CN105316353A - 一种利用碱性标签和内含肽融合表达纯化重组蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体公开了一种利用碱性标签和内含肽(Intein)融合表达纯化重组蛋白的方法及其应用。所述方法将所要研究的目的蛋白与具有自剪接功能的Intein以及碱性标签融合表达,可通过离子交换层析快速实现目的蛋白的纯化。与传统方法相比,本发明所述方法可省却外源性酶的应用,并且离子交换成本较低,对于放大规模的工业生产具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体公开了一种利用碱性标签和内含肽融合表达纯化重组蛋白的方法及其应用。
背景技术
酶、蛋白、抗体等重组蛋白类产品在人们的生产、生活、医疗中发挥着不可或缺的作用。尤其是重组蛋白、单克隆抗体等生物技术药物是20世纪后期随着生命科学的发展而出现的最新一代药物,具有高效、低毒、生物功能明确等一系列优势,连续6年的全球销售额增长率保持在15%~33%,已成为我国的战略支柱产业。
然而重组蛋白在表达和纯化工艺上还存在相当大的技术困难,远未达到满足人们需求的程度。为达到增加表达量,提高产物的正确构象及可溶性,方便下游纯化操作,人们可采用亲和标签融合表达的方式,应用如麦芽糖结合蛋白MBP,谷胱甘肽硫转移酶GST,多聚组氨酸6His等。这些亲和表达策略大大促进了蛋白的研究和应用,但面临两个主要的问题,一是亲和纯化介质的成本较高;二是为保持目的蛋白的结构、功能等特性,必须采取一定的方法将标签去除。目前去除标签最常用的是酶切方法,包括激酶,Xa因子等,但酶的应用存在成本高,酶切效率低下以及后续酶本身的去除等问题,难以实现大规模的工业生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,提供一种表达纯化目的蛋白的方法,用于解决现有技术中的问题。所述方法将所要研究的目的蛋白与具有自剪接功能的内含肽(Intein)以及碱性标签融合表达,可通过离子交换层析快速实现目的蛋白的纯化。与传统方法相比,本发明所述方法可省却外源性酶的应用,并且离子交换层析与亲和层析相比成本较低,对于放大规模的工业生产具有很好的应用前景。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明的第一方面公开了一种表达纯化目的蛋白的方法,所述方法具体包括如下步骤:
(1)构建目的蛋白表达载体:将目的蛋白编码基因序列与具有自剪接功能的Intein编码基因序列以及碱性标签编码基因序列融合后获得目的蛋白表达单元,并将所述目的蛋白表达单元***表达质粒上,构建获得目的蛋白表达载体;
(2)将步骤(1)中所得目的蛋白表达载体转化宿主***,获得转化的宿主,并在表达条件下,培养转化的宿主,从而表达由目的蛋白、碱性标签、Intein组成的融合蛋白;
(3)去除不溶性物质并采用离子交换层析法分离由目的蛋白、碱性标签、Intein组成的融合蛋白;
(4)将步骤(3)所得融合蛋白在适当的条件下孵育,进行切割,将目的蛋白从融合蛋白中释放到溶液中;
(5)分离目的蛋白和碱性标签:将步骤(4)中所得溶液进行离子交换层析,洗脱得到目的蛋白。
优选的,步骤(1)中,所述碱性标签为pI>7的超碱性蛋白或多肽,包括但不限于Zbasic,Zbasic2。
更优选的,所述碱性标签为Zbasic,所述Zbasic的编码基因序列如SEQIDNO.1所示,具体为:
GTTGATAACAAATTTAACAAAGAACGTCGCCGTGCTCGTCGTGAAATCCGTCATCTGCCGAATCTGAATCGTGAACAGCGTCGTGCGTTTATTCGTAGCCTGCGCGATGACCCGTCACAAAGCGCAAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGATGCCCAACCGAAA。
优选的,所述Intein包括具有自剪接或自我断裂功能的已知各类Intein的顺式及反式剪接形式。
更优选的,所述Intein为来源于MtuRecAintein的ΔI-CM,所述ΔI-CM的编码基因序列如SEQIDNO.2所示,具体为:
GCCCTCGCAGAGGGCACTCGGATCTTCGATCCGGTCACCGGTACAACGCATCGCATCGAGGATGTTGTCGgtGGGCGCAAGCCTATTCATGTCGTGGCTGCTGCCAAGGACGGAACGCTGCATGCGCGGCCCGTGGTGTCCTGGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCGGGTTGCGGATCGCCGGTGGCGCCATCctgtgGGCGACACCCGATCACAAGGTGCTGACAGAGTACGGCTGGCGTGCCGCCGGGGAACTCCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCGACGCTTCGATGGATTCGGTGACAGTGCGCCGATTCCGGCGCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAAC。
优选的,步骤(1)中,所述目的蛋白表达单元的序列还包括以下特征中的任一项:
a)所述目的蛋白表达单元的序列含有从N端到C端依次排列的碱性标签编码基因序列、Intein编码基因序列以及目的蛋白编码基因序列;
b)所述目的蛋白表达单元的序列含有从N端到C端依次排列的目的蛋白编码基因序列、Intein编码基因序列以及碱性标签编码基因序列;
c)所述目的蛋白表达单元的序列含有两个阅读框,分别是断裂Intein的N端部分,即Int(N);从N端到C端依次排列的碱性标签编码基因序列、断裂Intein的C端部分即Int(C)编码基因序列以及目的蛋白编码基因序列。
优选的,所述碱性标签编码基因序列与Intein编码基因序列之间可以直接连接,也可以采用GGGGS或GGSG及其重复等柔性肽端连接。
优选的,步骤(1)中,所述目的蛋白表达单元的序列还包括两端的酶切位点序列。
优选的,步骤(1)中,所述表达质粒为适用于原核或真核表达***的质粒。
更优选的,所述表达质粒为采用T7、lac、tac、araBAD、FLD1、AOX1、GAP、CMV、E1α等启动子的适用于原核或真核表达***的质粒。
最优选的,所述表达质粒为pET30a。
在本发明的一个较优实施例中,所述目的蛋白表达序列***到pET30a原核表达载体的限制性酶切位点之间。更优的,所述目的蛋白表达单元序列***到pET30a原核表达载体的NdeI酶和XhoI酶的限制性酶切位点之间。
较优的,步骤(1)具体为将目的蛋白表达单元通过酶切、连接的方法***pET30a原核表达载体,连接产物转化Top10感受态细胞,筛选正确连接的载体作为构建成功的目的蛋白表达载体。
所述筛选为采用添加有卡那霉素(Kana)的LB培养基选择培养转化了连接产物的感受态细胞,挑取单克隆进行测序分析,验证连接产物正确连入了pET30a原核表达载体。
优选的,步骤(1)中所述目的蛋白为白介素-15,所述白介素-15的编码基因序列如SEQIDNO.3所示,具体为:
CGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAAC。
在本发明的一个优选实施例中,所述目的蛋白表达单元的序列如SEQIDNO.4所示,具体为:
ATGGTTGATAACAAATTTAACAAAGAACGTCGCCGTGCTCGTCGTGAAATCCGTCATCTGCCGAATCTGAATCGTGAACAGCGTCGTGCGTTTATTCGTAGCCTGCGCGATGACCCGTCACAAAGCGCAAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGATGCCCAACCGAAAGCCCTCGCAGAGGGCACTCGGATCTTCGATCCGGTCACCGGTACAACGCATCGCATCGAGGATGTTGTCGgtGGGCGCAAGCCTATTCATGTCGTGGCTGCTGCCAAGGACGGAACGCTGCATGCGCGGCCCGTGGTGTCCTGGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCGGGTTGCGGATCGCCGGTGGCGCCATCctgtgGGCGACACCCGATCACAAGGTGCTGACAGAGTACGGCTGGCGTGCCGCCGGGGAACTCCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCGACGCTTCGATGGATTCGGTGACAGTGCGCCGATTCCGGCGCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAACCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAACTAATAATAA。
优选的,步骤(2)中,所述宿主***选自真核表达***或原核表达***。
进一步优选的,所述宿主***包括真核表达***,例如哺乳动物细胞,昆虫细胞,酵母等;原核表达***,例如大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌等。
更优选的,所述宿主***为为大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。
优选的,步骤(2)中,所述培养是将单菌落接种于添加有Kana+的LB液体培养基中,37℃200rpm培养12小时,作为种子菌;取种子菌接种于新鲜的培养基37℃培养至合适菌密度后,加诱导剂,在20℃~37℃温度下继续培养12~20h。
优选的,步骤(3)中,所述离子交换层析具体方法是采用含有酸性基团、磺酸基-SO3H、羧基-COOH等的凝胶介质,例如SPSehparose,CMSepharose,CaptoS,MonoS等,对目的融合蛋白进行有选择的吸附和洗脱,以达到富集与纯化的作用。
优选的,步骤(4)中,所述适当的条件是指适合Intein发挥自剪接或自断裂功能的合适的外部条件,如溶液pH值,温度,巯基试剂等。
更优选的,所述适当的条件是指在pH6.5、温度25℃,孵育2-24小时。
优选的,步骤(5)中,所述离子交换层析具体方法是由于目的蛋白的等电点较低,采用Q或DEAE阴离子交换层析能够特异性吸附目的蛋白,而不吸附带有碱性标签的蛋白组分,从而实验目的蛋白的纯化与富集。
本发明第二方面公开了前述的方法在表达纯化生物大分子目的蛋白中的用途。
优选的,所述小分子目的蛋白包括细胞因子、酶、抗菌肽、抗体或抗体片段等各种基因重组药物产品。更优选为白介素。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1)该方法所采用的标签和intein***,与目的蛋白单独表达的传统技术相比,能够克服目的蛋白在原核表达***易形成包涵体的缺点,使目的蛋白实现可溶性表达,方便后续纯化;
2)本发明与常见的亲和标签和蛋白酶组合的技术相比,能够免除外源性蛋白酶的使用,降低成本,简化纯化步骤;
3)本发明与亲和标签和intein的组合相比,能够避免亲和标签如His的融合蛋白易形成包涵体的现象,以及避免分子量较大的亲和标签如MBP等对intein构象和功能的影响。
图1是层析标签融合在顺式intein的N-末端,目的蛋白融合在intein的C-末端的蛋白表达纯化技术示意图。
图2是层析标签融合在顺式intein的C-末端,目的蛋白融合在intein的N-末端的蛋白表达纯化技术示意图。
图3是层析标签融合在反式intein的Int(C)的N-末端,目的蛋白融合在Int(C)的C-末端的蛋白表达纯化技术示意图。
图4是采用本发明技术以一种白介素Interleukin为目的蛋白进行表达量的优化。A图为Interleukin单独表达,其分子量约12kDa,从SDS-PAGE难以看到箭头所指位置的明显条带,表达量很低,只能通过Western进行鉴定;B图为采用本发明方法融合表达Zbasic-intein-interleukin,分子量约37kDa,箭头指示位置在诱导3小时后样品中有非常浓的融合蛋白条带,与Western显色条带大小一致。从图中看出融合表达后目的蛋白表达量大幅提高。
图5是采用His作为亲和标签,His-intein-interleukin融合蛋白的可溶性表达情况。M:蛋白质分子量标准;1:大肠杆菌BL21(DE3)诱导前全菌蛋白;2:诱导4h后全菌蛋白;3:细胞破碎后上清中可溶性蛋白;4:细胞破碎沉淀中包涵体。从图中可见,融合蛋白全部为不可溶的包涵体形式。
图6是采用本发明技术以Zbasic作为纯化标签,Zbasic-intein-interleukin融合表达可溶性的Western鉴定。M:蛋白质分子量标准;PC:Peprotech标准品0.3ug;1:大肠杆菌BL21(DE3)细胞破碎包涵体;2:细胞破碎上清可溶性蛋白。与图5相比,Zbasic-intein标签明显提高了融合蛋白的可溶性。
图7是本发明技术采用Zbasic标签利用阳离子交换层析纯化融合蛋白的层析图及电泳鉴定。M:蛋白质分子量标准;Z0:大肠杆菌BL21(DE3)细胞破碎液;FL:流穿;Z1-Z4:不同盐浓度下洗脱的蛋白;箭头指向融合蛋白。该图是对应于实施例2的实验结果,说明采用阳离子交换层析能够实现融合蛋白的初步纯化和富集。
图8是采用本发明技术将融合蛋白孵育发挥intein活性释放Interleukin的Western鉴定图。M:蛋白质分子量标准;0-24:融合蛋白在pH6.5,25度孵育时间(小时)。箭头指向的融合蛋白逐渐减少,而释放出来的单独Interleukin逐渐增多。该图是对应于实施例2的实验结果,说明通过intein的自断裂功能,能够实现碱性标签和intein与目的蛋白的特异性分离。
图9是采用亲和标签MBP和inteinΔI-CM联用,用直链淀粉层析纯化融合蛋白并进行intein断裂的电泳及Western鉴定。M:蛋白质分子量标准;1:大肠杆菌BL21(DE3)细胞破碎上清液,即可溶性蛋白;2:细胞破碎沉淀,即包涵体;3:流穿;4、5:25度孵育过夜从层析介质脱落的蛋白;6:层析介质用10mM麦芽糖洗脱的蛋白。箭头指向融合蛋白。该图是对应于实施例3的实验结果,说明MBP和intein联合标签能够实现融合蛋白的可溶性表达及纯化,但是过夜孵育只观察到部分来自于菌体的MBP蛋白的脱落,未观察到目的蛋白,即intein未发挥自断裂功能。分析原因,可能是由于MBP的分子量较大,约42kDa,或其结构对intein的空间结构造成了阻碍。该图从另一个侧面说明本发明中的碱性标签与intein联合具有较现有策略具有优势。
图10是采用亲和标签CBD和SspDnaBintein联用,表达融合蛋白的可溶性情况。M:蛋白质分子量标准;1:诱导前大肠杆菌BL21(DE3)细胞破碎沉淀,即包涵体蛋白;2:诱导前细胞破碎上清,即可溶性蛋白;3:25度0.1mM的IPTG诱导沉淀;4:25度0.1mM的IPTG诱导上清;5:25度0.5mM的IPTG诱导沉淀;6:25度0.5mM的IPTG诱导上清;7:25度1mM的IPTG诱导沉淀;8:25度1mM的IPTG诱导上清;9:37度0.1mM的IPTG诱导沉淀;10:37度0.1mM的IPTG诱导上清;11:37度0.5mM的IPTG诱导沉淀;12:37度0.5mM的IPTG诱导上清;13:37度1mM的IPTG诱导沉淀;14:37度1mM的IPTG诱导上清。该图是对应于实施例4的实验结果,说明CBD和SspDnaBintein联合标签能够提高融合蛋白的表达量,但不能提高可溶性。该图从另一个侧面说明本发明中的碱性标签与intein联合具有较现有策略具有优势。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,Secondedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989andThirdedition,2001;Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates;theseriesMETHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego,1998;METHODSINENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,SanDiego,1999;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)HumanaPress,Totowa,1999等。
下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。
实施例1His与ΔI-CM融合表达Interleukin
本实验中采用His基因序列为如SEQIDNO.5所示,具体为:
CACCATCATCATCATCAT。根据JBacteriol(1991)173(18):5653-5662和BiotechnolProg,2000,16:1055-1063的信息得到MtuRecAintein经过改造的形式ΔI-CM,所述ΔI-CM的编码基因序列如SEQIDNO.2所示)。ΔI-CM是目前研究最多的intein之一,其活性在pH6.0-6.5时最高,具有C-端断裂活性,因此可以将融合表达在C端的目的蛋白Interleukin(白介素)单独释放,得到Zbasic-Intein与Interleukin两部分。所述Interleukin(白介素-15)的编码基因序列如SEQIDNO.3所示。
将His和ΔI-CM及Interleukin的基因通过桥式PCR的方法克隆连接到一起,所得到的His-ΔI-CM-Interleukin从N端到C端依次排列为His编码基因序列、ΔI-CM编码基因序列以及Interleukin编码基因序列,所述His-ΔI-CM-Interleukin的序列如SEQIDNO.6所示,具体为ATGCACCATCATCATCATCATGCCCTCGCAGAGGGCACTCGGATCTTCGATCCGGTCACCGGTACAACGCATCGCATCGAGGATGTTGTCGgtGGGCGCAAGCCTATTCATGTCGTGGCTGCTGCCAAGGACGGAACGCTGCATGCGCGGCCCGTGGTGTCCTGGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCGGGTTGCGGATCGCCGGTGGCGCCATCctgtgGGCGACACCCGATCACAAGGTGCTGACAGAGTACGGCTGGCGTGCCGCCGGGGAACTCCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCGACGCTTCGATGGATTCGGTGACAGTGCGCCGATTCCGGCGCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAACCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAACTAATAATAA。
然后通过酶切连接的方法将His-ΔI-CM-Interleukin***到原核表达载体pET30a的NdeI酶和XhoI酶之间,得到表达载体pET30a/Zbasic-Intein-Interleukin。通过测序验证载体构建正确后,将质粒按照碱裂解法抽提并转化表达宿主菌BL21(DE3)。
将含有重组质粒pET30a/His-Intein-Interleukin的表达宿主菌单菌落接种于Kana+的LB液体培养中,37℃200rpm培养12小时,作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种与无菌的Kana+LB培养基中,37℃200rpm培养3小时,将温度调到20℃培养4小时。将2L诱导后的菌液进行离心收菌,用100mL50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬菌体,然后细胞破碎。将裂解菌液4000g离心30分钟分离上清和沉淀,并将沉淀用去离子水或PBS重悬至离心前体积,对表达产物进行SDS-PAGE分析。
结果如图5所示,采用His作为亲和标签,His-intein-interleukin融合蛋白的可溶性。M:蛋白质分子量标准;1:大肠杆菌BL21(DE3)诱导前全菌蛋白;2:诱导4h后全菌蛋白;3:细胞破碎后上清中可溶性蛋白;4:细胞破碎沉淀中包涵体。
从图5中可见,融合蛋白全部为不可溶的包涵体形式。
实施例2Zbasic与ΔI-CM融合标签表达Interleukin
(1)Zbasic与ΔI-CM融合标签表达载体和宿主菌的构建
根据文献JChromatogrA(2002)942(1-2):157-66报道的信息将Zbasic的DNA序列全基因合成(南京金斯瑞公司),所述Zbasic的编码基因序列如SEQIDNO.1所示。
根据JBacteriol(1991)173(18):5653-5662和BiotechnolProg,2000,16:1055-1063的信息得到MtuRecAintein经过改造的形式ΔI-CM,所述ΔI-CM的编码基因序列如SEQIDNO.2所示。ΔI-CM是目前研究最多的intein之一,其活性在pH6.0-6.5时最高,具有C-端断裂活性,因此可以将融合表达在C端的目的蛋白Interleukin(白介素)单独释放,得到Zbasic-Intein与Interleukin两部分。所述Interleukin(白介素-15)的编码基因序列如SEQIDNO.3所示。
将Zbasic和ΔI-CM及Interleukin的基因通过桥式PCR的方法克隆连接到一起,所得到的Zbasic-ΔI-CM-Interleukin从N端到C端依次排列为Zbasic编码基因序列、ΔI-CM编码基因序列以及Interleukin编码基因序列,所述Zbasic-ΔI-CM-Interleukin的序列如SEQIDNO.4所示。
然后通过酶切连接的方法将Zbasic-ΔI-CM-Interleukin***到原核表达载体pET30a,得到表达载体pET30a/Zbasic-Intein-Interleukin。通过测序验证载体构建正确后,将质粒按照碱裂解法抽提并转化表达宿主菌BL21(DE3)。
(2)重组Zbasic-Intein-Interleukin的表达与纯化
将含有重组质粒pET30a/Zbasic-Intein-Interleukin的表达宿主菌单菌落接种于Kana+的LB液体培养中,37℃200rpm培养12小时,作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种与无菌的Kana+LB培养基中,37℃200rpm培养3小时,将温度调到20℃培养12小时。将2L诱导后的菌液进行离心收菌,用100mL50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬菌体,然后细胞破碎。将裂解菌液4000g离心30分钟或直接过滤,去除不溶性的菌体蛋白。
SPSepharose阳离子交换层析柱经过50mMPB,20mMNaCl,2mMEDTA,pH8.0平衡后,将上述上清液进行吸附及洗脱,得到纯化的融合蛋白Zbasic-Intein-Interleukin。将洗脱蛋白调至pH6.0,在25度孵育过夜后,目的蛋白被释放。由于目的蛋白Interleukin的等电点较低,pI<5,因此采用QSepharose阴离子交换层析,目的蛋白被纯化和富集。
(3)对照:单独表达Interleukin
按照文献BiotechnolProg.(2012)28(2):497-507所报道方法,将人IL-15序列***到原核表达载体pET28b,得到表达载体pET28b/Interleukin,通过测序验证载体构建正确后,将质粒按照碱裂解法抽提并转化表达宿主菌BL21(DE3)。将含有重组质粒pET28b/Interleukin的表达宿主菌单菌落接种于Kana+的LB液体培养中,37℃200rpm培养12小时,作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种与无菌的Kana+LB培养基中,37℃200rpm培养3小时,加入1mMIPTG诱导3小时,收集菌液并离心,将菌体沉淀按照10%浓度重悬到50mMTris-HCl,20mMEDTA,100mMNaCl,pH7.4的缓冲液中,高压裂解细胞。裂解菌液16000g离心30分钟分离上清和沉淀,进行SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况。
(4)结果分析:
对表达量进行分析,结果如图4所示,左图为:Interleukin目的蛋白Interleukin单独表达,其分子量约12kDa,从SDS-PAGE难以看到箭头所指位置的明显条带,表达量很低,约占总蛋白的0.3%左右;右图为采用本发明方法融合表达Zbasic-intein-interleukin,分子量约37kDa,箭头指示位置在诱导3小时后样品中有非常浓的融合蛋白条带,从图中看出融合表达后目的蛋白表达量大幅提高,经灰度扫描分析,约占总蛋白的10%。
对可溶性进行分析,结果如图6所示,Zbasic-intein-interleukin融合表达可溶性的Western鉴定。M:蛋白质分子量标准;PC:Peprotech标准品0.3ug;1:大肠杆菌BL21(DE3)细胞破碎包涵体;2:细胞破碎上清可溶性蛋白。与图5相比,Zbasic-intein标签明显提高了融合蛋白的可溶性。
实施例3MBP与ΔI-CM融合标签表达Interleukin
(1)MBP与ΔI-CM融合标签表达载体和宿主菌的构建
从NEB公司(NewEnglandBiolabs)的载体pMAL-p2X克隆得到MBP的基因表达序列,所述MBP的编码基因序列如SEQIDNO.7所示,具体为:
ATGAAAATAAAAACAGGTGCACGCATCCTCGCATTATCCGCATTAACGACGATGATGTTTTCCGCCTCGGCTCTCGCCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACT。
将MBP和ΔI-CM及Interleukin的基因通过桥式PCR的方法克隆连接到一起,所得到的MBP-ΔI-CM-Interleukin从N端到C端依次排列为MBP编码基因序列、ΔI-CM编码基因序列以及Interleukin编码基因序列,所述MBP-ΔI-CM-Interleukin的序列如SEQIDNO.8所示。
然后通过酶切连接的方法将MBP-ΔI-CM-Interleukin***到原核表达载体pET30a,得到表达载体pET30a/MBP-Intein-Interleukin。通过测序验证载体构建正确后,将质粒按照碱裂解法抽提并转化表达宿主菌BL21(DE3),具体为:
ATGAAAATAAAAACAGGTGCACGCATCCTCGCATTATCCGCATTAACGACGATGATGTTTTCCGCCTCGGCTCTCGCCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTGCCCTCGCAGAGGGCACTCGGATCTTCGATCCGGTCACCGGTACAACGCATCGCATCGAGGATGTTGTCGgtGGGCGCAAGCCTATTCATGTCGTGGCTGCTGCCAAGGACGGAACGCTGCATGCGCGGCCCGTGGTGTCCTGGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCGGGTTGCGGATCGCCGGTGGCGCCATCctgtgGGCGACACCCGATCACAAGGTGCTGACAGAGTACGGCTGGCGTGCCGCCGGGGAACTCCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCGACGCTTCGATGGATTCGGTGACAGTGCGCCGATTCCGGCGCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAACCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAACTAATAATAA。
(2)重组MBP-Intein-Interleukin的表达与纯化
将含有重组质粒pET30a/MBP-Intein-Interleukin的表达宿主菌单菌落接种于Kana+的LB液体培养中,37℃200rpm培养12小时,作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种与无菌的Kana+LB培养基中,37℃200rpm培养3小时,将温度调到20℃培养12小时。将2L诱导后的菌液进行离心收菌,用20mMTris-HCl,200mMNaCl,1mMEDTA,1mMDTT,pH8.5缓冲液重悬菌体,然后细胞破碎。将裂解菌液4000g离心30分钟分离可溶性与不可溶性蛋白。可溶性部分在20mMTris-HCl,200mMNaCl,1mMEDTA,1mMDTT,pH8.5条件下与直链淀粉层析介质亲和,经过25度20mMTris-HCl,200mMNaCl,1mMEDTA,1mMDTT,pH6.0过夜孵育后将从介质脱落的蛋白收集,并进一步用20mMTris-HCl,200mMNaCl,1mMEDTA,1mMDTT,10mMmatlose,pH8.5将层析介质上的蛋白洗脱。根据图9所示的结果,MBP-ΔI-CM可以实现融合蛋白的可溶性表达及纯化,但是intein未发挥自断裂的功能,无法得到目的蛋白。
实施例4CBD与SspDnaB融合标签表达Interleukin
从NEB公司(NewEnglandBiolabs)的载体载体pTWIN1含有几丁质亲和标签CBD和inteinSspDnaB,将Interleukin的基因通过酶切连接的方法***到pTWIN1的NcoI酶和PstI酶之间,得到表达载体pTWIN/CBD-SspDnaB-Interleukin。通过测序验证载体构建正确后,将质粒按照碱裂解法抽提并转化表达宿主菌BL21(DE3)。将含有重组质粒pTWIN/CBD-SspDnaB-Interleukin的表达宿主菌单菌落接种于Amp+的LB液体培养中,37℃200rpm培养12小时,作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种与无菌的Amp+LB培养基中,37℃200rpm培养3小时,将温度调到25℃或37℃,加入0.1mM、0.5mM、或1mMIPTG培养8小时,SDS-PAGE观察融合蛋白的表达情况。根据图10的结果,37℃诱导的表达量较高,但在所考察条件下,融合蛋白均以不可溶形式表达。
Claims (9)
1.一种表达纯化目的蛋白的方法,所述方法具体包括如下步骤:
(1)构建目的蛋白表达载体:将目的蛋白编码基因序列与具有自剪接功能的Intein编码基因序列以及碱性标签编码基因序列融合后获得目的蛋白表达单元,并将所述目的蛋白表达单元***表达质粒上,构建获得目的蛋白表达载体;
(2)将步骤(1)中所得目的蛋白表达载体转化宿主***,获得转化的宿主,并在表达条件下,培养转化的宿主,从而表达由目的蛋白、碱性标签、Intein组成的融合蛋白;
(3)去除不溶性物质并采用离子交换层析法分离由目的蛋白、碱性标签、Intein组成的融合蛋白;
(4)将步骤(3)所得融合蛋白在适当的条件下孵育,进行切割,将目的蛋白从融合蛋白中释放到溶液中;
(5)分离目的蛋白和碱性标签:将步骤(4)中所得溶液进行离子交换层析及后续精制纯化步骤,洗脱得到目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述碱性标签为pI>7的各类超碱性蛋白或多肽,包括但不限于Zbasic,Zbasic2。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述Intein包括具有自剪接或自我断裂功能的已知各类Intein的顺式及反式剪接形式。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述目的蛋白表达单元的序列还包括以下特征中的任一项:
a)所述目的蛋白表达单元的序列含有从N端到C端依次排列的碱性标签编码基因序列、Intein编码基因序列以及目的蛋白编码基因序列;
b)所述目的蛋白表达单元的序列含有从N端到C端依次排列的目的蛋白编码基因序列、Intein编码基因序列以及碱性标签编码基因序列;
c)所述目的蛋白表达单元的序列含有两个阅读框,分别是断裂Intein的N端部分,即Int(N);从N端到C端依次排列的碱性标签编码基因序列、断裂Intein的C端部分即Int(C)编码基因序列以及目的蛋白编码基因序列。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述表达质粒为适用于原核或真核表达***的质粒。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述宿主***选自真核表达***或原核表达***。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述适当的条件是指适合Intein发挥自剪接或自断裂功能的合适的外部条件。
8.如权利要求1-8任一权利要求所述的方法在表达纯化生物大分子目的蛋白中的用途。
9.根据权利要求9所述的用途,其特征在于,所述目的蛋白为基因重组药物产品,具体包括细胞因子、酶、抗菌肽、抗体或抗体片段。
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