CN111560361B - 一种提高aa-2g产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 - Google Patents

一种提高aa-2g产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高AA‑2G产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过对来源于Bacillus circulans 251的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，得环糊精葡萄糖基转移酶突变体Y195F。以廉价的淀粉或淀粉衍生物为底物，利用突变体Y195F催化生产AA‑2G，AA‑2G产量可达29g/L，较野生型提高了52.6％。

Description

一种提高AA-2G产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
技术领域
本发明涉及一种提高AA-2G产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
维生素C(VC)是一种人体自身不能合成的水溶性维生素，参与体内很多的生理活动，如促进胆固醇转变为胆汁酸，促进肾上腺皮质激素的合成，参与芳香氨基酸的代谢，促进铁的吸收及参与体内多种氧化还原反应，在维持和促进人体健康中扮演着重要的角色。另外，维生素C还能促进胶原蛋白的合成，还原已形成的黑色素，对保持皮肤弹性、美白、除皱有一定的作用。广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。但是VC二位碳的羟基极不稳定，非常容易氧化降解而限制了其应用。2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)是一种维生素C的糖类衍生物，是最稳定、性能最佳的VC替代品，近些年主要作为一种美白添加剂应用于多种品牌的高端化妆品中。
目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶是最常用的催化酶。现有技术针对环糊精葡萄糖基转移酶的基因改造和高效表达研究较多，但是实现环糊精葡萄糖基转移酶在工业化生产中仍存在很大的问题，如酶催化制备AA-2G的转化率低。CGTase具有以分子间转糖基反应制备特定产物的优良应用性能，其受体分子具有广谱性，但针对不同受体，获得的转化率差异很大，通常以糖类分子作为天然受体分子，其转化率明显高于非糖类分子，如本研究中的VC，并且以非糖分子做受体的产量以提高。然而，α-环糊精价格昂贵，β-环糊精很难溶于水，所以从生产成本考虑，两者均不适合大规模生产AA-2G。因此，以价廉易得的淀粉或麦芽糊精为糖基供体，通过分子改造CGTase技术提高VC作为受体的底物特异性，将推动L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明将来源于Bacillus circulans 251的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，得到了一种能使AA-2G产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体。
本发明提供一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体是以氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶为亲本，将亲本的第195位进行突变。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本，将亲本第195位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，并将其命名为Y195F。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体Y195F的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供一种编码所述突变体Y195F的基因。
本发明提供一种携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1或pCDFDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。
本发明提供一种携带编码所述突变体酶的基因的宿主细胞，所述宿主细胞为重组原核细胞或真核细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法为将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。
本发明提供一种提高AA-2G产量的方法，所述方法为以麦芽糊精为底物，在突变体Y195F的催化下，生产得到AA-2G。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为在含有40～60g·L-1的麦芽糊精和40～60g·L-1的L-抗坏血酸的体系中，以1500～2000U/g麦芽糊精的加酶量加入纯化后的突变体Y195F，在28～32℃反应20～25h。
本发明还要求保护所述突变体，或编码所述突变体Y195F的基因，或表达载体或宿主细胞在化工领域制备AA-2G或其衍生产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过对来源于Bacillus circulans 251的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，得环糊精葡萄糖基转移酶突变体Y195F。以廉价的淀粉或淀粉衍生物为底物，利用突变体Y195F催化生产AA-2G，AA-2G产量可达29g/L，为野生型的1.5倍。
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1
TB培养基：胰蛋白胨12g·L-1，酵母粉24g·L-1，甘油5g·L-1，KH2PO4 2.31g·L-1，K2HPO4·3H2O 16.43g·L-1，甘氨酸7.5g·L-1
酶活定义：利用歧化反应测定歧化活力。一个酶活单位(U)定义为一个单位活性定义为每分钟转化1μmol 4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷-4-6-O-亚乙基(EPS)的酶量。
歧化活力测定步骤：
(1)预热：各取300uL的4mM 4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷-4-6-O-亚乙基(EPS)和80mM麦芽糖(50mM，pH 5.5的磷酸缓冲液配制)，50℃保温10min。
(2)反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加热终止反应，然后加入100μL去离子水及100μLα-葡萄糖苷酶在60℃条件下反应1h，
(3)测量：加入100μL 1M Na2CO3终止反应并调节pH至8.0左右显色，在401nm下测量样品的吸光度并计算酶活力。
实施例1：环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备
根据氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列，设计并合成引入有Y195F突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶基因进行定点突变。
利用快速PCR技术，以表达载体pET20b(+)/cgt载体为模板(pet-20b载体上含有T7启动子，启动子后为信号肽序列，用于启动基因的表达)，pET20b(+)/cgt记载于杜立《糖基转移酶在海藻糖制备中的应用性能表征、分子改造及其发酵优化》(公开日2019年)中。
引入Y195F突变的定点突变引物为：
正向引物：CAAGAACCTGTTCGATCTGGCGGATCTG，SEQ ID NO.4；
反向引物：CAGATCCGCCAGATCGAACAGGTTCTTG，SEQ ID NO.5。
PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，Primerstar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后20个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。
重组菌的制备：
将PCR产物经DpnⅠ消化(消化体系为：DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×TBuffer 5μL)，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
化学转化法具体步骤：
①将10μL同源重组产物导入100mL BL21感受态细胞；
②冰浴15-30min；
③42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；
④加入800μL无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；
⑤5000rpm离心2min收菌；
⑥移去上清，剩余100-200μL吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。
⑦挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。
经测序，亲本酶第195位的酪氨酸(Tyr)变成Phe(苯丙氨酸)，将得到的阳性转化子命名为BL21(DE3)/pET20b(+)-Y195F。
(3)突变体的发酵
挑取阳性转化子于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长8-10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在25℃摇床中培养60h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液得到粗酶液。
(4)突变体酶活测定
测定突变体Y195F酶活，环糊精葡萄糖基转移酶单突变和双突变体酶的摇瓶培养60h酶活力列于表中，突变体Y195F的酶活略有降低。
表1 环糊精葡萄糖转移酶突变体的酶活
Figure BDA0002512721340000041
实施例2：突变体的歧化比活力
将实施例1中获得的酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量分数26％的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4℃条件下静置8-10h沉淀蛋白。混合物经离心(8000rpm，10min)收集沉淀，再用最小体积的20mM KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(溶液A pH7.5)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清，4℃下将复溶液置于缓冲液A中透析24h，透析后在12000r·min-1，4℃离心5min，收集上清酶液。将上清液经过0.22μm有机膜过滤制成上样样品。用Mono Q阴离子交换柱对CGTase进行纯化。首先用缓冲液A对Mono Q阴离子交换柱进行冲洗预平衡，将样品上样后，用缓冲液A洗脱两个柱体积，然后用含缓冲液A和缓冲液B(含1mol·L-1氯化钠的缓冲液A)的混合液以1m L·min-1的流速进行线性梯度洗脱。在波长为280nm紫外监测条件下，收集紫外吸收峰大于200m Au的洗脱液，测定酶活并进行蛋白电泳检测，并测定纯酶的歧化比活力，突变体Y195F的歧化比活与野生酶相比有所提高，是野生酶的1.1倍。
表2 野生酶以及突变体的歧化比活力
Figure BDA0002512721340000051
实施例3：酶学性质的探究
(1)温度对酶活的影响：
采用歧化酶活的测定方法，分别在不同温度(45-75℃)测定酶活，发现野生型和突变体Y195F的最适温度均在60℃。
将酶液用pH 6.0的缓冲液适度稀释，并置于45℃水浴锅中保温，定期取样，按照歧化酶活的测定方法，测定残留酶活酶活，设定0h酶活为100％。野生型环糊精葡萄糖基转移酶的半衰期为13h,突变体Y195F的半衰期为13h。
(2)pH对酶活的影响：
分别在50℃，pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0条件下测定野生型酶和突变酶的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，由此计算最适pH。
发现野生型和突变体Y195F的最适pH均在6.0。
实施例4：利用麦芽糊精制备AA-2G
在反应器中加入50g/L的L-抗坏血酸、50g/L的麦芽糊精(DE值5-7)作为底物，用20％的氢氧化钠水溶液将pH调节到5.0，加入一定量(2000U/g麦芽糊精)的实例3中获得的野生酶和突变体的浓缩酶液，在30℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时，反应结束后加入60U葡萄糖淀粉酶，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应24h取样并加入同体积的三氯乙酸(10％，v/v)终止反应并沉淀蛋白，沉淀4小时后将样品12000rpm离心10min，取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，LC-9A紫外检测器；流动相为20mM的稀磷酸，流速0.8mL min-1；柱温35℃。
表3 野生酶以及突变体生产AA-2G的产量
Figure BDA0002512721340000052
结果见表3，突变体表达获得的突变酶与野生酶相比，可以发现，突变体Y195的AA-2G产量与野生酶相比提高了52.6％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高AA-2G产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 686
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 1
Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn
20 25 30
Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Asp Gly Thr Cys Thr Asn Leu Arg Leu
35 40 45
Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly
50 55 60
Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val
65 70 75 80
Glu Asn Ile Tyr Ser Ile Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala
85 90 95
Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr
100 105 110
Gly Thr Ile Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Ala Ala Ala His Ala Lys
115 120 125
Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala
130 135 140
Ser Ser Asp Gln Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn
145 150 155 160
Gly Thr Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His
165 170 175
His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Thr Glu Asn Gly Ile Tyr Lys
180 185 190
Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Thr Val Asp
195 200 205
Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Ile Asp
210 215 220
Gly Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys
225 230 235 240
Ser Phe Met Ala Ala Val Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly
245 250 255
Glu Trp Phe Leu Gly Val Asn Glu Val Ser Pro Glu Asn His Lys Phe
260 265 270
Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys
275 280 285
Val Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys
290 295 300
Ala Met Leu Glu Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Gln Val Asp Asp Gln
305 310 315 320
Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Ala Ser Asn
325 330 335
Ala Asn Arg Arg Lys Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser
340 345 350
Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Asp Pro Asp Asn Arg Ala Arg Ile Pro Ser Phe Ser Thr Ser
370 375 380
Thr Thr Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Cys
385 390 395 400
Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Glu Arg Trp Ile Asn Asn
405 410 415
Asp Val Leu Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Ser Asn Val Ala Val Val
420 425 430
Ala Val Asn Arg Asn Leu Asn Ala Pro Ala Ser Ile Ser Gly Leu Val
435 440 445
Thr Ser Leu Pro Gln Gly Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Leu Leu
450 455 460
Asn Gly Asn Thr Leu Ser Val Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe
465 470 475 480
Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Ala Thr
485 490 495
Ala Thr Pro Thr Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly
500 505 510
Val Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Ser Ser Lys Gly Thr
515 520 525
Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Ser Gly Ala Asp Ile Thr Ser Trp
530 535 540
Glu Asp Thr Gln Ile Lys Val Lys Ile Pro Ala Val Ala Gly Gly Asn
545 550 555 560
Tyr Asn Ile Lys Val Ala Asn Ala Ala Gly Thr Ala Ser Asn Val Tyr
565 570 575
Asp Asn Phe Glu Val Leu Ser Gly Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val
580 585 590
Val Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Tyr Leu Thr Gly
595 600 605
Ser Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Ala Lys Ala Ile Gly Pro
610 615 620
Met Tyr Asn Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Asn Trp Tyr Tyr Asp Val
625 630 635 640
Ser Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln
645 650 655
Gly Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Ser Asn His Thr Phe Thr Ala
660 665 670
Pro Ser Ser Gly Thr Ala Thr Ile Asn Val Asn Trp Gln Pro
675 680 685
<210> 2
<211> 2061
<212> DNA
<213> Bacillus circulans
<400> 2
gcaccggata ccagcgttag caacaagcag aatttcagca cggatgtgat ctatcagatc 60
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ggcacctgca ccaatctgcg tctgtactgt ggtggtgact ggcagggcat catcaacaag 180
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ctgattgcag cggcacatgc aaaaaacatt aaagtgatta tcgattttgc gccgaatcac 420
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ggtaccctgc tgggcggtta taccaatgac acccaaaatc tgtttcatca caacggtggt 540
accgatttta gcaccaccga gaatggtatt tacaagaacc tgtacgatct ggcggatctg 600
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ctgggcattg acggcattcg tatggatgcg gttaaacaca tgccattcgg ttggcaaaag 720
agctttatgg ccgcagttaa caattacaag ccggttttca cctttggcga atggttcctg 780
ggcgtgaatg aagtgagccc ggagaaccac aagtttgcga atgagagcgg tatgagcctg 840
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tatggcctga aggcgatgct ggaaggtagc gccgcagact atgcgcaagt tgacgatcaa 960
gtgaccttca ttgacaatca cgatatggaa cgcttccatg cgagcaacgc gaatcgtcgc 1020
aagctggaac aagcgctggc gtttaccctg acgagccgcg gtgttccggc gatctactat 1080
ggtacggaac agtatatgag cggtggcacc gacccggaca atcgtgcgcg tatcccaagt 1140
tttagcacga gcacgacggc ctaccaggtg attcagaaac tggcaccact gcgcaaatgt 1200
aacccagcca ttgcgtacgg tagcacgcaa gaacgttgga ttaacaacga cgttctgatc 1260
tacgaacgta aatttggcag caacgttgcc gttgttgcgg tgaaccgtaa cctgaacgca 1320
ccggcaagca tcagcggcct ggtgaccagc ctgccacaag gcagctataa cgatgttctg 1380
ggtggtctgc tgaacggtaa cacgctgagc gttggtagcg gcggtgcagc aagcaatttt 1440
acgctggcag ccggcggcac ggcagtttgg caatatacgg ccgcaaccgc gacgccgacc 1500
attggccatg tgggtccaat gatggcgaag ccaggtgtga ccattacgat tgatggtcgc 1560
ggcttcggca gcagcaaagg caccgtttac tttggtacga ccgccgttag cggtgcggat 1620
attacgagct gggaggatac ccaaatcaaa gttaagatcc cagccgttgc gggtggcaac 1680
tataacatca aggttgcgaa cgcggcaggt accgccagca atgtttacga caatttcgag 1740
gttctgagcg gcgaccaagt tagcgtgcgc tttgtggtga acaatgcaac cacggcgctg 1800
ggtcaaaatg tgtatctgac gggcagcgtg agcgaactgg gtaattggga cccggccaaa 1860
gcgatcggcc cgatgtacaa ccaagtggtg tatcagtatc cgaattggta ctatgatgtg 1920
agcgtgccag ccggtaaaac gatcgagttc aagttcctga agaaacaggg cagcaccgtg 1980
acgtgggaag gtggtagcaa tcatacgttt acggccccaa gcagcggtac ggccacgatt 2040
aacgtgaatt ggcaaccgta a 2061
<210> 3
<211> 686
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn
20 25 30
Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Asp Gly Thr Cys Thr Asn Leu Arg Leu
35 40 45
Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly
50 55 60
Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val
65 70 75 80
Glu Asn Ile Tyr Ser Ile Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala
85 90 95
Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr
100 105 110
Gly Thr Ile Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Ala Ala Ala His Ala Lys
115 120 125
Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala
130 135 140
Ser Ser Asp Gln Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn
145 150 155 160
Gly Thr Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His
165 170 175
His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Thr Glu Asn Gly Ile Tyr Lys
180 185 190
Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Thr Val Asp
195 200 205
Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Ile Asp
210 215 220
Gly Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys
225 230 235 240
Ser Phe Met Ala Ala Val Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly
245 250 255
Glu Trp Phe Leu Gly Val Asn Glu Val Ser Pro Glu Asn His Lys Phe
260 265 270
Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys
275 280 285
Val Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys
290 295 300
Ala Met Leu Glu Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Gln Val Asp Asp Gln
305 310 315 320
Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Ala Ser Asn
325 330 335
Ala Asn Arg Arg Lys Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser
340 345 350
Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Asp Pro Asp Asn Arg Ala Arg Ile Pro Ser Phe Ser Thr Ser
370 375 380
Thr Thr Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Cys
385 390 395 400
Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Glu Arg Trp Ile Asn Asn
405 410 415
Asp Val Leu Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Ser Asn Val Ala Val Val
420 425 430
Ala Val Asn Arg Asn Leu Asn Ala Pro Ala Ser Ile Ser Gly Leu Val
435 440 445
Thr Ser Leu Pro Gln Gly Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Leu Leu
450 455 460
Asn Gly Asn Thr Leu Ser Val Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe
465 470 475 480
Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Ala Thr
485 490 495
Ala Thr Pro Thr Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly
500 505 510
Val Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Ser Ser Lys Gly Thr
515 520 525
Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Ser Gly Ala Asp Ile Thr Ser Trp
530 535 540
Glu Asp Thr Gln Ile Lys Val Lys Ile Pro Ala Val Ala Gly Gly Asn
545 550 555 560
Tyr Asn Ile Lys Val Ala Asn Ala Ala Gly Thr Ala Ser Asn Val Tyr
565 570 575
Asp Asn Phe Glu Val Leu Ser Gly Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val
580 585 590
Val Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Tyr Leu Thr Gly
595 600 605
Ser Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Ala Lys Ala Ile Gly Pro
610 615 620
Met Tyr Asn Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Asn Trp Tyr Tyr Asp Val
625 630 635 640
Ser Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln
645 650 655
Gly Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Ser Asn His Thr Phe Thr Ala
660 665 670
Pro Ser Ser Gly Thr Ala Thr Ile Asn Val Asn Trp Gln Pro
675 680 685
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Gly Ala Thr
1 5 10 15
Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly
20 25
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagatccgcc agatcgaaca ggttcttg 28

Claims (8)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体以序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸为亲本，将亲本第195位由酪氨酸突变为苯丙氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC系列中的任意一种。
5.表达权利要求1所述突变体，或含有权利要求2所述基因的宿主细胞。
6.一种提高2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸产量的方法，其特征在于，所述方法为以麦芽糊精为底物，加入权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于，权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的添加量为1500~2500 U/g麦芽糊精。
8.权利要求1所述的突变体、权利要求2所述基因、权利要求3或4所述载体，或权利要求5所述宿主细胞，或权利要求6~7任一所述方法在生物化工领域制备2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸或其衍生产品中的应用。
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