Plant Mol Biol 12:619-32; Christensen et al., (1992) Plant Mol Biol 18:675-89); pEMU(Last et al., (1991) Theor Appl Genet 81:581-8); MAS(Velten et al., (1984) EMBO J 3:2723-30); ALS 프로모터(미국 특허 번호 5659026) 등을 들 수 있다. 기타 항시성 프로모터는 예를 들어, 미국 특허 번호 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 및 6177611에 기술되어 있다. 일부 예에서는 유도성 프로모터가 이용될 수 있다. 병원균에 의한 감염 후에 유도되는 병원균 유도성 프로모터로는 PR 단백질, SAR 단백질, 베타-1,3-글루카나제, 키티나제 등의 발현을 조절하는 것들을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
화학적으로 조절되는 프로모터는 외인성 화학적 조절자의 적용을 통해 식물에서 유전자의 발현을 조절하는 데 이용될 수 있다. 이러한 프로모터는 화학물질의 적용이 유전자 발현을 유도하는 화학물질 유도성 프로모터, 또는 화학물질의 적용이 유전자 발현을 억제하는 화학물질 억제성 프로모터일 수 있다. 화학물질 유도성 프로모터로는 벤젠 설폰아미드 제초제 약해경감제에 의해 활성화되는 옥수수 In2-2 프로모터(De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77), 잡초 발아 전에 사용하는 제초제로서 사용되는 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화되는 옥수수 GST 프로모터(GST-II-27, WO93/01294) 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1a 프로모터(Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기타 화학적으로 조절되는 프로모터로는 스테로이드 반응성 프로모터(예를 들어, 글루코코르티코이드 유도성 프로모터(Schena et al., (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10421-5; McNellis et al., (1998) Plant J 14:247-257); 테트라사이클린 유도성 및 테트라사이클린 억제성 프로모터(Gatz et al., (1991) Mol Gen Genet 227:229-37; 미국 특허 번호 5814618 및 5789156 참조)를 포함한다.
조직 선호 프로모터는 특정 식물 조직 내에서 발현 증진을 목표로 하는 데 활용될 수 있다. 조직 선호 프로모터로는 예를 들어, Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Hansen et al., (1997) Mol Gen Genet 254:337-43; Russell et al., (1997) Transgenic Res 6:157-68; Rinehart et al., (1996) Plant Physiol 112:1331-41; Van Camp et al., (1996) Plant Physiol 112:525-35; Canevascini et al., (1996) Plant Physiol 112:513-524; Lam, (1994) Results Probl Cell Differ 20:181-96; 및 Guevara-Garcia et al., (1993) Plant J 4:495-505를 들 수 있다. 잎 선호 프로모터로는 예를 들어, Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255-65; Kwon et al., (1994) Plant Physiol 105:357-67; Yamamoto et al., (1994) Plant Cell Physiol 35:773-8; Gotor et al., (1993) Plant J 3:509-18; Orozco et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1129-38; Matsuoka et al., (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:9586-90; Simpson et al., (1958) EMBO J 4:2723-9; Timko et al., (1988) Nature 318:57-8을 들 수 있다. 뿌리 선호 프로모터로는 예를 들어, Hire et al., (1992) Plant Mol Biol 20:207-18(대두 뿌리 특이적 글루타민 합성효소 유전자); Miao et al., (1991) Plant Cell 3:11-22(시토졸 글루타민 합성효소(GS)); Keller 및 Baumgartner, (1991) Plant Cell 3:1051-61(강낭콩의 GRP 1.8 유전자의 뿌리 특이적 조절 요소); Sanger et al., (1990) Plant Mol Biol 14:433-43(A. 투메파시엔스(tumefaciens) 만노파인(mannopine) 합성효소(MAS)의 뿌리 특이적 프로모터); Bogusz et al., (1990) Plant Cell 2:633-41 (파라스포니아 안데르소니(Parasponia andersonii) 및 트레마 토멘토사(Trema tomentosa)로부터 분리된 뿌리 특이적 프로모터); Leach 및 Aoyagi, (1991) Plant Sci 79:69-76 (A. 리조게네스(rhizogenes) rolC 및 rolD 뿌리 유도 유전자); Teeri et al., (1989) EMBO J 8:343-50(아그로박테리움(Agrobacterium) 상처 유도 TR1' 및 TR2' 유전자); VfENOD-GRP3 유전자 프로모터(Kuster et al., (1995) Plant Mol Biol 29:759-72); 및 rolB 프로모터(Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681-91; 파세올린 유전자(Murai et al., (1983) Science 23:476-82; Sengopta-Gopalen et al., (1988) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 82:3320-4)를 들 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5837876; 5750386; 5633363; 5459252; 5401836; 5110732 및 5023179 참조.
종자 선호 프로모터로는 종자 발달 중에 활성을 나타내는 종자 특이적 프로모터뿐만 아니라, 종자 발아 중에 활성을 나타내는 종자 발아 프로모터를 들 수 있다. Thompson et al., (1989) BioEssays 10:108 참조. 종자 선호 프로모터로는 Cim1(사이토키닌 유도 메세지); cZ19B1(옥수수 19 kDa 제인); 및 milps(미오-이노시톨-1-포스페이트 합성효소); (WO00/11177; 및 미국 특허 6225529)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 쌍떡잎식물의 경우, 종자 선호 프로모터로는 콩류 베타-파세올린, 나핀, 베타-콘글리시닌, 대두 렉틴, 크루시페린 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 외떡잎식물의 경우, 종자 선호 프로모터로는 옥수수 15 kDa 제인, 22 kDa 제인, 27 kDa 감마 제인, 왁시, 슈렁큰(shrunken) 1, 슈렁큰 2, 글로불린 1, 올레오신, 및 nuc1을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. END1 및 END2 유전자로부터의 종자 선호 프로모터가 개시된 WO00/12733도 참조할 것.
본원에 사용된 용어 "3' 비 암호화 서열", "전사 종결자" 및 "종결자"는 암호화 서열의 하류에 위치한 DNA 서열을 지칭한다. 이는 폴리아데닐화 인식 서열 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 신호를 암호화하는 기타 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "카세트"는 단백질 암호화 RNA 또는 비 단백질 암호화 RNA를 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 지칭한다. 카세트는 선택적으로 3' 비암호화 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 "상류" 및 "하류"는 각각 "이의 5'" 및 "이의 3'"을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 (i) 암호화 영역으로부터 RNA(예를 들어, mRNA, 또는 crRNA, tracrRNA 또는 gRNA와 같은 비 단백질 암호화 RNA)의 전사, 또는 (ii) mRNA로부터의 폴리펩티드의 번역을 지칭한다.
유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 설명하는 데 사용되는 경우, 용어 "하향 조절", "파괴", "억제", "불활성화" 및 "침묵화"는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사가 감소되거나 제거되는 경우를 지칭하도록 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이는 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 RNA 전사물의 감소 또는 제거를 초래하며, 이는 (유전자가 ORF를 포함한 경우) 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래된 단백질 발현의 감소 또는 제거를 초래한다. 대안적으로, 하향 조절은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 생성된 전사물로부터의 단백질 번역이 감소되거나 제거된 경우를 지칭할 수 있다. 또한, 대안적으로, 하향 조절은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된 단백질의 활성이 감소된 경우를 지칭할 수 있다. 세포에서 위의 공정(전사, 번역, 단백질 활성) 중 어느 하나의 감소는 적합한 대조 세포의 전사, 번역 또는 단백질 활성에 대하여 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있다. 하향 조절은, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 표적화 이벤트(예를 들어, 삽입-결실, 녹아웃)의 결과일 수 있다.
용어 "대조 세포" 및 "적합한 대조 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정 변형(예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 과발현, 폴리뉴클레오티드의 하향 조절)이 이루어진 세포(즉, "실험 세포")와 관련하여 언급될 수 있다. 대조 세포는 실험 세포의 특정 변형을 가지지 않거나 발현하지 않는 임의의 세포일 수 있다. 따라서, 대조 세포는 형질전환되지 않은 야생형 세포일 수 있거나, 유전적으로 변형될 수 있지만 유전적 형질전환을 발현하지 않는다. 예를 들어, 대조 세포는 실험 세포의 직접적인 부모일 수 있으며, 직접적인 부모 세포는 실험 세포에 있는 특정 변형을 가지지 않는다. 대안적으로, 대조 세포는 하나 이상의 세대에 의해 제거되는 실험 세포의 부모일 수 있다. 또한, 대안적으로, 대조 세포는 실험 세포의 형제일 수 있으며, 형제 세포는 실험세포에 존재하는 특정 변형을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "증가된"은 증가된 양 또는 활성이 비교되는 양 또는 활성보다 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 50%, 100%, 또는 200% 초과인 양 또는 활성을 지칭할 수 있다. 용어 "증가된", "상승된", "증진된", "보다 많은" 및 "개선된"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "증가된"은 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 특성화하는 데 사용될 수 있는데, 예를 들어, "증가된 발현"은 또한 "과발현"을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받는 둘 이상의 핵산 서열의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 그 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우에 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다시 말하면, 암호화 서열은 프로모터의 전사적 조절하에 있다. 암호화 서열은, 예를 들어, 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 또한, 예를 들어, crRNA는 crRNA의 tracrRNA 메이트 서열이 tracrRNA의 5' 서열과 어닐링하도록 본원의 tracrRNA에 작동 가능하게 연결(융합)될 수 있다. 이러한 작동 가능한 연결은 적합한 루프 형성 서열, 예컨대 GAAA(서열 번호 36), CAAA(서열 번호 37), 또는 AAAG(서열 번호 38)을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, RGEN은 하나 이상의 CPP에 작동 가능하게 연결(융합)될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합"은, 예를 들어, 화학적 합성에 의한 또는 유전자 조작 기법에 의해 분리된 핵산 세그먼트의 조작에 의한, 그렇지 않았다면 분리된 2개의 서열 세그먼트들의 인공적인 조합을 지칭한다.
본원의 재조합 구조물/벡터(예를 들어, 본원의 RNA 성분 카세트를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드, 또는 본원의 Cas 단백질 또는 Cas-CPP 융합 단백질을 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드)를 제조하는 방법은 예를 들어, J. Sambrook 및 D. Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); T.J. Silhavy et al. (Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1984); 및 F.M. Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. Current Protocols, John Wiley and Sons, Inc., NY, 2002)에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법을 따를 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형질전환"은 임의의 방법에 의한 숙주 유기체 또는 숙주 세포로의 핵산 분자의 전달을 지칭한다. 유기체/세포로 형질전환된 핵산 분자는 유기체/세포에서 독자적으로 복제하거나, 유기체/세포의 게놈으로 통합되거나, 복제되거나 통합되지 않고 세포에 일시적으로 존재하는 것일 수 있다. 플라스미드 및 선형 DNA 분자와 같은 형질전환에 적합한 핵산 분자의 비제한적인 예는 본원에 개시되어 있다.
본원의 "형질전환 식물"은 예를 들어, 그 게놈 내에 형질전환 단계에 의해 도입된 이종 기원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물을 포함한다. 이러한 이종 기원의 폴리뉴클레오티드는 게놈 내에 안정적으로 통합될 수 있어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 대대로 전달된다. 이러한 이종 기원의 폴리뉴클레오티드는 게놈 단독 내로 또는 재조합 DNA 구조물의 일부로 통합될 수 있다. 또한, 형질전환 식물은 그 게놈 내에 둘 이상의 이종 기원의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 각각의 이종 기원의 폴리뉴클레오티드는 이러한 형질전환 식물에 상이한 속성을 부여할 수 있다. 형질전환 식물 물질은 임의의 세포, 세포주, 캘러스, 조직, 식물 부분 또는 식물, 처음에 그렇게 변경된 형질전환체뿐만 아니라 초기의 형질전환체로부터 유성 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것들을 포함하는, 이종 기원의 핵산의 존재에 의해 변경된 유전형을 포함할 수 있다. 종래의 식물 육종법, 외래 폴리뉴클레오티드의 삽입을 초래하지 않는 게놈 편집 절차, 또는 자연적으로 발생하는 사건, 예컨대, 무작위 타화 수정, 비 재조합 바이러스 감염, 비 재조합 박테리아 형질변형, 비 재조합 전위, 또는 자연 돌연변이에 의한 게놈의 (염색체의 또는 염색체 외의) 변경은 형질전환체로 간주되지 않는다.
"표현형 마커"는 시각적 마커 및 그것이 양성의 선택 가능한 마커든 음성의 선택 가능한 마커든 선택 가능한 마커를 포함하는, 스크리닝이 가능하거나 선택 가능한 마커이다. 임의의 표현형 마커가 이용될 수 있다. 구체적으로, 선택 가능하거나 스크리닝 가능한 마커는 종종 특정한 조건 하에서, 그것을 함유하는 분자 또는 세포를 확인할 수 있게 하거나, 그것을 함유하는 분자 또는 세포를 선택할 수 있게 하거나, 그것을 함유하는 분자 또는 세포에 대해 선택할 수 있게 하는 DNA 세그먼트를 포함한다. 이들 마커는 활성, 예컨대, RNA, 펩티드, 또는 단백질의 생산(그러나 이에 한정되지 않음)을 암호화할 수 있거나, RNA, 펩티드, 단백질, 무기 및 유기 화합물 또는 조성물 등을 위한 결합 자리를 제공할 수 있다.
선택 가능한 마커의 예로는 제한 효소 부위를 포함하는 DNA 세그먼트; 항생제, 예컨대, 스펙티노마이신, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 바스타, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT)를 포함하는 독성 화합물에 대해 저항성을 제공하는 생성물을 암호화하는 DNA 세그먼트; 수용 세포에 결여되어 있는 생성물을 암호화하는 DNA 세그먼트(예컨대, tRNA 유전자, 영양요구성 마커); 용이하게 식별될 수 있는 생성물을 암호화하는 DNA 세그먼트(예를 들어, 표현형 마커, 예컨대, 베타-갈락토시다제, GUS; 형광 단백질, 예컨대, 녹색 형광 단백질(GFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP) 및 세포 표면 단백질); PCR을 위한 새로운 프라이머 부위의 생성(예컨대, 이전에는 나란히 놓여있지 않았던 두 DNA 서열의 병치), 제한 엔도뉴클레아제 또는 기타 DNA 변형 효소, 화학물질 등에 의해 영향 받지 않거나 영향 받는 DNA 서열의 포함; 및 식별을 가능하게 하는 특이적인 변형(예컨대, 메틸화)에 필요한 DNA 서열의 포함을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
추가적인 선택 가능한 마커로는 제초제 화합물, 예컨대, 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 이미다졸리논 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트(2,4-D)에 대해 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, Yarranton, (1992) Curr Opin Biotech 3:506-11; Christopherson et al., (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:6314-8; Yao et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol Microbiol 6:2419-22; Hu et al., (1987) Cell 48:555-66; Brown et al., (1987) Cell 49:603-12; Figge et al., (1988) Cell 52:713-22; Deuschle et al., (1989) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 86:5400-4; Fuerst et al., (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:2549-53; Deuschle et al., (1990) Science 248:480-3; Gossen, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al., (1993) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90:1917-21; Labow et al., (1990) Mol Cell Biol 10:3343-56; Zambretti et al., (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:3952-6; Baim et al., (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:5072-6; Wyborski et al., (1991) Nucleic Acids Res 19:4647-53; Hillen 및 Wissman, (1989) Topics Mol Struc Biol 10:143-62; Degenkolb et al., (1991) Antimicrob Agents Chemother 35:1591-5; Kleinschnidt et al., (1988) Biochemistry 27:1094-104; Bonin, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al., (1992) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 89:5547-51; Oliva et al., (1992) Antimicrob Agents Chemother 36:913-9; Hlavka et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al., (1988) Nature 334:721-4 참조.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 소정의 비교창에서 최대 상응도로 정렬되는 경우에 동일한 두 서열 내의 핵산 잔기 또는 아미노산 잔기를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성 백분율" 또는 "동일성 백분율"은 비교창에서 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하여 결정된 값을 지칭하며, 이때, 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 (삽입 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열과 비교하여 삽입 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 개수를 결정하여 일치하는 위치의 개수를 산출하고, 일치하는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산한다. DNA 서열과 RNA 서열 사이의 서열 동일성을 계산하는 경우, DNA 서열의 T 잔기가 RNA 서열의 U 잔기와 정렬되며, 이와 "동일"하다고 간주될 수 있음을 이해할 것이다. 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드의 백분율 상보성을 결정하기 위해, 예를 들어 (i) 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드의 보체 서열(또는 그 반대) 사이의 백분율 동일성, 및/또는 (ii) 표준(canonical) 왓슨과 크릭 염기쌍을 생성할 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 염기의 백분율을 결정함으로써 이를 얻을 수 있다.
예를 들어, 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 웹사이트에서 온라인으로 이용 가능한 기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool; BLAST) 알고리즘을 사용하여, 본원에 개시된 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열(BLASTN 알고리즘) 또는 폴리펩티드 서열(BLASTP 알고리즘) 사이의 백분율 동일성을 측정할 수 있다. 대안적으로, 서열 사이의 백분율 동일성은 클러스탈(Clustal) 알고리즘(예를 들어, 클러스탈W 또는 클러스탈V)을 사용하여 수행될 수 있다. 클러스탈 정렬 방법을 사용하는 다중 정렬의 경우, 디폴트 값은 갭 페널티(GAP PENALTY)=10 및 갭 길이 페널티(GAP LENGTH PENALTY)=10에 상응할 수 있다. 클러스탈 방법을 사용하는 단백질 서열의 백분율 동일성의 계산 및 쌍 정렬을 위한 디폴트 파라미터는 케이터플(KTUPLE)=1, 갭 페널티=3, 윈도우(WINDOW)=5 및 다이아고날스 세이브드(DIAGONALS SAVED)=5일 수 있다. 핵산의 경우, 이들 파라미터는 케이터플=2, 갭 페널티=5, 윈도우=4 및 다이아고날스 세이브드=4일 수 있다. 또한, 대안적으로, 서열 사이의 백분율 동일성은 블로섬(BLOSUM) 매트릭스(예를 들어, 블로섬62)를 사용하는 갭 오픈(GAP OPEN)=10, 갭 연장(GAP EXTEND)=0.5, 엔드 갭 페널티(END GAP PENALTY)=false, 엔드 갭 오픈=10, 엔드 갭 연장=0.5와 같은 파라미터를 갖는 엠보스(EMBOSS) 알고리즘(예를 들어, 니들(needle))을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에서, 제2 서열에 "상보적인" 제1 서열은 대안적으로 제2 서열에 대해 "안티센스(antisense)" 배향인 것으로 지칭될 수 있다.
다양한 폴리펩티드 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열은 개시된 본 발명의 특정 구현예의 특징으로서 본원에 개시되어 있다. 본원에 개시된 서열과 적어도 약 70 내지 85%, 85 내지 90%, 또는 90% 내지 95% 동일한 이들 서열의 변이체가 사용될 수 있다. 대안적으로, 변이체 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다. 변이체 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 개시된 서열과 동일한 기능/활성, 또는 개시된 서열의 기능/활성의 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 갖는다.
본원의 Cas9 단백질의 각각의 아미노산 위치에서의 본원에 개시된 모든 아미노산 잔기는 예이다. 특정 아미노산이 서로 유사한 구조적 특징 및/또는 전하 특징을 공유함(즉, 보존)을 고려하면, Cas9의 각 위치에서의 아미노산은 개시된 서열에서 제공된 것과 같거나, 다음과 같이 보존된 아미노산 잔기로 치환될 수 있다("보존적 아미노산 치환"):
1. 다음과 같은 작은 지방족의 비극성 또는 약간 극성인 잔기가 서로를 대체할 수 있다: Ala (A), Ser (S), Thr(T), Pro (P), Gly (G);
2. 다음과 같은 극성의 음으로 하전된 잔기 및 그들의 아미드가 서로를 대체할 수 있다: Asp (D), Asn (N), Glu (E), Gln (Q);
3. 다음과 같은 극성의 양으로 하전된 잔기가 서로를 대체할 수 있다: His (H), Arg (R), Lys (K);
4. 다음과 같은 지방족의 비극성 잔기가 서로를 대체할 수 있다: Ala (A), Leu (L), Ile (I), Val (V), Cys (C), Met (M); 및
5. 다음과 같은 큰 방향족 잔기가 서로를 대체할 수 있다: Phe (F), Tyr (Y), Trp (W).
세포 내에서 RGEN 매개성 DNA 표적화를 수행하기 위하여 세포 내에서 단백질 및 RNA 성분들을 발현시키는 데 있어서 진전이 이루어졌다(예컨대, 미국 가출원 번호 61/868,706 및 62/036,652). 이러한 전략은 전형적으로 표적 세포에서의 재조합 DNA 발현을 수반해왔다. RGEN 매개성 DNA 표적화를 매개하기 위하여 세포 내에서 단백질 및 RNA 성분들을 제공하는 추가적인 수단이 관심 대상이다.
개시된 발명의 구현예는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 이때, 이러한 RGEN 단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결되는 것인 조성물에 관한 것이다. 이러한 RGEN 단백질-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있다.
중요하게도, 개시된 발명의 특정 구현예는 RNA 성분과 이미 결합된(사전 결합된) RGEN을 세포 내로 전달하는 데 이용될 수 있다. 이러한 구현예는 RGEN RNA 성분을 발현하기 위하여 DNA 구조물을 세포 내로 전달할 필요성을 방지할 수 있어, 외인성 DNA를 세포 내로 도입하는 임의의 잠재적으로 원치 않는 효과를 피할 수 있다. 개시된 발명은 유연성이 있으나, 다른 특정 구현예에서, RGEN 단백질-CPP 복합체가 전달되는 세포에서 RNA 성분이 제공될 수 있다(예컨대, 발현될 수 있다). 이러한 방식으로 제공되는 RNA 성분은 RGEN 단백질-CPP 복합체가 세포 내로 전달/진입한 후 RGEN 단백질 성분과 결합할 수 있다. RNA 성분 전달 방식과 관계없이, 본원의 RGEN 단백질-CPP 복합체는 RNA 성분과 결합하여, 세포 내의 소정의 DNA 서열을 표적화할 수 있는 RGEN-CPP 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 개시된 발명은 RGEN 매개성 DNA 표적화를 수행하기 위하여 세포에 RGEN을 제공하기 위한 실질적인 유연성을 제공한다.
특정 구현예에 개시된 조성물은 RGEN의 적어도 하나의 단백질 성분을 포함한다. 본원에서 RGEN은 적어도 하나의 Cas 단백질과 적어도 하나의 RNA 성분을 포함하는 복합체를 지칭한다. 따라서, RGEN 단백질 성분은 Cas 단백질, 예컨대, Cas9를 지칭할 수 있다. 적합한 Cas 단백질의 예에는 유형 I, II 또는 III 크리스퍼 시스템 중 하나 이상의 Cas 엔도뉴클레아제가 포함된다(본원에 참고로 포함되는 Bhaya et al., Annu . Rev. Genet. 45:273-297). I형 크리스퍼 Cas 단백질은, 예를 들어 Cas3 또는 Cas4 단백질일 수 있다. II형 크리스퍼 Cas 단백질은, 예를 들어 Cas9 단백질일 수 있다. III형 크리스퍼 Cas 단백질은, 예를 들어 Cas10 단백질일 수 있다. Cas9 단백질이 바람직한 특정 구현예에서 사용된다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 박테리아 또는 고세균 단백질일 수 있다. 본원에서 I형 내지 III형 크리스퍼 Cas 단백질은 전형적으로 원핵생물 기원이며, 예를 들어, I형 및 III형 Cas 단백질은 박테리아 또는 고세균 종으로부터 유래될 수 있는 반면, II형 Cas 단백질(즉, Cas9)은 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 적합한 Cas 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체, 또는 변형된 버전 중 하나 이상을 포함한다.
개시된 발명의 다른 양태에서, 본원의 Cas 단백질은 다음의 속 중 임의의 것으로부터 유래할 수 있다: 아에로피룸(Aeropyrum), 피로바쿨룸(Pyrobaculum), 술폴로부스(Sulfolobus), 아캐오글로부스(Archaeoglobus), 할로아르쿨라(Haloarcula), 메타노박테리움(Methanobacteriumn), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노피러스(Methanopyrus), 피로코커스(Pyrococcus), 피크로필러스(Picrophilus), 써니오플라스니아(Thernioplasnia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아퀴펙스(Aquifex), 포르피로모나스(Porphyromonas), 클로로비움(Chlorobium), 써머스(Thermus), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 스타필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 마이코플라스마(Mycoplasma), 푸소박테리움(Fusobacterium), 아자쿠스(Azarcus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 디설포비브리오(Desulfovibrio), 게오박터(Geobacter), 미로코커스(Myrococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 볼리넬라(Wolinella), 아시네토박터(Acinetobacter), 에르위니아(Erwinia), 에스케리챠(Escherichia), 레지오넬라(Legionella), 메틸로코커스(Methylococcus), 파스퇴렐라(Pasteurella), 포토박테리움(Photobacterium), 살모넬라(Salmonella), 잔토모나스(Xanthomonas), 예시니아(Yersinia), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 프란시셀라(Francisella) 또는 써모토가(Thermotoga). 대안적으로, 본원의 Cas 단백질은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0093617에 개시된 바와 같이, 서열 번호 462 내지 465, 467 내지 472, 474 내지 477, 479 내지 487, 489 내지 492, 494 내지 497, 499 내지 503, 505 내지 508, 510 내지 516 또는 517 내지 521 중 임의의 것에 의해 암호화될 수 있다.
RGEN 단백질 성분은 예를 들어 Cas9 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 단백질 성분을 포함하는 RGEN은 전형적으로 RGEN의 엔도뉴클레아제 성분으로서 Cas9를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본원의 Cas9 단백질뿐만 아니라 본원의 기타 특정 Cas 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, 스트렙토코커스(예를 들어, S. 피오제네스(pyogenes), S. 뉴모니애(pneumoniae), S. 써모필러스(thermophilus), S. 아갈락티아(agalactiae), S. 파라상귀니스(parasanguinis), S. 오랄리스(oralis), S. 살리바리우스(salivarius), S. 마카카(macacae), S. 디스갈락티애(dysgalactiae), S. 안지노서스(anginosus), S. 콘스텔라투스(constellatus), S. 슈도포르시누스(pseudoporcinus), S. 뮤탄스(mutans)), 리스테리아(예를 들어, L. 인노쿠아(innocua)), 스피로플라즈마(Spiroplasma) (예를 들어, S. 아피스(apis), S. 시르피디콜라(syrphidicola)), 펩토스트렙토코카세(Peptostreptococcaceae), 아토포비움(Atopobium), 포르피로모나스(Porphyromonas) (예를 들어, P. 카토니아(catoniae)), 프레보텔라(Prevotella) (예를 들어, P. 인테르메디아(intermedia)), 베일로넬라(Veillonella), 트레포네마(Treponema)(예를 들어, T. 소크란스키(socranskii), T. 덴티콜라(denticola)), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 피네골디아(Finegoldia)(예를 들어, F. 마그나(magna)), 코리오박테리아세아에(Coriobacteriaceae)(예를 들어, C. 박테리움(bacterium)), 올스넬라(Olsenella)(예를 들어, O. 프로푸사(profusa)), 헤모필루스(Haemophilus)(예를 들어, H. 스푸토룸(sputorum), H. 피트마니아에(pittmaniae)), 파스퇴렐라(Pasteurella)(예를 들어, P. 베티아에(bettyae)), 올리비박터(Olivibacter)(예를 들어, O. 시티엔시스(sitiensis)), 에필리토니모나스(Epilithonimonas)(예를 들어, E. 테낙스(tenax)), 메소니아(Mesonia)(예를 들어, M. 모빌리스(mobilis)), 락토바실루스(Lactobacillus), 바실루스(예를 들어, B. 세레우스(cereus)), 아퀴마리나(Aquimarina)(예를 들어, A. 무엘레리(muelleri)), 크리세오박테리움(Chryseobacterium)(예를 들어, C. 파루스트레(palustre)), 박테로이데스(Bacteroides)(예를 들어, B. 그라미니솔벤스(graminisolvens)), 네이세리아(예를 들어, N. 메닝기티디스(meningitidis)), 프란시셀라(Francisella)(예를 들어, F. 노비시다(novicida)) 또는 플라보박테리움(Flavobacterium)(예를 들어, F. 프리기다리움(frigidarium), F. 솔리(soli)) 종으로부터 유래될 수 있다. 본원의 특정 양태에서 S. 피오제네스 Cas9가 바람직하다. 또 다른 예로서, Cas9 단백질은 본원에 참고로 포함되는 Chylinski et aL. (RNA Biology 10:726-737)에 개시된 Cas9 단백질 중 임의의 것일 수 있다.
따라서, 본원의 Cas9 단백질의 서열은, 예를 들어, 참고로 포함되는 진뱅크(GenBank) 등록번호 G3ECR1 (S. 써모필러스), WP_026709422, WP_027202655, WP_027318179, WP_027347504, WP_027376815, WP_027414302, WP_027821588, WP_027886314, WP_027963583, WP_028123848, WP_028298935, Q03JI6 (S. 써모필러스), EGP66723, EGS38969, EGV05092, EHI65578 (S. 슈도포르시누스), EIC75614 (S. 오랄리스), EID22027 (S. 콘스텔라투스), EIJ69711, EJP22331 (S. 오랄리스), EJP26004 (S. 안지노서스), EJP30321, EPZ44001 (S. 피오제네스), EPZ46028 (S. 피오제네스), EQL78043 (S. 피오제네스), EQL78548 (S. 피오제네스), ERL10511, ERL12345, ERL19088 (S. 피오제네스), ESA57807 (S. 피오제네스), ESA59254 (S. 피오제네스), ESU85303 (S. 피오제네스), ETS96804, UC75522, EGR87316 (S. 디스갈락티애), EGS33732, EGV01468 (S. 오랄리스), EHJ52063 (S. 마카카), EID26207 (S. 오랄리스), EID33364, EIG27013 (S. 파라상귀니스), EJF37476, EJO19166 (스트렙토코커스 종 BS35b), EJU16049, EJU32481, YP_006298249, ERF61304, ERK04546, ETJ95568 (S. 아갈락티아), TS89875, ETS90967 (스트렙토코커스 종 SR4), ETS92439, EUB27844 (스트렙토코커스 종 BS21), AFJ08616, EUC82735 (스트렙토코커스 종 CM6), EWC92088, EWC94390, EJP25691, YP_008027038, YP_008868573, AGM26527, AHK22391, AHB36273, Q927P4, G3ECR1 또는 Q99ZW2 (S. 피오제네스)에 개시된 Cas9 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 이들 Cas9 단백질 서열 중 임의의 것의 변이체가 사용될 수 있지만, 본원의 RNA 성분과 결합할 경우 DNA에 대한 특이적 결합 활성 및 선택적으로 절단 또는 닉킹 활성을 가져야 한다. 이러한 변이체는 기준 Cas9의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본원의 Cas9 단백질은, 예를 들어, (본원에 참고로 포함된) 미국 출원 공개 번호 2010/0093617에 개시된 바와 같은 서열 번호 462(S. 써모필러스), 474(S. 써모필러스), 489(S. 아갈락티아), 494(S. 아갈락티아), 499(S. 뮤탄스), 505(S. 피오제네스) 또는 518(S. 피오제네스) 중 임의의 것에 의해 암호화될 수 있다. 또한, 대안적으로, 본원의 Cas9 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 3, 또는 서열 번호 3의 잔기 1 내지 1368, 2 내지 1368, 또는 2 내지 1379의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 대안적으로, Cas9 단백질은, 예를 들어, 전술한 아미노산 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변이체인 Cas9 단백질은 본원의 RNA 성분과 결합할 경우 DNA에 대한 특이적 결합 활성, 및 선택적으로 절단 또는 닉킹 활성을 가져야 한다.
본원에서 사용된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)의 기원은 RNA 성분(들)이 유래된 것과 동일한 종으로부터 유래할 수 있거나, 그것은 상이한 종으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 종(예를 들어, S. 피오제네스 또는 S. 써모필러스)으로부터 유래된 Cas9 단백질을 포함하는 RGEN은 동일한 스트렙토코커스 종으로부터 유래된 서열(예를 들어, crRNA 반복 서열, tracrRNA 서열)을 갖는 적어도 하나의 RNA 성분과 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 본원에서 사용된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)의 기원은 RNA 성분(들)이 유래된 종과 상이한 종으로부터 유래할 수 있다(Cas 단백질 및 RNA 성분(들)은 서로 이종성일 수 있다); 이러한 이종 기원의 Cas/RNA 성분 RGEN은 DNA 표적화 활성을 가져야 한다.
소정의 표적 DNA 서열에 대한 본원의 Cas 단백질의 결합 활성 및/또는 엔도뉴클레오리틱 활성을 결정하는 것은 본원에 참고로 개시된 미국 특허 번호 8697359에 개시된 바와 같은, 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 분석법에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 세포에서 Cas 단백질과 적합한 RNA 성분을 발현한 후, 삽입-결실의 존재가 예측되는 DNA 표적 부위를 조사함으로써 결정이 이루어질 수 있다(이러한 특별한 분석법에서 Cas 단백질은 전형적으로 완전한 엔도뉴클레오리틱 활성[이중 가닥 절단 활성]을 가질 것이다). 예측되는 표적 부위에서 변형/변경(예를 들어, 삽입-결실)의 존재를 조사하는 것은, 예를 들어, DNA 시퀀싱 방법을 통해 또는 표적 서열의 기능 상실을 분석하여 변경/변형 형성을 추정함으로써 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, Cas 단백질 활성은, 표적 부위 또는 그 부근의 서열에 상동인 서열을 포함하는 공여 DNA를 제공한 세포에서 Cas 단백질과 적합한 RNA 성분을 발현시킴으로써 결정할 수 있다. (공여 서열과 표적 서열 사이의 성공적인 HR에 의해 예측되는 바와 같은) 표적 부위에서의 공여 DNA 서열의 존재는 표적화가 일어났음을 나타낼 것이다. 또 다른 예에서, Cas 단백질과 적합한 RNA 성분이, 적합한 표적 서열을 함유하는 DNA 폴리뉴클레오티드와 함께 서로 혼합되는 시험관 내 분석법을 이용하여 Cas 단백질 활성을 결정할 수 있다. 이러한 분석법은 절단 활성이 결여된 Cas 단백질에 의해 결합(예컨대, 겔 시프트)을 검출하거나, 엔도뉴클레오리틱 절단에 적합한 Cas 단백질에 의한 절단을 검출하는 데 이용될 수 있다.
본원의 Cas 단백질, 예컨대 Cas9는 특정 양태에서 이종 기원의 핵 국재화 서열(NLS)을 더 포함할 수 있다. 본원에서 이종 기원의 NLS 아미노산 서열은, 예를 들어, 본원의 세포의 핵에 검출 가능한 양으로 Cas 단백질 또는 Cas 단백질-CPP 복합체의 축적을 유도하기에 충분한 강도를 나타낼 수 있다. NLS는 염기성의, 양으로 하전된 잔기(예를 들어, 라이신 및/또는 아르기닌)의 하나(1부분(monopartite)) 이상(예를 들어, 2부분(bipartite))의 짧은 서열(예를 들어, 2 내지 20개의 잔기)을 포함할 수 있으며, Cas 아미노산 서열 중 어디에도 위치할 수 있지만 단백질 표면 상에 노출되어야 한다. NLS는, 예를 들어, 본원의 Cas 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 둘 이상의 NLS 서열이 예를 들어 Cas 단백질에 연결될 수 있는데, 예를 들어 Cas 단백질의 N 말단과 C 말단 모두에 연결될 수 있다. 본원에서 적합한 NLS 서열의 비제한적인 예에는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 6660830 및 7309576(예를 들어, 그 안의 표 1)에 개시된 것들이 포함된다. 본원에서 유용한 NLS의 또 다른 예에는 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1373 내지 1379가 포함된다. 본원에 개시된 Cas 단백질은 예를 들어 CPP에 융합될 수 있다(CPP에 공유적으로 연결된 Cas 단백질의 예). 이러한 Cas-CPP 융합 단백질도 위에 기술된 NLS를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, Cas 단백질이 상이한 세포 기관(예컨대, 미토콘드리아)을 표적화하는 아미노산 서열과 융합되는 구현예에서, 이러한 Cas 단백질은 전형적으로 NLS를 함유하지 않으리라는 점이 이해될 것이다.
특정 구현예에서, Cas 단백질에 의한 DNA 특이적 표적화를 유도하는 Cas 단백질 및 이의 각각의 RNA 성분(예를 들어, crRNA)은 세포, 특히 비 원핵 세포에 이종성일 수 있다. 이들 RGEN 성분의 이종성은 Cas 단백질 및 이들의 각각의 RNA 성분들이 원핵생물(박테리아 및 고세균)에만 존재하는 것으로 알려져 있기 때문이다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 하나 이상의 이종 기원의 단백질 도메인(예를 들어, Cas 단백질에 더하여 1개, 2개, 3개 이상의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. 이들 구현예는 예를 들어, CPP 및 하나 이상의 추가적인 이종 기원의 아미노산 서열에 공유적으로 연결된 Cas 단백질을 포함할 수 있다. 다른 구현예는 예를 들어 CPP를 포함하지 않는, 하나 이상의 추가적인 이종 기원의 아미노산 서열에 공유적으로 연결된 Cas 단백질을 포함할 수 있다(이러한 구현예에서 CPP는 Cas 융합 단백질에 비 공유적으로 연결될 것이다). Cas 단백질을 포함하는 융합 단백질은 임의의 추가적인 단백질 서열, 및 선택적으로 임의의 두 도메인 사이, 예컨대, Cas와 제1 이종 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. 본원의 Cas 단백질에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예에는 에피토프 태그(예를 들어, 히스티딘 [His, 폴리-히스티딘], V5, FLAG, 인플루엔자 혈구응집소 [HA], myc, VSV-G, 티오레독신 [Trx]), 리포터(예를 들어, 글루타티온-5-트랜스퍼라제 [GST], 홀스래디쉬 퍼록시다제 [HRP], 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 [CAT], 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제 [GUS], 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 [GFP], HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질[CFP], 황색 형광 단백질 [YFP], 청색 형광 단백질 [BFP]) 및 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성(예를 들어, VP16 또는 VP64), 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성 중 하나 이상을 갖는 도메인이 제한 없이 포함된다. 다른 구현예에서, Cas 단백질은 DNA 분자 또는 다른 분자, 예컨대 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD), GAL4A DNA 결합 도메인 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV) VP16에 결합하는 단백질과 융합될 수 있다. 본원의 Cas 단백질을 포함하는 융합 단백질의 일부가 될 수 있는 추가적인 도메인은 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0059502에 개시되어 있다. Cas 단백질이 이종 기원의 단백질(예를 들어, 전사 인자)에 융합되는 특정 구현예에서, Cas 단백질은 (본원의 적합한 RNA 성분과 복합체인 경우) DNA 인식 및 결합 활성을 가지나, DNA 닉킹 또는 절단 활성은 없다. 본원에 개시된 Cas 단백질은 예를 들어 CPP에 융합될 수 있다(CPP에 공유적으로 연결된 Cas 단백질의 예). 이러한 Cas-CPP 융합 단백질도, 원하는 경우, 위에 기술된 하나 이상의 이종 도메인과 융합될 수 있음이 이해될 것이다.
본원의 Cas 단백질에 연결될 수 있는 이종 기원의 도메인의 다른 예로 단백질을 특정 세포 기관으로 표적화하는 아미노산 서열들을 들 수 있다(즉, 국재화 신호). 표적화될 수 있는 세포 기관의 예로 미토콘드리아와 엽록체를 들 수 있다. 전형적으로, 핵 외부의 DNA 자리를 표적화할 때, 이러한 표적화 도메인이 NLS 대신 이용된다. 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)은 예를 들어, Cas 단백질의 N 말단에 또는 그 부근에 위치할 수 있다. MTS 예는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0011759 및 2014/0135275에 개시되어 있다. 엽록체 표적화 서열은 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0192262 또는 2012/0042412에 개시된 바와 같을 수 있다.
RGEN의 단백질 성분은 예를 들어, 세포 내의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 성분과 결합될 수 있다(그에 의해 완전한 RGEN을 구성함). 이러한 구현예에서 RGEN은 표적 부위 서열과 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 하나 또는 두 DNA 가닥을 절단할 수 있다. RGEN은 예를 들어, DNA 표적 서열의 한 가닥 또는 두 가닥을 절단할 수 있다. 또 다른 예에서, RGEN은 DNA 표적 서열의 두 가닥을 절단할 수 있다. 모든 이러한 구현예에서, RGEN 단백질 성분은 RGEN 단백질-CPP 복합체에서 적어도 하나의 CPP에 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결될 수 있음이 이해될 것이다. 본원의 RNA 성분과 RGEN 단백질-CPP 복합체의 결합은 RGEN-CPP 복합체를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다. RGEN에 관한 본원의 임의의 개시 내용은 달리 언급되지 않는 한 RGEN-CPP 복합체의 RGEN 성분에 비슷하게 적용될 수 있다.
DNA 표적 서열의 두 가닥을 절단할 수 있는 본원의 RGEN은 전형적으로 이의 엔도뉴클레아제 도메인 모두를 기능적 상태(functional state)로 가지는 Cas 단백질을 포함한다(예를 들어, 야생형 엔도뉴클레아제 도메인 또는 각각의 엔도뉴클레아제 도메인에서 일부 또는 모든 활성을 보유하는 이들의 변이체). 따라서, 야생형 Cas 단백질(예를 들어, 본원에 개시된 Cas9 단백질) 또는 Cas 단백질의 각각의 엔도뉴클레아제 도메인에서 일부 또는 모든 활성을 보유하는 이의 변이체가 DNA 표적 서열의 두 가닥을 절단할 수 있는 RGEN의 적합한 예이다. 기능적 RuvC 및 HNH 뉴클레아제 도메인을 포함하는 Cas9 단백질은 DNA 표적 서열의 두 가닥을 절단할 수 있는 Cas 단백질의 예이다. DNA 표적 서열의 두 가닥을 절단할 수 있는 본원의 RGEN은 전형적으로, 절단 부위에 평활 말단(즉, 뉴클레오티드 돌출부가 없음)을 형성하도록 동일한 위치에서 두 가닥을 절단한다.
DNA 표적 서열의 한 가닥을 절단할 수 있는 본원의 RGEN은 본원에서 닉카아제 활성(예를 들어, 부분 절단 능력)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본원의 Cas 닉카아제(예를 들어, Cas9 닉카아제)는 전형적으로, Cas가 DNA 표적 서열 중 한 가닥만 절단하도록 하는(즉, 닉을 형성하도록 하는) 하나의 기능적 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다. 예를 들어, Cas9 닉카아제는 (i) 돌연변이 기능장애 RuvC 도메인 및 (ii) 기능적 HNH 도메인(예를 들어, 야생형 HNH 도메인)을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, Cas9 닉카아제는 (i) 기능적 RuvC 도메인(예를 들어, 야생형 RuvC 도메인) 및 (ii) 돌연변이 기능장애 HNH 도메인을 포함할 수 있다.
본원에서 사용하기에 적합한 Cas9 닉카아제의 비제한적인 예는 본원에 참고로 포함되는 Gasiunas et al. (Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 109:E2579-E2586), Jinek et al. (Science 337:816-821), Sapranauskas et al. (Nucleic Acids Res. 39:9275-9282) 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0189896에 개시되어 있다. 예를 들어, 본원에서 Cas9 닉카아제는 Asp-31 치환(예를 들어, Asp-31-Ala)(돌연변이 RuvC 도메인의 예), 또는 His-865 치환(예를 들어, His-865-Ala), Asn-882 치환(예를 들어, Asn-882-Ala), 또는 Asn-891 치환(예를 들어, Asn-891-Ala)(돌연변이 HNH 도메인의 예)을 갖는 S. 써모필러스 Cas9를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 본원에서 Cas9 닉카아제는 Asp-10 치환(예를 들어, Asp-10-Ala), Glu-762 치환(예를 들어, Glu-762-Ala), 또는 Asp-986 치환(예를 들어, Asp-986-Ala)(돌연변이 RuvC 도메인의 예), 또는 His-840 치환(예를 들어, His-840-Ala), Asn-854 치환(예를 들어, Asn-854-Ala), 또는 Asn-863 치환(예를 들어, Asn-863-Ala)(돌연변이 HNH 도메인의 예)을 갖는 S. 피오제네스 Cas9를 포함할 수 있다. S. 피오제네스 Cas9에 관하여, 3개의 RuvC 서브도메인은 일반적으로 각각 아미노산 잔기 1 내지 59, 718 내지 769 및 909 내지 1098에 위치하고, HNH 도메인은 아미노산 잔기 775 내지 908에 위치한다(Nishimasu et al., Cell 156:935-949).
본원에서 Cas9 닉카아제는 원하는 경우, 세포에서 다양한 용도로 이용될 수 있다. 예를 들어, Cas9 닉카아제는 적합한 공여 폴리뉴클레오티드를 갖는 DNA 표적 부위 서열에서 또는 그 부근에서 HR을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 닉이 있는 DNA는 NHEJ 공정을 위한 기질은 아니지만 HR 공정에 의해 인식되므로, 소정의 표적 부위에서 DNA에 닉을 형성하는 것은 그 자리가 적합한 공여 폴리뉴클레오티드를 사용하는 HR을 더 잘 수용할 수 있게 해야 한다.
또 다른 예로서, DNA 표적화의 특이성을 증가시키기 위해 한 쌍의 Cas9 닉카아제가 사용될 수 있다. 일반적으로, 이는, 상이한 가이드 서열을 갖는 RNA 성분들과 결합되어 있기 때문에, 원하는 표적화를 위한 영역에서 반대 가닥 상의 가까운 DNA 서열을 표적화하고 닉을 형성하는 2개의 Cas9 닉카아제를 제공함으로써 수행될 수 있다. 각각의 DNA 가닥의 이러한 가까운 절단은 DSB(즉, 단일-가닥 돌출부를 갖는 DSB)를 생성하고, 이는 이어서 NHEJ(삽입-결실 형성을 유도함) 또는 HR(제공된다면, 적합한 공여 폴리뉴클레오티드와의 재조합을 유도함)의 기질로 인식된다. 이러한 구현예에서 각각의 닉은, 예를 들어, 서로 적어도 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100(또는 5와 100 사이의 임의의 정수)개의 염기만큼 이격될 수 있다. 본원에서 하나 또는 두 개의 Cas9 닉카아제 단백질이 위에서 기술한 바와 같이 Cas9 닉카아제 쌍에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 RuvC 도메인을 가지나 기능하는 HNH 도메인을 갖는 Cas9 닉카아제(즉, Cas9 HNH+/RuvC-)(예를 들어, S. 피오제네스 Cas9 HNH+/RuvC-)를 사용할 수 있다. 각각의 닉카아제를 각각의 특정 DNA 부위로 표적화하는 가이드 RNA 서열을 갖는 본원의 적합한 RNA 성분들을 사용하여, 서로 가까운 (100개 이하의 염기쌍만큼 이격된) 소정의 DNA 부위로 각각의 Cas9 닉카아제(예를 들어, Cas9 HNH+/RuvC-)를 유도할 것이다.
특정 구현예에서 RGEN은 DNA 표적 부위 서열에 결합할 수 있지만, 표적 부위 서열에서 임의의 가닥을 절단하지 않는다. 이러한 RGEN은 이의 모든 뉴클레아제 도메인이 돌연변이 기능장애인 Cas 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, DNA 표적 부위 서열에 결합할 수 있지만, 표적 부위 서열에서 임의의 가닥을 절단하지 않는 본원의 Cas9 단백질은 돌연변이 기능장애 RuvC 도메인 및 돌연변이 기능장애 HNH 도메인을 둘 다 포함할 수 있다. 이러한 Cas9 단백질의 비제한적인 예에는 위에 개시된 RuvC 및 HNH 뉴클레아제 도메인 돌연변이 중 임의의 것(예를 들어, Asp-10 치환, 예컨대 Asp-10-Ala 및 His-840 치환, 예컨대 His-840-Ala을 갖는 S. 피오제네스 Cas9)이 포함된다. 표적 DNA 서열에 결합하지만 절단하지 않는 본원의 Cas 단백질은 유전자 발현을 조절하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 이 경우 Cas 단백질은 전사 인자(또는 이의 일부)(예를 들어, 억제 인자 또는 활성 인자, 예컨대 본원에 개시된 것들 중 임의의 것)와 융합될 수 있다. 예를 들어, Asp-10 치환(예를 들어, Asp-10-Ala) 및 His-840 치환(예를 들어, His-840-Ala)을 갖는 S. 피오제네스 Cas9를 포함하는 Cas9는 VP16 또는 VP64 전사 활성 인자 도메인에 융합될 수 있다. 이러한 RGEN의 RNA 성분에서 사용되는 가이드 서열은, 예를 들어 유전자 프로모터 또는 다른 조절 요소(예를 들어, 인트론) 내의 DNA 서열에 상보적일 것이다.
본원의 RGEN은 세포의 게놈 내의 염색체, 에피솜 또는 임의의 다른 DNA 분자의 표적 부위 서열과 결합할 수 있고, 선택적으로 이러한 표적 부위 서열의 한 가닥 또는 두 가닥을 절단할 수 있다. RGEN의 RNA 성분이 표적 서열의 가닥에 상보적인 서열(가이드 서열)을 포함한다는 점을 고려할 때, 표적 서열의 이러한 인식 및 결합은 특이적인 것이다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 유일할 수 있다(즉, 대상 게놈에서 표적 부위 서열은 한번만 발생한다).
본원에서 표적 서열의 길이는, 예를 들어, 적어도 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 뉴클레오티드; 13 내지 30개의 뉴클레오티드; 17 내지 25개의 뉴클레오티드; 또는 17 내지 20개의 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 길이는 PAM 서열을 포함하거나 제외할 수 있다. 또한, 본원에서 표적 서열의 가닥은, 가이드 서열과 혼성화되고 (적합한 PAM이 표적 서열에 인접한 경우, 아래 참조) Cas 단백질 또는 Cas 단백질 복합체의 표적 서열과의 서열 특이적 결합을 유도하기 위하여, (crRNA 또는 gRNA의) 가이드 서열과 충분한 상보성을 갖는다. 가이드 서열과 이의 상응하는 DNA 표적 서열의 가닥 사이의 상보성 정도는, 예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 본원에서 표적 부위는, 예를 들어, 유전자 산물(예를 들어, 단백질 또는 RNA)을 암호화하는 서열 또는 비 암호화 서열(예를 들어, 조절 서열 또는 "정크" 서열) 내에 위치할 수 있다.
PAM(프로토스페이서-인접 모티프) 서열은 표적 부위 서열에 인접할 수 있다. PAM 서열은 본원의 RGEN에 의해 인식되는 짧은 DNA 서열이다. 결합된 PAM 및 DNA 표적 서열의 처음 11개의 뉴클레오티드는 Cas9/gRNA 표적화 및 절단에 중요할 수 있다(Jiang et al., Nat. Biotech. 31:233-239). 본원에서 PAM 서열의 길이는 사용되는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질 복합체에 따라 다를 수 있지만, 전형적으로는, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 뉴클레오티드 길이이다. PAM 서열은, 예를 들어, 결과적으로 RNA 성분 가이드 서열에 상보적인 표적 부위의 가닥에 상보적인 표적 부위 서열로부터 바로 하류에, 또는 이의 하류에 있는 2 또는 3개의 뉴클레오티드 내에 있다. RGEN이 RNA 성분과 엔도뉴클레오리틱한 활성이 있는 Cas9 단백질 복합체를 형성한 본원의 실시 형태에서, Cas9는 RNA 성분에 의해 유도된 바와 같이 표적 서열과 결합하고, PAM 서열 상류의 세 번째 뉴클레오티드 위치의 바로 5'에서 두 가닥을 절단한다. 표적 부위:PAM 서열의 다음의 예를 고려한다:
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNXGG-3’ (서열 번호 43). 이러한 예의 서열에서, N은 A, C, T 또는 G일 수 있고, X는 A, C, T 또는 G일 수 있다(X는 또한 NPAM으로도 지칭됨). 이러한 예에서 PAM 서열은 (밑줄 친) XGG이다. 적합한 Cas9/RNA 성분 복합체는 이중 밑줄 친 N의 바로 5'에서 이러한 표적을 절단할 것이다. 서열 번호 43에서 일련의 N은 본원의 RNA 성분의 가이드 서열과, 예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 표적 서열을 나타낸다(여기서, DNA 표적 서열의 임의의 T는 RNA 가이드 서열의 임의의 U와 정렬될 것이다). (본원에서 표적 부위를 나타내는) 이러한 표적 서열을 인식하고 결합하는 데 있어서, Cas9 복합체의 RNA 성분의 가이드 서열은, 일련의 N의 보체 서열과 어닐링될 것이며; 가이드 서열과 표적 부위 보체 사이의 퍼센트 상보성은, 예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. Cas9 닉카아제가 게놈에서 서열 번호 43을 표적화하는 데 사용되는 경우, 닉카아제는 닉카아제의 어느 엔도뉴클레아제 도메인이 기능장애인지에 따라, 이중 밑줄 친 N의 바로 5'에서 또는 상보성 가닥의 동일한 위치에서 닉을 형성할 것이다. (RuvC와 HNH 도메인이 모두 기능장애인) 핵산 분해 활성이 없는 Cas9가 게놈에서 서열 번호 43을 표적화하는데 사용되는 경우, 그것은 표적 서열을 인식하고 결합하지만, 서열에 어떠한 절단도 만들지 않을 것이다.
본원에서 PAM은 전형적으로, 사용되는 RGEN의 유형을 고려하여 선택된다. 본원에서 PAM 서열은, 예를 들어, Cas가 유래될 수 있는 본원에 개시된 임의의 종으로부터 유래된 Cas, 예컨대 Cas9를 포함하는 RGEN에 의해 인식되는 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 PAM 서열은 S. 피오제네스, S. 써모필러스, S. 아갈락티아, N. 메닝기티디스, T. 덴티콜라 또는 F. 노비시다로부터 유래된 Cas9를 포함하는 RGEN에 의해 인식되는 것일 수 있다. 예를 들어, S. 피오제네스로부터 유래된 적합한 Cas9는 NGG의 PAM 서열(서열 번호 44; N은 A, C, T 또는 G일 수 있음)을 갖는 게놈 서열을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 다른 예로서, 적합한 Cas9는 다음과 같은 PAM 서열을 갖는 DNA 서열을 표적화하는 경우 다음의 종 중 임의의 것로부터 유래될 수 있다: S. 써모필러스(NNAGAA[서열 번호 45]), S. 아갈락티아 (NGG[서열 번호 44]), NNAGAAW[서열 번호 46, W는 A 또는 T임], NGGNG[서열 번호 47]), N. 메닝기티디스(NNNNGATT[서열 번호 48]), T. 덴티콜라(NAAAAC[서열 번호 49]), 또는 F. 노비시다(NG[서열 번호 50])(여기서, 이러한 모든 특정 PAM 서열에서 N은 A, C, T 또는 G임). 본원에서 유용한 Cas9/PAM의 다른 예에는, 본원에 참고로 포함되는 Shah et al. (RNA Biology 10:891-899) 및 Esvelt et al. (Nature Methods 10:1116-1121)에 개시된 것들이 포함된다. 본원의 표적 서열들의 예는 서열 번호 43을 따르지만, 'XGG' PAM은 전술한 PAM 중 어느 하나에 의해 대체된다.
본원의 RNA 성분은 세포의 염색체 또는 에피솜의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. RGEN은 이러한 서열 상보성을 기초로, 표적 부위 서열과 특이적으로 결합할 수 있고, 선택적으로 이러한 표적 부위 서열의 한 가닥 또는 두 가닥을 절단할 수 있다. 따라서, 개시된 발명의 특정 구현예에서 RNA 성분의 상보적인 서열은 가이드 서열 또는 가변 표적화 도메인으로도 지칭될 수 있다.
본원에서 RNA 성분(예를 들어, crRNA 또는 gRNA)의 가이드 서열은 길이가, 예를 들어, 적어도 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 리보뉴클레오티드; 13개 내지 30개의 리보뉴클레오티드; 17개 내지 25개의 리보뉴클레오티드; 또는 17개 내지 20개의 리보뉴클레오티드일 수 있다. 일반적으로, 본원의 가이드 서열은 표적 DNA 서열의 가닥에 대해 충분한 상보성을 가져, 표적 서열과 혼성화되어 (적합한 PAM이 표적 서열에 인접한 경우) 표적 서열에 Cas 단백질 또는 Cas 단백질 복합체의 서열 특이적인 결합을 유도한다. 가이드 서열과 이의 상응하는 DNA 표적 서열 사이의 상보성 정도는, 예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 가이드 서열은 세포의 DNA 표적 서열로 RGEN을 표적화하도록 적절히 유전자 조작될 수 있다.
본원의 RNA 성분은, 예를 들어, 가이드 서열 및 반복 (tracrRNA 메이트) 서열을 포함하는 crRNA를 포함할 수 있다. 가이드 서열은 전형적으로 crRNA의 5' 말단에 또는 그 부근(1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 염기 내에)에 위치한다. crRNA의 가이드 서열의 하류는 tracrRNA의 5' 말단에서 서열에 상보적이고 이와 혼성화될 수 있는 "반복" 또는 "tracrRNA 메이트" 서열이다. 가이드 및 tracrRNA 메이트 서열은, 예를 들어, 바로 인접하거나, 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 염기에 의해 이격될 수 있다. tracrRNA 메이트 서열은 tracrRNA의 5' 말단에, 예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상보성을 갖는다. 일반적으로, 상보성 정도는 tracrRNA 메이트 서열과 tracrRNA 서열의 5' 말단의 최적 정렬을 참고하여, 두 서열 중 더 짧은 것의 길이에 따를 수 있다. 본원의 tracrRNA 메이트 서열의 길이는, 예를 들어 적어도 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 18개의 리보뉴클레오티드 길이일 수 있고, tracrRNA의 5' 말단에서 동일하거나 유사한 길이 (예를 들어, 플러스 또는 마이너스 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 염기)의 서열과 혼성화된다. 본원에서 tracrRNA 메이트 서열의 적합한 예에는 서열 번호 51(guuuuuguacucucaagauuua), 서열 번호 52(guuuuuguacucuca), 서열 번호 53 (guuuuagagcua), 또는 서열 번호 54(guuuuagagcuag), 또는 (i) 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, (ii) tracrRNA의 5'-말단 서열과 어닐링할 수 있는, 이들의 변이체가 포함된다. 본원의 crRNA의 길이는, 예를 들어, 적어도 약 18개, 20개, 22개, 24개, 26개, 28개, 30개, 32개, 34개, 36개, 38개, 40개, 42개, 44개, 46개 또는 48개의 리보뉴클레오티드; 또는 약 18개 내지 48개의 리보뉴클레오티드; 또는 약 25개 내지 50개의 리보뉴클레오티드일 수 있다.
tracrRNA는, II형 크리스퍼 시스템의 Cas9 단백질이 RGEN에 포함되는 구현예에서, crRNA와 함께 포함될 수 있다. 본원의 tracrRNA는 5'에서 3' 방향으로 (i) crRNA의 반복 영역(tracrRNA 메이트 서열)과 어닐링하는 서열 및 (ii) 스템 루프를 함유하는 부분을 포함한다. (i)의 서열의 길이는, 예를 들어, 위에 개시된 임의의 tracrRNA 메이트 서열의 길이와 동일하거나 유사할 수 있다(예를 들어, 플러스 또는 마이너스 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 염기). 본원의 tracrRNA의 총 길이(즉, 서열 성분 [i] 및 [ii])는, 예를 들어, 적어도 약 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 또는 90(또는 30 내지 90 사이의 임의의 정수)개의 리보뉴클레오티드일 수 있다. tracrRNA는 3'-말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 우라실 잔기를 더 포함할 수 있으며, 이는 전사 종결자 서열을 갖는 tracrRNA를 발현함으로써 존재할 수 있다.
본원의 tracrRNA는, 예를 들어, Cas9 서열이 유래될 수 있는, 위에 열거된 임의의 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다. 적합한 tracrRNA 서열의 예에는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 8697359 및 Chylinski et al. (RNA Biology 10:726-737)에 개시된 것들이 포함된다. 본원에서 바람직한 tracrRNA는 스트렙토코커스 종 tracrRNA(예를 들어, S. 피오제네스, S. 써모필러스)로부터 유래될 수 있다. 본원의 tracrRNA의 기타 적합한 예는
서열 번호 55:
uagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc,
서열 번호 56:
uagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaagug, 또는
서열 번호 57:
uagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuauca,
을 포함할 수 있으며, 이들은 S. 피오제네스 tracrRNA로부터 유래된다. 본원의 tracrRNA의 기타 적합한 예는
서열 번호 58:
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서열 번호 59:
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서열 번호 60:
ugcagaagcuacaaagauaaggcuucaugccgaaaucaacacccugucauuuuauggcagggugu,
을 포함할 수 있으며, 이들은 S. 써모필러스 tracrRNA로부터 유래된다.
본원의 tracrRNA의 또 다른 예는 (i) 적어도 약 80%, 85%, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, (ii) tracrRNA로서 작용할 수 있는, 이들 tracrRNA 서열 번호의 변이체이다(예를 들어, 5'-말단 서열은 crRNA의 tracrRNA 메이트 서열에 어닐링할 수 있고, 5'-말단 서열의 하류 서열은 하나 이상의 헤어핀을 형성할 수 있으며, 변이체 tracrRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있다).
본원에 개시된 RGEN의 RNA 성분(또는 상기 또 다른 방식에서, RGEN 단백질 성분과 결합될 수 있는 RNA 성분)은, 예를 들어, tracrRNA에 작동 가능하게 연결되거나 융합된 crRNA를 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함할 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, gRNA의 crRNA 성분은 tracrRNA 성분의 상류에 있다(즉, 이러한 gRNA는 5'에서 3' 방향으로 tracrRNA에 작동 가능하게 연결된 crRNA를 포함한다). 본원(예를 들어, 위의 구현예)에 개시된 바와 같은 임의의 crRNA 및/또는 tracrRNA(및/또는 이들의 부분, 예컨대 crRNA 반복 서열, tracrRNA 메이트 서열 또는 tracrRNA 5'-말단 서열)는, 예를 들어, gRNA에 포함될 수 있다.
본원에서 gRNA의 crRNA 성분의 tracrRNA 메이트 서열은 tracrRNA 성분의 5'-말단과 어닐링함으로써, 헤어핀 구조를 형성할 수 있어야 한다. (crRNA 성분의) tracrRNA 메이트 서열과 (tracrRNA 성분의) 5'-말단 서열 사이의 길이 및 퍼센트 상보성에 관한 위의 개시 내용 중 임의의 것은, 예를 들어 gRNA의 crRNA 및 tracrRNA 성분을 특징지을 수 있다. 이러한 어닐링을 용이하게 하기 위해, crRNA와 tracrRNA 성분의 작동 가능한 결합 또는 융합은 바람직하게는 적합한 루프 형성 리보뉴클레오티드 서열을 포함한다(즉, 루프 형성 서열은 crRNA와 tracrRNA 성분을 함께 연결하여 gRNA를 형성할 수 있다). RNA 루프 형성 서열의 적합한 예에는 GAAA(서열 번호 36), CAAA(서열 번호 37) 및 AAAG(서열 번호 38)가 포함된다. 그러나 대체 루프 서열이 사용되는 바와 같이, 더 길거나 더 짧은 루프 서열이 사용될 수 있다. 루프 서열은 바람직하게는, 리보뉴클레오티드 트리플렛(예를 들어, AAA) 및 트리플렛의 어느 한 말단에 추가적인 리보뉴클레오티드(예를 들어, C 또는 G)를 포함한다.
본원의 gRNA는 (crRNA 성분의) tracrRNA 메이트 서열과 tracrRNA 5'-말단 서열 부분을 어닐링하여 헤어핀("제1 헤어핀")을 형성한다. gRNA의 tracrRNA 성분의 서열에 따라, 하나 이상의(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개의) 추가적인 헤어핀 구조가 이러한 제1 헤어핀의 하류에 형성될 수 있다. 따라서, gRNA는, 예를 들어 최대 5개의 헤어핀 구조를 가질 수 있다. gRNA는 gRNA 서열의 말단에 이어지는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 이상의 잔기를 더 포함할 수 있는데, 이는, 예를 들어 전사 종결자 서열을 갖는 gRNA를 발현함으로써 존재할 수 있다. 이들 추가적인 잔기는, 예를 들어, 종결자 서열의 선택에 따라, 모두 U 잔기, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% U 잔기일 수 있다.
개시된 발명에 유용한, 적합한 gRNA의 비제한적인 예는
서열 번호 61:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuuguacucucaagauuuaGAAAuaaaucuugcagaagcuacaaagauaaggcuucaugccgaaaucaacacccugucauuuuauggcaggguguuuucguuauuuaa,
서열 번호 62:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuuguacucucaGAAAugcagaagcuacaaagauaaggcuucaugccgaaaucaacacccugucauuuuauggcaggguguuuucguuauuuaa,
서열 번호 63:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuuguacucucaGAAAugcagaagcuacaaagauaaggcuucaugccgaaaucaacacccugucauuuuauggcagggugu,
서열 번호 64:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuuguacucucaGAAAuagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc,
서열 번호 65:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuagagcuaGAAAuagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaagug,
서열 번호 66:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuagagcuaGAAAuagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuauca, 또는
서열 번호 67:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuagagcuaGAAAuagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu을 포함할 수 있다.
서열 번호 61 내지 67의 각각에서, 단일 밑줄 친 서열은 gRNA의 crRNA 부분을 나타낸다. 각각의 "N"은 적합한 가이드 서열의 리보뉴클레오티드 염기(A, U, G 또는 C)를 나타낸다. 소문자의 첫 번째 블록은 tracrRNA 메이트 서열을 나타낸다. 소문자의 두 번째 블록은 gRNA의 tracrRNA 부분을 나타낸다. 이중 밑줄 친 서열은 tracrRNA 메이트 서열과 어닐링하는 tracrRNA 서열 부분에 근접하여 제1 헤어핀을 형성한다. 루프 서열(GAAA, 서열 번호 36)은 대문자로 표시하였으며, 이는 각각의 gRNA의 crRNA와 tracrRNA 부분을 작동 가능하게 연결한다. 본원의 gRNA의 기타 예로는 (i) 이들 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성(이 계산에서 가이드 서열은 제외함)을 갖고, (ii) Cas9 단백질을 특이적으로 표적화하는 gRNA로서 작용하여 표적 DNA 서열에 결합하고, 선택적으로 닉을 형성하거나 절단할 수 있는, 전술한 gRNA의 변이체를 포함한다.
또한, 본원의 gRNA는 가이드 서열(VT 도메인)에 이어서 Cas 엔도뉴클레아제 인식(CER) 도메인을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. CER 도메인은 tracrRNA 메이트 서열 다음에 tracrRNA 서열을 포함한다. 본원에서 유용한 CER 도메인의 예로는 위의 서열 번호 61 내지 67에 포함되는 것들을 포함한다(각각의 CER 도메인은 VT 도메인의 N으로 이루어진 서열에 이어지는 서열이다). CER 도메인의 또 다른 적합한 예는 서열 번호 24(실시예 참조)이며, 이는 5'에서 3' 방향으로 서열 번호 53의 tracrRNA 메이트 서열, 서열 번호 36의 루프 형성 서열(GAAA) 및 서열 번호 55의 tracrRNA 서열을 포함한다.
RGEN의 RNA 성분은 선택적으로 5'-캡(7-메틸구아닐레이트 [m7G] 캡)을 갖지 않는다(즉, 이러한 RNA 성분은 이의 5'-말단에 m7G 캡을 갖지 않는다). 본원에서 RNA 성분은, 5'-캡 대신에 예를 들어 5'-하이드록실기를 가질 수 있다. 대안적으로, 본원에서 RNA 성분은, 5'-캡 대신에 예를 들어 5' 포스페이트를 가질 수 있다. 5'-캡핑된 RNA(즉, 5' m7G 캡을 갖는 RNA)가 핵외수송의 대상이기 때문에, 이들 구현예에서 RNA 성분은 (어떻게 RNA 성분이 본원에 제공되는지에 따라, RNA 성분의 핵에서의 전사 이후, 또는 이의 핵으로의 RGEN 매개성 도입 이후와 같이) 핵에 더 잘 축적될 수 있다고 여겨진다. 본원에서 캡핑되지 않은 RNA 성분의 바람직한 예로는 적합한 gRNA, crRNA 및/또는 tracrRNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 RNA 성분은 RNA 성분의 전구체의 5'-말단에서 리보자임 서열에 의한 RNA 자가 처리에 의해 5'-캡이 없고 대신에 선택적으로 5'-하이드록실기를 갖는다(즉, gRNA와 같은 RNA 성분의 상류에 리보자임 서열을 포함하는 전구체 RNA는 리보자임 서열을 제거하기 위해 리보자임 매개성 자가 처리를 거침으로써, 5'-캡이 없는 하류의 RNA 성분을 남긴다). 다른 특정 구현예에서, 본원의 RNA 성분은 RNA 폴리머라제 III(Pol III) 프로모터로부터의 전사에 의해 생성되지 않는다.
본원의 세포 침투성 펩티드(CPP)는 길이가 예를 들어, 약 5개 내지 30개, 5개 내지 25개, 5개 내지 20개, 10개 내지 30개, 10개 내지 25개, 또는 10개 내지 20개 아미노산 잔기일 수 있다. 기타 예로서, CPP는 길이가 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 아미노산 잔기일 수 있다. 또한, 본원의 추가적인 양태에서, CPP는 길이가 최대 약 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 또는 60개 아미노산 잔기일 수 있다.
본원에 개시된 CPP는 예를 들어, 양이온성 또는 양친매성일 수 있다. 본원의 양이온성 CPP는 전형적으로, 적어도 약 60% 양으로 하전된 아미노산, 예컨대, 라이신(K), 아르기닌(R), 및/또는 히스티딘(H)을 포함한다. 대안적으로, 양이온성 CPP는 예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 양으로 하전된 아미노산(예컨대, R 잔기; K 잔기; K 및 R 잔기; K, R 및 H 잔기)을 포함할 수 있다. 양이온성 CPP는 특정 구현예에서 아르기닌이 풍부(예컨대, 적어도 70% 또는 80% R 잔기를 포함)하거나 라이신이 풍부(예컨대, 적어도 70% 또는 80% L 잔기를 포함)하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본원에 유용한 양이온성 CPP의 예는 본원에 참고로 포함된 Schmidt et al. (FEBS Lett . 584:1806-1813) 및 Wender et al. (polylysine; Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:13003-13008)에 개시되어 있다. 양이온성 CPP의 다른 예로는 본래 HIV Tat 단백질로부터 유래된, GRKKRRQRRR(서열 번호 68), RKKRRQRRR(서열 번호 69), 또는 RKKRRQRR(서열 번호 70), 및 본래 초파리의 안테나페디아(Antennapedia) 호메오도메인 단백질을 위해 유도된 페네트라틴(RQIKIWFQNRRMKWKK, 서열 번호 71)이 포함된다.
양이온성 CPP의 또 다른 예로, CPP 및 이의 화물(예컨대, RGEN 단백질 성분 또는 RGEN)을 세포 내로 진입하도록 유도하기에 충분한 다수의 인접한 아르기닌을 가진 폴리아르기닌 서열을 포함한다. 이러한 폴리아르기닌 서열 내의 인접한 아르기닌 잔기의 수는 예를 들어, 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 내지 50개 아르기닌일 수 있다. 본원의 특정 양태에서, CPP는 6개 이상의 인접한 아르기닌 잔기(예컨대, 6개 내지 7개, 6개 내지 8개, 6개 내지 9개, 또는 6개 내지 10개 아르기닌 잔기)를 가질 수 있다. "폴리R"(GGGGRRRRRRRRRLLLL, 서열 번호 15)은 원한다면, 폴리아르기닌 CPP에 포함될 수 있다. 기타 폴리아르기닌 CPP 예로는 THRLPRRRRRR(서열 번호 72) 또는 GGRRARRRRRR(서열 번호 73)을 포함한다. 일부 구현예에서, CPP는 활성화할 수 있는 CPP("ACPP")(Aguilera et al., Integr Biol . ( Camb ) 1:371-381; 본원에 참고로 포함됨)이다. ACPP는 전형적으로, 매치되는 다가 음이온(예컨대, 아홉 개의 인접한 글루탐산)에 절단 가능한 링커를 통해 연결된 다가 양이온성 CPP(예컨대, 아홉 개의 인접한 아르기닌)을 포함하며, 이때, 다가 음이온은 순전하를 거의 영(0)까지 감소시켜 세포 내로의 CPP 부착 및 흡수를 억제한다. 링커 절단 시, 이러한 다가 음이온이 방출되어, 국소적으로 다가 양이온 부분 및 이의 고유한 부착성을 드러내, 그에 의해 CPP 세포 진입을 가능하게 한다. 본원에서 또 다른 예는 폴리라이신 CPP이다. R이 K로 대체된 위의 폴리아르기닌 구현예 중 임의의 것은 본원의 폴리라이신 CPP의 예이다.
본원의 양친매성 CPP는 극성/하전된 잔기 및 비극성, 소수성 잔기가 교대하는 패턴을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 다음의 CPP는 양친매성인 것으로 여겨지며, (양친매성 용어가 완전히 적용되는지와는 관계 없이) 특정 양태에서 유용하다: 트랜스포탄-10(TP10) 펩티드를 포함하는 CPP(예컨대, AGYLLGKINLKACAACAKKIL, 서열 번호 14); 혈관 내피 카데린 단백질로부터의 CPP, 예컨대 pVEC 펩티드를 포함하는 CPP(예컨대, LIILRRRIRKQAHAHSK, 서열 번호 74; LLIILRRRIRKQAHAHSK, 서열 번호 13); 엡스타인 바 바이러스 제브라 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 CPP, 예컨대, 제브라 펩티드를 포함하는 CPP(예컨대, ECDSELEIKRYKRVRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC, 서열 번호 12); (KFF)3K 펩티드를 포함하는 CPP(예컨대, KFFKFFKFFK, 서열 번호 75); MAP 펩티드를 포함하는 CPP(KLALKLALKALKAALKLA, 서열 번호 76); RRQRRTSKLMKR을 포함하는 CPP(서열 번호 77); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA를 포함하는 CPP(서열 번호 78). 본원에 적합한 기타 양친매성 CPP로는 프롤린이 풍부한 CPP, 예컨대, VHLPPP(서열 번호 79) 또는 VRLPPP(서열 번호 80)의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 반복을 포함하는 것들을 들 수 있다.
다른 예로서, 본원의 CPP는 MPG 펩티드(예컨대, GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV, 서열 번호 81); Pep-1 펩티드(예컨대, KETWWETWWTEWSQPKKKRKV, 서열 번호 82); 또는 인간 칼시토닌 단백질, 예컨대 hCT 펩티드로부터의 CPP(예컨대, LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP, 서열 번호 83; CGNLSTCMLGTYTQDFNK, 서열 번호 84)를 포함할 수 있다. 본원의 CPP의 또 다른 예로는 본원에 참고로 포함된 Regberg et al. (Int . J. Pharm. 464:111-116)에 개시된 것들을 포함한다.
본원에 적합한 CPP는 대안적으로, 예를 들어, 본원에 개시된 CPP 아미노산 서열들 중 임의의 것에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변이형 CPP 단백질은 CPP 활성, 예컨대, 분자 화물(예컨대, 하나 이상의 RGEN 단백질 성분[예컨대, Cas9]을 포함하는 아미노산 서열, 또는 RNA 성분과 결합된 하나 이상의 REGN 단백질 성분[예컨대, Cas9]을 포함하는 아미노산 서열)의 세포 흡수를 매개하는 능력을 가져야 한다. 변이형 CPP의 이러한 활성을 시험하는 것은 임의의 여러 가지 방법으로, 예컨대, 형광 단백질(예를 들어, GFP)와 그것을 공유적으로 결합시켜, CPP-형광 단백질 복합체와 접촉한 세포로부터 방출된 형광의 정도를 측정하여, 이루어질 수 있다.
본원의 CPP는, 원하는 경우, 세포 외부로부터 세포 내부로 RGEN 단백질 화물을 훨씬 더 잘 운반할 수 있도록 변형될 수 있다. 예를 들어, CPP는 그것의 N 말단 또는 C 말단에 지질기를 가지도록 변형될 수 있다. 본원의 적절한 지질기는 아실기, 예컨대, 스테아릴기 및 미리스틸기를 포함한다. 기타 지질기의 예는 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 또는 18개의 탄소를 가진 아실기이다. 본원에서 유용한 지질기로 펩티드를 변형하는 조건은 예를 들어, 본원에 참고로 포함된, Regberg et al. (Int . J. Pharm . 464:111-116) 및 Anko et al. (Biochim . Biophys . Acta - Biomembranes 1818:915-924)에 개시되어 있다.
본원에서 RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP는 본원의 특정 양태에서 RGEN 단백질-CPP 복합체에서 서로에 대해 공유적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP는 단일 아미노산 서열 내에서 서로 융합될 수 있다(즉, RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP는 융합 단백질 내에 포함될 수 있다). 따라서, 본원의 공유 연결의 예는 RGEN 단백질 성분의 아미노산 서열이 CPP의 아미노산 서열과 융합되어, 이들 아미노산 서열이 하나의 아미노산 서열 내에 함유되도록 한 펩티드 결합을 통한 것일 수 있다. 이러한 융합 단백질(또는 "키메라 단백질")은 본원의 RGEN 단백질-CPP 융합체를 특징으로 할 수 있다. RNA 성분이 RGEN 단백질 성분과 결합되는 이러한 구현예들에서, 이러한 융합 단백질은 RGEN-CPP 융합체를 특징으로 한다.
하나 이상의 CPP는 예를 들어, RGEN 단백질-CPP 융합체의 N 말단 또는 C 말단에 위치할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 CPP가 RGEN 단백질-CPP 융합체의 N 말단과 C 말단 둘 다에 위치할 수 있다. 또한, 대안적으로, 하나 이상의 CPP가 RGEN 단백질-CPP 융합체의 아미노산 서열 내에 위치할 수 있다. 둘 이상의 CPP를 포함하는 본원의 구현예는 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 CPP, 또는 5개 내지 10개, 5개 내지 20개, 또는 10개 내지 20개의 CPP를 포함할 수 있다. RGEN 단백질 성분에 융합된 CPP는 동일하거나 상이할 수 있다(예컨대, 2개, 3개, 4개 이상의 상이한 유형의 CPP). 하나 이상의 CPP가 RGEN 단백질의 아미노산 서열에 직접적으로 융합될 수 있고/있거나, RGEN 단백질과 융합된 이종 기원의 도메인(들)(예컨대, NLS 또는 기타 세포 기관을 표적화하는 서열, 예컨대, MTS)에 융합될 수 있다.
본원의 CPP와 RGEN 단백질 성분 사이의 융합체는 직접적일 수 있다(즉, CPP 아미노산 서열이 펩티드 결합에 의해 직접적으로 RGEN 아미노산 서열에 연결된다). 대안적으로, CPP와 RGEN 단백질 성분 사이의 융합체는 중간의 아미노산 서열을 통한 것일 수 있다(이것은 간접적으로 연결되는 CPP와 RGEN 단백질 성분의 예이다). 중간 아미노산 서열의 예로 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개의 아미노산 잔기들, 예컨대, 글리신, 세린, 알라닌 및/또는 프롤린을 포함하는 적절한 링커 서열을 들 수 있다. 적합한 아미노산 링커들은 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 8828690, 8580922 및 5990275에 개시되어 있다. 중간 아미노산 서열의 기타 예로는 하나 이상의 다른 유형의 단백질 및/또는 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 마커 단백질(예컨대, 본원에 개시된 것들 중 임의의 것과 같은 형광 단백질)은 중간 아미노산 서열에 포함될 수 있다.
융합 단백질에서와 같이, RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP의 공유적 복합체를 포함하는 조성물은 본원에 개시된 임의의 세포 유형과 함께 이용될 수 있다. 그러나, 선택적으로, 이러한 조성물은 효모, 균류 및 식물과 같은 비 포유동물과 함께 이용될 수 있으나, 포유동물 세포 상에서의 사용은 제외한다.
본원의 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질의 예로 서열 번호 39(제브라 CPP-Cas9-NLS 융합 단백질), 서열 번호 40(PolyR CPP-Cas9-NLS 융합 단백질), 서열 번호 41(TP10 CPP-Cas9-NLS 융합 단백질), 또는 서열 번호 42(pVEC CPP-Cas9-NLS 융합 단백질)를 포함할 수 있다. 서열 번호 39 내지 42는 Cas9-CPP 융합 단백질의 예이다. RGEN 단백질-CPP 융합 단백질의 기타 예는 서열 번호 39 내지 42 중 임의의 것에 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변이형 융합 단백질은 (i) 융합 단백질의 세포 흡수를 매개할 수 있는 CPP 도메인, 및 (ii) RNA 성분과 결합되었을 때 DNA에 대해, 특이적인 결합 활성, 및 선택적으로 절단 또는 닉킹 활성이 있는 Cas9 단백질을 가져야 한다. 서열 번호 39, 40, 41 및 42는 각각, Cas9(S. 피오제네스)-NLS 단백질(서열 번호 3의 2 내지 1379 잔기)에 작동 가능하게 연결된, 제브라 CPP(서열 번호 12), PolyR CPP(서열 번호 15), TP10 CPP(서열 번호 14) 및 pVEC CPP(서열 번호 13)를 포함한다.
특정 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템의 단백질 성분은 CPP에 융합될 수 있는데, 이때, CPP는
(i) 엡스타인 바 바이러스 제브라 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 CPP,
(ii) 6개 이상의 인접한 아르기닌 잔기를 가진 CPP,
(iii) 트랜스포탄-10(TP10) CPP,
(iv) 혈관 내피 카데린 단백질로부터의 CPP, 또는
(vi) 합성 노나-아르기닌 CPP, 히스티딘이 풍부한 노나-아르기닌 CPP 및 Pas 노나-아르기닌 CPP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CPP를 포함한다.
합성 노나-아르기닌 CPP, 히스티딘이 풍부한 노나-아르기닌 CPP 및 Pas 노나-아르기닌 CPP의 예는, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 Liu et al. (Advanced Studies in Biology 5(2):71-88, HIKARI Ltd)에 개시되어 있다.
RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP가 공유적으로 연결될 수 있는 방법에 대한 또 다른 예는 가교연결(화학적 가교연결)을 통해서이다. 따라서, 본원의 RGEN 단백질-CPP 복합체의 예는 적어도 하나의 CPP에 가교연결된 RGEN 단백질을 포함할 수 있다. 본원의 가교연결은 공유 결합(들)에 의해 둘 이상의 분자들(이 경우, RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP)을 화학적으로 연결하는 공정을 지칭한다. 가교연결은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0190813, 미국 특허 번호 8642744, 및 Bioconjugate Techniques, 2nd Edition (G.T. Hermanson, Academic Press, 2008)에 개시된 것들과 같은, 당해 분야에 공지된 임의의 다수 공정들을 이용하여 수행될 수 있다.
전형적으로, CPP는 그 N 말단, C 말단, 및/또는 아미노산 측기에 CPP를 RGEN 단백질 성분에 가교연결하려는 목적으로 적합한 단백질 연결기를 함유하도록 변형 및/또는 합성될 수 있다. "단백질 연결기"는 RGEN 단백질에 CPP를 공유적으로 연결하기 위한 적합한 조건(예컨대, 수성 조건)하에서 자발적으로 또는 활성화 후(예컨대, 빛), RGEN 단백질 성분의 접근 가능한 곁사슬 기능기와 직접적으로 반응할 수 있는 기를 지칭한다. 단백질 연결기는 단백질에 대한 공유 연결을 생성하기 위하여, 예를 들어, RGEN 단백질의 Lys, Cys, Ser, Thr, Tyr, His, 또는 Arg 아미노산 잔기의 곁사슬 기능기와 반응할 수 있다. 예를 들어, 동종이기능(예컨대, 아민을 아민에 연결할 수 있는) 또는 이종이기능(예컨대, 아민을 티올에 연결할 수 있는) 단백질 연결기가 이용될 수 있다. 특정 구현예에서 CPP 상의 단백질 연결기는 RGEN 단백질의 말단 기(예컨대, N 말단)과도 반응할 수 있다. 본원의 적합한 단백질 연결기에는 아미노 반응성기(예컨대, NHS 에스테르 또는 이미도에스테르), 티올(설프하이드릴) 반응성기(예를 들어, 말레이미드, 예컨대, BMOE, BMB, 또는 BMH), 하이드록실 반응성기, 이미다졸릴 반응성기, 또는 구아니디닐 반응성기가 포함된다. 예시적인 단백질 연결기로 활성 에스테르(예컨대, 아미노 반응성 NHS 에스테르), 및 티올 반응성 말레이미드 또는 요오도아세트아미드 기를 포함한다. 본원에서 유용한 추가적인 예시적 단백질 연결기 및 이를 이용하는 방법은 예를 들어, Bioconjugate Techniques, 2nd Edition (G.T. Hermanson, Academic Press, 2008)에 기술되어 있다.
본원의 단백질 연결기는 전형적으로 길이가 20개 원자 이하의 백본으로 CPP와 RGEN 단백질 사이에 연결을 생성할 수 있다. 예를 들어, 이러한 연결은 길이가 1 내지 20개 원자일 수 있거나, 길이가 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 8개, 10개, 12개, 14개, 16개, 18개 또는 20개 탄소 원자일 수 있다. 특정 구현예에서, 연결은 선형, 가지형, 고리형 또는 단일 원자일 수 있다. 어떤 경우, 링커 백본의 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개 이상의 탄소 원자는 황, 질소 또는 산소 헤테로원자로 치환될 수 있다. 백본 원자들 사이의 결합은 포화 또는 불포화일 수 있다(대개는 링커 백본에서 하나, 둘, 또는 셋 이하의 불포화 결합). 링커는 올리고(에틸렌 글리콜); 에테르; 티오에테르, 3차 아민; 또는 직선형 또는 가지형일 수 있는 알킬기(예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, n-펜틸, t-부틸)를 제한 없이 포함할 수 있다. 다른 예로서, 링커 백본은 아릴, 헤테로고리, 또는 헤테로알킬기와 같은 고리기로서, 여기서 고리기의 둘 이상의 원자(예컨대, 2개, 3개, 또는 4개 원자)는 백본 내에 포함되는 것인 고리기를 포함할 수 있다.
두 가지 이상 유형의 CPP(예컨대, 2가지, 3가지, 4가지 이상의 상이한 유형의 CPP)가 특정 구현예에서 RGEN 단백질 성분에 가교 연결될 수 있다. 가교 연결 시 이용할 수 있는 RGEN 단백질에 대한 CPP(들)의 비율(몰 비율)은 예를 들어, 적어도 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 또는 50:1일 수 있다. 다른 양태에서, RGEN 단백질에 가교 연결된 CPP의 평균 개수는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개, 또는 적어도 5개 내지 10개, 5개 내지 15개, 5개 내지 20개, 또는 5개 내지 25개일 수 있다.
RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP는 원하는 경우, 하나 이상의 다른 단백질/펩티드/도메인을 더 포함하는 복합체에 가교 연결될 수 있다. 이러한 다른 요소는 선택적으로 RGEN 단백질 성분을 CPP와 다리로 연결하는 데 이용될 수 있으며, 위에 기술된 중간 아미노산 서열들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
본원의 특정 양태에서, RGEN 단백질 성분과 본원의 적어도 하나의 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 비 공유적으로 연결될 수 있다. 임의의 특정 이론 또는 메커니즘에 구속되고자 하는 것은 아니지만, RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP 사이의 비 공유적 연결은 정전기력, 반 데르 발스 힘, 및/또는 소수성 힘에 기인할 수 있음이 고려된다. RNA 성분이 RGEN 단백질 성분과 결합되는 구현예들에 있어서, 그러한 구현예들은 RGEN-CPP 복합체에서 적어도 하나의 CPP에 비 공유적으로 연결되는 RGEN을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 비 공유적으로 연결된 RGEN 단백질 성분과 CPP를 포함하는 조성물은 선택적으로, 이들 성분들의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
특정 구현예에서, RGEN 단백질 성분은 적어도 하나의 CPP에 CPP 아미노산 서열로만 이루어지는 아미노산 서열로 비 공유적으로 연결된다. 이러한 CPP는 임의의 "비 CPP" 아미노산 서열을 가지고 있지 않지만, 선택적으로, 본원에 개시된 바와 같은 지질기와 같은 변형을 포함할 수 있다.
대안적으로, RGEN 단백질 성분에 비 공유적으로 연결되는 CPP는 CPP 아미노산 서열 및 하나 이상의 이종 기원의 아미노산 서열들(비 RGEN 단백질 서열들) 둘 다가 있는 융합 단백질에 포함될 수 있다. 이러한 구현예에서 이종 기원의 서열은 도메인 또는 단백질의 서열일 수 있다(예컨대, 본원에 개시된 것들 중 임의의 것과 같은 형광 단백질 또는 Cas 융합체과 관련하여 위의 개시 내용에 열거된 임의의 도메인/단백질). 또 다른 예는 이합체화 도메인을 CPP에 융합하는 것으로, 이합체화 도메인은 RGEN 단백질 성분에 연결되거나 융합된 이합체와 도메인과 결합할 수 있다.
류신 지퍼 도메인은 본원의 이합체화 도메인의 예이다. 류신 지퍼 도메인은 이러한 도메인을 함유한다고 알려진 천연 단백질로부터의 것들(예컨대, 전사 인자)을 나타낼 수 있거나, 합성으로 설계될 수 있다. CPP에 연결된 류신 지퍼 도메인은 RGEN 단백질 성분의 류신 지퍼 도메인과 결합("함께 지퍼로 잠금")할 수 있으며, 그에 의해 비 공유적 복합체 내에서 CPP와 RGEN 단백질 성분을 연결할 수 있다. CPP와 RGEN 단백질 성분을 비 공유적으로 연결하기 위한 한 쌍의 류신 지퍼 도메인은 동일하거나(이러한 도메인 쌍은 동종이합체 류신 지퍼를 형성함) 상이할 수 있다(이러한 도메인 쌍은 이종이합체 류신 지퍼를 형성함). 류신 지퍼 도메인의 예로는 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0108869 및 2004/0147721에 개시된 것들이 포함된다. 특정 양태에서, 동종이합체 류신 지퍼는 GCN4 전사 인자로부터의 류신 지퍼 도메인을 이용하여 형성될 수 있는 반면, 다른 양태에서, 이종이합체 류신 지퍼는 각각 fos 전사 인자와 jun 전사 인자로부터의 류신 지퍼 도메인을 이용하여 형성될 수 있다.
RGEN 단백질 성분 및 적어도 하나의 CPP의 비 공유적 복합체는 원하는 경우, 하나 이상의 다른 단백질/펩티드/도메인을 더 포함할 수 있다. 이러한 다른 요소들은 선택적으로, RGEN 단백질 성분을 CPP와 다리로 연결하는 데 이용될 수 있으며, 위에 기술된 중간 아미노산 서열들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
두 가지 이상 유형의 CPP(예컨대, 2가지, 3가지, 4가지 이상의 상이한 유형의 CPP)가 특정 구현예에서 RGEN 단백질 성분에 비 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 복합체를 제조하는 데 이용할 수 있는 RGEN 단백질에 대한 CPP(들)의 비율(몰 비율)은 예를 들어, 적어도 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 또는 50:1일 수 있다. 다른 양태에서, RGEN 단백질에 비 공유적으로 연결된 CPP의 평균 개수는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개, 또는 적어도 5개 내지 10개, 5개 내지 15개, 5개 내지 20개, 또는 5개 내지 25개일 수 있다.
특정 구현예에서, RGEN 단백질 성분과 적어도 하나의 CPP의 비 공유적 복합체는 수성 매질에서 (예컨대, 위에 개시된 RGEN 단백질에 대한 CPP의 비율을 얻기 위해서와 같이) 적당한 양의 각각의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다. 적합한 수성 매질은 예를 들어, PBS와 같은 완충 용액 또는 DMEM과 같은 무혈청 배지를 포함할 수 있다. 이러한 혼합물은 비 공유적 RGEN 단백질-CPP 복합체의 형성을 가능하게 하기 위하여, 예를 들어, 약 4 내지 45℃의 온도에서 약 30분, 60분, 90분, 또는 120분 동안 배양될 수 있다. 이러한 복합체를 포함하는 적합한 부피(예컨대, 처리되는 세포를 적당하게 커버하는/담그는 최소 부피)의 이 용액은 세포 유형에 적절한 방식으로 세포에 적용될 수 있다. RNA 성분이 RGEN 단백질 성분과 결합되는 구현예에서, 이러한 RGEN의 형성은 CPP를 RGEN 단백질 성분과 배양하기 전에, 배양하는 것과 동시에, 또는 배양한 후에, RNA 성분을 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
RGEN 단백질 성분 및 적어도 하나의 CPP의 비 공유적 복합체를 포함하는 조성물은 본원에 개시된 임의의 세포 유형과 함께 이용될 수 있다. 그러나, 선택적으로, 이러한 조성물은 효모, 균류 및 식물과 같은 비 포유동물 세포와 함께 이용될 수 있으나, 포유동물 세포 상에서의 사용은 제외한다.
RGEN 단백질-CPP 복합체는, 세포에 적용하기 전에 그것이 조성물 내에 존재할 수 있는 있으므로, 예를 들어, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 순수할 수 있다. 이러한 순도는 특정 구현예에서 단백질을 기초로 한 것일 수 있다. 예로서, 복합체의 순도가 적어도 80%인 경우, 이것은 조성물 내의 모든 단백질의 적어도 80%는 이러한 복합체로 구성됨을 의미할 것이다. 복합체 순도는 대안적으로 단백질을 기초로 한 순도뿐만 아니라, 기타 생체분자(예컨대, 지질, 당류, 및/또는 핵산)도 고려할 수 있다. 예로서, 복합체의 순도가 적어도 80%인 경우, 이것은 본원의 조성물 내의 모든 생체분자의 적어도 80%가 이러한 복합체로 구성됨을 의미할 수 있다. 특정 구현예에서, 탄수화물, 염, 및/또는 지질 등과 같은 화합물은 본원의 퍼센트 순도의 결정에 영향을 미치지 않는다. 순도와 관련하여 이들 개시 내용 전부는 RGEN-CPP 복합체에도 적용할 수 있다(즉, 복합체의 RGEN 단백질 성분은 RNA 성분과 결합된다).
본원의 조성물은 바람직하게는 수성이며, 이때, RGEN 단백질-CPP 복합체 또는 RGEN-CPP 복합체가 용해되는 용매는 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99 wt% 물이다. 조성물 내의 복합체의 농도는 예를 들어, 적어도 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 또는 10.0 μM 또는 약 0.5 내지 5.0 μM, 0.5 내지 2.5 μM, 1.0 내지 5.0 μM, 1.0 내지 2.5 μM, 또는 2.5 내지 5.0 μM일 수 있다. 이러한 조성물은 액체 상태일 수 있음은 이해될 것이다.
특정 구현예에서 조성물의 pH는 약 4.0 내지 약 10.0 사이일 수 있다. 대안적으로, pH는 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0일 수 있다. HEPES, 인산(예컨대, PBS), 트리스, 트리스-HCl, 시트르산, 또는 이의 조합을 비제한적으로 포함하는 적합한 완충액의 첨가 또는 도입으로 pH를 조정하거나 제어할 수 있다. 본원의 조성물 내 완충액의 농도는 예를 들어, 0 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 10 mM, 20 mM, 또는 50 mM일 수 있다. 특정 양태에서, HEPES 완충액(예를 들어, 약 25 mM HEPES, 예컨대, 25 mM HEPES/KOH pH 7.5, 200 mM KCl, 20% 글리세롤, 1 mM DTT)이 이용될 수 있다.
본원의 조성물은 선택적으로 RGEN 단백질-CPP 복합체 또는 RGEN-CPP 복합체 이외에 다른 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 하나 이상의 염, 예컨대, 나트륨 염(예를 들어, NaCl, Na2SO4)을 포함할 수 있다. 기타 비제한적인 염의 예로는 (i) 알루미늄, 암모늄, 바륨, 칼슘, 크로뮴(II 또는 III), 구리(I 또는 II), 철(II 또는 III), 수소, 납(II), 리튬, 마그네슘, 망간(II 또는 III), 수은(I 또는 II), 칼륨, 은, 스트론튬 나트륨, 주석(II 또는 IV), 또는 아연 양이온, 및 (ii) 아세트산염, 붕산염, 브롬산염, 브롬화물, 탄산염, 염소산염, 염화물, 아염소산염, 크롬산염, 중크롬산염, 인산 2수소염, 페리시안화물, 페로시안화물, 불화물, 탄산수소염, 인산수소염, 황산수소염, 황화수소, 아황산수소염, 수소화물, 수산화물, 차아염소산염, 요오드산염, 요오드화물, 질산염, 질화물, 아질산염, 수산염, 산화물, 과염소산염, 과망간산염, 과산화물, 인산염, 인화물, 아인산염, 규산염, 주석산염, 아주석산염, 황산염, 황화물, 아황산염, 타르타르산염, 또는 티오시안산염 음이온을 갖는 것들을 들 수 있다. 따라서, 예를 들어, 위의 (i)의 양이온 및 위의 (ii)의 음이온을 갖는 임의의 염이 본원의 조성물에 존재할 수 있다. 염은, 예를 들어, 약 0.01 내지 약 10.00(또는 0.01 내지 10.00 사이의 임의의 1/100 증가)의 wt%로 존재할 수 있다.
본원의 RGEN 단백질-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있다. RGEN 단백질 성분이 RNA 성분과 결합하는 (그에 의해 완전한 RGEN을 구성하는) 구현예에서, RGEN-CPP 복합체는 유사하게도 이러한 세포막/세포벽을 가로지르는 능력을 갖는다. RGEN 단백질-CPP 복합체 또는 RGEN-CPP 복합체는 본원의 특정 양태에서 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있다.
본원의 RGEN 단백질-CPP 또는 RGEN-CPP 복합체는 선택적으로 당질층(캡슐)을 포함하는 세포벽을 가로지를 수 있다. 이들 구현예는 전형적으로 원핵세포(예컨대, 박테리아)에 관한 것이며, 이들 중 일부는 종 유형 및 성장 조건에 따라 당질층을 가질 수 있다.
임의의 특정 이론 또는 메커니즘에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본원의 CPP는 RGEN 단백질 성분을 세포내 섭취 프로세스를 통해 세포 내로 전달할 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 프로세스의 예로는 대음세포작용, 클라트린 매개성 세포내 섭취, 포낭/지질 뗏목 매개성 세포내 섭취, 및/또는 수용체 매개성 세포내 섭취 메커니즘(예컨대, 스캐빈저 수용체 매개성 흡수, 프로테오글리칸 매개성 흡수)을 포함할 것이다.
일단 RGEN 단백질-CPP 또는 RGEN-CPP 복합체가 세포 내부에 있으면, 그것은 예를 들어, 핵막 또는 미토콘드리아 막과 같은 세포 기관 막을 가로지를 수 있다. 특정 구현예에서, 이 능력은 RGEN 단백질과 함께 포함되는 적어도 하나의 세포 기관 표적화 서열(예컨대, NLS, MTS)의 존재에 의존한다. 또한, 다른 구현예에서, 핵막 또는 미토콘드리아 막과 같은 세포 기관 막을 가로지르는 능력은 세포 기관 표적화 서열의 존재에 의존하지 않는다(즉, 이러한 구현예에서 CPP[들]은 핵 또는 미토콘드리아와 같은 세포 기관으로의 RGEN 횡단 허용을 초래할 수 있다).
본원의 세포는 포유류 세포 또는 비 포유류 세포일 수 있는데, 후자가 바람직한 특정 구현예에서 이용된다. 다른 특정 양태에서, 본원의 세포는 (i) 생체 내에서 유기체/조직으로, (ii) 생체 외에서 조직 또는 세포의 집단으로, 또는 (iii) 시험관 내 상태로 존재하는 것처럼 있을 수 있다.
본원의 미생물 세포는 단리된 상태(예컨대, 시험관 내 세포, 배양된 세포) 또는 비 단리된 상태로 존재하는 것처럼 있을 수 있다.
특정 구현예에서 미생물 세포는 균류 세포, 예컨대, 효모 세포이다. 본원의 특정 양태에서 효모는 무성으로(무성생식형) 또는 유성으로(유성생식형) 생식하는 것일 수 있다. 본원의 효모는 전형적으로 단일세포 형태로 존재하지만, 이들 효모의 특정 유형은 선택적으로, 가성균사(일렬로 연결된 발아 세포)를 형성할 수 있다. 또 다른 양태에서, 효모는 반수체 또는 이배체일 수 있고/있거나, 이들 배수성 형태 중 어느 하나로 존재하는 능력을 가질 수 있다.
본원의 효모의 예로 통상적인 효모와 비 통상적인 효모를 들 수 있다. 특정 구현예에서 통상적인 효모는 비 상동 말단 결합(NHEJ)에 의해 매개되는 복구 공정보다 상동 재조합(HR) DNA 복구 공정을 선호하는 효모이다. 본원의 통상적인 효모의 예로는 사카로마이세스(예를 들어, 출아효모, 빵 효모 및/또는 맥주 효모로도 알려진 S. 세레비시아; S. 바야누스(bayanus); S. 보울라디(boulardii); S. 불데리(bulderi); S. 카리오카누스(cariocanus ); S. 카리오쿠스(cariocus); S. 체발리에리(chevalieri); S. 다이레넨시스(dairenensis); S. 엘립소이데우스(ellipsoideus); S. 유바야누스(eubayanus); S. 엑시거스(exiguus); S. 플로렌티누스(florentinus); S. 클루이베리(kluyveri); S. 마티니에(martiniae); S. 모나센시스(monacensis); S. 노르벤시스(norbensis); S. 파라독서스(paradoxus); S. 파스토리아누스(pastorianus); S. 스펜서로룸(spencerorum); S. 투리센시스(turicensis); S. 우니스포루스(unisporus); S. 우바룸(uvarum); S. 조나투스(zonatus)) 및 스키조사카로마이세스(예를 들어, 분열 효모로도 알려진 S. 폼베(pombe); S. 크리오필러스(cryophilus); S. 자포니쿠스(japonicus); S. 옥토스포루스(octosporus) 속의 종을 들 수 있다.
본원의 비 통상적인 효모는 사카로마이세스(예컨대, S. 세레비시아) 또는 스키조사카로마이세스(예컨대, S. 폼베) 종과 같은 통상적인 효모가 아니다. 특정 구현예에서 비 통상적인 효모는 HR에 의해 매개되는 복구 공정보다 NHEJ DNA 복구 공정을 선호하는 효모일 수 있다. 통상적인 효모, 예컨대 S. 세레비시아 및 S. 폼베는 전형적으로, 짧은 플랭킹 상동성 암(30 내지 50 bp)을 갖는 공여 DNA의 특이적 통합을 일반적으로 70%를 초과하는 효율로 나타내는 반면, 비 통상적인 효모, 예컨대 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리폴리티카 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)는 보통 유사한 구조의 공여 DNA와 1% 미만의 효율로 특이적 통합을 나타낸다(Chen et al., PLoS ONE 8:e57952]). 따라서, HR 공정에 대한 선호도는, 예를 들어, 효모를 적합한 공여 DNA로 형질전환시키고, 공여 DNA에 의해 표적화될 것으로 예측되는 게놈 부위와 특이적으로 재조합되는 정도를 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 이러한 검정 결과, 효모 게놈에서 높은 정도의 공여 DNA의 무작위적 통합이 산출되는 경우, NHEJ에 대한 선호도(또는 HR에 대한 낮은 선호도)가 명백할 것이다. 효모에서 DNA의 특이적(HR-매개) 및/또는 무작위적(NHEJ-매개) 통합의 비율을 결정하는 검정법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Ferreira and Cooper, Genes Dev . 18:2249-2254; Corrigan et al., PLoS ONE 8:e69628; Weaver et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 78:6354-6358; Keeney and Boeke, Genetics 136:849-856).
낮은 수준의 HR 활성을 고려하면, 본원의 비 통상적인 효모는 (i) 예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% 또는 8% 미만의 30 내지 50 bp의 플랭킹 상동성 암을 갖는 적합한 공여 DNA에 의한 특이적인 표적화 비율을 나타내고/내거나 (ii) 예를 들어, 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% 또는 75%를 초과하는 전술한 공여 DNA의 무작위적 통합 비율을 나타낼 수 있다. 적합한 공여 DNA의 (i) 특이적 표적화 및/또는 (ii) 무작위적 통합의 이러한 비율은 본원에 개시된 바와 같이 RGEN이 제공되기 전에 존재하는 그대로의 비 통상적인 효모를 특성화할 수 있다. 특정 구현예에서, 비 통상적인 효모에 RGEN을 제공하는 목적은 특정 부위에서 효모를 HR 쪽으로 편향시키기 위한 부위 특이적 DNA 단일 가닥 절단 (SSB) 또는 이중 가닥 절단 (DSB)을 생성하는 것이다. 따라서, 비 통상적인 효모에서 적합한 RGEN을 제공하는 것은 전형적으로 이러한 효모가 특정 공여 DNA와의 HR 비율의 증가를 나타낼 수 있게 해야 한다. 이러한 증가된 비율은 적합한 대조(예를 들어, 동일한 공여 DNA로 형질전환되었지만, 적합한 RGEN이 결여된 동일한 비 통상적인 효모)에서의 HR 비율보다 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 높을 수 있다.
본원의 비 통상적인 효모는 Non-Conventional Yeasts in Genetics, Biochemistry and Biotechnology: Practical Protocols (K. Wolf, K.D. Breunig, G. Barth, Eds., Springer-Verlag, Berlin, Germany, 2003), Yeasts in Natural and Artificial Habitats (J.F.T. Spencer, D.M. Spencer, Eds., Springer-Verlag, Berlin, Germany, 1997), 및/또는 Yeast Biotechnology: Diversity and Applications (T. Satyanarayana, G. Kunze, Eds., Springer, 2009)(이들 모두는 본원에 참고로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 배양될 수 있다.
본원의 비 통상적인 효모의 비제한적인 예는 다음 속의 효모를 포함한다: 야로위아, 피키아, 쉬반니오마이세스, 클루이베로마이세스, 아르술라, 트리코스포론, 칸디다, 유스틸라고, 토룰롭시스, 자이고사카로마이세스, 트리고놉시스, 크립토코커스, 로도토룰라, 파피아, 스포로볼로마이세스, 파치솔렌, 및 모닐리엘라(Moniliella). 야로위아 종의 적합한 예는 Y. 리폴리티카이다. 피키아 종의 적합한 예에는 P. 파스토리스, P. 메타놀리카(methanolica), P. 스티피티스, P. 아노말라(anomala) 및 P. 앙구스타(angusta)를 포함한다. 쉬반니오마이세스 종의 적합한 예에는 S. 카스텔리이(castellii), S. 알루비우스(alluvius), S. 호미니스 (hominis), S. 옥시덴탈리스(occidentalis), S. 카프리오티이(capriottii), S. 에트첼시이(etchellsii), S. 폴리모르푸스(polymorphus), S. 슈도폴리모르푸스(pseudopolymorphus), S. 반리자에(vanrijiae) 및 S. 야마다에(yamadae)가 포함된다. 클루이베로마이세스 종의 적합한 예에는 K. 락티스, K. 마르시아누스(marxianus), K. 프라길리스(fragilis), K. 드로소필라룸(drosophilarum), K. 써모톨레란스(thermotolerans), K. 파세올로스포루스(phaseolosporus), K. 바누데니이(vanudenii), K. 왈티이(waltii), K. 아프리카누스(africanus) 및 K. 폴리스포루스(polysporus)가 포함된다. 아르술라 종의 적합한 예에는 A. 아데니니보란스(adeninivorans) 및 A. 테레스트레(terrestre)가 포함된다. 트리코스포론 종의 적합한 예에는 T. 쿠타네움(cutaneum), T. 카피타툼(capitatum), T. 인킨(inkin) 및 T. 비메리(beemeri)가 포함된다. 칸디다 종의 적합한 예에는 C. 알비칸스(albicans), C. 아스칼라피다룸(ascalaphidarum), C. 암피시아(amphixiae), C. 안타르티카(antarctica), C. 아피코라(apicola), C. 아르젠티아(argentea), C. 아틀란티카(atlantica), C. 아트모스패리카(atmosphaerica), C. 블랏타에(blattae), C. 브로멜리아세아룸(bromeliacearum), C. 카르포필라(carpophila), C. 카르바잘리스(carvajalis), C. 세람비시다룸(cerambycidarum), C. 차우리오데스(chauliodes), C. 코리달리(corydali), C. 도스세이(dosseyi), C. 듀블리니엔시스(dubliniensis), C. 얼가텐시스(ergatensis), C. 프룩투스(fructus), C. 글라브라타(glabrata), C. 퍼멘타티(fermentati), C. 귈리어몬디이(guilliermondii), C. 해뮬로니이(haemulonii), C. 인섹타멘스(insectamens), C. 인섹토룸(insectorum), C. 인터메디아(intermedia), C. 제프레시이(jeffresii), C. 케피르(kefyr), C. 케로세네아에(keroseneae), C. 크루세이(krusei), C. 루시타니애(lusitaniae), C. 릭소소필라(lyxosophila), C. 말토사(maltosa), C. 마리나(marina), C. 멤브라니파시엔스(membranifaciens), C. 밀러리(milleri), C. 모기이(mogii), C. 올레오필라(oleophila), C. 오레고넨시스(oregonensis), C. 파라프실로시스(parapsilosis), C. 퀴어시트루사(quercitrusa), C. 루고사(rugosa), C. 사케(sake), C. 쉐하테아(shehatea), C. 템노칠라에(temnochilae), C. 테누이스(tenuis), C. 테아에(theae), C. 톨러란스(tolerans), C. 트로피칼리스(tropicalis), C. 츠시이아에(tsuchiyae), C. 시놀라보란티움(sinolaborantium), C. 소자에(sojae), C. 수브하쉬이(subhashii), C. 비스와나치이(viswanathii), C. 유틸리스(utilis), C. 우바투벤시스(ubatubensis) 및 C. 젬플리니나(zemplinina)가 포함된다. 유스틸라고 종의 적합한 예에는 U. 아베나에(avenae), U. 에스쿨렌타(esculenta), U. 호르데이(hordei), U. 마이디스(maydis), U. 누다(nuda) 및 U. 트리티치(tritici)가 포함된다. 토룰롭시스 종의 적합한 예에는 T. 게오차레스(geochares), T. 아지마(azyma), T. 글라브라타(glabrata) 및 T. 칸디다가 포함된다. 자이고사카로마이세스 종의 적합한 예에는 Z. 바일리이(bailii), Z. 비스포루스(bisporus), Z. 시드리(cidri), Z. 퍼멘타티(fermentati), Z. 플로렌티누스(florentinus), Z. 콤부차엔시스(kombuchaensis), Z. 렌투스(lentus), Z. 멜리스(mellis), Z. 미크로엘리프소이데스(microellipsoides), Z. 엠라키이(mrakii), Z. 슈도룩시(pseudorouxii) 및 Z. 룩시(rouxii)가 포함된다. 트리고놉시스 종의 적합한 예에는 T. 바리아빌리스(variabilis)가 포함된다. 크립토코커스 종의 적합한 예에는 C. 라우렌티이(laurentii), C. 알비두스(albidus), C. 네오포르만스(neoformans), C. 가티이(gattii), C. 유니구툴라투스(uniguttulatus), C. 아델리엔시스(adeliensis), C. 아에리우스(aerius), C. 알비도시밀리스(albidosimilis), C. 안타르크티쿠스(antarcticus), C. 아쿠아티쿠스(aquaticus), C. 아테르(ater), C. 부타넨시스(bhutanensis), C. 콘소르티오니스(consortionis), C. 쿠르바투스(curvatus), C. 페놀리쿠스(phenolicus), C. 스킨네리(skinneri), C. 테레우스(terreus) 및 C. 비쉬니아치(vishniacci)가 포함된다. 로도토룰라 종의 적합한 예에는 R. 아체니오룸(acheniorum), R. 툴라(tula), R. 아쿠타(acuta), R. 아메리카나(americana), R. 아라우카리아에(araucariae), R. 아르티카(arctica), R. 아르메니아카(armeniaca), R. 아우란티아카(aurantiaca), R. 아우리쿨라리아에(auriculariae), R. 바카룸(bacarum), R. 벤티카(benthica), R. 비오우르게이(biourgei), R. 보고리엔시스(bogoriensis), R. 브론치알리스(bronchialis), R. 부포니이(buffonii), R. 칼립토게나에(calyptogenae), R. 충나멘시스(chungnamensis), R. 클라디엔시스(cladiensis), R. 코랄리나(corallina), R. 크레솔리카(cresolica), R. 크로세아(crocea), R. 사이클로클라스티카(cycloclastica), R. 다이레넨시스(dairenensis), R. 디플루덴스(diffluens), R. 에베르글라디엔시스(evergladiensis), R. 페룰리카(ferulica), R. 폴리오룸(foliorum), R. 프라가리아(fragaria), R. 푸지사넨시스(fujisanensis), R. 푸트로넨시스(futronensis), R. 겔라티노사(gelatinosa), R. 글라시알리스(glacialis), R. 글루티니스(glutinis), R. 그라실리스(gracilis), R. 그라미니스(graminis), R. 그린베르그시이(grinbergsii), R. 히말라옌시스(himalayensis), R. 힌눌레아(hinnulea), R. 히스톨리티카(histolytica), R. 힐로필리아(hylophila), R. 인카르나타(incarnata), R. 인게니오사(ingeniosa), R. 자바니카(javanica), R. 코이쉬카웬시스(koishikawensis), R. 락토사(lactosa), R. 라멜리브라치아에(lamellibrachiae), R. 라린기스(laryngis), R. 리그노필라(lignophila), R. 리니(lini), R. 론기스시마(longissima), R. 루드위기이(ludwigii), R. 리시노필라(lysinophila), R. 마리나(marina), R. 마르티니아에-프라간티스(martyniae-fragantis), R. 마트리텐시스(matritensis), R. 멜리(meli), R. 미누타(minuta), R. 무실라기노사(mucilaginosa), R. 니텐스(nitens), R. 노쏘파기(nothofagi), R. 오리자에(oryzae), R. 파시피카(pacifica), R. 팔리다(pallida), R. 페네아우스(peneaus), R. 필릴라(philyla), R. 필로플라나(phylloplana), R. 필라티이(pilatii), R. 필리마나에(pilimanae), R. 피니콜라(pinicola), R. 플리카타(plicata), R. 폴리모르파(polymorpha), R. 사이크로페놀리카(psychrophenolica), R. 사이크로필라(psychrophila), R. 푸스툴라(pustula), R. 레티노필라(retinophila), R. 로사세아(rosacea), R. 로술라타(rosulata), R. 루베파시엔스(rubefaciens), R. 루벨라(rubella), R. 루베센스(rubescens), R. 루브라(rubra), R. 루브로루고사(rubrorugosa), R. 루풀라(rufula), R. 루틸라(rutila), R. 산구이네아(sanguinea), R. 산니에이(sanniei), R. 사르토리이(sartoryi), R. 실베스트리스(silvestris), R. 심플렉스(simplex), R. 시넨시스(sinensis), R. 슬루피아에(slooffiae), R. 순키이(sonckii), R. 스트라미네아(straminea), R. 수베리콜라(subericola), R. 수가니이(suganii), R. 타이와넨시스(taiwanensis), R. 타이와니아나(taiwaniana), R. 테르페노이달리스(terpenoidalis), R. 테레아(terrea), R. 텍센시스(texensis), R. 토쿄엔시스(tokyoensis), R. 울자마에(ulzamae), R. 바닐리카(vanillica), R. 부일레미니이(vuilleminii), R. 야로위이, R. 윤나넨시스(yunnanensis) 및 R. 졸티이(zsoltii)가 포함된다. 파피아 종의 적합한 예에는 P. 로도지마(rhodozyma)가 포함된다. 스포로볼로마이세스 종의 적합한 예에는 S. 알보루베센스(alborubescens), S. 반나엔시스(bannaensis), S. 베이징엔시스(beijingensis), S. 비스초피아에(bischofiae), S. 클라바투스(clavatus), S. 코프로스마에(coprosmae), S. 코프로스미콜라(coprosmicola), S. 코랄리누스(corallinus), S. 디메나에(dimmenae), S. 드라코필리(dracophylli), S. 에론가투스(elongatus), S. 그라실리스(gracilis), S. 이노시토필루스(inositophilus), S. 존소니이(johnsonii), S. 코알라에(koalae), S. 마그니스포루스(magnisporus), S. 노보제알란디쿠스(novozealandicus), S. 오도루스(odorus), S. 파타고니쿠스(patagonicus), S. 프로덕투스(productus), S. 로세우스(roseus), S. 사시콜라(sasicola), S. 쉬바타누스(shibatanus), S. 신굴라리스(singularis), S. 수브룬네우스(subbrunneus), S. 시메트리쿠스(symmetricus), S. 시지기이(syzygii), S. 타우포엔시스(taupoensis), S. 수가에(tsugae), S. 잔투스(xanthus) 및 S. 윤나넨시스가 포함된다. 파치솔렌 및 모니리엘라 종의 적합한 예에는 각각 P. 탄노필루스(tannophilus) 및 M. 폴리니스가 포함된다. 본원의 또 다른 비 통상적인 효모의 예로는 슈도지마(Pseudozyma) 종(예컨대, S. 안타르티카), 토도토루라(Thodotorula) 종(예컨대, T. 보고리엔시스(bogoriensis)), 위커하미엘라(Wickerhamiella) 종(예컨대, W. 도메르크퀴아에(domercquiae)), 및 스타르메렐라(Starmerella) 종(예컨대, S. 봄비콜라(bombicola))가 포함된다.
야로위아 리폴리티카는 본원에 개시된 특정 구현예에서 바람직하다. 적합한 Y. 리폴리티카의 예로는 ATCC(American Type Culture Collection, 미국 버지니아 주 매나사스)로부터 입수 가능한 다음의 분리주가 포함된다: 균주명 ATCC #20362, #8862, #8661, #8662, #9773, #15586, #16617, #16618, #18942, #18943, #18944, #18945, #20114, #20177, #20182, #20225, #20226, #20228, #20327, #20255, #20287, #20297, #20315, #20320, #20324, #20336, #20341, #20346, #20348, #20363, #20364, #20372, #20373, #20383, #20390, #20400, #20460, #20461, #20462, #20496, #20510, #20628, #20688, #20774, #20775, #20776, #20777, #20778, #20779, #20780, #20781, #20794, #20795, #20875, #20241, #20422, #20423, #32338, #32339, #32340, #32341, #34342, #32343, #32935, #34017, #34018, #34088, #34922, #34922, #38295, #42281, #44601, #46025, #46026, #46027, #46028, #46067, #46068, #46069, #46070, #46330, #46482, #46483, #46484, #46436, #60594, #62385, #64042, #74234, #76598, #76861, #76862, #76982, #90716, #90811, #90812, #90813, #90814, #90903, #90904, #90905, #96028, #201241, #201242, #201243, #201244, #201245, #201246, #201247, #201249, 및/또는 #201847.
본원의 균류 세포는 (예컨대, 위에 기술된 바와 같이) 효모 또는 사상균류와 같은 임의의 다른 균류 유형일 수 있다. 예를 들어, 본원의 균류는 담자균, 접합균, 호상균 또는 자낭균 균류일 수 있다. 본원의 사상균류의 예에는 트리코데르마, 크리소스포리움(Chrysosporium), 티엘라비아(Thielavia), 뉴로스포라(Neurospora)(예를 들어, N. 크라사(crassa), N. 시토필라(sitophila)), 크리포넥트리아(Cryphonectria)(예를 들어, C. 파라시티카(parasitica)), 아우레오바시디움(Aureobasidium)(예를 들어, A. 풀루란스(pullulans)), 필리바시디움(Filibasidium), 피로마이세스(Piromyces), 크리플로콕쿠스(Cryplococcus), 아크레모니움(Acremonium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 시탈리디움(Scytalidium), 스키조필룸(Schizophyllum), 스포로트리쿰(Sporotrichum), 페니실리움(Penicillium) (예를 들어, P. 빌라이아에(bilaiae), P. 카멤베르티(camemberti), P. 칸디둠(candidum), P. 크리소게눔(chrysogenum), P. 엑스펜숨(expansum), P. 퍼니쿨로섬(funiculosum), P. 글라우컴(glaucum), P. 마네페이(marneffei), P. 로커포르티(roqueforti), P. 베르루코숨(verrucosum), P. 비리디카툼(viridicatum)), 기베렐라(Gibberella) (예를 들어, G. 아쿠미나타(acuminata), G. 아베나세아(avenacea), G. 바카타(baccata), G. 키르키나타(circinata), G. 시아노게나(cyanogena), G. 푸지쿠로이(fujikuroi), G. 인트리칸스(intricans), G. 풀리카리스(pulicaris), G. 스틸보이데스(stilboides), G. 트리킨크타(tricincta), G. 제에(zeae)), 미셀리오프토라(Myceliophthora), 뮤코(Mucor)(예를 들어, M. 룩시(rouxii), M. 시르시넬로이데스(circinelloides)), 아스퍼질러스(Aspergillus)(예를 들어, A. 니거(niger), A. 오리자에(oryzae), A. 니둘란스(nidulans), A. 플라버스(flavus), A. 렌툴루스(lentulus), A. 테레우스, A. 클라바투스, A. 푸미가투스(fumigatus)), 푸사리움(Fusarium)(예를 들어, F. 그라미네아룸(graminearum), F. 옥시스포룸(oxysporum), F. 부비게눔(bubigenum), F. 솔라니(solani), F. 옥시스포룸, F. 베르티실리오이데스(verticillioides), F. 프로리페라툼(proliferatum), F. 베네나툼(venenatum)) 및 후미콜라(Humicola) 속의 것들 및 이들의 무성 생식형과 유성 생식형이 포함된다. 본원의 균류의 속 및 종은 원하는 경우 Barnett and Hunter (Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3rd Edition, Burgess Publishing Company, 1972)에 개시된 바와 같은 형태에 의해 정의될 수 있다. 특정 구현예에서, 균류는 선택적으로 식물 또는 동물(예컨대, 인간)의 해충/병원균으로 특징지어질 수 있다.
본원의 특정 양태에서 트리코데르마 종에는 T. 아그레시범(aggressivum), T. 아마조니쿰(amazonicum), T. 아스페렐룸(asperellum), T. 아트로비리데(atroviride), T. 아우레오비리데(aureoviride), T. 아우스트로코닌기이(austrokoningii), T. 브레비콤팩툼(brevicompactum), T. 칸디둠, T. 카리 배움(caribbaeum), T. 카톱트론(catoptron), T. 크레메움(cremeum), T. 세라미쿰(ceramicum), T. 세리넘(cerinum), T. 클로로스포룸(chlorosporum), T. 크로모스페르뭄(chromospermum), T. 신나모메움(cinnamomeum), T. 시트리노비리데(citrinoviride), T. 크라숨(crassum), T. 크레메움(cremeum), T. 딩글레예아(dingleyeae), T. 도로테아에(dorotheae), T. 에푸숨(effusum), T. 에리나세움(erinaceum), T. 에스토니쿰(estonicum), T. 페르틸레(fertile), T. 겔라티노수스(gelatinosus), T. 가넨세(ghanense), T. 하마툼(hamatum), T. 하르지아눔(harzianum), T. 헬리쿰(helicum), T. 인트리카툼(intricatum), T. 코니랑브라(konilangbra), T. 코닌기이(koningii), T. 코닌지옵시스(koningiopsis), T. 론지브라치아툼(longibrachiatum), T. 론지필레(longipile), T. 미누티스포룸(minutisporum), T. 오블론지스포룸(oblongisporum), T. 오발리스포룸(ovalisporum), T. 페테르세니(petersenii), T. 필로스타히디스(phyllostahydis), T. 필루리페룸(piluliferum), T. 플레우로티콜라(pleuroticola), T. 플레우로툼(pleurotum), T. 폴리스포룸(polysporum), T. 슈도코닌기(pseudokoningii), T. 푸베센스(pubescens), T. 레세이(reesei), T. 로게르소니(rogersonii), T. 로시쿰(rossicum), T. 사투르니스포룸(saturnisporum), T. 시넨시스(sinensis), T. 시누오숨(sinuosum), T. 스피랄레(spirale), T. 스트라미네움(stramineum), T. 스트리고숨(strigosum), T. 스트로마티쿰(stromaticum), T. 수로툰둠(surrotundum), T. 타이와넨세(taiwanense), T. 타일랜디쿰(thailandicum), T. 텔레포리콜룸(thelephoricolum), T. 테오브로미콜라(theobromicola), T. 토멘토숨(tomentosum), T. 벨루티눔(velutinum), T. 비렌스(virens), T. 비리데(viride) 및 T. 비리데센스(viridescens)가 포함된다. 본원의 트리코데르마 종은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 Trichoderma : Biology and Applications (P.K. Mukherjee et al., Eds., CABI, Oxfordshire, UK, 2013)에 기재된 바와 같이 배양되고/배양되거나 조작될 수 있다.
특정 구현예에서, 미생물 세포는 조류 세포이다. 예를 들어, 조류 세포는 다음 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다: 녹조류, 홍조류, 갈조류, 규조류 및 와편모충류(와편모조류). 다른 양태에서, 조류 세포는 미세조류(예를 들어, 식물성 플랑크톤, 미소식물 또는 플랑크톤 조류) 또는 거대조류(켈프, 해초)일 수 있다. 추가적인 예로, 본원의 조류 세포는 포르피라(Porphyra)(김), 팔마리아(Palmaria) 종, 예컨대 P. 팔마타(palmata)(덜스(dulse)), 아르트로스피라(Arthrospira) 종, 예컨대 A. 플라텐시스(platensis)(스피룰리나(spirulina)), 클로렐라(Chlorella)(예를 들어, C. 프로토테코이데스(protothecoides)), 콘드루스(Chondrus) 종, 예컨대 C. 크리스푸스(crispus)(아이리쉬 모스(Irish moss)), 아파니조메논(Aphanizomenon), 사르가쑴(Sargassum), 코차유요(Cochayuyo), 보트리오코쿠스(Botryococcus)(예를 들어, B. 브라우니이(braunii)), 두날리엘라(Dunaliella)(예를 들어, D. 테르티올렉타(tertiolecta), 그라실라리아(Gracilaria), 플레우로크리시스(Pleurochrysis)(예를 들어, P. 카르테라에(carterae)), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus), 시클로텔라(Cyclotella), 한츠슈이아(Hantzschia), 난노클로리스(Nannochloris), 난노클로롭시스(Nannochloropsis), 니츠키아(Nitzschia), 패오닥틸룸(Phaeodactylum)(예를 들어, P. 트리코누툼(tricornutum)), 세네데스무스(Scenedesmus), 스티코코커스(Stichococcus), 테트라셀미스(Tetraselmis)(예를 들어, T. 수에시카(suecica)), 탈라시오시라(Thalassiosira)(예를 들어, T. 슈도나나((pseudonana)), 크립테코디니움(Crypthecodinium)(예를 들어, C. 코흐니(cohnii)), 네오클로리스(Neochloris) (예를 들어, N. 올레오아분단스(oleoabundans)) 또는 치오키트리움(Schiochytrium)일 수 있다. 본원의 조류 종은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 Thompson (eolss.net/sample-chapters 인터넷 사이트에서 이용할 수 있는 Algal Cell Culture. Encyclopedia of Life Support System ( EOLSS ), Biotechnology Vol 1)에 기재된 바와 같이 배양되고/배양되거나 조작될 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 미생물 세포를 RNA-유도 엔도뉴클레아제 (RGEN)의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 미생물 세포 내로 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분을 전달하는 방법을 포함하며, 이때, 상기 단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되어 있으며, 상기 RGEN 단백질-CPP 복합체는 이러한 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로질러, 이러한 미생물 세포 내로 들어간다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 유용한 미생물 세포는 피토프토라(Phytophtora) 종, 예컨대, 피토프토라 카프시시(Phytophtora capsici)(Lamour et al. 2012. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Mol. Plant Pathol. May 13(4) : 329-337), 지모셉토리아(Zymoseptoria) 종, 예컨대, 셉토리아 트리티시(Septoria tritici)(Testa et al. 2015. Overview of genomic and bioinformatics resources for Zymoseptoria tritici. Fungal Genet. Biol. Jun. 79:13-16) 및 보트리티스(Botrytis) 종, 예컨대, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)(Hahn M. 2014. The rising threat of fungicide resistance in plant pathogenic fungi: Botrytis as a case study. J. Chem. Biol 7:133-141)로부터 선택되는 세포를 포함한다.
본원의 원생생물 세포는 예를 들어, 섬모충강(예컨대, 테트라히메나(Tetrahymena), 파라메시움(Paramecium), 콜피디움(Colpidium), 콜포다(Colpoda), 글라우코마(Glaucoma), 플라티오프르야(Platyophrya), 보르티셀라(Vorticella), 포토마쿠스(Potomacus), 슈도코닐렘부스(Pseudocohnilembus), 유플로테스(Euplotes), 엔겔마니엘라(Engelmaniella) 및 스틸로니키아(Stylonichia) 속), 편모충아문(편모류), 식물성 편모충강(예컨대, 유글레나(Euglena), 아스타시아(Astasia), 해마토콕쿠스(Haematococcus) 및 크립테코디니움(Crypthecodinium) 속), 동물성 편모충강, 근족충상강, 엽상근족충강(예컨대, 아메바(Amoeba) 속) 및 진동균충강(예컨대, 딕티오스텔리움(Dictyostelium) 및 피사룸(Physarum) 속)으로부터 선택될 수 있다. 본원의 특정 원생생물은 본원에 참고로 포함된, 예를 들어, ATCC® Protistology Culture Guide: tips and techniques for propagating protozoa and algae (2013, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 인터넷 사이트에서 이용 가능함)에 기술된 바와 같이 배양되고/배양되거나 조작될 수 있다. 원생생물은 특정 구현예에서 선택적으로 식물 또는 동물(예컨대, 인간)의 해충/병원균으로 특징지어질 수 있다.
특정 구현예에서 박테리아 세포는 구균, 간균, 스피로헤타, 스페로플라스트, 원형질체 등의 형태인 것들일 수 있다. 기타 비제한적인 박테리아의 예로는 그램 음성 및 그램 양성인 것들이 포함된다. 또 다른 비제한적인 박테리아의 예에는 살모넬라(예컨대, S. 티피(typhi), S. 엔테리티디스(enteritidis)), 시겔라(예컨대, S. 디스엔테리아에(dysenteriae))), 에스케리챠(예컨대, 대장균), 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia), 프로테우스(Proteus), 예시니아, 시트로박터(Citrobacter), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 프로비덴시아(Providencia), 클레브시엘라(Klebsiella), 하프니아(Hafnia), 에윈겔라(Ewingella), 클루이베라(Kluyvera), 모르가넬라(Morganella), 플라노코커스(Planococcus), 스토마토코커스(Stomatococcus), 미크로코커스(Micrococcus), 스타필로코커스(예컨대, S. 아우레우스(aureus), S. 에피데르미디스(epidermidis)), 비브리오(예컨대, V. 콜레라에(cholerae)), 아에로모나스(Aeromonas), 플레스시오모나스(Plessiomonas), 해모필루스(Haemophilus)(예컨대, H. 인플루엔자), 악티노바실루스(Actinobacillus), 파스퇴렐라(Pasteurella), 마이코플라스마(Mycoplasma)(예컨대, M. 뉴모니아(pneumonia)), 우레아플라스마(Ureaplasma), 리케챠(Rickettsia), 콕시엘라(Coxiella), 로카리마에(Rochalimaea), 에르리키아(Ehrlichia), 스트렙토코커스(Streptococcus)(예컨대, S. 피오제네스, S. 뮤탄스, S. 뉴모니아에), 엔테로코커스(Enterococcus)(예컨대, E. 패칼리스(faecalis)), 애로코커스(Aerococcus), 게멜라(Gemella), 락토코커스(Lactococcus)(예컨대, L. 락티스(lactis)), 류코노스톡(Leuconostoc)(예컨대, L. 메센테로이데스(mesenteroides), 페디코커스(Pedicoccus), 바실루스(예컨대, B. 세레우스(cereus), B. 서브틸리스(subtilis), B. 튜린겐시스(thuringiensis)), 코리네박테리움(Corynebacterium)(예컨대, C. 디프테리아(diphtheriae)), 아르카노박테리움(Arcanobacterium), 악티노마이세스(Actinomyces), 로도코커스(Rhodococcus), 리스테리아(Listeria)(예컨대, L. 모노시토게네스(monocytogenes)), 에리시페로트릭스(Erysipelothrix), 가드네렐라(Gardnerella), 네이세리아(Neisseria)(예컨대, N. 메닌기티디스(meningitidis), N. 고노르호에(gonorrhoeae)), 캄필로박터(Campylobacter), 아르코박터(Arcobacter), 울리넬라(Wolinella), 헬리코박터(Helicobacter)(예컨대, H. 파일로리(pylori)), 아크로모박터(Achromobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium)(예컨대, A. 투메파시엔스(tumefaciens)), 알카리게네스(Alcaligenes), 크리세오모나스(Chryseomonas), 코마모나스(Comamonas), 에이케넬라(Eikenella), 플라비모나스(Flavimonas), 플라보박테리움(Flavobacterium), 모라셀라(Moraxella), 올리겔라(Oligella), 슈도모나스(Pseudomonas)(예컨대, P. 애루기노사(aeruginosa)), 세와넬라(Shewanella), 위크셀라(Weeksella), 산토모나스(Xanthomonas), 보르데텔라(Bordetella), 프란시에셀라(Franciesella), 브루셀라(Brucella), 레지오넬라(Legionella), 아피피아(Afipia), 바르토넬라(Bartonella), 카림마토박테리움(Calymmatobacterium), 카르디오박테리움(Cardiobacterium), 스트렙토바실루스(Streptobacillus), 스피릴룸(Spirillum), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 펩토코커스(Peptococcus), 사르시니아(Sarcinia), 코프로코커스(Coprococcus), 루미노코커스(Ruminococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 모비룬커스(Mobiluncus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 락토바실루스(Lactobacillus)(예컨대, L. 락티스(lactis), L. 아시도필루스(acidophilus)), 로티아(Rothia), 클로스트리듐(Clostridium)(예컨대, C. 보툴리눔(botulinum), C. 퍼프린겐스(perfringens)), 박테로이데스(Bacteroides), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 빌로필라(Bilophila), 렙토트리키아(Leptotrichia), 울리넬라(Wolinella), 아시다미노코커스(Acidaminococcus), 메가스패라(Megasphaera), 베일로넬라(Veilonella), 노르카르디아(Norcardia), 악티노마두라(Actinomadura), 노르카디옵시스(Norcardiopsis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 마이크로폴리스포라스(Micropolysporas), 테르모악티노마이세테스(Thermoactinomycetes), 마이코박테리움(Mycobacterium)(예컨대, M. 튜버큘로시스(tuberculosis), M. 보비스(bovis), M. 레프라(leprae)), 트레포네마(Treponema), 보렐리아(Borrelia)(예컨대, B. 부르그도르페리(burgdorferi)), 렙토스피라(Leptospira) 및 클라미디아(Chlamydiae) 속의 것들을 들 수 있다. 특정 구현예에서 박테리아는 선택적으로 식물 또는 동물(예컨대, 인간)의 해충/병원균을 특징으로 할 수 있다. 박테리아는 특정 구현예에서 (예컨대, 기타 박테리아를 함유하거나 효모 및/또는 기타 박테리아를 함유하는) 혼합 미생물 집단 내에 포함될 수 있다.
특정 구현예에서 고세균 세포는 임의의 고세균 문(Archaeal phylum), 예컨대, 유리고세균(Euryarchaeota), 크렌고세균(Crenarchaeota), 나노고세균(Nanoarchaeota), 코르고세균(Korarchaeota), 아이가르고세균(Aigarchaeota), 또는 타움고세균(Thaumarchaeota)으로부터 유래할 수 있다. 본원의 고세균 세포는 예를 들어, 호극성일 수 있다(예컨대, 대부분의 생명체에 유해한 물리적으로 또는 지구화학적으로 극도의 조건에서 성장 및/또는 번식할 수 있다). 호극성 고세균의 일부 예에는 호온성(예컨대, 45~122℃의 온도에서 성장할 수 있음), 과호열성(예컨대, 80~122℃의 온도에서 성장할 수 있음), 호산성(예컨대, 3 이하의 pH 수준에서 성장할 수 있음), 호알칼리성(예컨대, 9 이상의 pH 수준에서 성장할 수 있음), 및/또는 호염성(예컨대, 고염 농도[예를 들어, 20-30% NaCl]에서 성장할 수 있음)인 것들이 포함된다. 고세균 종의 예로는 할로박테리움(Halobacterium)(예컨대, H. 볼카니이(volcanii)), 설폴로부스(Sulfolobus)(예컨대, S. 설파타리쿠스(solfataricus), S. 아시도칼다리우스(acidocaldarius)), 써모코커스(Thermococcus)(예컨대, T. 알칼리필루스(alcaliphilus), T. 셀레르(celer), T. 키토노파구스(chitonophagus), T. 감마톨레란스(gammatolerans), T. 하이드로써말리스(hydrothermalis), T. 코다카렌시스(kodakarensis), T. 리토랄리스(litoralis), T. 펩토노필루스(peptonophilus), T. 프로푼두스(profundus), T. 스테테리(stetteri)), 메타노칼도코커스(Methanocaldococcus)(예컨대, M. 써모리토트로피쿠스(thermolithotrophicus), M. 잔나스키이(jannaschii)), 메타노코커스(Methanococcus)(예컨대, M. 마리팔루디스(maripaludis)), 메타노써모박터(Methanothermobacter)(예컨대, M. 마르부르겐시스(marburgensis), M. 써마우토트로피쿠스(thermautotrophicus)), 아캐오글로부스(Archaeoglobus)(예컨대, A. 풀기두스(fulgidus), 니트로소푸밀루스(Nitrosopumilus)(예컨대, N. 마리티무스(maritimus)), 메탈로스패라(Metallosphaera)(예컨대, M. 세둘라(sedula)), 페로플라스마(Ferroplasma), 써모플라스마(Thermoplasma), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter)(예컨대, M. 스미시(smithii)), 및 메타노스패라(Methanosphaera)(예컨대, M. 스타츠마나(stadtmanae)) 속의 것들이 포함된다.
본원의 곤충 세포의 예로 예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포, 봄빅스 모리(Bombyx mori) 세포 등이 포함된다. S. 프루기페르다 세포는 예를 들어, Sf9와 Sf21을 포함한다. T. 니 난소 세포는 예를 들어, (인비트로젠(Invitrogen)이 제조한 BTI-TN-5B1-4라고 알려져 있는) 하이 파이브(HIGH FIVE) 세포를 포함한다. B. 모리 세포는 예를 들어, N4를 포함한다. 본원의 특정 곤충 세포는 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는, Growth and Maintenance of Insect cell lines (2010, 인비트로젠, 매뉴얼 파트 번호 25-0127, MAN0000030)에 기술된 바와 같이 배양되고/배양되거나 조작될 수 있다. 다른 양태에서, 곤충 세포는 거염벌레(armyworm), 검거세미(black cutworm), 큰담배밤나방 유충(corn earworm), 옥수수 뜀벼룩갑충(corn flea beetle), 옥수수잎진딧물(corn leaf aphid), 옥수수뿌리진딧물(corn root aphid), 유럽옥수수나무좀(European corn borer), 밤나방과 나방(fall armyworm), 낟알 야도충(granulate cutworm), 알풍뎅이(Japanese beetle), 명충나방 유충(lesser cornstalk borer), 옥수수 바구미(maize billbug), 멜라노투스 코무니스(melanotus communis), 씨고자리파리(seedcorn maggot), 잔디 벌집 나방(sod webworms), 수수 깔따구(sorghum midge), 수수밤나방(sorghum webworm), 남부 옥수수 바구미(southern corn billbug), 남부 옥수수 뿌리벌레(southern corn rootworm), 남부 조명충 나방(southern cornstalk borer), 남부 감자 방아벌레 유충(southern potato wireworm), 잎진드기(spider mite), 줄기 명나방(stalk borer), 사탕수수 딱정벌레(sugarcane beetle), 담배 방아벌레 유충(tobacco wireworm), 굼벵이(white grub), 진딧물(aphid), 면화씨 바구미(boll weevil), 목화다래벌레(bollworm complex), 양배추 은무늬밤나방 유충(cabbage looper), 장님노린재(tarnished plant bug), 총채벌레(thrip), 점박이응애(two spotted spider mite), 노란 줄무늬 거염벌레(yellow striped armyworm), 알팔파 바구미(alfalfa weevil), 클로버 잎 바구미(clover leaf weevil), 클로버 뿌리 바구미(clover root curculio), 밤나방 유충(fall armyworm), 메뚜기, 가라지거품벌레(meadow spittlebug), 완두 진딧물(pea aphid), 감자 매미충(potato leafhopper), 잔디 벌집 나방(sod webworm), 뒷흰날개밤나방(variegated cutworm), 명충나방 유충(lesser cornstalk borer), 담배 총채벌레(tobacco thrip), 방아벌레 유충(wireworm), 긴가슴잎벌레(cereal leaf beetle), 긴 노린재(chinch bug), 보리수염진딧물(English grain aphid), 녹색 진딧물(greenbug), 밀혹파리(hessian fly), 콩잎딱정벌레(bean leaf beetle), 파밤나방(beet armyworm), 가룃과 딱정벌레(blister beetle), 꼽추잎벌레(grape colaspis), 녹색 클로버충(green cloverworm), 멕시칸 콩 딱정벌레(Mexican bean beetle), 콩 루퍼(soybean looper), 콩 명밤나비(soybean stem borer), 노린재(stink bug), 삼색 알팔파 톡토기(three-cornered alfalfa hopper), 벨벳콩쐐기벌레(velvetbean caterpillar), 눈벌레(budworm), 양배추 은무늬밤나방 유충(cabbage looper), 거세미(cutworm), 초록풍이(green june beetle), 복숭아혹진딧물(green peach aphid), 박각시나방(hornworm), 감자나방(potato tuberworm), 남부 땅강아지(southern mole cricket), 석플라이(suckfly), 담배 뜀벼룩갑충(tobacco flea beetle), 채소 바구미(vegetable weevil), 또는 화이트 프린지드 비틀(whitefringed beetle)과 같은 식물 해충/병원균의 세포일 수 있다. 대안적으로, 곤충 세포는 동물(예컨대, 인간)의 해충/병원균의 세포일 수 있다.
예를 들어, 선충 세포는 다음 속 중 임의의 것으로부터의 선충일 수 있다: 멜로이도기네(Meloidogyne, 뿌리혹 선충), 프라틸렌쿠스(Pratylenchus, 뿌리썩이 선충), 헤테로데라(Heterodera, 시스트 선충), 글로보데라(Globodera, 시스트 선충), 디틸렌쿠스(Ditylenchus, 줄기 구근 선충), 틸렌쿨루스(Tylenchulus, 감귤 선충), 자이피네마(Xiphinema, 검 선충), 라도폴루스(Radopholus, 천공 선충), 로틸렌쿨루스(Rotylenchulus, 콩팥 선충), 헬리코틸렌쿠스(Helicotylenchus, 나선 선충), 또는 벨로노라이무스(Belonolaimus, 침 선충). 특정 구현예에서 선충은 선택적으로 식물 또는 동물(예컨대, 인간)의 해충/병원균을 특징으로 할 수 있다. 다른 양태에서 선충은 C. 엘레간스(elegans)일 수 있다.
본원의 어류 세포는 본원에 참고로 포함된, 예를 들어, 미국 특허 번호 7408095 및 7217564, 그리고 Tissue Culture of Fish Cell Lines(T. Ott, NWFHS Laboratory Procedures Manual - Second Edition, Chapter 10, 2004)에 개시된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 이들 참고문헌은 어류 세포의 배양 및/또는 조작에 관한 정보도 개시하고 있다. 어류 세포의 비제한적인 예는 경골 어류, 예컨대, 제브라피쉬, 메다카(medaka), 자이언트 레리오(Giant rerio), 또는 복어로부터 유래하는 것일 수 있다.
본원의 식물 세포는 예를 들어, 외떡잎식물 세포 또는 쌍떡잎식물 세포일 수 있다. 본원의 외떡잎식물의 예로는 옥수수(제아 메이스(Zea mays)), 벼(오리자 사티바(Oryza sativa)), 호밀(세칼레 세레알레(Secale cereale)), 수수(소르검 비칼라(Sorghum bicolor), 소르검 불가레(Sorghum vulgare)), 밀렛(예컨대, 펄 밀렛(pearl millet), 페니세툼 글라쿰(Pennisetum glaucum)), 기장(proso millet, 파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum)), 조(foxtail millet(세타리아 이탈리카(Setaria italica)), 손가락조(finger millet(엘류신 코라카나(Eleusine coracana))), 밀(트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum), 사탕수수(사카룸(Saccharum) 종), 귀리(아베나(Avena)), 보리(호르데움(Hordeum)), 스위치그래스(파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 파인애플(아나나스 코모수스(Ananas comosus)), 바나나(무사(Musa) 종), 야자, 관상용 식물 및 잔디를 들 수 있다. 본원의 쌍떡잎식물의 예로는 콩(글리신 맥스(Glycine max)), 카놀라(브라시카 나푸스(Brassica napus) 및 B. 캠페스트리스(campestris)), 알팔파(메디카고 사티바(Medicago sativa)), 담배(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)), 아라비돕시스(A. 탈리아나(thaliana)), 해바라기(헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)), 목화(고시피움 아르보레움(Gossypium arboreum)), 땅콩(아라키스 하이포개아(Arachis hypogaea)), 토마토(솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)) 및 감자(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum))를 들 수 있다. 식물 세포는 식물의 임의의 부분 및/또는 식물 발달의 임의의 단계로부터 유래할 수 있다.
본원의 식물 세포는 종래의 조건을 이용하여 재배되거나 식물 내로 재생될 수 있다. 예를 들어, McCormick et al., (1986) Plant Cell Rep 5:81-4 참조. 그런 다음, 재생된 식물은 재배될 수 있고, 동일한 계통으로 또는 상이한 계통으로 수분될 수 있어, 원하는 특징을 갖는/갖거나(예컨대, 개량) 도입된, 확인된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 자손을 가져올 수 있다. 개량이 안정적으로 유지되고 유전되며, 종자가 수확됨을 확실히 하기 위해서 두 세대 이상을 재배할 수 있다.
특정 구현예에서, 포유류 세포는 인간, 비 인간 영장류(예컨대, 원숭이, 유인원), 설치류(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니 피크), 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 말, 염소, 또는 양 세포일 수 있다. 본원의 포유류 세포의 기타 예로 1차 상피 세포(예컨대, 케라티노사이트, 경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포, 망막 상피 세포); 확립된 세포주(예컨대, 293 배아 신장 세포, HeLa 경부 상피 세포, PER-C6 망막 세포, MDBK 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CHO 세포, BeWo 세포, 장(Chang) 세포, 디트로이트(Detroit) 562 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS 180 세포, LS 174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론(Clone) M-3 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, LLC-PK1 세포, PK-15 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, TH-I 세포, B1 세포); 임의의 조직 또는 기관(예컨대, 피부, 심장; 간; 신장; 결장; 장; 식도; 위; 신경 조직, 예컨대, 뇌 또는 척수; 폐; 혈관 조직; 림프양 조직, 예컨대, 림프샘, 아데노이드, 편도, 골수, 또는 혈액; 비장)으로부터의 임의의 상피 세포, 중간엽 세포(예컨대, 섬유아세포), 신경 세포, 또는 근육 세포; 및 섬유아세포 또는 섬유아세포 유사 세포주(예컨대, TRG-2 세포, IMR-33 세포, 돈(Don) 세포, GHK-21 세포, 시트룰리네미아(citrullinemia) 세포, 뎀지(Dempsey) 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl1 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, 베로(Vero) 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDM1C3 세포, KLN205 세포, 맥코이(McCoy) 세포, 마우스(Mouse) L 세포, SCC-PSA1, 스위스(Swiss)/3T3 세포, 인디안 문트잭(Indian muntjac) 세포, SIRC 세포, 젠슨(Jensen) 세포)가 포함된다. 포유류 세포주를 배양하고 조작하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
특정 구현예에서, 미생물 세포는 동물 또는 식물의 임의의 병원균 및/또는 해충일 수 있다. 이러한 병원균/해충의 예로는 다양한 유형의 박테리아, 균류, 효모, 원생생물, 선충 및 곤충을 들 수 있다. 당업자라면 위에 개시된 이러한 병원균/해충의 예를 인식할 것이다.
본원에 기술된 바와 같이(실시예 10 참조), 세포 침투성 펩티드는 화물을 피토프토라 카프시시, 셉토리아 트리티시 및 보트리티스 시네레아를 포함하는 상이한 진핵생물 종에 전달할 수 있었다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 미생물 세포를 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 피토프토라 카프시시, 셉토리아 트리티시 및 보트리티스 시네레아로 이루어지는 군으로부터 선택된 미생물 세포 내로 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분을 전달하는 방법으로, 이때, 상기 단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되어 있으며, 상기 RGEN 단백질-CPP 복합체는 이러한 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로질러, 이러한 미생물 세포 내로 들어간다.
본원의 특정 구현예의 조성물은 가이드 폴리뉴클레오티드/ Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함할 수 있는데, 이때, 이러한 단백질 성분과 CPP는 폴리뉴클레오티드/엔도뉴클레아제 단백질-CPP 복합체에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 결합되어 있고, 이러한 폴리뉴클레오티드/엔도뉴클레아제 단백질-CPP 복합체는 세포(예컨대, 미생물 세포)의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있다. 이러한 가이드 폴리뉴클레오티드와 Cas 엔도뉴클레아제는, Cas 엔도뉴클레아제가 DNA 표적 부위에서 이중 가닥 절단을 도입할 수 있게 하는, "가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체"라 지칭되는 복합체를 형성할 수 있다.
또한, 개시된 발명은 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분을 세포(예컨대, 미생물 세포) 내로 전달하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 세포를 RGEN 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는데, 이때, RGEN 단백질과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 결합되어 있다. 이러한 접촉 단계의 결과로, RGEN 단백질-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있어, 그에 의해 세포에 진입할 수 있다. RGEN 단백질 성분이 RNA 성분과 결합되는(그에 의해 RGEN을 형성하는) 특정 구현예에서, 개시된 방법은 RGEN-CPP 복합체를 세포 내로 전달하는 것을 대상으로 한다. 추가적으로, RGEN은 특정 구현예에서, RGEN 매개성 DNA 표적화에 이용될 수 있으므로, 이러한 방법은 선택적으로, 세포에서 DNA를 표적화하는 방법으로 특징지어질 수 있다.
이 방법은 각 방법의 특징(예컨대, 세포 유형, RGEN 단백질 성분, CPP, 세포 기관 표적화 서열 등)과 관련하여 예를 들어 위에 개시된 구현예 또는 아래 실시예 중 임의의 것을 이용하여 실현될 수 있다. 따라서, 위 또는 실시예에서 개시된 임의의 특징, 또는 이들 특징의 임의의 조합은 본원의 전달 방법의 구현예를 특징짓는 데 적절히 이용될 수 있다. 다음의 전달 방법 특징들이 예이다.
본원의 전달 방법의 구현예는 세포(예컨대, 미생물 세포)를 RGEN 단백질-CPP 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 접촉은 세포의 외부 표면(예컨대, 세포막, 세포벽)과 복합체의 상호 작용을 초래하여, 그에 의해 복합체의 CPP 성분이 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로질러 복합체의 횡단을 개시할 수 있게 한다고 여겨진다.
RGEN 단백질-CPP 복합체를 포함하는 조성물을 세포(예컨대, 미생물 세포)와 접촉시키는 것은 이러한 복합체가 세포 내로 진입할 수 있도록 하는 온도에서 이루어질 수 있다. 이러한 접촉은 예를 들어, 약 4 내지 45℃ 사이의 임의의 온도에서 이루어질 수 있다. 비제한적인 구현예에서 접촉 온도는 약 4, 15, 20, 30, 37, 또는 42℃일 수 있다. 동일한 온도 또는 온도 범위가 접촉 단계 도중에 유지될 수 있거나, 적절히 변경될 수 있다(예컨대, 둘 이상의 상이한 온도).
RGEN 단백질-CPP 복합체를 포함하는 조성물을 세포와 접촉시키는 것은 이러한 복합체가 세포 내로 진입할 수 있도록 하기에 적당한 시간 동안 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세포는 적어도 약 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600, 660, 또는 720분 동안 RGEN 단백질-CPP 복합체와 배양될 수 있다.
접촉이 수행되는 환경(예컨대, 완충액, 물과 염 농도, pH, RGEN 단백질-CPP 복합체의 순도)은 RGEN 단백질-CPP 복합체를 포함하는 조성물과 관련하여 위에 개시된 조건들 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 세포는 HEPES 완충액(예컨대, 약 25 mM HEPES, 예를 들어, 25 mM HEPES/KOH pH 7.5, 200 mM KCl, 20% 글리세롤, 1 mM DTT) 또는 PBS(예컨대, 1X PBS, pH 7)에서 복합체와 배양될 수 있다.
하나 이상의 세포(예컨대, 미생물 세포)가 RGEN 단백질-CPP 복합체를 포함하는 조성물과 접촉될 수 있다. 본원의 세포는 (i) 생체 내에서 유기체/조직으로, (ii) 생체 외에서 조직 또는 세포 집단으로, 또는 (iii) 시험관 내 상태(예컨대, 배양된 세포)로 존재할 수 있다.
본원의 RGEN 단백질-CPP 복합체의 세포 내로의 진입은 전형적으로 복합체가 완전히 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로질러, 적어도 세포 원형질 내에 포함될 때를 지칭한다. 임의의 특정 이론 또는 메커니즘에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 비 공유적 연결에 의해 서로 묶인 RGEN 단백질-CPP 복합체는 RGEN 단백질-CPP 복합체가 세포로 진입한 후에 완전한 또는 부분적인 복합체로 남아있거나, RGEN 단백질 성분이 복합체의 CPP 성분(들)로부터 분리된다고 여겨진다. 어떠한 사례에서도, RGEN 단백질 성분은 본원의 적합한 RNA 성분과 결합할 수 있다; 이러한 결합은 예를 들어, 세포질, 핵 또는 미토콘드리아에서 발생할 수 있다. 이러한 능력은 공유적 연결에 의해 서로 묶인 RGEN 단백질-CPP 복합체에 마찬가지로 적용된다.
RGEN 단백질 전달 방법의 특정 구현예에서, 본원의 조성물은 RGEN 단백질-CPP 복합체의 RGEN 단백질 성분과 결합되는 적어도 하나의 RNA 성분을 더 포함한다(즉, 조성물이 RGEN-CPP 복합체를 포함한다). 이 구현예에서 미생물 세포의 염색체 또는 에피솜의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하는 RNA 성분은 본원에 개시된 바와 같을 수 있다. RGEN은 표적 부위 서열과 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 하나의 DNA 가닥 또는 두 DNA 가닥을 절단할 수 있다. 또한, 이러한 구현예는 RGEN-CPP 복합체를 미생물 세포 내로 전달하는 방법, 또는 대안적으로 RNA를 미생물 세포 내로 전달하는 방법을 특징으로 할 수 있다.
이러한 구현예에 사용하기 위한 RNA 성분(예컨대, gRNA)은 당해 분야에 공지된 임의의 수의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본원의 RNA 성분을 제조하기 위하여 시험관 내 전사 공정을 이용할 수 있다. 비제한적인 특정 구현예에서 RNA 성분을 암호화하는 적합한 DNA 구조물로부터 RNA 성분을 전사하기 위하여 박테리아 RNA 폴리머라제(예를 들어, T7, T3, SP6)를 이용할 수 있다. RNA 성분은 원하는 경우, 다른 생체분자(예를 들어, 단백질, 당류, 지질)에 대하여 적어도 약 70%, 80%, 90%, 또는 95% 순도까지 가공될 수 있다.
RNA 성분 및 RGEN 단백질-CPP 복합체를 포함하는 조성물을 제조하기 위하여, RNA 성분은 RGEN 단백질-CPP 복합체가 이미 용해된 조성물에 용해될 수 있거나 그 역도 같다(또는 이들 성분은 동시에 용해될 수 있다). 이들 요소가 함께 혼합될 때, 예를 들어, 적어도 약 0.5:1, 1.0:1, 1.5:1, 2.0:1, 2.5:1, 3.0:1, 3.5:1, 또는 4.0:1의 RGEN 단백질-CPP 복합체에 대한 RNA 성분의 몰 비율이 이용될 수 있다. 특정 양태에서, RGEN 단백질-CPP 복합체에 대한 RNA 성분의 몰 비율은 약 3.0:1일 수 있거나, 약 2.5:1 내지 3.5:1, 2.75:1 내지 3.25:1, 또는 2.9:1 내지 3.1:1의 범위일 수 있다. 이러한 양태 및 기타 양태에서, RNA 성분과 혼합되는 RGEN 단백질-CPP 복합체의 농도는 적어도 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 또는 10.0 μM, 또는 약 0.5 내지 5.0 μM, 0.5 내지 2.5 μM, 1.0 내지 5.0 μM, 1.0 내지 2.5 μM, 또는 2.5 내지 5.0 μM일 수 있다. RGEN 단백질-CPP 복합체와 RNA가 결합하여 RGEN-CPP 복합체를 형성하는 데 허용되는 시간은 예를 들어, 적어도 약 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 45분, 또는 60분일 수 있다. RNA 성분이 RGEN 단백질-CPP 복합체와 결합될 수 있는 기타 조건(예컨대, 온도, 완충액, 물 및 염의 농도, pH, RGEN 단백질-CPP 복합체의 순도)는 (i) RGEN 단백질-CPP 복합체를 포함하는 조성물, 또는 (ii) RGEN 단백질-CPP 복합체를 세포와 접촉시키는 것과 관련하여 위에 개시된 조건들 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, RNA 성분, 예컨대, gRNA는 실온(예컨대, 약 20 내지 25℃)에서 약 15분 동안 HEPES 완충액(예컨대, 약 25 mM HEPES, 예를 들어 25 mM HEPES/KOH pH 7.5, 200 mM KCl, 20% 글리세롤, 1 mM DTT), 또는 PBS(예를 들어, 1X PBS, pH 7) 내의 RGEN 단백질-CPP 복합체와 접촉될 수 있다. RGEN 단백질-CPP 복합체가 비 공유적 연결로 서로 묶여있는 구현예에서, RNA 성분의 RGEN 단백질에 대한 결합은 CPP를 RGEN 단백질 성분과 배양하기 전에, 배양하는 것과 동시에, 또는 배양한 후에, RNA 성분을 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
RNA 성분을 RGEN 단백질-CPP 복합체와 결합시킨 후, 그에 따른 RGEN-CPP 복합체를 포함하는 조성물(예컨대, CPP-Cas9/gRNA)은 예를 들어, 즉시 세포와 접촉될 수 있다. 접촉은 예를 들어, RNA 성분과 RGEN 단백질-CPP 복합체가 결합된 환경(예컨대, 위 참조)에서 이루어질 수 있다. RGEN-CPP 복합체를 포함하는 조성물은 약 실온, 4℃에서 보관될 수 있거나, 원한다면, 나중에 사용하기 위하여 동결시킬 수 있다(예를 들어, -20 또는 -80℃). RGEN-CPP 복합체 안정성, 및/또는 세포로 진입하여 DNA 표적화를 가져오는 능력은 심지어 이러한 복합체가 1회, 2회, 또는 그 이상의 동결-해동 사이클을 거친 조성물 내에 있더라도 변화되지 않고 남아있을 수 있거나, 각각의 활성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 나타낼 수 있다.
세포와의 접촉을 위하여, RGEN 단백질-CPP 복합체 또는 RGEN-CPP 복합체를 포함하는 조성물은 선택적으로 하나 이상의 부피 배제제(volume exclusion agent)를 포함할 수 있는데, 이것은 세포와 복합체 사이의 접촉점을 강화하는 것으로 생각된다. 본원의 적합한 부피 배제제의 예에는 글리세롤과 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 기타 예로 음이온성 고분자, 예컨대, 폴리아크릴레이트, 폴리메틸아크릴레이트, 또는 음이온성 다당류 고분자(예를 들어, 덱스트란 설페이트)를 들 수 있다. 또 다른 부피 배제제의 예는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 4886741에 개시되어 있다.
RGEN 단백질 전달 방법의 특정 구현예에서, 세포(예컨대, 미생물 세포)는 RGEN 단백질-CPP 복합체가 세포에 진입한 후(즉, 그에 의해 세포 내에서 RGEN-CPP 복합체를 형성) RGEN 단백질-CPP 복합체의 RGEN 단백질 성분과 결합하는 RNA 성분을 포함한다. 이러한 구현예에서 세포의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하는 RNA 성분은 본원에 개시된 바와 같을 수 있다. RGEN은 표적 부위 서열과 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 하나의 DNA 가닥 또는 두 DNA 가닥을 절단할 수 있다.
본원의 하나 이상의 RNA 성분은 예를 들어, RGEN 단백질-CPP 복합체가 도입되는 세포(예를 들어, 미생물 세포)에서 안정적으로 또는 일시적으로 발현될 수 있다. 일시적인 발현의 예로, RGEN 단백질-CPP 복합체는 (i) 이전에 RNA 성분을 일시적으로 발현하도록 개질되었던 세포 내로 전달될 수 있거나, (ii) RNA 성분과 세포 내로 공동으로 전달될 수 있거나, (iii) 일시적인 RNA 성분 발현을 위해 세포가 개질되기 전의 세포 내로 전달될 수 있다.
(ii) RNA 성분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 (ii) 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로, 본원에서 안정적인 및/또는 일시적인 RNA 성분 발현을 위해 이용될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 플라스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 코스미드, 파지미드, 박테리아 인공 염색체(BAC), 바이러스, 또는 선형 DNA(예를 들어, 선형 PCR 생성물) 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포로 전달하는 데 유용한 임의의 기타 유형의 벡터 또는 구조물 내에 포함될 수 있다. 이 폴리뉴클레오티드 서열은 세포에서 일시적으로 존재할 수 있거나(즉, 게놈으로 통합되지 않음) 안정적으로 존재할 수 있다(즉, 게놈으로 통합됨). 또한, 이 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 적합한 마커 서열(예를 들어, 선택 또는 표현형 마커)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본원의 RNA 성분을 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드 서열에 포함되는 적합한 프로모터는 예를 들어 항시성 또는 유도성일 수 있다. 특정 양태의 프로모터는 단위 시간당 상대적으로 많은 수의 생산 개시를 유도할 수 있는 프로모터인 강력한 프로모터를 포함할 수 있고/있거나, 이러한 강력한 프로모터를 포함하는 세포에서 유전자의 평균 전사 수준보다 더 높은 전사 수준을 유도하는 프로모터이다.
본원의 본원의 특정 양태에서(예컨대, 균류 및/또는 효모 세포) 유용한 강력한 프로모터의 예로는 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 출원 번호 2012/0252079(DGAT2), 2012/0252093(EL1), 2013/0089910(ALK2), 2013/0089911(SPS19), 2006/0019297(GPD 및 GPM), 2011/0059496(GPD 및 GPM), 2005/0130280(FBA, FBAIN, FBAINm), 2006/0057690(GPAT) 및 2010/0068789(YAT1)에 개시된 것들을 들 수 있다. 강력한 프로모터의 다른 예로 예를 들어, 균류 및/또는 효모 세포에도 유용할 수 있는, 표 2에 열거된 것들을 들 수 있다.
강력한 프로모터
프로모터 명칭 고유 유전자 참고문헌 a
XPR2 알칼리성 세포외 프로테아제 미국 특허 번호 4937189; EP220864
TEF 번역 신장 인자 EF1-α (tef) 미국 특허 번호 6265185
GPD, GPM 글리세르알데하이드-3-포스페이트-데하이드로게나제(gpd), 포스포글리세레이트 뮤타아제(gpm) 미국 특허 번호 7259255 및 7459546
GPDIN 글리세르알데하이드-3-포스페이트-데하이드로게나제(gpd) 미국 특허 번호 7459546
GPM/FBAIN 키메라 포스포글리세레이트 뮤타아제(gpm)/ 프룩토스-비스포스페이트 알돌라제(fba1) 미국 특허 번호 7202356
FBA, FBAIN, FBAINm 프룩토스-비스포스페이트 알돌라제(fba1) 미국 특허 번호 7202356
GPAT 글리세롤-3-포스페이트
O-아세틸트랜스퍼라제(gpat)		 미국 특허 번호 7264949
YAT1 암모늄 전달효소(yat1) 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0094102
EXP1 수송 단백질 미국 특허 번호 7932077
a 이 표의 각각의 참고문헌은 본원에 참고로 포함된다.
본원의 특정 구현예에 유용한 강력한 프로모터의 기타 예로 PGK1, ADH1, TDH3, TEF1, PHO5, LEU2, 및 GAL1 프로모터뿐만 아니라, 본원에 참고로 포함되는, Velculescu et al.(Cell 88:243-251)에 개시된 강력한 효모 프로모터가 포함된다.
본원의 RNA 성분의 안정적인 및/또는 일시적인 발현을 위한 프로모터는 예를 들어, RNA 폴리머라제 II(Pol II) 프로모터일 수 있다. 위에 열거된 모든 강력한 프로모터는 적합한 Pol II 프로모터의 예라고 여겨진다. Pol II 프로모터로부터의 전사는, 예를 들어, 적어도 약 12개의 단백질(예를 들어, RPB1-RPN12 단백질)의 RNA 폴리머라제 II 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 본원의 Pol II 프로모터로부터 전사된 RNA는 전형적으로 5'-캡핑(예를 들어, 5'-말단에 m7G 기를 함유함)되고/되거나, 예를 들어 폴리아데닐레이트(polyA) 꼬리가 있다. Pol II 프로모터로부터 RNA 성분을 발현시킬 때, 원한다면, RNA 성분으로부터 5'-캡 및/또는 polyA 꼬리를 제거하는 수단을 이용할 수 있다. 본원의 Pol II-전사된 RNA 성분으로부터 5'-캡 및/또는 polyA 꼬리를 효과적으로 제거하는 적합한 방법은, 예를 들어, 하나 이상의 리보자임(아래 참조), 그룹 1 자가-스플라이싱 인트론 및 그룹 2 자가-스플라이싱 인트론의 적절한 사용을 포함한다.
대안적으로, 본원의 RNA 성분의 안정적인 및/또는 일시적인 발현을 위한 프로모터는 예를 들어, RNA 폴리머라제 III(Pol III) 프로모터일 수 있다. RNA 폴리머라제 III을 이용한 전사의 개시 및 종결은 제어할 수 있으므로, 이러한 프로모터는 전형적으로 한정된 5' 말단 및 3' 말단으로 RNA 성분을 발현시키는 것을 허용한다. 본원에서 유용한 Pol III 프로모터의 예로 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. 기타 적합한 Pol III 프로모터는 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 미국 출원 공개 번호 2010/0160416에 개시되어 있다.
Pol II 프로모터가 세포에서 RNA 성분을 발현시키는 데 이용되는 구현예에서와 같이, 하나 이상의 리보자임 서열은 한정된 5' 및/또는 3' 전사 말단을 형성하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, RNA 성분을 암호화하는 본원의 뉴클레오티드 서열은 이러한 RNA 성분을 암호화하는 서열의 상류에 있는 리보자임을 추가로 암호화할 수 있다. 따라서, 특정 구현예의 세포는 (ii) 5'에서 3' 방향으로 리보자임과 RNA 성분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 (i) 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 전사물은 자체 촉매 작용으로 리보자임 서열을 제거하여, (5'-캡이 없는), RNA 성분 서열을 포함하는 한정된 5'-말단이 있는 RNA를 생성한다. 이러한 "자가 처리된" RNA는 예를 들어, crRNA 또는 gRNA를 포함할 수 있으며, RGEN 단백질 성분, 예컨대 Cas9와 복합체를 형성하여 RGEN을 형성할 수 있다.
본원의 리보자임은, 예를 들어, 망치머리(HH) 리보자임, 델타 간염 바이러스(HDV) 리보자임, 그룹 I 인트론 리보자임, RnaseP 리보자임, 또는 헤어핀 리보자임일 수 있다. 본원의 리보자임의 기타 비제한적인 예는 VS(Varkud satellite) 리보자임, 글루코사민-6-포스페이트 활성화 리보자임(glmS) 및 CPEB3 리보자임을 포함한다. Lilley(Biochem . Soc . Trans. 39:641-646)는 리보자임 구조와 활성에 관한 정보를 개시하고 있다. 본원에 사용하기에 적합한 리보자임의 예에는 본원에 참고로 포함되는 EP0707638 및 미국 특허 번호 6063566, 5580967, 5616459, 및 5688670에 개시된 리보자임이 포함된다. 한정된 5' 및/또는 3' 말단이 있는 RNA 성분을 발현시키기 위해 리보자임을 이용하는 것에 관한 추가적인 정보는 (2014년 8월 13일 제출된) 미국 특허 출원 번호 62/036,652에 개시되어 있다.
특정 구현예에서, RNA 성분을 발현하기 위한 카세트를 포함하는 DNA 폴리뉴클레오티드는 RNA 성분 서열의 하류에 적합한 전사 종결 서열을 포함한다. 본원에 유용한 전사 종결 서열의 예는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0186906에 개시되어 있다. 이러한 구현예는 전형적으로, 종결자 서열의 선택에 따라, RNA 성분 서열의 말단 다음에, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 이상의 잔기를 포함한다. 이러한 추가적인 잔기는 종결자 서열의 선택에 따라, 전부 U 잔기이거나, 예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% U 잔기일 수 있다. 대안적으로, 리보자임 서열(예컨대, 망치머리 또는 HDV 리보자임)은 예를 들어, RNA 성분 서열의 (하류의 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상 뉴클레오티드의) 3'일 수 있다. 따라서, 3' 리보자임 서열은 그것이 RNA 성분 서열로부터 그 자신을 절단하도록 위치할 수 있고, 이러한 절단은 전사물이 RNA 성분 서열의 말단에서 정확하게, 또는 예를 들어, RNA 성분 서열의 말단 다음에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 잔기가 있도록 전사물을 종료시킬 것이다.
다른 예에서 RNA 성분은 RGEN 단백질-CPP 복합체가 전달되는 세포의 핵 및/또는 세포질에 제공될 수 있다. 예를 들어, 5'에 위치한 리보자임 서열을 사용하지 않고 Pol II 프로모터로부터 발현된 RNA 성분은 핵과 세포질 둘 다에 존재할 것으로 기대할 수 있다. 임의의 유형의 프로모터(예컨대, Pol II 또는 III 프로모터)로부터 발현되고 5'에 위치한 리보자임 서열을 이용하는 RNA 성분은 다른 구현예에서 대부분 핵에 존재할 것으로 기대할 수 있다. 특정 양태에서 Pol III 프로모터로부터 발현된 RNA 성분은 대부분 핵에 존재할 것으로 기대할 수 있다. 특정 양태에서, RNA 성분은 (예컨대, Pol III 프로모터로부터 발현되기 때문에, 및/또는 리보자임 자가 처리에 의하여) 캡핑되지 않고 전형적으로 핵에 위치하지만, 다른 양태에서는 캡핑되고 핵 및 세포질 위치에 위치한다. 일반적으로, RGEN 단백질-CPP 복합체의 RGEN 단백질 성분은 일단 세포 내로 전달되면 (RNA 성분 위치에 따라) 세포질 및/또는 핵에서 RNA 성분과 결합할 수 있다(그에 의해 RGEN을 형성할 수 있다). 핵에서의 이러한 결합은 일반적으로, NLS에 의해 유도되는 바와 같이 핵으로 국재화할 수 있는 본원의 RGEN 단백질 성분의 능력 때문이다.
본원의 RGEN은 RGEN 매개성 DNA 표적화에 유용하다. RGEN 단백질 성분을 세포로 전달하는 것과 관련하여 위의 구현예들 중 임의의 것은 DNA 표적화 방법에 적용될 수 있다. 예를 들어, RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 외부에서 적어도 하나의 RNA 성분과 접촉되어, 세포로 전달하여 그 안에서 DNA 표적화를 하기 위한 RGEN-CPP 복합체를 형성할 수 있다. 또 다른 예로, RGEN 단백질-CPP 복합체는, 미생물 세포 내로의 전달 후, 미생물 세포의 내부에서 적어도 하나의 RNA 성분과 접촉될 수 있으며, 그 후 DNA 표적화를 매개화할 수 있는 RGEN-CPP 복합체를 그 안에 형성할 수 있다. 표적화 방법에 관한 다음의 개시는 "RGEN-CPP 복합체"를 지칭하는 것과는 반대로, "RGEN"을 지칭한다. 따라서, 공유적 RGEN-CPP 복합체가 본원의 RGEN 전달 방법에 사용되는지 또는 비 공유적 RGEN-CPP 복합체가 본원의 RGEN 전달 방법에 사용되는지에 따라 (그리고 비 공유적 RGEN-CPP 복합체를 활용하는 구현예에서 비 공유적 연결이 얼마나 강력한지에 따라) 아래의 RGEN에 대한 언급은 이러한 RGEN-CPP 복합체를 지칭한다고 이해될 것이다.
DNA 표적 서열의 하나의 또는 두 개의 DNA 가닥을 절단할 수 있는 본원의 RGEN은 예를 들어, DNA 표적화 방법에 이용될 수 있다. 이러한 DNA 표적화 방법은 적합한 공여 DNA가 방법에 제공되는 경우 HR 매개성 DNA 표적화를 수반할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원의 표적화 방법의 미생물 세포는 표적 부위 서열(본원의 RGEN에 의해 특이적으로 표적화되는 서열)에 있거나 그 부근에 있는 서열에 상동성인 적어도 하나의 서열을 포함하는 공여 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 구현예는 선택적으로, 이러한 표적화 방법이 적합한 공여 폴리뉴클레오티드를 미생물 세포에 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원의 공여 폴리뉴클레오티드는 표적 부위가 (예를 들어, 본원의 RGEN을 이용하여 도입될 수 있는) SSB 또는 DSB를 함유하는 경우, DNA 표적 부위 또는 그 부근의 서열과 HR을 겪을 수 있다. 본원의 공여 폴리뉴클레오티드 내의 "상동성 서열"은 예를 들어, 표적 부위 서열 또는 그 부근의 서열과 100% 동일성, 또는 표적 부위 서열 또는 그 부근의 서열과 예를 들어 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는, 적어도 약 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9000개 또는 10000개의 뉴클레오티드, 또는 약 50개 내지 500개, 50개 내지 550개, 50개 내지 600개, 50개 내지 650개, 또는 50개 내지 700개 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본원의 공여 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 표적 부위 서열 또는 그 부근의 서열에 이종성인 서열에 의해 이격된 2개의 상동성 서열 (상동성 암)을 가질 수 있다. 이러한 공여 폴리뉴클레오티드와 표적 부위 서열 사이의 HR은 전형적으로 표적 부위에서 서열을 공여 폴리뉴클레오티드의 이종 서열로 대체시킨다(즉, 공여 폴리뉴클레오티드의 상동성 암에 상동성인 표적 부위 서열들 사이에 위치한 표적 부위 서열은 공여 폴리뉴클레오티드의 이종 서열에 의해 대체된다). 2개의 상동성 암을 갖는 공여 폴리뉴클레오티드에서, 암은, 예를 들어, 적어도 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 250개, 500개, 1000개, 2500개, 5000개, 10000개, 15000개, 20000개, 25000개 또는 30000개의 뉴클레오티드만큼 이격될 수 있다(즉, 공여 폴리뉴클레오티드의 이종 서열은 길이가 적어도 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 250개, 500개, 1000개, 2500개, 5000개, 10000개, 15000개, 20000개, 25000개 또는 30000개 뉴클레오티드이다). 각각의 상동성 암의 길이(예를 들어, 상동성 서열에 대해 위에 개시된 임의의 길이)는 동일하거나 상이할 수 있다. 각각의 표적 부위 또는 그 부근의 상동성 서열을 갖는 각각의 암의 백분율 동일성(예를 들어, 상동성 서열에 대해 위에 개시된 임의의 % 동일성)은 동일하거나 상이할 수 있다.
공여 폴리뉴클레오티드의 상응하는 상동성 서열에 상동성인 표적 부위 서열 또는 그 부근(대안적으로, 인근 또는 이의 근접에 있는)의 DNA 서열은, 예를 들어, 표적 서열 내의 예측되는 RGEN 절단 부위(DSB 또는 닉)로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 450, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000 또는 60000(또는 1 내지 60000 사이의 임의의 정수)개의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 1 내지 1000, 100 내지 1000, 500 내지 1000, 1 내지 500 또는 100 내지 500개 뉴클레오티드) 내에 있을 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 거리는 절단 부위로부터 상동성 서열의 첫번째 뉴클레오티드까지로 표시될 수 있으며, 절단 부위로부터 상류 또는 하류 방향으로 진행될 수 있다. 예를 들어, 공여 폴리뉴클레오티드의 상응하는 서열에 상동성인 표적 서열 근처의 서열은 표적 서열에서 예측되는 RGEN 절단 부위의 하류의 500개의 뉴클레오티드 염기쌍에서 시작할 수 있다. 2개의 상동성 암(예를 들어, 이종 서열에 의해 이격된 제1 및 제2 상동성 암)을 갖는 공여 폴리뉴클레오티드를 사용하는 본원의 구현예에서, 예를 들어, (공여자의 제1 상동성 암과 상동성에 해당하는) 상동성 서열은 예측되는 RGEN 절단 부위의 상류에 있을 수 있고, (공여자의 제2 상동성 암과 상동성에 해당하는) 상동성 서열은 예측되는 RGEN 절단 부위의 하류에 있을 수 있다. 예측되는 절단 부위로부터 이러한 상류 및 하류 상동성 서열 각각의 뉴클레오티드 거리는 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, 위에 개시된 뉴클레오티드 거리 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, (공여자의 제1 상동성 암과 상동성에 해당하는) 상동성 서열의 3' 말단은 예측되는 RGEN 절단 부위의 상류에서 600개의 뉴클레오티드 염기쌍에 위치할 수 있고, (공여자의 제2 상동성 암과 상동성에 해당하는) 상동성 서열의 5' 말단은 예측되는 RGEN 절단 부위의 하류에서 400개의 뉴클레오티드 염기쌍에 위치할 수 있다.
다양한 양태에서 공여 폴리뉴클레오티드는, RGEN 단백질-CPP 복합체가 세포 내로 전달되는 시점에 또는 그에 가깝게(예컨대, 1시간, 2시간, 3시간 이상 이내) 세포(예컨대, 미생물 세포) 내로 전달될 수 있다. 이러한 전달은 사용되는 세포의 특정 유형에 적합한, 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 통해서 이루어질 수 있다. 이러한 기법은 예를 들어, 형질전환(예컨대, 아세트산 리튬 형질전환[Methods in Enzymology, 194:186-187]), 형질감염, 바이올리스틱 충격(biolistic impact), 전기천공 및 미세주입을 포함한다. 예로서, 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 번호 4880741 및 5071764, 그리고 Chen et al. (Appl . Microbiol . Biotechnol. 48:232-235)은 Y. 리폴리티카에 대한 DNA 전달 기술을 기재하고 있다. 식물에서 유용한 전달 방식의 예로는 아그로박테리움 매개성 형질전환 및 바이올리스틱 유전자총법을 들 수 있다.
DNA 표적 서열의 하나의 DNA 가닥 또는 두 개의 DNA 가닥을 절단하는 RGEN은 본원의 DNA 표적화의 다른 비제한적인 구현예에서 삽입-결실을 생성하는 데 이용될 수 있다. 세포에서 삽입-결실을 형성하는 방법은 HR 매개성 표적화에 대해 위에 개시된 바와 같이 수행될 수 있지만, 표적 DNA 부위 또는 그 부근에서 HR을 겪을 수 있는 공여 DNA 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공하지 않는다(즉, 이 방법에서는 NHEJ가 유도된다). 생성될 수 있는 삽입-결실의 예가 본원에 개시되어 있다. 삽입-결실의 크기는, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 염기일 수 있다. 특정 구현예에서 삽입-결실은 적어도 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개 또는 150개의 염기와 같이, 훨씬 더 클 수 있다. 또 다른 구현예에서, 삽입 또는 결실은 적어도 약 500개, 750개, 1000개 또는 1500개의 염기일 수 있다. 특정 구현예에서 삽입-결실을 생성하고자 시도하는 경우, 표적 부위 서열에 단일 염기 치환이 대신 형성될 수 있다. 따라서, 본원의 표적화 방법은, 예를 들어, 단일 염기 치환을 생성하기 위한 목적으로 수행될 수 있다.
삽입-결실 형성을 목적으로 한 본원의 표적화 방법의 특정 구현예에서, 비 통상적인 효모(예를 들어, Y. 리폴리티카)에서 삽입-결실의 형성의 빈도는 통상적인 효모, 예컨대 S. 세레비시아에서 동일하거나 유사한 표적화 전략을 사용하여 관찰되는 것보다 상당히 더 높다. 예를 들어, 삽입-결실의 형성의 빈도는 통상적인 효모에서 약 0.0001 내지 0.001일 수 있는 반면(DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 41:4336-4343), 본원의 비 통상적인 효모에서의 빈도는 적어도 약 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75 또는 0.80일 수 있다. 따라서, 본원의 비 통상적인 효모에서 삽입-결실의 형성의 빈도는 통상적인 효모에서 동일하거나 유사한 RGEN 매개성 표적화 전략을 사용하여 발견되는 것보다, 예를 들어, 적어도 약 50배, 100배, 250배, 500배, 750배, 1000배, 2000배, 4000배, 또는 8000배 더 높을 수 있다.
특정 구현예에서 표적화 방법은 단백질 또는 비 암호화 RNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열을 파괴하기 위하여 수행될 수 있다. 파괴를 위해 표적화될 수 있는 이러한 서열의 예는 마커를 암호화하는 것(즉, 마커 유전자)이다. 본원의 마커의 비제한적인 예에는 스크리닝 가능한 마커와 선택 가능한 마커가 포함된다. 본원의 스크리닝 가능한 마커는 적절한 조건하에서 세포를 시각적으로 상이하게 만드는 것일 수 있다. 스크리닝 가능한 마커의 예에는 베타-글루쿠로니다제(GUS), 베타-갈락토시다제(lacZ) 및 형광 단백질(예를 들어, GFP, RFP, YFP, BFP)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본원의 선택 가능한 마커는 세포를 선택적 제제 또는 선택적 환경에 대해 저항성을 나타내도록 만드는 것일 수 있다. 선택 가능한 마커의 예는 세포, 예컨대, 효모 세포가 각각 외인성으로 공급된 히스티딘, 류신, 트립토판, 메티오닌 또는 우라실의 부재 하에 생존할 수 있게 하는 영양요구성 마커, 예컨대 HIS3, LEU2, TRP1, MET15 또는 URA3이다. 선택 가능한 마커의 다른 예는 세포가 암피실린, 클로람페니콜, 하이그로마이신 B, 누오르세오트리신(nourseothricin), 플레오마이신, 퓨로마이신 또는 네오마이신(예를 들어, G418)에 대한 저항성을 나타내도록 만드는 것들과 같은, 항생제 또는 항진균제 저항성 마커이다. 이들 방법의 예는 선택적으로 마커 재활용 방법을 특징으로 할 수 있다.
특정 구현예에서 마커를 파괴하는 적어도 하나의 목적은 마커 재활용일 수 있다. 마커 재활용은 예를 들어, (i) 세포를 마커 및 이종 기원의 DNA 서열로 형질전환시키는 단계, (ii) 마커 및 이종 기원의 DNA 서열을 포함하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계(여기서 마커 선택 가능한 세포는 전형적으로 이종 기원의 DNA 서열을 함유할 확률이 더 높다), (iii) 마커를 파괴한 후 (동일한 [또는 상이한] 마커를 사용하지만, 각각의 사이클은 상이한 이종 기원의 DNA 서열을 사용하는) 단계 (i) 내지 (iii)을 필요한 만큼 반복하여 다수의 이종 기원의 DNA 서열로 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 공정이다. 이러한 공정에서 하나 이상의 이종 기원의 서열은 공여 폴리뉴클레오티드의 형태로 마커 그 자체를 포함할 수 있다(예를 들어, 특정 유전자좌를 표적화화기 위한 상동성 암에 의해 플랭킹된 마커). 본원의 마커 재활용 공정의 예에는 효모(예컨대, Y. 리폴리티카와 같은 비 통상적인 효모)를 이용하는 특정 방법에서와 같이, 마커로서 URA3을 사용하는 것들이 포함된다.
DNA 표적 부위 서열에 결합할 수 있지만 표적 부위 서열에서 임의의 가닥을 절단하지 않는 본원의 RGEN은 다른 구현예에서 DNA 표적화 방법에 이용될 수 있다. 기능장애 뉴클레아제 도메인만 가지고 있지만 특이적인 DNA 결합 활성을 보유하는 본원에 개시된 임의의 RGEN은 이러한 유형의 표적화 방법에 이용될 수 있다.
기능성 뉴클레아제 도메인을 가지고 있지 않은 RGEN을 이용한 DNA 표적화의 특정 구현예에서, RGEN은 표적 부위와 결합하여 폴리뉴클레오티드 서열의 전사(즉, 유전자 전사)를 조절할 수 있다. 전형적으로, RGEN은 조절 서열, 예컨대, (예를 들어, 전사 개시 부위의 상류에서 1개 내지 1000개, 1개 내지 500개, 1개 내지 250개, 1개 내지 125개, 또는 1개 내지 50개 염기 내의) 프로모터, 5'-비해독 RNA 서열을 암호화하는 서열, 또는 인트론(예컨대, 제1 인트론)으로 표적화되어 폴리뉴클레오티드 서열의 전사적 조절을 가져온다.
비제한적인 예로서, 억제 인자 전사 인자 또는 이의 억제 인자 도메인에 연결되거나 융합된 RGEN은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 억제하거나 침묵화하는 데 이용될 수 있다. 대안적인 특정 구현예에서 RGEN은 (억제 인자 또는 이의 도메인 없이) 그 자체로 유전자 발현을 억제할 수 있다; 이러한 RGEN은 표적화될 수 있으며, 그 결과 전사를 위해 필수적인 RNA 전사 기구의 결합 및/또는 이동을 억제한다. 임의의 억제화 RGEN을 도입하는 방법은 선택적으로, 유전자 침묵화 또는 전사적 침묵화 방법을 특징으로 할 수 있다. 침묵화 방법에서 전사적 하향 조절의 수준은, 억제화 RGEN의 적용 전의 전사 수준과 비교하여, 예를 들어, 약 100%(완전히 침묵화된 유전자), 또는 적어도 약 30%(적당히 침묵화된 유전자), 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%(상당히 침묵화된 유전자)일 수 있다.
활성 인자 전사 인자 또는 이의 활성 인자 도메인에 연결되거나 융합된 RGEN은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 상향 조절하는 데 이용될 수 있다. 이러한 활성화 RGEN을 도입하는 방법은 선택적으로, 전사적 상향 조절 또는 활성화 방법을 특징으로 할 수 있다. 이러한 방법에서 전사적 상향 조절의 수준은 활성화 RGEN의 적용 전의 전사 수준과 비교하여, 예를 들어, 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 250%, 500%, 또는 1000%일 수 있다.
특정 구현예에서, DNA 표적 부위 서열과 결합할 수 있지만 바람직하게는 표적 부위 서열에서 임의의 가닥을 절단하지 않는 RGEN은 진단 도구(예컨대, DNA 서열을 검출하기 위한 프로브)로 이용될 수 있다. DNA 프로브의 RGEN 단백질 성분은 예를 들어, 리포터 단백질(예컨대, GFP와 같은 형광 단백질)과 같은 리포터 작용제에 연결될 수 있다. RGEN의 RNA 성분에 의해 구체화되는 바와 같이, RGEN-리포터 단백질의 특이적인 DNA 결합은 이에 따라 검출 시스템 내에 도입되어, 리포터 작용제의 활성을 이용할 수 있다. 유세포 분석법(예컨대, 유동 활성화 세포 분류[FACS]) 및 형광동소보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH)은 형광 리포터를 사용하는 본원의 적합한 검출 시스템의 예이다.
본원의 표적화 방법은 예를 들어, 둘 이상의 DNA 표적 부위가 표적화되는 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 방법은 선택적으로 다중 방법을 특징으로 할 수 있다. 특정 구현예에서 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열 개 이상의 표적 부위가 동시에 표적화될 수 있다. 다중 방법은 복수의 상이한 RNA 성분들이 제공되며 각각 RGEN을 고유의 DNA 표적 부위로 유도하도록 설계된 본원의 표적화 방법에 의해 전형적으로 수행된다. 예를 들어, 둘 이상의 상이한 RNA 성분들이 (예컨대, RNA 성분을 RGEN 단백질-CPP 복합체와 결합시키기 위하여 본원에 개시된 절차에 따라) 시험관 내에서 RGEN-CPP 복합체의 혼합물을 제조하는 데 이용될 수 있으며, 그 후, 이러한 혼합물은 세포와 접촉된다.
본원의 다중 표적화의 또 다른 양태는 세포 내로 횡단했던 RGEN 단백질-CPP 복합체들의 RGEN 단백질 성분들과 결합하는 둘 이상의 상이한 RNA 성분들을 세포에 제공하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 세포에 (i) 각각이 특정한 RNA 성분을 발현하는 개별적인 DNA 폴리뉴클레오티드들, 및/또는 (ii) 둘 이상의 RNA 성분들을 암호화하는 적어도 하나의 DNA 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함할 수 있다(예를 들어, 탠덤 리보자임-RNA 성분 카세트와 관련하여 아래의 개시 내용 참조).
다중 방법은 선택적으로, 동일한 서열(예를 들어, 프로모터 또는 오픈 리딩 프레임)과 매우 가까운 DNA 부위들, 및/또는 서로 멀리 있는 (예를 들어, 상이한 유전자 및/또는 염색체) 부위들을 표적화할 수 있다. 다른 구현예에서 다중 방법은 (엔도뉴클레아제 또는 닉카아제 능력이 있는 RGEN이 사용되는 경우) 원하는 표적화의 결과에 따라 적합한 공여 DNA 폴리뉴클레오티드를 사용하거나(HR의 경우) 사용하지 않고(삽입-결실 및/또는 염기 치환을 초래하는 NHEJ의 경우) 수행될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 다중 방법은 본원에 개시된 바와 같은 억제화 또는 활성화 RGEN으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 유전자 세트들, 예컨대, 특정 대사 경로에 관여하는 유전자들을 하향 조절하는 다수의 억제화 RGEN이 제공될 수 있다.
특정 구현예에서 다중 방법은 (ii) 둘 이상의 리보자임-RNA 성분 카세트(즉, 탠덤 카세트를 포함하는 서열에 (i) 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 세포에 제공하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 DNA 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 전사물은, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 카세트를 가질 수 있다. 3' 리보자임 서열은, 전사물 서열의 하류로부터 RNA 성분의 절단 및 분리를 허용하기 위해 모든 또는 일부 RNA 성분 서열 다음에 선택적으로 포함될 수 있다(즉, 탠덤 카세트는 하나 이상의 리보자임-RNA 성분-리보자임 카세트를 포함할 수 있다). 탠덤 리보자임-RNA 성분-리보자임 카세트를 발현하기 위한 본원의 DNA 폴리뉴클레오티드는 각각의 카세트(예를 들어, 비 암호화 스페이서 서열) 사이에 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개 이상의 뉴클레오티드가 존재하도록 설계될 수 있다. 각각의 카세트 사이의 거리는 동일하거나 상이할 수 있다.
본원에 기술된 RNA 성분을 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 구조물 또는 벡터가, 사용되는 특정 유형의 세포에 적합한, 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포 내로 공여 DNA를 전달하기 위한, 위에서 개시된 임의의 수단이 활용될 수 있다.
본원의 특정 구현예는 미생물 세포의 게놈에서 표적 부위를 수정 또는 변경하는 방법으로, 이때, 이러한 방법은 미생물 세포를 가이드 폴리뉴클레오티드 및, CPP에 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결된 Cas 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 것을 포함하고, 이때, 이러한 가이드 폴리뉴클레오티드 및 CPP-Cas 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제가 미생물 세포의 게놈의 표적 부위에서 이중 가닥 절단을 도입할 수 있게 하는 복합체를 형성할 수 있는 것인, 미생물 세포의 게놈에서 표적 부위를 수정 또는 변경하는 방법에 관한 것이다. 표적 부위의 수정 또는 변경은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 교체, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원의 특정 구현예는 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 임의의 융합 단백질은 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 선택적으로, 프로모터 서열과 작동 가능한 연결 상태에 있을 수 있다. 특정 구현예는, 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 RGEN 단백질-CPP 융합체를 암호화하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 벡터 또는 구조물)를 포함한다. 이러한 암호화 영역은 예를 들어, 세포(예를 들어, 박테리아 세포; 진핵생물 세포, 예컨대, 효모, 곤충, 또는 포유류 세포)에서 또는 시험관 내 단백질 발현 시스템에서, RGEN 단백질-CPP 융합체를 발현시키기에 적합한 프로모터 서열에 선택적으로 작동 가능하게 연결될 수 있다. 벡터 또는 구조물의 예로는 원형(예를 들어, 플라스미드) 및 비 원형(예를 들어, 선형 DNA, 예컨대, 증폭된 DNA 서열) 폴리뉴클레오티드 분자를 들 수 있다.
본원의 특정 구현예는 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계 및 이러한 폴리뉴클레오티드 서열로부터 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 발현시켜, RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에서 발현 단계는 선택적으로 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 예컨대, 대장균; 진핵세포, 예컨대, 효모[예를 들어, S. 세레비시아], 곤충, 또는 포유류 세포)에서 수행될 수 있다. 대안적으로, RGEN 단백질-CPP 융합 단백질의 발현은 시험관 내 단백질 발현 시스템(예를 들어, 무세포 단백질 발현 시스템, 예컨대, 토끼 망상적혈구 용해물 또는 밀 배아 추출물을 활용하는 것들)에서 수행될 수 있다. 또한, 발현 단계에서 생산된 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질은 선택적으로 단리될 수 있다. 이러한 단리는 예를 들어, 위에 개시된 특징들(예를 들어, 순도, pH, 완충액, 및/또는 염 수준) 중 임의의 것이 있는 조성물을 생산하는 방식으로 수행될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 비제한적 예는 다음을 포함한다:
1. RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결되고,
RGEN 단백질-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 조성물.
2. 구현예 1에 있어서, RGEN의 단백질 성분은 세포의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 성분과 결합되며, RGEN은 표적 부위 서열에 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 조성물.
3. 구현예 2에 있어서, RNA 성분은 트랜스-활성화 크리스퍼 RNA(tracrRNA)에 작동 가능하게 연결된 크리스퍼 RNA(crRNA)를 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는, 조성물.
4. 구현예 2에 있어서, RGEN은 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 조성물.
5. 구현예 1에 있어서, RGEN은 크리스퍼-결합(Cas) 단백질-9(Cas9) 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
6. 구현예 1에 있어서, RGEN 단백질 성분과 CPP는 공유적으로 연결된, 조성물.
7. 구현예 1에 있어서, RGEN 단백질 성분과 CPP는 비 공유적으로 연결된, 조성물.
8. 구현예 1에 있어서, CPP는 양이온성 또는 양친매성인, 조성물.
9. 구현예 1에 있어서, CPP는
(i) 엡스타인 바 바이러스 제브라 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 CPP,
(ii) 6개 이상의 인접한 아르기닌 잔기를 가진 CPP,
(iii) 트랜스포탄-10(TP10) CPP, 또는
(iv) 혈관 내피 카데린 단백질로부터의 CPP를 포함하는, 조성물.
10. 구현예 1에 있어서, RGEN 단백질-CPP 복합체는 세포의 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 조성물.
11. 구현예 1의 조성물을 포함하는 세포.
12. RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분을 세포 내로 전달하는 방법으로서,
세포를 RGEN의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하되,
단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결되고,
RGEN 단백질-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로질러, 세포 내로 들어가는, 방법.
13. 구현예 12에 있어서,
(i) 조성물이 RGEN의 단백질 성분과 결합된 적어도 하나의 RNA 성분을 더 포함하거나;
(ii) 세포가 RNA 성분을 포함하고, RNA 성분은 RGEN 단백질-CPP 복합체가 세포로 들어간 후에 RGEN의 단백질 성분과 결합하며;
RNA 성분은 세포의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하며, RGEN은 표적 부위 서열에 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 방법.
14. 구현예 13에 있어서, RGEN은 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 방법.
15. 구현예 14에 있어서, 세포는 표적 부위 서열의 서열 또는 표적 부위 서열 근처의 서열과 상동인 적어도 하나의 서열을 포함하는 공여 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 방법.
16. 구현예 12에 있어서, 세포는 비 포유류 세포인, 방법.
17. 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 단백질 성분 및 CPP는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되고, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있고, 세포는 선택적으로 식물 세포인, 조성물.
18. 구현예 17에 있어서, Cas 엔도뉴클레아제는 식물 최적화된 Cas9 엔도뉴클레아제인, 조성물.
19. 구현예 17에 있어서, 가이드 폴리뉴클레오티드는
(i) 표적 DNA의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 제1 뉴클레오티드 서열 도메인, 및
(ii) Cas 엔도뉴클레아제와 상호작용하는 제2 뉴클레오티드 서열 도메인을 포함하고,
제1 뉴클레오티드 서열 도메인 및 제2 뉴클레오티드 서열 도메인은 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 이들의 조합으로 구성되는, 조성물.
20. 구현예 17에 있어서, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 식물 세포의 세포벽을 가로지를 수 있는, 조성물.
21. 구현예 17에 있어서, CPP는
(i) 엡스타인 바 바이러스 제브라 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 CPP,
(ii) 6개 이상의 인접한 아르기닌 잔기를 가진 CPP,
(iii) 트랜스포탄-10(TP10) CPP,
(iv) 혈관 내피 카데린 단백질로부터의 CPP, 또는
(vi) 합성 노나-아르기닌 CPP, 히스티딘이 풍부한 노나-아르기닌 CPP 및 Pas 노나-아르기닌 CPP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CPP를 포함하는, 조성물.
22. 구현예 20에 있어서, 식물 세포는 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 세포인, 조성물.
23. 구현예 22에 있어서, 외떡잎식물은 옥수수, 쌀, 수수, 호밀, 보리, 밀, 밀렛, 귀리, 사탕 수수, 잔디 및 스위치그래스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
24. 구현예 22에 있어서, 쌍떡잎식물은 콩, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 면화, 담배, 땅콩, 감자, 담배, 애기장대, 및 잇꽃으로 이루어지 군으로부터 선택되는, 조성물.
25. 세포의 게놈에서 표적 부위를 변형하는 방법으로서, 가이드 폴리뉴클레오티드, 세포 침투성 펩티드(CPP) 및 Cas 엔도뉴클레아제를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 가이드 폴리뉴클레오티드, Cas 엔도뉴클레아제 및 CPP는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되며, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있고, 세포는 선택적으로 식물 세포인, 방법.
26. 구현예 25에 있어서, 표적 부위에서의 변형을 갖는 적어도 하나의 식물 세포를 확인하는 것을 더 포함하고, 표적 부위에서의 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 대체, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
27. 구현예 25에 있어서, 식물 세포는 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 세포인, 방법.
28. RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결되고,
RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 조성물.
29. 구현예 28에 있어서, RGEN의 단백질 성분은 미생물 세포의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 성분과 결합되며, RGEN은 표적 부위 서열에 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 조성물.
30. 구현예 28에 있어서, RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 조성물.
31. 구현예 28의 조성물을 포함하는 미생물 세포.
32. RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분을 미생물 세포 내로 전달하는 방법으로서,
미생물 세포를 RGEN의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하되,
단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결되고,
RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로질러, 미생물 세포 내로 들어가는, 방법.
33. 구현예 32에 있어서,
(i) 조성물이 RGEN의 단백질 성분과 결합된 적어도 하나의 RNA 성분을 더 포함하거나;
(ii) 미생물 세포가 RNA 성분을 포함하고, RNA 성분은 RGEN 단백질-CPP 복합체가 미생물 세포로 들어간 후에 RGEN의 단백질 성분과 결합하며;
RGEN 성분은 미생물 세포의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하며, RGEN은 표적 부위 서열에 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 방법.
34. 구현예 33에 있어서, RGEN은 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 방법.
34. 구현예 34에 있어서, 미생물 세포는 표적 부위 서열의 서열 또는 표적 부위 서열 근처의 서열과 상동인 적어도 하나의 서열을 포함하는 공여 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 방법.
36. 구현예 32에 있어서, 세포는 효모 세포인, 방법.
37. 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 단백질 성분 및 CPP는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되고, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 조성물.
38. 구현예 37에 있어서, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 미생물 세포의 세포벽을 가로지를 수 있는, 조성물.
39. 미생물 세포의 게놈에서 표적 부위를 변형하는 방법으로서, 가이드 폴리뉴클레오티드, 세포 침투성 펩티드(CPP) 및 Cas 엔도뉴클레아제를 미생물 세포에 제공하는 것을 포함하며, 가이드 폴리뉴클레오티드, Cas 엔도뉴클레아제 및 CPP는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되며, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 방법.
23. 구현예 39에 있어서, 표적 부위에서의 변형을 갖는 적어도 하나의 미생물 세포를 확인하는 것을 더 포함하고, 표적 부위에서의 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 대체, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시예
개시된 발명은 다음의 실시예들에서 더 정의된다. 이 실시예들은 본 발명의 바람직한 특정 양태를 나타내지만 단지 예시로 제공된다는 것을 이해해야 된다. 상기 설명 및 이 실시예들로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특징들을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 용도 및 조건에 적합하게 본 발명을 다양하게 변경하고 수정할 수 있다.
실시예 1
대장균에서 Cas9 - CPP(세포 침투성 펩티드)융합 단백질을 발현하는 벡터
본 실시예에서는, Cas9 단백질 및 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 번역 융합 단백질의 유도성 발현을 위해 설계된 벡터를 생성하고 대장균에서의 발현에 대해 시험하였다. Cas9-CPP 융합 단백질은 예상대로 대장균에서 발현하는 것으로 나타났고, 이어서 Cas9-CPP 융합 단백질을 정제하였다.
스트렙토코커스 피오제네스 M1 GAS(SF370)로부터의 Cas9 유전자의 오픈 리딩 프레임을 표준 기법에 따라 야로위아에서의 발현에 대해 코돈 최적화하여 서열 번호 1을 생성하였다. 유인원 바이러스 40(SV40) 1부분 핵 국재화 신호(NLS) 및 짧은 링커(4개의 아미노산)를 암호화하는 DNA 서열을 서열 번호 1의 마지막 센스 코돈 다음에 삽입하여 서열 번호 2로 만들었다. 서열 번호 2는 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 암호화한다. 서열 번호 3의 마지막 7개의 아미노산은 첨가된 NLS를 암호화하는 반면, 서열 번호 3의 1369 내지 1372 위치에 있는 잔기는 첨가된 링커를 암호화한다. 야로위아 코돈 최적화된 Cas9-NSL 서열(서열 번호 2)을 표준 분자 생물학 기법에 의해 야로위아 항시성 프로모터, FBA1(서열 번호 4)에 연결하였다. 항시성 FBA1 프로모터, 야로위아 코돈 최적화된 Cas9 및 SV40 NLS를 함유하는 야로위아 코돈 최적화된 Cas9 발현 카세트는 서열 번호 5에 기재되어 있다. 이 Cas9 발현 카세트(서열 번호 5)를 플라스미드 pZUF에 클로닝하여 구조물 pZUFCas9(도 1, 서열 번호 6)로 만들었다.
야로위아 코돈 최적화된 Cas9-NSL 서열을 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 pZUFCas9(서열 번호 6)로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 반응에 대한 프라이머는 서열 번호 7(정방향) 및 서열 번호 8(역방향)이었고, 이들을 증폭된 DNA 생성물에 5’ EcoRI 부위 및 3’ HindIII 부위를 각각 추가하였다. 추가된 5’ EcoRI 부위는 증폭된 생성물에서 Cas9-NLS 오픈 리딩 프레임(ORF)의 ATG 개시 코돈을 대체하였다. 증폭된 생성물(서열 번호 9)을 EcoRI 및 HindIII로 분해한 후, ZymocleanTM 및 농축기 컬럼(캘리포니아주, 어바인의 Zymo Research)을 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 Life Technologies(캘리포니아주, 칼즈배드)로부터의 플라스미드 pBAD/HisB(도 2a, 서열 번호 10)의 EcoRI 및 HindIII 부위에 클로닝하여 플라스미드 구조물 pRF48(도 2b, 서열 번호 11)을 생성하였다. 플라스미드 pRF48은 대장균, N 말단에 헥사히스티딘(6xHis)을 포함하는 Cas9-NLS를 발현할 수 있다.
Cas9-NLS에 세포 침투성 펩티드(CPP) 서열을 융합하기 위해, 각각 대장균에서의 발현을 위해 코돈 최적화되고, 특정 CPP 아미노산 서열: 엡스타인 바 바이러스 제브라 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 제브라 펩티드(ECDSELEIKRYKRVRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC, 서열 번호 12); 뮤린 내피 카데린 단백질로부터의 pVEC 펩티드(LLIILRRRIRKQAHAHSK, 서열 번호 13); 뉴로펩티드 갈라닌 단백질로부터의 TP10 펩티드(AGYLLGKINLKACAACAKKIL, 서열 번호 14); 및 아르기닌이 풍부한 합성 “PolyR” 펩티드(GGGGRRRRRRRRRLLLL, 서열 번호 15)에 연결된 6xHis 태그를 암호화하는 서열을 포함하는, 각각의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하였다. 각각의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 다음과 같은 클로닝 서열을 생성하기 위한 5’-말단 NcoI 제한 부위 및 3’-말단 EcoRI 부위를 포함하였다: NcoI-6xHis-CPP-EcoRI (서열 번호 16 내지 19). 서열 번호 16 내지 19의 각각을 pRF48의 NcoI 및 EcoRI 부위에 각각 클로닝함으로써, 대장균에서 특정 6xHis-CPP-Cas9-NLS 융합 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드 구조물을 생성하였다. 특히, 6xHis-제브라 CPP-Cas9-NLS 융합을 발현하기 위해 플라스미드 구조물 pRF144(도 3a, 서열 번호 20)를 제조하였고, 6xHis-PolyR CPP-Cas9-NLS 융합을 발현하기 위해 플라스미드 구조물 pRF145(도 3b, 서열 번호 21)를 제조하였고, 6xHis-TP10 CPP-Cas9-NLS 융합을 발현하기 위해 플라스미드 구조물 pRF146(도 3c, 서열 번호 22)을 제조하였고, 6xHis-pVEC CPP-Cas9-NLS 융합을 발현하기 위해 플라스미드 구조물 pRF162(도 3d, 서열 번호 23)를 제조하였다.
각각의 플라스미드 pRF48, pRF144, pRF145, pRF146 및 pRF162를 개별적으로 TOP10 적격 세포로 형질전환시켰다(Life Technologies). 세포를 0.4%(w/v) 글루코스 및 100 μg/mL 암피실린을 함유한 L 부용(Miller)에서 진탕하면서(220 rpm) 37℃에서 밤새 성장시켰다. 각각의 예비 배양물을 100 μg/mL의 암피실린을 함유한 2X YT 배지에서 1:100으로 희석하고, 진탕하면서(220 rpm) 37℃에서 더 성장시켰다. 배양물이 약 0.5의 OD600에 도달했을 때, L-아라비노오스를 0.2%(w/v)의 최종 농도로 첨가하여 각 플라스미드로부터의 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 진탕하면서(200 rpm) 18℃에서 추가 18시간 동안 성장시켰다. 세포를 4℃에서 15분 동안 5000 x g로 펠렛화하였다. 배지를 제거하고, 세포 펠렛을 -80℃에서 적어도 4시간 동안 동결시켰다. 세포 펠렛을 얼음에서 15분 동안 해동시키고, 원래 배양물 1 리터 당 15 mL의 용해 완충액(20 mM 트리스 pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 10 mM 이미다졸, 120 단위/mL DNaseI, 1 mM PMSF, 1 mM DTT )에 재현탁시켰다. 세포를 16000 psi에서 대형 프렌치 압력 셀에 2회 통과시켜 용해시켰다. 세포 파편을 4℃에서 30분 동안 20000 x g로 펠렛화하였다. 상청액을 50 mL 원추형 튜브에 옮기고, 각각의 발현된 융합 단백질의 6xHis 태그를 결합시키기 위해 Ni-NTA 수지(Qiagen) 50% 슬러리 2 ml를 첨가하였다. 각각의 튜브를 4℃에서 1시간 동안 천천히 회전시킨 후, 상청액이 흐를 수 있는 빈 중력 컬럼에 적용하였다. 통과액 샘플(75 μL)을 취해 25 μL의 4배 감소된 램리 완충액에 첨가하고 얼음에 보관하였다. 각각의 컬럼에서 수지를 5 ml의 세척 완충액(20 mM 트리스 pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 1 mM PMSF, 1 mM DTT)으로 4회 세척하였다. 각각의 세척액으로부터 샘플(75 μL)을 취해 25 μL의 4배 감소된 램리 완충액에 첨가하고 얼음에 보관하였다. 용리 완충액(20 mM 트리스 pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 500 mM 이미다졸, 1 mM PMSF, 1 mM DTT) 1 ml씩을 각 컬럼의 수지에 가하고 10분 동안 배양하였다. 280 nm에서의 흡수도에 의해 단백질 용리를 모니터링하였다. 각각의 용리액으로부터 샘플(75 μL)을 취해 25 μL의 4배 감소된 램리 완충액에 첨가하고 얼음에 보관하였다. 각각의 플라스미드 발현 실험에 대해, 컬럼으로부터의 용리 단백질을 함유한 분획들을 합하고, 10000 MWCO 투석막에 로딩하고, 4℃에서 적어도 14시간 동안 투석 완충액(25 mM HEPES/KOH pH 7.5, 200 mM KCl, 20% 글리세롤, 1 mM DTT)에 대해 투석하였다. 브래드포드 분석 및 565 nm에서의 흡수도를 이용하여 각각의 투석액의 단백질 농도를 결정하였다. 정제된 단백질을 2개의 분획으로 나누고, 그 중 하나는 -80℃에서 동결시키고, 다른 하나는 4℃에서 얼음에 보관하였다. 각각의 플라스미드 발현 실험에 대한 컬럼 정제 과정 중에 얻은 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하고, 4%(w/v)의 스태킹 겔을 갖는 8%(w/v)의 트리스-글리신 폴리아크릴아미드 분해 겔에 로딩하였다. 단백질을 200 볼트에서 30분 동안 전기영동으로 분리하고, 쿠마시블루로 염색하였다. 일례로서, 6xHis-제브라-Cas9-NLS 정제 과정에 대한 겔을 도 4에 나타내었다.
따라서, 네 가지 상이한 CPP-Cas9 융합 단백질이 발현되고 단리되었다. 이 융합 단백질들은 본원에서 RGEN 단백질-CPP 복합체의 예들을 나타낸다.
실시예 2
시험관 내 전사에 의한 짧은 가이드 RNA( sgRNA ) 발현
본 실시예에서는, 리보자임에 융합된 sgRNA를 5’- 및 3’-말단에서 각각 암호화하는 DNA 서열(“RGR”로 지칭됨)을 설계하였다. RGR 서열은 정확히 정의된 말단을 갖는 sgRNA의 T7 RNA 폴리머라제에 의한 시험관 내 전사를 가능하게 한다.
도 5는 두 개의 영역, 가변 표적화 도메인(VT)(가이드 서열) 및 Cas 엔도뉴클리아제 인식(CER) 도메인(서열 번호 24는 CER의 일례를 나타냄)을 포함하는 단일 RNA 분자인 sgRNA 분자를 도시한다. VT 영역은, 예를 들어 표적화된 핵산 분자와 동일성을 갖는 RNA 폴리뉴클레오티드의 20 mer일 수 있다. VT 도메인은 PAM 모티프의 5’에 있는 표적 부위에서의 절단을 위해 표적 부위를 지정한다. CER 도메인은 Cas9 단백질과 상호작용하며, VT 도메인이 상호작용하고 Cas9 단백질 절단을 유도할 수 있도록 한다(Jinek et al., Science 337:816-821). VT 도메인과 CER 도메인은 모두 sgRNA의 기능에 필요하다.
sgRNA 서열에 5’ 망치머리(HH) 및 3’ 델타 간염 바이러스(HDV) 리보자임을 첨가하면, 일부 RNA 폴리머라제의 특정 전사 요구 사항에 대한 고려 없이(예를 들어, T7 RNA 폴리머라제는 전사의 개시 직후 하나의 전사된 G 잔기를 필요로 하지만, 3개의 전사된 G 잔기로 가장 잘 작동함) 임의의 프로모터로부터 sgRNA의 발현을 할 수 있다. 이러한 sgRNA가 발현될 때, 예비-sgRNA 전사물에 존재하는 리보자임은 자동으로 절단되어, 변형되지 않은 sgRNA를 남기고 전사물로부터 분리된다.
야로위아 리폴리티카에서 Can1-1 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 암호화하는 DNA 서열(서열 번호 25)을 제조하였다; 이 sgRNA는 CER 도메인으로서 서열 번호 24를 포함한다. HH 리보자임의 처음 6개 염기가 sgRNA의 VT 영역의 처음 6개 염기와 역으로 상보적이 되도록, sgRNA 암호화 서열 5’-말단을 HH 리보자임을 암호화하는 서열(서열 번호 26)에, 3’-말단을 HDV 리보자임을 암호화하는 서열(서열 번호 27)에 연결하였다. 이 특정 RGR sgRNA는 서열 번호 28로 암호화된다. 이어서, 표준 분자 생물학 기법을 통해 서열 번호 28의 RGR sgRNA를 T7 RNA 폴리머라제 프로모터(서열 번호 29)에 연결하여 플라스미드 pRF46(서열 번호 30)을 생성하였다.
표준 기법을 이용하여 플라스미드 pRF46(서열 번호 30)으로부터 T7-RGR sgRNA 암호화 서열을 PCR 증폭하였다. PCR 반응에 대한 프라이머는 서열 번호 31(T7 정방향 프라이머) 및 서열 번호 32(gRNArev1 역방향 프라이머)였다. PCR 생성물을 에탄올 침전에 의해 정제하고 ddH2O에 재현탁시켰다; 이 DNA는 시험관 내 전사 반응에서 주형으로 사용되었다. 주형 DNA를 20 μL의 시험관 내 전사 반응물(MEGAshortscript™ T7 키트, Life Technologies)에 150 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 시험관 내 전사에 적절한 조건을 결정하기 위해 여러 번 반응이 진행되도록 하였다(2시간, 4시간, 6시간, 및 밤새)(도 6). 이어서, 반응물을 37℃에서 15분 동안 10 단위의 DNaseI로 처리하여 주형 DNA를 제거하였다. 에탄올과 표준 프로토콜을 사용하여 RNA를 침전시켰다. 각각의 20 μl의 시험관 내 전사 반응물은 60 내지 100 μg의 RNA를 생성하였다.
따라서, 정의된 5’- 및 3’-말단을 갖는 sgRNA를 시험관 내 합성하였다. 이하 실시예 3에 설명하는 바와 같이, 시험관 내 전사된 sgRNA는 Cas9-CPP 융합 단백질과 결합되어 RGEN-CPP 복합체를 형성할 수 있다.
실시예 3
sgRNA와 복합화된 Cas9 - CPP 융합 단백질을 이용한 표적 DAN 서열의 특이적 시험관 내 절단
본 실시예에서는, CPP와의 융합이 Cas9 엔도뉴클레아제 활성을 저해하지 않음을 확인하기 위해 sgRNA와의 복합체인 (서열 번호 39를 포함하는) 제브라 CPP-Cas9 융합 단백질의 표적화 엔도뉴클레아제 기능을 시험하였다.
서열 번호 25의 Can1-1 표적 서열을 포함하는 시험관 내 Can1 절단 분석 DNA 폴리뉴클레오티드(서열 번호 35)를 Y. 리폴리티카 세포(ATCC 20362)로부터 PCR 증폭하고 표준 기법을 이용하여 정제하였다. PCR 반응에 대한 프라이머는 서열 번호 33(IV-업 정방향 프라이머) 및 서열 번호 34(IV-다운 역방향 프라이머)였다.
정제된 제브라 CPP-Cas9 융합 단백질(600 ng, 실시예 1에서 제조), Can1-1 표적 부위를 표적화하는 sgRNA(250 ng, 실시예 2에서 제조), NEBuffer 3.1(메사추세츠주, 입스위치의 New England BioLabs), 및 Can1 절단 분석 DNA(150 ng, 서열 번호 35)를 10 μL 반응물(부피는 ddH2O로 최종 부피로 맞춤)에서 혼합하였다. 음성 대조로서, 제브라 CPP-Cas9 융합 단백질 또는 sgRNA가 없는 반응물도 제조하였다. 양성 대조로서, 야생형 Cas9 단백질(캘리포니아주, 사우전드오크스의 PNA Bio)을 제브라 CPP-Cas9 대신 반응에 사용하였다. 반응물을 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 이어서, RNaseI(4 μg)을 각각의 반응물에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 배양하여 sgRNA를 분해하였다. 정지 용액(1 μL; 30% [w/v] 글리세롤, 1.2% [w/v] SDS, 250 mM EDTA, pH 8.0)을 첨가하여 반응을 종료시킨 후, 반응물을 37℃에서 15분 동안 더 배양하였다. 각각의 반응물을 1.2% FlashGel™(스위스, 바젤의 Lonza)에 로딩하고 200 볼트에서 10분 동안 전기 영동하였다(도 7). 제브라 CPP-Cas9에 의해 만들어진 표적 DNA 절단 패턴은 야생형 Cas9에 의해 만들어진 절단 패턴과 일치하였고(도 7), 따라서 제브라 CPP-Cas9이 시험관 내에서 정상적으로 기능함을 나타낸다. 또한, 이 활성은 2회의 동결-해동 사이클을 거친 제브라 CPP-Cas9/sgRNA를 사용하여 저해되지 않았다.
따라서, 적절한 sgRNA와 복합화된 CPP-Cas9 융합 단백질(즉, RGEN-CPP 복합체의 예)은 특이적 DNA 절단 활성을 가졌다. 이 활성은 야생형 Cas9-sgRNA 복합체의 활성과 유사하게 나타났으므로, CPP 융합이 Cas9-sgRNA 엔도뉴클레오리틱 기능을 저해하지 않음을 나타낸다. 본 실시예의 CPP-Cas9 융합 단백질은 서열 번호 39(제브라 CPP-Cas9)를 포함하였지만, 예를 들어 서열 번호 40, 41, 또는 42를 포함하는 CPP-Cas9 융합 단백질 또한, RNA 성분으로서 적절한 sgRNA와 결합되는 경우, 절단 활성을 갖는 것으로 생각된다.
실시예 4
효모 세포 내로의 CPP - Cas9 / sgRNA 복합체 전달 및 그 안에서 표적 DNA의 절단
본 실시예에서는, 세포와의 간단한 접촉 후 효모 세포에 들어가는 능력에 대해 sgRNA와의 복합체인 (서열 번호 39를 포함하는) 제브라 CPP-Cas9 융합 단백질(제브라 CPP-Cas9/sgRNA)을 시험하였다. Can1-1에 특이적인 제브라 CPP-Cas9/sgRNA는 세포에 들어가 Can1 유전자를 절단할 수 있었고, 따라서 세포를 카나바닌에 저항성을 갖도록 한다.
Y. 리폴리티카 효모 세포(ATCC 20362)를 진탕하면서(220 rpm) 30℃에서의 YPD(2% 글루코스, 2% 펩톤, 1% 효모 추출물) 액체 배지에서 OD600 = 0.5(배양물 1 mL 당 약 5x106 세포)까지 성장시켰다. 정제된 제브라 CPP-Cas9 융합 단백질(실시예 1에서 제조) 및, Can1-1 표적 부위를 표적화하는 sgRNA(실시예 2에서 제조)를 실시예 1에서 사용된 투석 완충액에서 각각 1:3의 몰비로 혼합하고, sgRNA가 제브라 CPP-Cas9과 결합할 수 있도록 실온에서 15분 동안 예비 배양하였다. 제브라 CPP-Cas9의 최종 농도가 1 μM, 2.5 μM, 또는 5 μM이 되도록 5x105개의 Y. 리폴리티카 세포를 제브라 CPP-Cas9/sgRNA 제제에 혼합하였다. 음성 대조로서 5 μM 최종 농도의 제브라 CPP-Cas9 단독(RNA 성분으로서 sgRNA 없음)과도 세포를 혼합하였다. 모든 세포-Cas9 제제를 진탕하면서(220 rpm) 30℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 1000 내지 10000배로 연속 희석하였다. 각각의 연속 희석액(100 μL)을 아르기닌이 없는 완전 배지(CM-Arg)에 도말하고, 30℃에서 48시간 동안 회복시켰다.
10-3-희석 플레이트의 콜로니를 계수하여 도말된 총 세포 수를 결정하였다. 평판 복제 기술을 통해 콜로니를 카나바닌(60 μg/mL)이 있는 CM-Arg 플레이트로 옮겼다. 콜로니를 30℃에서 48시간 동안 성장하도록 하였다. 카나바닌에 저항성이 있는 콜로니의 수를 기록하고 (카나바닌이 없는 플레이트로부터의) 콜로니의 총 수로 나누어 각각의 경우에 대한 돌연변이 빈도를 결정하였다. 세포를 제브라 CPP-Cas9/sgRNA 복합체와 접촉시켜 총 콜로니의 약 2% 내지 10%의 빈도로 카나바닌에 저항성이 있는 콜로니를 생성하였다(도 8). 이러한 카나바닌 저항성은 Can1 유전자 암호화 서열의 예측된 Cas9 절단 부위 또는 그 부근에서의 삽입-결실 형성에 의한 Can1 유전자 기능의 상실로 인한 것으로 예상된다. 그러나, 세포를 제브라 CPP-Cas9 단독(sgRNA 없음)과 접촉시킨 경우 카나바닌에 저항성이 있는 콜로니를 생성하지 않았고(도 8), 이는 실험 세포의 카나바닌 저항성이 CPP-Cas9 단백질에 주어진 sgRNA 기반의 특이성에 의존했음을 나타낸다. 효모 세포의 특성을 감안하면, CPP-Cas9/sgRNA 복합체는 특이적 DNA 표적화를 매개하기 위해 세포벽과 세포막 구조 모두를 가로질러야 했을 것 같다.
따라서, 적절한 sgRNA와 복합화된 CPP-Cas9 융합 단백질(즉, RGEN-CPP 복합체의 예)은 효모 세포에 들어갈 수 있고(세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있고) 그 안에서 특정 DNA 서열을 표적화할 수 있다. 본 실시예의 CPP-Cas9 융합 단백질은 서열 번호 39(제브라 CPP-Cas9)를 포함하였지만, 예를 들어 서열 번호 40, 41, 또는 42를 포함하는 CPP-Cas9 융합 단백질 또한, RNA 성분으로서 적절한 sgRNA와 결합되는 경우, 세포 진입 활성 및 세포 내 특이적 DNA 표적화 활성을 갖는 것으로 생각된다.
실시예 5
식물 세포 내로의 CPP -촉진 Cas9 / sgRNA 복합체 전달 및 그 안에서 표적 DNA의 절단
대두 세포 내로의 CPP-촉진 단백질 전달은 CPP에 융합된 DS-RED 형광 단백질과 함께 대두 캘러스 세포를 배양하여 시험될 수 있다. CPP-DS-RED 처치에서는 형광 신호가 예상되지만, DS-RED 단백질로만 배양된 대조에서는 예상되지 않는다. 이러한 방식으로 다양한 CPP를 시험하여 단백질 화물의 식물 세포 침투 및 전달에 가장 효과적인 CPP를 확인하는 데 도움을 줄 수 있다. 시험될 수 있는 CPP의 일부 예는 다음을 포함한다:
(i) 엡스타인 바 바이러스 제브라 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 CPP,
(ii) 6개 이상의 인접한 아르기닌 잔기를 가진 CPP,
(iii) 트랜스포탄-10(TP10) CPP,
(iv) 혈관 내피 카데린 단백질로부터의 CPP, 또는
(vi) 합성 노나-아르기닌 CPP, 히스티딘이 풍부한 노나-아르기닌 CPP 및 Pas 노나-아르기닌 CPP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CPP. 합성 노나-아르기닌 CPP, 히스티딘이 풍부한 노나-아르기닌 CPP 및 Pas 노나-아르기닌 CPP의 예는, 예를 들어 Liu et al. (Advanced Studies in Biology 5(2):71-88, HIKARI Ltd)에 개시되어 있다.
시험관 내 번역된 Cas9 단백질 및 합성 sgRNA는, Cas9/sgRNA가 세포 내로 전달될 수 있는지를 시험하기 위해, 그 자체로 또는 융합으로(예를 들어, 상기 CPP-DS-RED) CPP와 혼합되고 대두 캘러스와 함께 배양될 수 있다. 일단 세포에 들어가면, Cas9/sgRNA 복합체는 sgRNA 표적화 서열에 의해 특정된 게놈 표적을 인지하여 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 할 수 있다. 세포 조직에 의한 DSB의 자발적 회복은 비 상동 말단 결합(NHEJ)을 통한 돌연변이, 또는 적절한 공여 DNA가 존재하는 경우 상동 재조합을 통한 유전자 삽입을 초래할 수 있다. CPP는 잠재적으로 더 나은 효율을 위해 Cas9 단백질에 공유적으로 연결될 수도 있다. 대두 세포 내로의 CPP-Cas9/sgRNA 전달의 성공 및 이에 따른 식물 세포벽 및 식물 세포막을 가로지르는 CPP-Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 전달은, 예를 들어 PCR 분석에 의해 특정 표적 부위에서 돌연변이 또는 유전자 삽입을 검출하여 확인될 수 있다.
실시예 6
대장균 세포로부터 CPP - dsREDexpress 단백질의 발현 및 정제
소정의 세포 침투성 펩티드가 특정 세포 유형에 들어가는 능력을 빠르게 평가하기 위해 dsREDexpress 단백질(서열 번호 85)과의 CPP 융합체를 생성하고, 대장균 세포에서 발현하고, 정제하였다. CPP-dsREDexpress 단백질 융합체는 소정의 CPP에 의한 소정의 세포 유형 내로의 화물 전달을 신속하게 평가할 수 있는 도구이다. 이를 통해 종, 세포 유형, 또는 균주 특이적 CPP 분자를 선택하여, 현미경 또는 유세포 분석에 의해 세포 형광을 평가함으로써 신속하고 높은 처리량 방식으로 화물의 전달을 극대화할 수 있다.
대장균 코돈 최적화된 dsREDexpress 유전자(서열 번호 86)을 합성하고(IDT DNA), pBAD/HisB(서열 번호 87)의 NcoI/HinDIII 부위에 클로닝하여 pRF161(서열 번호 88)을 생성하였다. 대장균 코돈 최적화된 dsREDexpress는 NcoI/EcoRI에 의한 플라스미드의 분해가 his 태그를 다양한 his 태그-CPP 서열로 대체하여 his 태그-CPP-dsREDexpress 융합 발현 플라스미드를 생성할 수 있도록 내부 EcoRI 부위를 포함하였다. 다양한 his-태그-CPP 융합체; TAT(서열 번호 89), TLM(서열 번호 90), MPG1(서열 번호 91), pep1(서열 번호 92), 및 CFFKDEL(서열 번호 93);을 대장균에 코돈 최적화하고, 프레임 5’ NcoI 및 3’ EcoRI 부위(각각 서열 번호 94 내지 98)에서 플랭킹하고, 표준 기법을 이용하여 pRF161(서열 번호 88)의 NcoI/EcoRI 부위에 클로닝하여, his 태그 서열을 해당 his 태그-CPP 융합체로 대체하고 플라스미드 pRF224(his-TAT-dsREDexpress 서열 번호 99), pRF214(his-TLM-dsREDexpress 서열 번호 100), pRF213(his-MPG1-dsREDexpress 서열 번호 101), pRF217(his-pep1-dsREDexpress 서열 번호 102), pRF216(his-CFFKDEL-dsREDexpress 서열 번호 103)을 생성하였다. 표준 시퀀싱 기법 및 올리고 36(서열 번호 104)을 이용하여 삽입된 단편의 서열을 확인하였다.
표준 PCR 기법과 함께 올리고 36(서열 번호 104) 및 올리고 153(서열 번호 111)을 이용하여, 대장균 코돈 최적화된 His-제브라(서열 번호 105), His-tp 10(서열 번호 106), 및 His-pVEC(서열 번호 107)를 각각 pRF144(서열 번호 108), pRF162(서열 번호 109), 및 pRF146(서열 번호 110)으로부터 PCR 증폭하였다. PCR 단편을 pRF161(서열 번호 88)의 NcoI/EcoRI 부위에 클로닝하여 플라스미드 pRF186(his-제브라-dsREDexpress 서열 번호 112), pRF192(his-tp10-dsREDexpress 서열 번호 113), 및 pRF190(his-pVEC-dsREDexpress 서열 번호 114)를 생성하였다. 올리고 36(서열 번호 104)을 이용하여 서열을 확인하였다.
표준 기법을 이용하여 His 태그된 CPP-dsREDexpress 융합 단백질을 발현하였다. 간략하게, 125 ml 플라스크 내 10 ml ZYM-505(1% N-Z 아민, 0.5% 효모 추출물, 5% 글리세롤, 1.0% 덱스트로스, 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 1x 미량 금속(Teknova), 5x10-5% 티아민, 2 mM MgCl2, 100 μg/ml 암피실린) 또는 용원성 부용(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨, 100 μg/ml 암피실린, 0.4% 덱스트로스)에서 37℃ 및 220 RPM에서 12~16시간 동안 세포를 예비 배양하였다. 예비 배양물을 500ml ZYM-5052(1% N-Z 아민, 0.5% 효모 추출물, 5% 글리세롤, 0.5% 덱스트로스, 2% L-아라비노오스, 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 1x 미량 금속(Teknova), 5x10-5% 티아민, 2 mM MgCl2, 100 μg/ml 암피실린)에서 1:1000(ZYM-505)으로 또는 500 ml 2xYT(1.6% 트립톤, 1% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 100 μg/ml 암피실린)에서 1:100(용해 부용)으로 희석하고, 2.9 L 페른바흐 플라스크에서 37℃, 220 RPM에서 약 0.5 OD600까지 성장시켰다. 2x YT 배양물에 L-아라비노오스를 0.1%의 최종 농도로 첨가하고, 단백질 발현을 위해 모든 배양물을 20~30시간 동안 18℃, 220 RPM으로 옮겼다. 5000 RPM에서 10분 동안 세포를 채취하고, 사용된 배지는 버리고, 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시켰다.
세포 펠렛을 해동하고 변성 용해 완충액(50 mM 트리스 pH 8.0, 150 mM NaCl, 8 M 요소, 20 mM 이미다졸)에 재현탁시키고, 16,000 PSI에서 프렌치 압력 셀에 2회 통과시켜 용해시켰다. 10,000 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 상청액으로부터 고체 침전물을 제거하였다. 20 μl의 정제 추출물을 20 μl의 2x 램리 완충액(4% SDS, 20% 글리세롤, 100 mM DTT, 0.004% 브로모페놀 블루, 125 mM 트리스 pH 6.8)과 혼합하고, 95℃까지 5분 동안 가열하고, -20℃에서 동결시켜 분석을 위해 보관하였다. 정제 추출물을 실온에서 1시간 동안 50%(v/v) 니켈-NTA-아가로오스 슬러리 6 ml와 혼합하였다. 5분 동안 2000 RPM으로 혼합물로부터 비드를 펠렛화하였다. 상청액을 제거하고 정제 추출물에서와 같이 20 μl의 샘플을 취하였다. 펠렛화된 비드를 10 ml의 변성 용해 완충액에 재현탁시키고, 중력 유동 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 액체를 흘려 내보내 압축된 비드 층을 남겼다. 이 층을 상이한 비율의 세척 완충액 1(50 mM 트리스 pH 8.0, 150 mM NaCl, 8 M 요소, 20 mM 이미다졸) 및 세척 완충액 2(50 mM 트리스 pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)을 사용하여 연속 세척하여 변성제(요소)의 농도를 낮추고 NaCl의 농도를 높이고 단백질이 컬럼에 재폴딩되도록 하였다. 간략하게, 컬럼을 (완충액 1: 완충액 2): 1:0(8 M 요소, 150 mM NaCl) 10 ml, 7:1(7 M 요소, 194 mM NaCl) 10 ml, 3:1(6 M 요소, 238 mM NaCl) 10 ml, 5:3(5 M 요소, 281 mM NaCl) 10 ml, 1:1(4 M 요소, 325 mM NaCl) 10 ml, 3:5(3 M 요소, 369 mM NaCl) 20 ml, 1:3(2 M 요소, 413 mM NaCl) 20 ml, 3:13(1.5 M 요소, 434 mM NaCl) 20 ml, 1:5(1 M 요소, 456 mM NaCl) 20 ml, 1:15(0.5 M 요소, 478 mM NaCl) 20 ml, 및 0:1(0 M 요소, 500 mM NaCl) 30 ml로 세척하였다. 단백질을 천연 용리 완충액(50 mM 트리스 pH 8.0, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 500 mM 이미다졸)에서 10x 1ml 분획으로 용출시켰다. 용출된 dsREDexpress 또는 CPP-dsREDexpress 단백질을 함유한 분획은 적색이었다. 적색 분획을 합하고, 1000 부피의 투석 완충액(50 mM 트리스 pH 8.0, 10% 글리세롤)에 대해 10,000 MWCO 재생 셀룰로오스 투석막에서 실온에서 밤새 투석하였다. 투석막으로부터 단백질 용액을 제거하고 0.22 μM Tuffryn®막을 사용하여 필터를 멸균하였다. 정제 세포 추출물에서와 같이 20 μl의 단백질 용액을 처리하였다.
램리 완충액에서의 정제 중에 취한 샘플을 5분 동안 95℃까지 가열하고 12.5%의 PAGE 겔에 로딩하였다. 겔을 1시간 동안 200 볼트로 일정하게 유지시키고 간단한 블루 염색을 이용하여 염색하였다. CPP-dsREDexpress 태그된 단백질의 정제를 위한 대표적인 PAGE 겔의 예를 도 9에 나타내었다. 각각의 정제된 단백질에 대한 총 단백질 농도는 소혈청알부민을 표준물질로 사용하는 Pierce™ Coomassie Plus 분석을 이용하여 결정하였다. 각각의 정제된 CPP-dsREDexpress 융합체의 농도를 표 3에 나타내었다.
Figure pct00001
실시예 7
대장균 세포로부터 추가 CPP - Cas9 단백질의 발현 및 정제
상이한 세포 유형 내로의 Cas9의 전달은 상이한 CPP 분자로 태그된 Cas9를 필요로 할 수 있다. 다양한 CPP-Cas9 융합 단백질을 분리하기 위해, 다양한 CPP를 대장균 발현 벡터에서 Cas9에 융합하였다. Cas9/sgRNA 리보핵산단백질 복합체를 세포에 CPP 매개 전달하는 데 사용하기 위해 이 단백질들을 발현하고 대장균 세포로부터 정제하였다.
His-CFFKDEL-Cas9(서열 번호 115) 및 His-MPG1-Cas9 (서열 번호 116) 융합 발현 카세트를 제조하기 위해, 표준 기법을 이용하여 pRF216(CFFKDEL 서열번호 103) 또는 pRF213(MPG1 서열 번호 101)의 NcoI/EcoRI 단편을 Cas9 단백질 발현 플라스미드 pRF48(서열 번호 117)의 동일한 부위에 클로닝하여 플라스미드 pRF243(his-CFFKDEL-Cas9 서열 번호 118) 및 pRF238(his-MPG1-Cas9, 서열 번호 119)을 각각 생성하였다. 올리고 36(서열 번호 104)을 이용한 Sanger 시퀀싱을 통해 MPG1-Cas9 또는 CFFKDEL-Cas9 융합 카세트의 올바른 구조를 확인하였다.
표준 기법을 이용하여 His 태그된 CPP-Cas9 융합 단백질을 발현하였다. 간략하게, 125 ml 플라스크 내 10 ml ZYM-505(1% N-Z 아민, 0.5% 효모 추출물, 5% 글리세롤, 1.0% 덱스트로스, 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 1x 미량 금속(Teknova), 5x10-5% 티아민, 2 mM MgCl2, 100 μg/ml 암피실린) 또는 용원성 부용(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨, 100 μg/ml 암피실린, 0.4% 덱스트로스)에서 37℃ 및 220 RPM에서 12~16시간 동안 세포를 예비 배양하였다. 예비 배양물을 500ml ZYM-5052(1% N-Z 아민, 0.5% 효모 추출물, 5% 글리세롤, 0.5% 덱스트로스, 2% L-아라비노오스, 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 1x 미량 금속(Teknova), 5x10-5% 티아민, 2 mM MgCl2, 100 μg/ml 암피실린)에서 1:1000(ZYM-505)으로 또는 500 ml 2xYT(1.6% 트립톤, 1% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 100 μg/ml 암피실린)에서 1:100(용해 부용)으로 희석하고, 2.9 L 페른바흐 플라스크에서 37℃, 220 RPM에서 약 0.5 OD600까지 성장시켰다. 2x YT 배양물에 L-아라비노오스를 0.1%의 최종 농도로 첨가하고, 단백질 발현을 위해 모든 배양물을 20~30시간 동안 18℃, 220 RPM으로 옮겼다. 5000 RPM에서 10분 동안 세포를 채취하고, 사용된 배지는 버리고, 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시켰다. 실시예 1에 설명한 바와 같이 단백질을 정제하였다. Coomasie Plus 분석(Pierce™)에 의해 결정된 정제된 CPP-Cas9 단백질의 최종 농도를 표 4에 나타내었다.
정제된 CPP-Cas9 단백질의 농도
단백질 mg/ml μM
제브라-Cas9(서열 번호 758) 1.5 9
CFFKDEL-Cas9(서열 번호 730) 4.6 28
MPG1-Cas9(서열 번호 731) 3.8 23
pVEC-Cas9(서열 번호 759) 2.5 15
실시예 8
대장균 세포에서의 CPP - Cas9 / gRNA 매개 유전자 표적화
본 실시예는 대장균의 galK 유전자를 표적화하는 sgRNA와의 CPP-Cas9/sgRNA 리보핵산단백질 복합체를 이용한 대장균 세포의 처치를 보여준다. CPP-Cas9/sgRNA의 세포 내 진입은 galK 유전자 내에서 표적화 및 절단이 일어날 수 있도록 하여, 갈락토스에 대한 저항성으로 표현형 모니터링될 수 있는, 오류가 발생하기 쉬운 DNA 복구 메커니즘에 의해 유전자 불활성화를 초래한다. 이 방법은 CPP 매개 전달을 통해 Cas9/sgRNA 화물을 세포에 전달하는 것에 의존한다.
설탕 갈락토스의 존재 하에 galE 돌연변이에서 발견되는 갈락토스 민감성 표현형은 대장균의 galK 유전자(서열 번호 120)에 기인한다. 갈락토스가 세포에 들어갈 때, 갈락토스는 galK 유전자(서열 번호 120)의 생성물인 갈락토키나제에 의해 인산화된다. 갈락토스 인산염은 세포에 독성이다. 야생형 세포에서, 갈락토스 인산염은 gale(서열 번호 121) 및 galT(서열 번호 122) 유전자의 생성물에 의해 추가로 대사되고 탄소 공급원으로서 사용된다. galE 또는 galT 기능 상실 돌연변이에서, 갈락토스 인산염이 축적되어 세포 사멸을 초래한다. 따라서, galK 유전자에서 기능 상실 돌연변이는 갈락토스의 존재 하에 콜로니 형성을 가능하게 하는 galE 돌연변이의 원인에서 선택될 수 있다.
galK2-1 표적 부위(서열 번호 134)에서 galK 유전자(서열 번호 120)를 표적화하는 sgRNA(서열 번호 135)를 제조하기 위해, 시험관 내 전사 주형(서열 번호 131)을 제조하였다. 우선, CER 도메인을 암호화하는 DNA의 PCR 생성물(서열 번호 123)을 표준 PCR 반응에서 CER 정방향 프라이머(서열 번호 126) 및 일반 역방향 프라이머(서열 번호 127)를 사용하여 pRF291(서열 번호 125)로부터 증폭하였다(서열 번호 124). CER 암호화 PCR 생성물(서열 번호 124)을 Zymo™ 정제 및 농축 25 컬럼을 이용하여 정제하고 35 μl의 ddH2O로 용출시켰다. sgRNA 시험관 내 전사 주형의 증폭은 T7 프로모터를 포함하는 일반 정방향 프라이머(서열 번호 128), T7 프로모터의 일부 및 표적 부위의 일부를 포함하는 표적 특이적 정방향 프라이머(서열 번호 129), 표적 부위의 일부를 포함하고 CER 도메인과 중첩하는 표적 역방향 프라이머(서열 번호 130), 및 일반 역방향 프라이머(서열 번호 127)의 4개의 프라이머를 포함하는 다중 PCR을 사용하였다. 15 nM CER 도메인 PCR 생성물(서열 번호 124), 각각 1 μM의 일반 정방향 프라이머(서열 번호 128) 및 역방향 프라이머(서열 번호 127) 및 각각 300 nM의 표적 정방향 프라이머(서열 번호 129) 및 표적 역방향 프라이머(서열 번호 130)를 함유한 Phusion 플래시 마스터 믹스를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 표준 반응에서와 같이 PCR 반응을 순환시켰다. sgRNA 시험관 내 전사 주형(서열 번호 131)을 Zymo 정제 및 농축 25 컬럼을 이용하여 정제하고 35 μl의 ddH2O로 용출시켰다. sgRNA 시험관 내 전사 주형(서열 번호 131)은 T7 프로모터(서열 번호 132), galK2-1 가변 표적화 도메인을 암호화하는 DNA(서열 번호 133), 및 CER 도메인을 암호화하는 DNA(서열 번호 125)를 포함하였다. galK2-1 sgRNA(서열 번호 135)를 생성하기 위한 시험관 내 전사 반응을 실시예 2에 설명한 바와 같이 수행하였다.
galE에 대해 결실된 대장균의 균주를 용원성 부용(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NACl)에서 37℃, 220 RPM에서 밤새 성장시켜 Cas9/sgRNA 핵단백질 복합체의 CPP 전달을 수행하였다. 배양물을 깨끗한 용원성 부용에서 1:100으로 희석하고 37℃, 220 RPM에서 2시간 동안 성장시켜 지수 성장 단계의 세포를 수득하였다. CPP-Cas9(pvEC-Cas9 (서열 번호 144), 제브라-Cas9(서열 번호 143), MPG1-Cas9(서열 번호 116), CFFKDEL-Cas9(서열 번호 115))를 50 μl의 부피의 10 μM galK2-1 sgRNA(서열 번호 135)의 존재 또는 부재 하에 실온에서 30분 동안 10 μM의 최종 농도로 배양하였다. 처치를 위해 1.2 ml의 세포를 3000 RPM으로 3분 동안 펠렛화하고, 상청액을 버리고, 2x 뉴클레아제 완충액(200 mM NaCl, 100 mM 트리스-HCl, 20 mM MgCl2, 200 μg/ml BSA pH 7.9)을 함유한 600 μl의 LB에 세포를 재현탁하였다. 50 μl의 세포 현탁액을 각각의 반응물뿐만 아니라 gRNA 단독 대조 및 미처치와 혼합하였다. 샘플을 37℃, 220 RPM에서 4시간 동안 배양하였다. 100 μl 의 10-3, 10-4, 및 10-5 희석 샘플을 용원성 부용 플레이트에 도말하여 처치 종료시 생존 세포 수를 얻었고, 나머지 반응물은 용원성 부용 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 10-5 희석액으로부터 생존 세포를 계수하여 샘플 용원성 부용 플레이트에 도말된 생존 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 결정하였다. 탄소 공급원으로서 0.2%(w/v) 글리세롤 및 0.2%(w/v) 갈락토스를 함유한 1.5%(w/v)박토 한천으로 응고된 최소 A 배지(1 g/L(NH4)2SO4, 4.5 g/L KH2PO4, 10.5 g/L K2HPO4, 0.5 g/L 시트르산나트륨·2H2O, 1 mM MgSO4·7H2O, 5 x 10-5 % 티아민)에 샘플 플레이트를 표준 기법을 통해 평판 복제하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니의 형성을 기록하였다. 갈락토스를 함유한 플레이트 상에서의 galE 균주로부터의 각각의 CFU는 galK 유전자의 유전자 불활성화 사건을 나타낸다. 평판 복제의 결과를 표 5에 나타내었다.
CPP-Cas9/sgRNA로 처치된 galE 돌연변이 대장균 세포에서 galK 유전자 불활성화의 빈도
Cas9 단백질 sgRNA 갈락토스 상의 CFU 갈락토스에 도말된 CFU GalR CFU의 빈도 빈도 배수 GalR/미처치 GalR 빈도
없음 없음 21 1.65 x 108 1.27 x 10-7 1.00
pVEC-Cas9 없음 21 1.18 x 108 1.78 x 10-7 1.39
pVEC-Cas9 galK2-1 15 1.23 x 108 1.22 x 10-7 0.96
MPG1-Cas9 없음 22 1.34 x 108 1.65 x 10-7 1.29
MPG1-Cas9 galK2-1 16 1.11 x 108 1.44 x 10-7 1.13
제브라-Cas9 없음 29 1.89 x 108 1.53 x 10-7 1.20
제브라-Cas9 galK2-1 25 8.88 x 107 2.82 x 10-7 2.21
CFFKDEL-Cas9 없음 29 1.24 x 108 2.34 x 10-7 1.84
CFFKDEL-Cas9 galK2-1 63 1.24 x 108 5.10 x 10-7 4.00
없음 galK2-1 31 1.42 x 108 2.19 x 10-7 1.72
일부 경우에 CPP-Cas9/sgRNA 리보핵산단백질 복합체에 의한 대장균 세포의 처치는 galK 불활성화의 빈도를 미처치 세포의 백그라운드에 비해 약 4배 향상시켰다. 이러한 향상은 CPP-Cas9 단독 또는 sgRNA 단독으로 처치된 세포에서는 나타나지 않았고, 이는 galK 유전자의 증가된 불활성화가, 세포에 들어가 galK 유전자 내 galK2-1 표적 부위에서 DNA 이중 가닥 절단을 형성하는 CPP-Cas9/sgRNA 리보핵산단백질로 인한 것임을 암시한다.
실시예 9
고세균 세포로의 CPP - dsREDexpress 단백질의 전달
세포 침투성 펩티드를 이용한 화물의 고세균 세포로의 전달을 시험하고, 박테리아 및 진핵 세포벽(예를 들어, 인지질) 및 막과 유사한 요소 및 분명히 고세균인 요소(예를 들어, S-층)를 포함하는 고세균 세포벽을 가로지르는 후보 CPP를 결정하기 위해, 고세균 세포를 CPP-dsREDexpress 단백질 융합체로 처치하였다. 본 스크린에서 확인된 CPP는 다른 화물(예를 들어, Cas9/sgRNA 리보핵산단백질 복합체)을 고세균 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다.
1.5% 박토 한천으로 응고된 배지 213(250 g/L NaCl, 10 g/L MgSO4·7H2O, 5 g/L KCl, 0.2 g/L CaCl2·6H2O, 10 g/L 효모 추출물, 2.5 g/L 트립톤)에서 콜로니가 형성될 때까지(4일) 37℃에서 고세균 할로박테리움 살리나룸 ATCC19700을 성장시켰다. 250 ml 플라스크에서 50 ml의 배지 213을 접종하는 데 단일 콜로니를 사용하였다. OD600이 지수 성장 단계를 나타내는 약 0.5에 도달할 때까지 37℃, 220 RPM에서 배양물을 성장시켰다. 100 μl의 세포를 24 웰 블록에서 단백질 없이, 5 μM dsREDexpress(서열 번호 85), 5 μM MPG1-dsREDexpress(서열 번호 136), 5 μM pVEC-dsREDexpress(서열 번호 137), 5 μM CFFKDEL-dsREDexpress(서열 번호 138), 5 μM TLM-dsREDexpress(서열 번호 139), 5 μM pep1-dsREDexpress(서열 번호 141), 또는 5 μM tp10 dsRED-express(서열 번호 142)와 혼합하였다. 혼합물을 37℃, 220 RMP에서 4시간 동안 배양하였다. 트립톤 및 효모 추출물이 없는 배지 213으로 세포를 2회 세척하고, 트립톤 및 효모 추출물이 없는 100 μl의 배지 213에 재현탁시켰다. 어떤 CPP 태그가 dsREDexpress 화물을 H. 살리나룸 세포에 전달하는지 판단하기 위해 Accuri C5 유세포 측정기의 레드 채널에서의 형광에 대해 세포를 분석하였다. 게이트가 레드 게이트에서 떨어지는 0.2%의 미처치 세포의 거짓 양성 빈도를 생성하도록 미처치 세포를 사용하여 비적혈구와 적혈구 간의 유세포 측정 데이터에 대한 분석 게이트를 생성하였다.
H. 살리나룸으로의 dsREDexpress의 CPP 전달
처치 적혈구 게이트의 개체 백분율 ± 표준 편차1 dsREDexpress 단독 대비 레드 개체의 증가 배수
비 dsREDexpress 0.21±0.06 0.73
dsREDexpress 0.29±0.21 1.00
MPG1-dsREDexpress 0.37±0.08 1.27
pVEC-dsREDexpress 16.87±9.90 57.50
CFFKDEL-dsREDexpress 0.33±0.14 1.14
TLM-dsREDexpress 2.03±1.02 6.93
pep1-dsREDexpress 0.36±0.18 1.23
tp10-dsREDexpress 0.91±0.27 3.09
1데이터는 3회 반복 ± 표준 편차를 나타낸다.
고세균 세포 내로의 dsREDexpress 화물의 전달은, 적어도 3개의 세포 침투성 펩티드(pVEC, TLM, tp10)가 dsREDexpress 단백질 단독 전달의 효율보다 50배 초과만큼 높은 효율로 단백질 화물을 고세균 세포에 전달할 수 있음을 보여주며, 이는 다른 화물(예를 들어, Cas9 리보핵산단백질 복합체)을 고세균 세포에 전달하는 데 이 세 가지 CPP 모티프가 사용될 수 있음을 시사한다. 추가로, CPP 모티프는 화물을 전체 세포 개체의 16%까지 전달하며, 이는 CPP에 의해 화물을 고세균 세포에 전달하는 것이 효율적인 과정이라는 것을 시사한다.
실시예 10
진핵 세포로의 CPP - dsREDexpress 단백질의 전달
상이한 진핵생물 종에 화물을 전달하는 세포 침투성 펩티드의 능력을 시험하기 위해, 세 가지 종, 피토프토라 카프시시(난균류), 셉토리아 트리티시(진균류), 및 보트리티스 시네레아(진균류)를 다양한 CPP-dsREDexpress 융합체로 처치하였다. FACS 분석에 의해 다양한 CPP 모이어티에 대해 dsREDexpress 화물의 전달을 모니터링하여 화물이 전달된 세포의 비율을 결정하였다. 이들 세포에 dsREDexpress 화물을 전달할 수 있는 CPP는 CPP가 이러한 종류의 진핵 세포에 다른 화물(예를 들어, Cas9/sgRNA 리보핵산단백질 복합체)을 전달할 수 있음을 시사한다.
1.8% 박토 한천으로 응고된 V8 배지(20% V8 주스, 4.5 g/L CaCO3)에서 P. 카프시시를 23℃의 암실에서 3일 동안 성장시켰다. 이어서, 플레이트를 추가 7일 동안 23℃의 밝은 곳에 두었다. 플레이트를 4℃에서 30분 동안 냉각시켰다. 단지 표면을 덮도록 플레이트 위에 물을 두고, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 액체를 제거하여 유주포자를 채취하였다. 현미경 분석을 통해 유주포자를 확인하였다. 동일한 부피의 2x 포낭형성 배지(40g/L 트립톤, 10 g/L 효모 추출물, 200 ml/L 10x SOC 염[5.84 g/L NaCl, 1.86 g/L KCl, 20.3 g/L MgCl2·6H2O, 24.6 g/L MgSO4·7H2O, 36 g/L 덱스트로오스], 36.4 g/L 소르비톨, 1.47 g/L CaCl2·2H2O)를 유주포자에 첨가하고 서서히 혼합하였다. 포낭형성 배지 내 유주포자를 실온에서 20분 동안 배양시켰다. 현미경으로 포낭형성을 확인하였다. 포자를 펠렛화하고 동일한 부피의 YMA 배지(2 g/L 효모 추출물, 4 g/L 맥아 추출물)에 재현탁시키고 혈구계를 이용하여 계수하였다. 유주포자를 YMA에서 3x 107 포자/ml로 희석하였다. YMA 중의 유주포자 100 μl를 다양한 dsREDexpress 융합 단백질(새로운 실시예 5, 표 N1)과 5 μM 단백질의 최종 농도로 혼합하였다. 혼합물을 25℃, 400 RPM에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 인산 완충 식염수(PBS)(8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4·2H2O, 0.24 g/L KH2PO4 pH 6.8)로 2회 세척하고 최종 부피 200 μl의 PBS에 재현탁시켰다. 할로박테리움 살리나리움(실시예 9)에서와 같이 유세포 측정기를 이용하여 dsREDexpress 융합 단백질의 흡수를 모니터링하였다. 화물이 성공적으로 전달된 세포의 비율은, 개체의 0.1%가 거짓 양성 레드 사건으로 기록되도록(1:1000 세포) dsREDexpress 처치 세포에서 임의의 게이트를 뽑아 결정하였다. 이 처치의 결과는 표 7에서 볼 수 있다. pVEC, pep1, 및 tp10은 dsREDexpress 처치 세포 단독보다 5.8, 5.5, 및 1.8배 더 많은 적혈구를 생성하며, 이는 이러한 CPP 모이어티가 다른 화물(예를 들어, Cas9/sgRNA 리보핵산단백질 복합체)을 난균류에 전달하기 위한 후보일 수 있음을 시사한다.
피토프토라 카프시시로의 dsREDexpress의 CPP 전달
처치 적혈구 게이트의 개체 백분율 ± 표준 편차1 dsREDexpress 단독 대비 레드 개체의 증가 배수
dsREDexpress 0.10±0.03 1.00
pVEC-dsREDexpress 0.56±0.16 5.79
CFFKDEL-dsREDexpress 0.01±0.01 0.07
TLM-dsREDexpress 0.00±0.00 0.00
pep1-dsREDexpress 0.53±0.29 5.52
Tp10-dsREDexpress 0.17±0.14 1.76
MPG-dsREDexpress 0.00±0.00 0.00
제브라-dsREDexpress 0.03±0.05 0.34
1데이터는 3회 생물학적 반복 ± 표준 편차를 나타낸다.
1.8% 박토 한천으로 응고된 PDA 배지(24 g/L 감자 덱스트로오스 부용)에서 B. 시네레아를 암실에서 5 내지 10일 동안 성장시켰다. 멸균 플라스틱 스프레더로 물에서 분생포자를 채취하고 이를 2층의 치즈클로스를 통해 여과하였다. 혈구계 상에서 분생포자를 계수하고, YMA 배지에서 ml 당 3 x 107 분생포자까지 희석하였다. YMA 중의 분생포자 100 μl를 다양한 dsREDexpress 융합 단백질(새로운 실시예 5, 표 N1)과 5 μM 단백질의 최종 농도로 혼합하였다. 혼합물을 25℃, 400 RPM에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 인산 완충 식염수(PBS)(8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4·2H2O, 0.24 g/L KH2PO4 pH 6.8)로 2회 세척하고 최종 부피 200 μl의 PBS에 재현탁시켰다. 할로박테리움 살리나리움(실시예 8)에서와 같이 유세포 측정기를 이용하여 dsREDexpress 융합 단백질의 흡수를 모니터링하였다. 화물이 성공적으로 전달된 세포의 비율은, 개체의 0.1%가 거짓 양성 레드 사건으로 기록되도록(1:1000 세포) dsREDexpress 처치 세포에서 임의의 게이트를 뽑아 결정하였다. 이 처치의 결과는 표 8에서 볼 수 있다.
보트리티스 시네레아로의 dsREDexpress의 CPP 전달
처치 적혈구 게이트의 개체 백분율 ± 표준 편차1 dsREDexpress 단독 대비 레드 개체의 증가 배수
dsREDexpress 0.12±0.04 1.00
pVEC-dsREDexpress 0.08±0.10 0.68
CFFKDEL-dsREDexpress 0.03±0.01 0.22
TLM-dsREDexpress 0.01±0.01 0.05
pep1-dsREDexpress 0.01±0.01 0.05
Tp10-dsREDexpress 0.03±0.02 0.24
MPG-dsREDexpress 0.01±0.02 0.11
제브라-dsREDexpress 0.01±0.02 0.11
1데이터는 3회 생물학적 반복 ± 표준 편차를 나타낸다.
1.8% 박토 한천으로 응고된 YMA 배지에서 S. 트리티시를 23℃의 밝은 곳에서 성장시켰다. 5 내지 10일 후에 멸균 플라스틱 스프레더와 물로 분생포자를 채취하였다. 혈구계 상에서 분생포자를 계수하고, YMA 배지에서 3 x 107 분생포자까지 희석하였다. YMA 중의 분생포자 100 μl를 다양한 dsREDexpress 융합 단백질(새로운 실시예 5, 표 N1)과 5 μM 단백질의 최종 농도로 혼합하였다. 혼합물을 25℃, 400 RPM에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 인산 완충 식염수(PBS)(8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4·2H2O, 0.24 g/L KH2PO4 pH 6.8)로 2회 세척하고 최종 부피 200 μl의 PBS에 재현탁시켰다. 할로박테리움 살리나리움(실시예 9)에서와 같이 유세포 측정기를 이용하여 dsREDexpress 융합 단백질의 흡수를 모니터링하였다. 화물이 성공적으로 전달된 세포의 비율은, 개체의 0.1%가 거짓 양성 레드 사건으로 기록되도록(1:1000 세포) dsREDexpress 처치 세포에서 임의의 게이트를 뽑아 결정하였다. 이 처치의 결과는 표 9에서 볼 수 있다. pVEC, TLM, pep1, 및 tp10은 dsREDexpress의 전달을 dsREDexpress 단독에 비해 각각 25, 4, 3, 및 5배 증가시켰다. 이는 이러한 CCP가 다른 화물(예를 들어, Cas9/sgRNA 리보핵산단백질 복합체)를 진균류에 전달하기 위한 좋은 후보일 것이라는 것을 시사한다.
셉토리아 트리티시로의 dsREDexpress의 CPP 전달
처치 적혈구 게이트의 개체 백분율 ± 표준 편차1 dsREDexpress 단독 대비 레드 개체의 증가 배수
dsREDexpress 0.12±0.03 1.00
pVEC-dsREDexpress 3.02±0.91 25.2
CFFKDEL-dsREDexpress 0.00±0.01 0.03
TLM-dsREDexpress 0.48±0.14 4.03
pep1-dsREDexpress 0.37±0.21 3.06
Tp10-dsREDexpress 0.71±0.69 5.94
MPG-dsREDexpress 0.14±0.05 1.17
제브라-dsREDexpress 0.00±0.00 0.00
1데이터는 3회 생물학적 반복 ± 표준 편차를 나타낸다.
실시예 11
7 가지 장내 박테리아로의 7개의 CPP - dsRED 및 2개의 CPP - 태그RFP의 전달
본 실시예에서는, 2개의 화물 단백질, dsRED 및 태그RTF를 7 가지 장내 박테리아 종(숙주 생리학에 미치는 이들의 유익한 효과는 입증되었음) 내로 전달함에 있어 CPP의 효능을 시험하였다.
혐기성 텐트(80% N2, 15% CO2, 및 5% H2) 내 150 rpm의 회전 진탕기에서 박테리아 세포를 37℃에서의 적절한 배지(표 10 참조)에서 밤새 성장시켰다. 분석을 위해, 1x108 박테리아 세포를 96 웰 플레이트에서 최종 농도 5 uM의 CPP-dsRED 및 CPP-태그RFP 단백질과 혼합한 다음, 37℃에서 2시간 더 성장시켰다. 세포 내 dsRED 및 RFP 형광 신호를 측정하기 위해, 박테리아 세포를 원심분리(3,500 × g, 4℃, 20분)로 채취하고, 인산 완충 식염수(웰 당 100 ul)에서 2회 세척하였다. 10 nm 대역폭의 554 nm 여기 및 586 nm 방출 필터가 장착된 Tecan Spark 10 M 플레이트 리더(스위스 만네도르프의 Tecan)로 형광 강도를 정량화하였다. 미처치 세포의 형광 값에서 원시 형광 값을 감하였다(백그라운드). 세포 내 CPP의 전달에 대한 최소 컷오프로서 7000의 형광 강도 값을 사용하였다.
Figure pct00002
표 11에 나타낸 바와 같이, 이 결과들은 MPG, pVEC, TLM, ZEBRA, 및 pep1을 포함하는 5개의 CPP가 피르미쿠테스 및 박테로이데테스 문에 속하는 혐기성 장내 박테리아 내로 효과적으로 전달되었음을 나타내며, 따라서 CPP가 이들의 세포막을 통과할 수 있음을 나타낸다(표 9).
Figure pct00003
SEQUENCE LISTING <110> E. I. du Pont de Nemours and Company Fan, Xiaochun Frisch, Ryan Hong, Seung-Pyo Jackson, Ethel Noland <120> PEPTIDE-MEDIATED DELIVERY OF RNA-GUIDED ENDONUCLEASE INTO CELLS <130> CL6273 PCT <150> 62/075999 <151> 2014-11-06 <160> 144 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4107 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> S. pyogenes Cas9 <400> 1 atggacaaga aatactccat cggcctggac attggaacca actctgtcgg ctgggctgtc 60 atcaccgacg agtacaaggt gccctccaag aaattcaagg tcctcggaaa caccgatcga 120 cactccatca agaaaaacct cattggtgcc ctgttgttcg attctggcga gactgccgaa 180 gctaccagac tcaagcgaac tgctcggcga cgttacaccc gacggaagaa ccgaatctgc 240 tacctgcagg agatcttttc caacgagatg gccaaggtgg acgattcgtt ctttcatcga 300 ctggaggaat ccttcctcgt cgaggaagac aagaaacacg agcgtcatcc catctttggc 360 aacattgtgg acgaggttgc ttaccacgag aagtatccta ccatctacca cctgcgaaag 420 aaactcgtcg attccaccga caaggcggat ctcagactta tctacctcgc tctggcacac 480 atgatcaagt ttcgaggtca tttcctcatc gagggcgatc tcaatcccga caacagcgat 540 gtggacaagc tgttcattca 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cgtgacacca cgatgcctgt 5220 agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 5280 gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 5340 ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg 5400 tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 5460 ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 5520 gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 5580 acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 5640 aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 5700 atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 5760 gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 5820 tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 5880 ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 5940 ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 6000 ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 6060 aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 6120 cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 6180 gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 6240 ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 6300 cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 6360 tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 6420 cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg 6480 cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac 6540 tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta 6600 cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 6660 gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 6720 tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa ttcgcgcgcg 6780 aaggcgaagc ggcatgcata atgtgcctgt caaatggacg aagcagggat tctgcaaacc 6840 ctatgctact ccgtcaagcc gtcaattgtc tgattcgtta ccaattatga caacttgacg 6900 gctacatcat tcactttttc ttcacaaccg gcacggaact cgctcgggct ggccccggtg 6960 cattttttaa atacccgcga gaaatagagt tgatcgtcaa aaccaacatt gcgaccgacg 7020 gtggcgatag gcatccgggt ggtgctcaaa agcagcttcg cctggctgat acgttggtcc 7080 tcgcgccagc ttaagacgct aatccctaac tgctggcgga aaagatgtga cagacgcgac 7140 ggcgacaagc aaacatgctg tgcgacgctg gcgatatcaa aattgctgtc tgccaggtga 7200 tcgctgatgt actgacaagc ctcgcgtacc cgattatcca tcggtggatg gagcgactcg 7260 ttaatcgctt ccatgcgccg cagtaacaat tgctcaagca gatttatcgc cagcagctcc 7320 gaatagcgcc cttccccttg cccggcgtta atgatttgcc caaacaggtc gctgaaatgc 7380 ggctggtgcg cttcatccgg gcgaaagaac cccgtattgg caaatattga cggccagtta 7440 agccattcat gccagtaggc gcgcggacga aagtaaaccc actggtgata ccattcgcga 7500 gcctccggat gacgaccgta gtgatgaatc tctcctggcg ggaacagcaa aatatcaccc 7560 ggtcggcaaa caaattctcg tccctgattt ttcaccaccc cctgaccgcg aatggtgaga 7620 ttgagaatat aacctttcat tcccagcggt cggtcgataa aaaaatcgag ataaccgttg 7680 gcctcaatcg gcgttaaacc cgccaccaga tgggcattaa acgagtatcc cggcagcagg 7740 ggatcatttt gcgcttcagc catacttttc atactcccgc cattcagaga agaaaccaat 7800 tgtccatatt gcatcagaca ttgccgtcac tgcgtctttt actggctctt ctcgctaacc 7860 aaaccggtaa ccccgcttat taaaagcatt ctgtaacaaa gcgggaccaa agccatgaca 7920 aaaacgcgta acaaaagtgt ctataatcac ggcagaaaag tccacattga ttatttgcac 7980 ggcgtcacac tttgctatgc catagcattt ttatccataa gattagcgga tcctacctga 8040 cgctttttat cgcaactctc tactgtttct ccatacccgt tttttgggct aacaggagga 8100 attaaccatg gggcatcacc accatcacca cttattgatt atcttgcgtc gtcgcatccg 8160 caaacaggcg cacgcacata gcaagg 8186 <210> 24 <211> 80 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Cas9 endonuclease recognition (CER) domain <400> 24 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 25 tcaaacgatt acccaccctc 20 <210> 26 <211> 43 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Hammerhead (HH) ribozyme <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or u <400> 26 nnnnnncuga ugaguccgug aggacgaaac gaguaagcuc guc 43 <210> 27 <211> 68 <212> RNA <213> hepatitis delta virus <400> 27 ggccggcaug gucccagccu ccucgcuggc gccggcuggg caacaugcuu cggcauggcg 60 aaugggac 68 <210> 28 <211> 211 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HH-sgRNA-HDV (RGR) pre-sgRNA expression cassette <400> 28 gtttgactga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtctcaaacg attacccacc 60 ctcgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 120 agtggcaccg agtcggtgct tttggccggc atggtcccag cctcctcgct ggcgccggct 180 gggcaacatg cttcggcatg gcgaatggga c 211 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Bacteriophage T7 <400> 29 taatacgact cactataggg 20 <210> 30 <211> 2875 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> pRF46 plasmid <400> 30 agcttgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg 60 gaccatgccg gccaaaagca ccaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact 120 agccttattt taacttgcta tttctagctc taaaacgagg gtgggtaatc gtttgagacg 180 agcttactcg tttcgtcctc acggactcat cagtcaaacc cctatagtga gtcgtattag 240 aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 300 cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 360 ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 420 ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 480 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 540 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 600 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 660 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 720 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 780 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 840 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 900 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 960 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 1020 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 1080 tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 1140 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 1200 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 1260 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 1320 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 1380 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1440 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1500 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1560 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 1620 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 1680 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 1740 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 1800 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 1860 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 1920 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 1980 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 2040 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 2100 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 2160 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 2220 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 2280 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 2340 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 2400 ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 2460 acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 2520 ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 2580 ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag 2640 attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 2700 taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 2760 cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 2820 tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgcca 2875 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> T7 forward PCR primer <400> 31 ccggctcgta tgttgtgtgg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNArev1 reverse primer <400> 32 aaaagcaccg actcggtgcc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> IV-up forward primer <400> 33 ccacgaaacg acgtttcgac c 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> IV-down reverse primer <400> 34 gcaaagactc ggttgatggc 20 <210> 35 <211> 982 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 35 ccacgaaacg acgtttcgac cttaacgacc ctgccgtctc catccatccg accacaatgg 60 aaaagacatt ttcaaacgat tacccaccct ccgggactga ggcccacatc cacatcaacc 120 acacggccca ctcggatgac tcagaggagg tgccctcgca caaggaaaat tacaacacca 180 gtggccacga cctggaggag tccgacccgg ataaccatgt cggtgagacc ctcgaggtca 240 agcgaggtct caagatgcga cacatctcca tgatctcgct tggaggaacc attggtaccg 300 gtctcttcat tggtaccgga ggagctctcc agcaggccgg tccctgtggc gccctcgtcg 360 cctacgtgtt catggccacc attgtctact ctgttgccga gtctcttgga gaactggcta 420 cgtacattcc catcaccggc tcctttgccg tctttactac ccgatatctg tcacagtcgt 480 ttggtgcctc catgggctgg ctatactggt tctcgtgggc gatcaccttc gccatcgagc 540 tcaacaccat tggtcccgtg attgagtact ggactgacgc cgttcctact gctgcctgga 600 ttgccatctt cttcgtcatc ctcactacca tcaacttctt ccccgtgggc ttctatggcg 660 aagtcgagtt ctgggtggcc tccgtgaagg tcattgccat cattggatgg ctcatctacg 720 cgctctgcat gacgtgtgga gcaggtgtaa caggtcctgt gggattcaga tactggaacc 780 accccggacc catgggagac ggaatctgga ccgacggcgt gcccattgtg cgaaacgcgc 840 ccggtcgacg attcatggga tggctcaatt cgctcgttaa cgccgccttc acctaccagg 900 gctgtgagct ggtcggagtc actgccggtg aggcccagaa ccccagaaag tccgtccctc 960 gagccatcaa ccgagtcttt gc 982 <210> 36 <211> 4 <212> RNA <213> unknown <220> <223> RNA loop-forming sequence (GAAA) <400> 36 gaaa 4 <210> 37 <211> 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Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys 805 810 815 Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu 820 825 830 Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp 835 840 845 Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser 850 855 860 Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp 865 870 875 880 Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys 885 890 895 Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr 900 905 910 Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser 915 920 925 Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg 930 935 940 Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr 945 950 955 960 Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr 965 970 975 Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr 980 985 990 Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu 995 1000 1005 Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu 1010 1015 1020 Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg 1025 1030 1035 Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala 1040 1045 1050 Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu 1055 1060 1065 Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu 1070 1075 1080 Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp 1085 1090 1095 Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile 1100 1105 1110 Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser 1115 1120 1125 Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys 1130 1135 1140 Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val 1145 1150 1155 Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser 1160 1165 1170 Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met 1175 1180 1185 Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1190 1195 1200 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro 1205 1210 1215 Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu 1220 1225 1230 Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro 1235 1240 1245 Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val 1265 1270 1275 Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser 1280 1285 1290 Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys 1295 1300 1305 Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu 1310 1315 1320 Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly 1325 1330 1335 Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys 1340 1345 1350 Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His 1355 1360 1365 Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln 1370 1375 1380 Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1385 1390 1395 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Example of a Cas9 target site:PAM sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = A, C, T, or G <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n = A, C, T, or G (indicated as an "X" in Specification) <400> 43 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23 <210> 44 <211> 3 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PAM sequence NGG <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = A, C, T, or G <400> 44 ngg 3 <210> 45 <211> 6 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PAM sequence NNAGAA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n = A, C, T, or G <400> 45 nnagaa 6 <210> 46 <211> 7 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PAM sequence NNAGAAW <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n = A, C, T, or G <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> w = A or T <400> 46 nnagaaw 7 <210> 47 <211> 5 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PAM sequence NGGNG <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = A, C, T, or G <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n = A, C, T, or G <400> 47 nggng 5 <210> 48 <211> 8 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PAM sequence NNNNGATT <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n = A, C, T, or G <400> 48 nnnngatt 8 <210> 49 <211> 6 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PAM sequence NAAAAC <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = A, C, T, or G <400> 49 naaaac 6 <210> 50 <211> 2 <212> DNA <213> unknown <220> <223> PAM sequence NG <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = A, C, T, or G <400> 50 ng 2 <210> 51 <211> 22 <212> RNA <213> unknown <220> <223> TracrRNA mate sequence example 1 <400> 51 guuuuuguac ucucaagauu ua 22 <210> 52 <211> 15 <212> RNA <213> unknown <220> <223> TracrRNA mate sequence example 2 <400> 52 guuuuuguac ucuca 15 <210> 53 <211> 12 <212> RNA <213> unknown <220> <223> TracrRNA mate sequence example 3 <400> 53 guuuuagagc ua 12 <210> 54 <211> 13 <212> RNA <213> unknown <220> <223> TracrRNA mate sequence example 4 <400> 54 guuuuagagc uag 13 <210> 55 <211> 60 <212> RNA <213> Streptococcus pyogenes <400> 55 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 <210> 56 <211> 45 <212> RNA <213> Streptococcus pyogenes <400> 56 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aagug 45 <210> 57 <211> 32 <212> RNA <213> Streptococcus pyogenes <400> 57 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau ca 32 <210> 58 <211> 85 <212> RNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 58 uaaaucuugc agaagcuaca aagauaaggc uucaugccga aaucaacacc cugucauuuu 60 auggcagggu guuuucguua uuuaa 85 <210> 59 <211> 77 <212> RNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 59 ugcagaagcu acaaagauaa ggcuucaugc cgaaaucaac acccugucau uuuauggcag 60 gguguuuucg uuauuua 77 <210> 60 <211> 65 <212> RNA <213> Streptococcus thermophilus <400> 60 ugcagaagcu acaaagauaa ggcuucaugc cgaaaucaac acccugucau uuuauggcag 60 ggugu 65 <210> 61 <211> 131 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNA example 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = A, C, U, or G <400> 61 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuuguac ucucaagauu uagaaauaaa ucuugcagaa 60 gcuacaaaga uaaggcuuca ugccgaaauc aacacccugu cauuuuaugg caggguguuu 120 ucguuauuua a 131 <210> 62 <211> 117 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNA example 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = A, C, U, or G <400> 62 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuuguac ucucagaaau gcagaagcua caaagauaag 60 gcuucaugcc gaaaucaaca cccugucauu uuauggcagg guguuuucgu uauuuaa 117 <210> 63 <211> 104 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNA example 3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = A, C, U, or G <400> 63 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuuguac ucucagaaau gcagaagcua caaagauaag 60 gcuucaugcc gaaaucaaca cccugucauu uuauggcagg gugu 104 <210> 64 <211> 99 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNA example 4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = A, C, U, or G <400> 64 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuuguac ucucagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60 guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugc 99 <210> 65 <211> 81 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNA example 5 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = A, C, U, or G <400> 65 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu g 81 <210> 66 <211> 68 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNA example 6 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = A, C, U, or G <400> 66 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuauca 68 <210> 67 <211> 100 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNA example 7 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = A, C, U, or G <400> 67 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 68 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 69 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 70 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 71 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> polyarginine CPP example 2 <400> 72 Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> polyarginine CPP example 3 <400> 73 Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 74 Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His Ser 1 5 10 15 Lys <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> (KFF)3K CPP <400> 75 Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys 1 5 10 <210> 76 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MAP peptide CPP <400> 76 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CPP (RRQRRTSKLMKR) <400> 77 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 78 <211> 33 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CPP (KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA) <400> 78 Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30 Ala <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Proline-rich CPP repeat example 1 <400> 79 Val His Leu Pro Pro Pro 1 5 <210> 80 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Proline-rich CPP repeat example 2 <400> 80 Val His Arg Pro Pro Pro 1 5 <210> 81 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MPG peptide CPP <400> 81 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 82 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Pep-1 peptide CPP <400> 82 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 83 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 20 <210> 84 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe 1 5 10 15 Asn Lys <210> 85 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> his tagged dsRED <400> 85 Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Phe Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val Arg 20 25 30 Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly 35 40 45 Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr 50 55 60 Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe 65 70 75 80 Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp 85 90 95 Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met 100 105 110 Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu 115 120 125 Gln Asp Gly Ser Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn Phe 130 135 140 Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala 145 150 155 160 Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu Ile 165 170 175 His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu Phe 180 185 190 Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr Tyr 195 200 205 Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr 210 215 220 Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His His Leu Phe Leu 225 230 235 240 <210> 86 <211> 731 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> E. coli codon optimized dsRED <400> 86 ccatgggctc cagccatcat catcaccatc atgaattcgg aggtggcggt gcatcctcgg 60 aggatgtgat taaagaattt atgcggttta aagtacgtat ggaaggatcg gtgaatggcc 120 atgaatttga gattgagggt gaaggcgaag gccgcccgta cgaaggaact caaacagcga 180 aattaaaagt tacaaaagga ggtcctctgc cgtttgcctg ggacatcttg agcccgcaat 240 tccagtacgg ttccaaagtg tatgtaaaac accctgcgga tattccggat tataaaaaac 300 tgagttttcc cgaggggttt aaatgggaac gggtgatgaa ttttgaggat ggtggagttg 360 tcaccgtgac ccaggactct agcttacaag acggtagttt catctacaaa gtaaaattta 420 tcggcgtaaa cttcccatcg gacggccccg tcatgcagaa aaagacgatg ggctgggaag 480 ccagcaccga acgtttgtac ccacgggacg gcgttttgaa aggggaaatc cataaggccc 540 ttaaactgaa agacggtggt cactatctcg tggagtttaa atcgatttat atggctaaaa 600 aaccagtaca gcttccgggt tattattacg ttgactccaa attggacatc acatcgcata 660 atgaagatta cacgattgtt gaacagtacg agcgcgccga gggccggcac catctgtttc 720 tgtaaaagct t 731 <210> 87 <211> 4092 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> pBAD/HisB <400> 87 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc 300 taacaggagg aattaaccat ggggggttct catcatcatc atcatcatgg tatggctagc 360 atgactggtg gacagcaaat gggtcgggat ctgtacgacg atgacgataa ggatccgagc 420 tcgagatctg cagctggtac catatgggaa ttcgaagctt ggctgttttg gcggatgaga 480 gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa 540 tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa 600 acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga actgccaggc 660 atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt 720 cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc 780 aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaattaagc 840 agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactcttttg tttatttttc 900 taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 960 tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 1020 gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 1080 gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 1140 cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 1200 tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 1260 tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 1320 atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 1380 ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 1440 gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 1500 gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 1560 gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 1620 gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 1680 gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 1740 cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 1800 atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 1860 tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 1920 ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 1980 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 2040 tgcttgcaaa caaaaaaacc 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Claims (19)

  1. RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 상기 단백질 성분과 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결되고,
    상기 RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, RGEN의 단백질 성분은 미생물 세포의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 RNA 성분과 결합되며, RGEN은 표적 부위 서열에 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, RNA 성분은 트랜스-활성화 크리스퍼 RNA(tracrRNA)에 작동 가능하게 연결된 크리스퍼 RNA(crRNA)를 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는, 조성물.
  4. 제2항에 있어서, RGEN은 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, RGEN은 크리스퍼-결합(Cas) 단백질-9(Cas9) 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, RGEN 단백질 성분과 CPP는 공유적으로 연결된, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, RGEN 단백질 성분과 CPP는 비 공유적으로 연결된, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, CPP는 양이온성 또는 양친매성인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, CPP는
    (i) 엡스타인 바 바이러스 제브라 트랜스-활성화인자 단백질로부터의 CPP,
    (ii) 6개 이상의 인접한 아르기닌 잔기를 가진 CPP,
    (iii) 트랜스포탄-10(TP10) CPP, 또는
    (iv) 혈관 내피 카데린 단백질로부터의 CPP를 포함하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 RGEN 단백질-CPP 복합체는 미생물 세포의 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 조성물.
  11. 제1항의 조성물을 포함하는 세포.
  12. RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분을 미생물 세포 내로 전달하는 방법으로서,
    미생물 세포를 RGEN의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하되,
    상기 단백질 성분 및 CPP는 RGEN 단백질-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로 또는 비 공유적으로 연결되고,
    상기 RGEN 단백질-CPP 복합체는 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로질러, 미생물 세포 내로 들어가는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    (i) 조성물이 RGEN의 단백질 성분과 결합된 적어도 하나의 RNA 성분을 더 포함하거나;
    (ii) 미생물 세포가 RNA 성분을 포함하고, RNA 성분은 RGEN 단백질-CPP 복합체가 미생물 세포로 들어간 후에 RGEN의 단백질 성분과 결합하며;
    RNA 성분은 세포의 염색체 또는 에피솜 상의 표적 부위 서열에 상보적인 서열을 포함하며, RGEN은 표적 부위 서열에 결합할 수 있고, 선택적으로 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, RGEN은 표적 부위 서열에서 DNA 가닥 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 미생물 세포는 표적 부위 서열의 서열 또는 표적 부위 서열 근처의 서열과 상동인 적어도 하나의 서열을 포함하는 공여 폴리뉴클레오티드를 더 포함하되, 공여 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 서열에서 또는 표적 부위 서열 근처에서 상동 재조합에 의해 통합되는, 방법.
  16. RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 선택적으로, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드 서열.
  17. RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    (a) 제16항의 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 것;
    (b) 폴리뉴클레오티드 서열로부터 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 발현시켜, RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 생산하는 것으로서, 상기 발현은 선택적으로 세포에서 이루어지는 것; 및
    (c) 선택적으로, (b) 단계에서 생산된 RGEN 단백질-CPP 융합 단백질을 분리하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 적어도 하나의 단백질 성분 및 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드(CPP)를 포함하는 조성물로서, 상기 단백질 성분 및 CPP는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되고, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 조성물.
  19. 세포의 게놈에서 표적 부위를 변형하는 방법으로서, 가이드 폴리뉴클레오티드, 세포 침투성 펩티드(CPP) 및 Cas 엔도뉴클레아제를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드, Cas 엔도뉴클레아제 및 CPP는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체 내에서 서로에 대해 공유적으로, 또는 비 공유적으로 연결되며, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제-CPP 복합체는 미생물 세포의 (i) 세포막, 또는 (ii) 세포벽 및 세포막을 가로지를 수 있는, 방법.
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