CN109943556A

CN109943556A - 一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法

Info

Publication number: CN109943556A
Application number: CN201910232310.9A
Authority: CN
Inventors: 杨胜远; 韦锦
Original assignee: Lingnan Normal University
Current assignee: Lingnan Normal University
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN109943556B

Abstract

本发明涉及一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，该制备方法为：甘蔗髓→粉碎→筛分→甘蔗髓粉→用水充分浸泡→滤除水份→加入浓磷酸(体积百分比＞85％)→搅拌均匀分散→冰浴1～2h(间歇拌)→滤除不溶物→收集滤浆→加入冰水稀释→常温搅拌0.5～1h→充分沉淀→过滤或离心→收集沉淀→用水洗涤沉淀3次→用水重悬沉淀→用Na₂CO₃或NaOH溶液调节悬浊液→过滤或离心→收集沉淀→用水洗涤沉淀5次→过滤或离心→收集沉淀→磷酸改性甘蔗髓不溶性载体，该方法采用磷酸对甘蔗髓进行改性，制备可高效亲和吸附纤维素结合域融合酶固定化载体，解决了甘蔗髓综合利用提升附加值的问题，又解决了酶工程固定化载体短缺的问题。

Description

一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，属于酶工程领域。

背景技术

甘蔗渣是制糖工业的主要废弃物(占24％～27％)。南方蔗区甘蔗总产量7000多万吨，每年产生的甘蔗渣产量约为2000多万吨。在甘蔗渣的综合利用方面，长甘蔗渣部分(主要为甘蔗的皮质部分)常用于造纸，而短纤维和细粉部分(主要为甘蔗芯部分，称为甘蔗髓，Sugarcane pulp，SP)不能作为造纸原料，常采用投放到锅炉中进行燃烧处理，或者将其降解制备成低聚木糖。甘蔗髓中的细胞形态是近似圆形的，不具备纤维形态(长宽比大于100)，而且很容易破碎。关于甘蔗髓吸水性海绵材料的制备及甘蔗髓与其他有机物接枝共聚方面的研究都有相关的报道，但是都未对甘蔗髓进行充分综合利用。因此，如何对甘蔗髓进行有效利用，提升蔗髓的附加值，一直是制糖工业亟需解决的热点问题。

由于甘蔗渣的纤维素和半纤维素含量较高、来源丰富、价廉，难溶并可化学改性，故理论上将是固定化酶的良好载体。然而，甘蔗渣的吸附性不强，固定化酶易脱落，缺乏特异性，难以克服杂蛋白或其它杂质的干扰，效果不理想。必须对甘蔗渣进行改性，才有望获得改善。

大多数纤维素降解酶包含三个结构域：纤维素结合结构域(cellulose-bindingdomain，CBD)、柔性连接区域和催化结构域。由于CBD可与纤维素特异和不可逆结合，在酶工程领域常将CBD作为亲和标签，构建融合酶，采用纤维素作为不溶性载体制备固定化酶。现有报道主要采用微晶纤维素进行改性制备不溶性固定化载体，成本较高，难以满足现有工业生产需要。开发成本低适合工业生产的载体，有利于工业化生产发展，尤其是采用甘蔗髓来制备，不仅成本低，还为甘蔗髓的综合利用提供了新的途径。目前还未见有用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方面的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，该方法采用磷酸对甘蔗髓进行改性，制备可高效亲和吸附纤维素结合域融合酶固定化载体，既解决了甘蔗髓综合利用提升附加值的问题，又解决了酶工程固定化载体短缺的问题。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

该制备方法所采用的技术路线为：

甘蔗髓→粉碎→用筛子筛分→甘蔗髓粉→用水充分浸泡→滤除水份→加入浓磷酸→搅拌均匀分散→冰浴(间歇拌)→滤除不溶物→收集滤浆→加入冰水稀释→常温搅拌→充分沉淀→过滤或离心→收集沉淀→用水充分洗涤沉淀→用水重悬沉淀→用Na₂CO₃或NaOH溶液调节悬浊液pH接近中性→过滤或离心→收集沉淀→用水充分洗涤沉淀→过滤或离心→收集沉淀→磷酸改性甘蔗髓不溶性载体；

其制备方法的具体步骤如下：

(1)将甘蔗髓采用粉碎机进行粉碎，采用目数为60目的筛子进行筛分，收集筛过物(细粉)，称为甘蔗髓粉；

(2)将甘蔗髓粉用4～6倍质量的水浸泡5～10h，滤除水分，获得湿甘蔗髓粉；

(3)冰浴条件下，在湿甘蔗髓粉中边搅拌边缓慢加入其质量40～60倍的已于-5～-10℃预冻的浓磷酸，继续在冰浴下间歇搅拌1～2h，直至混合物变透明；

(4)采用80或100目的不锈钢网筛滤除不溶物，获得甘蔗髓浆；

(5)常温搅拌下缓慢加水将甘蔗髓浆稀释40～60倍，继续间歇搅拌0.5～1h，使甘蔗髓充分沉淀，抽滤，收集甘蔗髓沉淀；

(6)在甘蔗髓沉淀中加入其20～30倍质量的水，搅拌重悬，再抽滤，收集甘蔗髓沉淀，如此重复洗涤3次，以洗除磷酸；

(7)在甘蔗髓沉淀中加入其20～30倍质量的水，搅拌重悬，用2mol/L Na₂CO₃或1mol/L NaOH溶液调节悬浊液pH接近中性，中和残余的磷酸，抽滤收集甘蔗髓沉淀；

(8)按照步骤(6)用水重复洗涤甘蔗髓沉淀5次，收集沉淀，即为磷酸改性甘蔗髓不溶性载体。

步骤(3)所述浓磷酸为市售浓磷酸，磷酸浓度大于85％。

步骤(2)、(5)、(6)、(7)、(8)所述水可为自来水、去离子水、蒸馏水或工业处理软水，优选去离子水、蒸馏水或工业处理软水。

本发明的有益效果是：本发明主要采用磷酸对甘蔗髓进行改性，制备出可高效亲和吸附纤维素结合域融合酶固定化载体，既解决了甘蔗髓综合利用提升附加值的问题，又解决了酶工程固定化载体短缺的问题。

附图说明

图1是不同粒度的甘蔗髓对改性甘蔗髓不溶性载体得率的影响；其中，PAMSP为Phosphoric acid modified sugarcane pulp的缩写，表示磷酸改性甘蔗髓；PAMSP得率(％)以PAMSP与初始甘蔗髓原料的质量百分比表示；

图2是不同改性温度对改性甘蔗髓不溶性载体得率的影响；其中，PAMSP为Phosphoric acid modified sugarcane pulp的缩写，表示磷酸改性甘蔗髓；PAMSP得率(％)以PAMSP与初始甘蔗髓原料的质量百分比表示；

图3是不同磷酸浓度对改性甘蔗髓不溶性载体得率的影响；其中，PAMSP为Phosphoric acid modified sugarcane pulp的缩写，表示磷酸改性甘蔗髓；PAMSP得率(％)以PAMSP与初始甘蔗髓原料的质量百分比表示；

图4是不同改性时间对改性甘蔗髓不溶性载体得率的影响；其中，PAMSP为Phosphoric acid modified sugarcane pulp的缩写，表示磷酸改性甘蔗髓；PAMSP得率(％)以PAMSP与初始甘蔗髓原料的质量百分比表示；

图5是不同固定化载体对纤维素结合域谷氨酸脱羧酶的固定化效果；其中，SP为Sugarcane pulp的缩写，表示未经过改性的甘蔗髓；PAMSP为Phosphoric acid modifiedsugarcane pulp的缩写，表示磷酸改性甘蔗髓；RAC为regenerated amorphous cellulose的缩写，表示由微晶纤维素改性获得的再生无定形纤维素；相对酶活(％)是以RAC固定化的纤维素结合域谷氨酸脱羧酶的酶活力为100％计算的相对酶活力。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明，这些说明仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将甘蔗髓采用粉碎机进行粉碎，采用60目的筛子进行筛分，收集筛过物(细粉)，称为甘蔗髓粉；

(2)将甘蔗髓粉用4倍质量的水浸泡5h，滤除水分，获得湿甘蔗髓粉；

(3)冰浴条件下，在湿甘蔗髓粉中边搅拌边缓慢加入其质量40倍的已于-5～-10℃预冻的浓磷酸，继续在冰浴下间歇搅拌2h，直至混合物变透明；

(4)采用大于80目的不锈钢网筛滤除不溶物，获得甘蔗髓浆；

(5)常温搅拌下缓慢加水将甘蔗髓浆稀释40倍，继续间歇搅拌1h，使甘蔗髓充分沉淀，抽滤，收集甘蔗髓沉淀；

(6)在甘蔗髓沉淀中加入其20倍质量的水，搅拌重悬，再抽滤，收集甘蔗髓沉淀，如此重复洗涤3次，以洗除磷酸；

(7)在甘蔗髓沉淀中加入其20倍质量的水，搅拌重悬，用2mol/L Na₂CO₃溶液调节悬浊液pH接近中性，中和残余的磷酸，抽滤收集甘蔗髓沉淀；

实施例2

(1)将甘蔗髓采用粉碎机进行粉碎，采用80目的筛子进行筛分，收集筛过物(细粉)，称为甘蔗髓粉；

(2)将甘蔗髓粉用5倍质量的水浸泡8h，滤除水分，获得湿甘蔗髓粉；

(3)冰浴条件下，在湿甘蔗髓粉中边搅拌边缓慢加入其质量50倍的已于-5～-10℃预冻的浓磷酸，继续在冰浴下间歇搅拌1h，直至混合物变透明；

(4)采用80目的不锈钢网筛滤除不溶物，获得甘蔗髓浆；

(5)常温搅拌下缓慢加水将甘蔗髓浆稀释约50倍，继续间歇搅拌0.5h，使甘蔗髓充分沉淀，抽滤，收集甘蔗髓沉淀；

(6)在甘蔗髓沉淀中加入其30倍质量的水，搅拌重悬，再抽滤，收集甘蔗髓沉淀，如此重复洗涤3次，以洗除磷酸；

(7)在甘蔗髓沉淀中加入其30倍质量的水，搅拌重悬，用1mol/L NaOH溶液调节悬浊液pH接近中性，中和残余的磷酸，抽滤收集甘蔗髓沉淀；

实施例3

(2)将甘蔗髓粉用6倍质量的水浸泡6h，滤除水分，获得湿甘蔗髓粉；

(3)冰浴条件下，在湿甘蔗髓粉中边搅拌边缓慢加入其质量60倍的已于-5～-10℃预冻的浓磷酸，继续在冰浴下间歇搅拌1.5h，直至混合物变透明；

(4)采用100目的不锈钢网筛滤除不溶物，获得甘蔗髓浆；

(5)常温搅拌下缓慢加水将甘蔗髓浆稀释60倍，继续间歇搅拌0.8h，使甘蔗髓充分沉淀，抽滤，收集甘蔗髓沉淀；

(6)在甘蔗髓沉淀中加入其25倍质量的水，搅拌重悬，再抽滤，收集甘蔗髓沉淀，如此重复洗涤3次，以洗除磷酸；

(7)在甘蔗髓沉淀中加入其25倍质量的水，搅拌重悬，用2mol/L Na₂CO₃溶液调节悬浊液pH接近中性，中和残余的磷酸，抽滤收集甘蔗髓沉淀；

实施例4

(2)将甘蔗髓粉用5.5倍质量的水浸泡6h，滤除水分，获得湿甘蔗髓粉；

(3)冰浴条件下，在湿甘蔗髓粉中边搅拌边缓慢加入其质量55倍的已于-5～-10℃预冻的浓磷酸，继续在冰浴下间歇搅拌2h，直至混合物变透明；

(4)采用100目的不锈钢网筛滤除不溶物，获得甘蔗髓浆；

(5)常温搅拌下缓慢加水将甘蔗髓浆稀释55倍，继续间歇搅拌0.6h，使甘蔗髓充分沉淀，抽滤，收集甘蔗髓沉淀；

(6)在甘蔗髓沉淀中加入其28倍质量的水，搅拌重悬，再抽滤，收集甘蔗髓沉淀，如此重复洗涤3次，以洗除磷酸；

(7)在甘蔗髓沉淀中加入其28倍质量的水，搅拌重悬，用1mol/L NaOH溶液调节悬浊液pH接近中性，中和残余的磷酸，抽滤收集甘蔗髓沉淀；

本发明申请的主要研究结果示例：

1.不同粒度的甘蔗髓对改性甘蔗髓不溶性载体得率的影响

分别以粒径为20～40目、40～60目、60～80目和80目以下的甘蔗髓作为原料进行磷酸改性，制备的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率如附图1，结果表明随着粒度减小，磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率增加，其原因主要为粒度越小越容易溶解于浓磷酸；粒度越小，原料粉碎难度加大，成本将增高，从附图1可见，当初始甘蔗髓的粒度小于60目时，磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率较高，得率达到了93.46％以上，粒度继续减小，得率增加不显著，因此优选60目筛过物(即粒度小于60目)作为初始原料。

2.不同改性温度对改性甘蔗髓不溶性载体得率的影响

分别在冰浴、30℃、60℃和90℃采用浓磷酸对60目筛过物进行改性，制备的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率如附图2，结果表明在冰浴下，甘蔗髓最易溶于浓磷酸，磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率较高，得率达到了92.89％以上，30～90℃之间却呈现随着温度升高而得率增加的趋势，但90℃高温改性的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率仍显著低于冰浴，因此优选冰浴改性。

3.不同磷酸浓度对改性甘蔗髓不溶性载体得率的影响

在冰浴下，分别采用体积分数为50％、60％、70％和85％浓磷酸(市售浓磷酸，以85％计)对60目筛过物进行改性，制备的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率如附图3，结果表明随着磷酸的浓度增加，磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率也增加，采用85％浓磷酸改性的得率最高，达到了94.38％以上，因此优选85％以上的浓磷酸改性。

4.不同改性时间对改性甘蔗髓不溶性载体得率的影响

采用85％浓磷酸分别冰浴0.5h、1h、2h，间歇搅拌，对60目筛过物进行改性，结果如附图4。结果表明冰浴0.5h，磷酸不溶物相对较多，冰浴1h以上，磷酸不溶物显著减少，制备的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率相对较高，研究表明不同批次粉碎的甘蔗髓的粒度分布存在一定差异，改性时间也略有偏差，但当冰浴1～2h，混合液基本均可呈现透明的悬浮液状态，继续增加冰浴时间，不溶物溶解不显著，因此从成本考虑，优选改性时间为1～2h。在此范围内，磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的得率基本都可达到91.44％以上。

5.磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的应用效果

以纤维素结合域谷氨酸脱羧酶(Cellulose-Binding Domain-GlutamateDecarboxylase，CBD-GAD)粗酶液为酶源，分别以未经过改性的甘蔗髓(Sugarcane pulp，SP)、磷酸改性甘蔗髓(Phosphoric acid modified sugarcane pulp，PAMSP)、以微晶纤维素改性获得的再生无定形纤维素(regenerated amorphous cellulose，RAC)为不溶性固定化载体，对不同固定化载体对纤维素结合域谷氨酸脱羧酶的固定化效果进行实验。结果如附图5，结果表明采用本专利方法制备的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体(PAMSP)作为固定化载体，对纤维素结合域融合酶的亲和吸附性强，固定化效果较好，与以微晶纤维素改性获得的再生无定形纤维素(RAC)的固定化能力相当，显著优于未经改性的甘蔗髓(SP)。微晶纤维素价格较贵，而甘蔗髓为废弃物，价格低廉，开发为纤维素结合域融合酶固定化载体具有显著优势。

Claims

1.一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：

甘蔗髓→粉碎→筛分→甘蔗髓粉→用水充分浸泡→滤除水份→加入体积百分比＞85％的浓磷酸→搅拌均匀分散→冰浴1～2h→滤除不溶物→收集滤浆→加入冰水稀释→常温搅拌0.5～1h→充分沉淀→过滤或离心→收集沉淀→用水洗涤沉淀3次→用水重悬沉淀→用Na₂CO₃或NaOH溶液调节悬浊液pH接近中性→过滤或离心→收集沉淀→用水洗涤沉淀5次→过滤或离心→收集沉淀→磷酸改性甘蔗髓不溶性载体；具体步骤如下：

(1)将甘蔗髓用粉碎机粉碎，用60目的筛子筛分，收集筛过物即细粉，称为甘蔗髓粉；

(3)冰浴条件下，在湿甘蔗髓粉中边搅拌边缓慢加入湿甘蔗髓粉质量40～60倍的已于-5～-10℃预冻的浓磷酸，继续在冰浴下间歇搅拌1～2h，直至混合物变透明；

(4)用80或100目的不锈钢网筛滤除不溶物，获得甘蔗髓浆；

(6)在甘蔗髓沉淀中加入其20～30倍质量的水，搅拌重悬，再抽滤，收集甘蔗髓沉淀，重复洗涤3次，以洗除磷酸；

(7)在甘蔗髓沉淀中加入其20～30倍质量的水，搅拌重悬，用碱液2mol/L Na₂CO₃或1mol/LNaOH溶液调节悬浊液pH接近中性，中和残余的磷酸，抽滤收集甘蔗髓沉淀；

2.根据权利要求1所述的一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述浓磷酸为市售浓磷酸，磷酸体积百分比浓度大于85％。

3.根据权利要求1所述的一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，其特征在于：步骤(2)、(5)、(6)、(7)、(8)所述水为自来水、去离子水、蒸馏水或工业处理软水。

4.根据权利要求3所述的一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，其特征在于：所述水为去离子水、蒸馏水或工业处理软水。

5.根据权利要求1所述的一种用于纤维素结合域融合酶固定化的磷酸改性甘蔗髓不溶性载体的制备方法，其特征在于：步骤(7)所述碱液为2mol/LNa₂CO₃或1mol/LNaOH。