CN109415432A - Tau免疫疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了针对tau的抗体。所述抗体抑制或延迟与tau相关联的病理和相关联的症状恶化。

Description

TAU免疫疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年5月2日提交的美国临时申请号62/330,786的优先权并且与2013年3月13日提交的美国临时申请号61/780,624和2013年3月15日提交的美国临时申请号61/800,382以及US 14/776,724相关，所述专利各自出于所有目的以引用方式全文并入。
序列表
本申请包括以文本文件形式一并提交的序列表，该文本文件名为“497106_SEQLST.TXT”、创建于2017年5月2日并包含54,309个字节。该文本文件中包含的材料出于所有目的以引用的方式全文并入。
背景技术
Tau是可以磷酸化形式存在的众所周知的人蛋白(参见，例如，G oedert,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:4051-4055(1988)；Goedert,EMBO J.8:393-399(1989)；Lee,Neuron 2:1615-1624(1989)；Goeder t,Neuron 3:519-526(1989)；Andreadis,Biochemistry 31:10626-10633(1992)。据报道，Tau在稳定微管方面发挥作用，尤其是在中枢神经***中。总tau(t-tau，即磷酸化和非磷酸化形式)和磷酸化-tau(p-ta u，即磷酸化tau)由脑部响应于神经元损伤和神经变性而释放，并且据报道，相对于普通群体，在阿尔茨海默病患者的CSF中以增大的水平存在(Jack等人,Lancet Neurol 9:119–28(2010))。
Tau是神经原纤维缠结的主要成分，其与斑一起是阿尔茨海默病的标志性特征。缠结构成直径测量为10nm的异常原纤维，其成对出现，以螺旋方式缠绕，具有80nm的规则周期性。神经原纤维缠结内的tau被异常磷酸化(过度磷酸化)，其中磷酸酯基团附接于分子上的特定位点。在阿尔茨海默病中的内嗅皮质的II层神经元、海马的CA1和钩回下区、扁桃体和新皮质的深层(III层、V层和表层VI)中观察到神经原纤维缠结的严重受累。另外已有报道，过度磷酸化的tau干扰微管组装，这可能促进神经元网络的破坏。
Tau内含物是几种神经变性疾病的定义神经病理学的一部分，所述疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶变性、进行性核上性麻痹以及皮克氏病(Pick’s disease)。
发明内容
本发明提供了一种抗体，其包含具有与SEQ ID NO:15至少90％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和与SEQ ID NO:22至少90％相同的成熟轻链可变区。任选地，SEQ IDNO:15的三个Kabat CDR和SEQ ID NO:22的三个Kabat CDR。任选地，位置H13、H28、H48和H91中的至少一个分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少一个分别被N、L、F和S占据。任选地，位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少两个分别被N、L、F和S占据。任选地，位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少三个分别被N、L、F和S占据。任选地，位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43分别被N、L、F和S占据。任选地，抗体包含具有与SEQ ID NO:15至少95％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和与SEQ ID NO:22至少95％相同的成熟轻链可变区。任选地，来自SEQ ID NO:15和22的成熟重链可变区和成熟轻链可变区的CDR的任何差异分别位于位置H60-H65。任选地，成熟重链可变区具有命名为SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有命名为SEQ ID NO:21、22或23的氨基酸序列。任选地，成熟重链可变区具有命名为SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有命名为SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明还提供了一种抗体，其包含具有与SEQ ID NO:35至少90％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和与SEQ ID NO:36至少90％相同的成熟轻链可变区，条件是位置H1为E和/或位置L9为S。任选地，抗体包含SEQ ID NO:15的三个Kabat CDR和SEQ ID NO:22的三个Kabat CDR。任选地，位置H13、H28、H48和H91中的至少一个分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少一个分别被N、L、F和S占据。任选地，位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少两个分别被N、L、F和S占据。任选地，位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少三个分别被N、L、F和S占据。任选地，位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43分别被N、L、F和S占据。任选地，位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43分别被D、L、F和S占据。任选地，位置H1被E占据。任选地，位置L9被S占据。任选地，位置H1为E并且位置L9为S。任选地，抗体包含具有与SEQ ID NO:35至少95％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和与SEQ ID NO:36至少95％相同的成熟轻链可变区。
在一些抗体中，成熟重链可变区与重链恒定区融合，并且成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。任选地，重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相对于天然人恒定区，所述突变形式与Fcγ受体的结合减少。任选地，重链恒定区属于IgG1同种型，任选地SEQ ID NO:29，条件是C末端赖氨酸可以缺失并且轻链恒定区为κ，优选地SEQ ID NO:32。
一些抗体缀合于细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。一些抗体是Fab片段。
本发明还提供了一种编码如在任何以上抗体中中描述的抗体的重链和/或轻链的核酸。
本发明还提供了一种治疗阿尔茨海默病或实现阿尔茨海默病的预防的方法，包括施用任何以上抗体的有效方案，从而治疗阿尔茨海默病或实现阿尔茨海默病的预防。任选地，患者是ApoE4载体。
本发明还提供了一种治疗与tau相关联的疾病或实现与tau相关联的疾病的预防的方法，包括施用如在任何以上抗体中定义的抗体的有效方案。任选地，疾病是神经疾病。
本发明还提供了一种减少tau的异常传播的方法，包括施用任何以上抗体的有效方案，从而减少tau的传播。
本发明还提供了一种诱导tau的吞噬的方法，包括施用任何以上抗体的有效方案，从而诱导tau的吞噬。任选地，疾病是神经疾病。
本发明还提供了一种抑制tau聚集或沉积的方法，包括施用任何以上抗体的有效方案，从而抑制tau聚集或沉积。任选地，疾病是神经疾病。
本发明还提供了一种抑制tau缠结形成的方法，包括施用任何以上抗体的抗体的有效方案。任选地，疾病是神经疾病。
本发明还提供了一种核酸，其包含编码具有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:35的序列的重链可变区的区段。任选地，核酸还包含编码IgG1恒定区的区段。任选地，IgG1恒定区是人IgG1恒定区。任选地，IgG1恒定区具有SEQ ID NO:29的序列，条件是可以省略C末端赖氨酸。任选地，编码IgG1恒定区的区段具有SEQ ID NO:30的核苷酸序列。任选地，核酸还包含连接编码重链可变区和IgG1恒定区的区段的内含子。任选地，编码IgG1恒定区的区段具有SEQ ID NO:31的核苷酸序列。任选地，核酸还包含编码κ恒定区的区段。任选地，κ恒定区是人κ恒定区。任选地，κ恒定区具有SEQ ID NO:32的序列。任选地，编码κ恒定区的核酸具有SEQ ID NO:33的序列。任选地，核酸还包含将编码轻链可变区的区段连接至编码κ恒定区的区段的内含子。任选地，编码κ恒定区的区段具有SEQ ID NO:34的序列。
本发明还提供了编码SEQ ID NO:15的重链可变区和/或SEQ ID NO:21、22或23的轻链可变区的一种或多种核酸。
附图说明
图1描绘了设计用于绘制由16B5单克隆抗体结合的一个或多个表位的图谱的实验的结果。含有全长Tau或Tau的缺失突变体(Δ5-24或Δ25-44)的蛋白质印迹(Westernblot)用16B5抗体(左图)或Tau46抗体(右图)染色。Tau46抗体结合至Tau的C末端表位。
图2描绘了设计用于绘制由16B5单克隆抗体结合的一个或多个表位的图谱的实验的结果。含有全长Tau或Tau的缺失突变体的蛋白质印迹用16B5抗体(左上图)或Tau46抗体(右图)染色。在左下图中示出用16B5抗体染色的印迹的更长时间暴露。该实验中分析的Tau的缺失突变体包括Δ25-44、Δ5-24、Δ23-32、Δ30-39以及Δ37-46。
图3描绘了设计用于绘制由16B5单克隆抗体结合的一个或多个表位的图谱的丙氨酸扫描实验的结果。含有野生型Tau(WT)或Tau的丙氨酸点突变体的蛋白质印迹用16B5抗体(左图)或Tau46抗体(右图)染色。该实验中分析的Tau的丙氨酸突变体包括T30A、M31A、H32A、Q33A、D34A、Q35A、E36A、G37A、D38A、T39A、D40A、A41L以及G42A。
图4示出在表达人tau.P301L蛋白的转基因小鼠的脑干的sarkosyl不溶性级分中检测到的tau蛋白的相对量。用16B5抗体或6F10抗体(非免疫IgG1同种型对照)对小鼠进行被动免疫。通过蛋白质印迹、抗体染色和所得信号的定量分析样品。用于检测tau的抗体包括抗-磷酸化-tau特异性抗体(AT8，左上图；AT100，左下图；或1F5，右上图)和泛tau抗体(HT7，右下图)。
图5示出在表达人tau.P301L蛋白的转基因小鼠的总脑干匀浆中检测到的磷酸化-tau与总tau蛋白的比率(左图)和总tau的归一化量(右图)。用16B5抗体或6F10抗体(非免疫IgG1同种型对照)对小鼠进行被动免疫。通过蛋白质印迹、抗体染色和所得信号的定量分析样品。AT8抗体用于检测磷酸化-tau并且HT7抗体用于检测总tau。使用抗-GAPDH抗体来归一化在用16B5抗体对比对照6F10抗体处理的小鼠中检测到的tau量。
图6描绘了使用AT8抗-磷酸化-tau抗体进行免疫组织化学染色的表达人tau.P301L蛋白的转基因小鼠的小脑核切片。用16B5抗体(左上图)或6F10抗体(非免疫IgG1同种型对照)(右下图)对小鼠进行被动免疫。用AT8抗体在来自用16B5或6F10抗体被动免疫的小鼠的小脑的间位核、前部和后部、附件侧小脑核(IntA/P/LAT)和底丘脑核附件未定带(STH/ZI)中检测到的tau染色的量的定量在上部条形图中示出。使用AT100抗-磷酸化-tau抗体在来自用16B5或6F10抗体被动免疫的小鼠的IntA/P/LAT和STH/ZI切片上检测到的磷酸化-tau染色的量的定量在下部条形图中示出。使用Student的t检验评估统计学显著性，p<0.05。
图7描绘了用嵌合16B5抗体和人源化16B5抗体(H1L2和H1L3型式)获得的tau免疫沉淀结果。从获自阿尔茨海默病患者的尸检额皮质样品的可溶性和不溶性级分中免疫沉淀Tau。使用多克隆抗-tau抗体(tau pAb)检测印迹的免疫沉淀物中存在的Tau。
图8描绘了人源化H1、H2和嵌合16B5重链的序列比对以及人源化L2、L4和嵌合16B5轻链的序列比对。
图9描绘了H1L2、H1L4和H2L4的热稳定性分析。使用差示扫描量热法(DSC)分析热稳定性。
定义
单克隆抗体或其他治疗剂通常以分离形式提供。这意味着剂通常至少50％w/w不含由其生产或纯化产生的干扰性蛋白质和其他污染物，但不排除剂与过量的一种或多种药学上可接受的载体或旨在便于其使用的其他媒介物组合的可能性。有时单克隆抗体(或其他治疗剂)至少60％、70％、80％、90％、95％或99％w/w不含由其生产或纯化产生的干扰性蛋白质和污染物。
本发明的抗体通常与其指定靶标以至少106、107、108、109或1010M-1的缔合常数结合。这种结合是特异性结合，因为其量级可检测地更高，并且可区别于对至少一种不相关的靶标发生的非特异性结合。特异性结合可以是特定官能团之间形成键或特定空间配合(例如，锁钥型)的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合不一定意味着单克隆抗体仅仅结合一个靶标。
基本抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。此可变区最初被表达为与可切割的信号肽连接。没有信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区意指没有轻链信号肽的轻链可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。恒定区可包括CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区中的任一个或全部。
轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10或更多个氨基酸的“D”区。(大致参见Fundamental Immunology(Paul,W.编辑,第2版Raven Press,N.Y.,1989),第7章(出于所有目的以引用的方式整体并入)。
每个轻/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。除双功能或双特异性抗体外，两个结合位点是相同的。所有链都表现出由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连结的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自每一对的两条链的CDR通过框架区对齐，使得能够结合特定的表位。从N末端到C末端，轻链和重链包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸的分配与Kabat的定义一致，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1987和1991)，或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature 342:878-883(1989)。Kabat还提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被指定相同的编号。
术语“抗体”包括完整抗体及其结合片段。通常，片段与衍生它们的完整抗体竞争与靶标的特异性结合。片段包括单独的重链、轻链Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Fv和单结构域抗体。单(可变)结构域抗体包括在常规抗体中与它们的VL配偶体分离的VH区(或反之亦然)(Ward等人,1989,Nature 341:544-546)以及来自诸如骆驼或软骨鱼(例如，铰口鲨)的物种的VH区(有时称为VHH)，其中VH区不与VL区缔合(参见，例如，WO 9404678)。其中一条链与其天然配偶体分离的单结构域抗体有时称为Dab并且来自骆驼或软骨鱼的单结构域抗体有时称为纳米抗体。恒定区或恒定区的部分可以或可以不存在于单结构域抗体中。例如，来自骆驼的天然单可变区抗体包括VHH可变区以及CH2和CH3恒定区。单结构域抗体可通过与常规抗体类似的方法进行人源化。Dab类型的抗体通常从人来源的抗体获得。NANOBODY类型的抗体是骆驼或鲨鱼来源的，并且可进行人源化。片段可以通过重组DNA技术产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离产生。术语“抗体”还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体(参见，例如，Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.,148:1547-53(1992))。
术语“表位”是指抗原上与抗体结合的位点。表位可由连续氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3个、且更通常至少5或8-10个氨基酸。当说表位在蛋白质中的氨基酸残基的范围内时(例如，在tau的残基25至44内)，该范围将限定其边界的残基包括在内。该范围内的某些残基有助于表位，而其他残基可能不。形成表位的残基可以或可以不是彼此连续的。类似地，当抗体与存在于特定氨基酸范围内的表位结合时，抗体不需要接触该范围内的所有氨基酸残基，并且抗体所接触的表位的残基可以或可以不是彼此连续的。确定表位的空间构象的方法包括，例如，x射线晶体学和2维核磁共振。参见，例如，EpitopeMapping Protocols,在Methods in Molecular Biology中,第66卷,Glenn E.Morris编辑,(1996)。
识别相同或重叠表位的抗体可以在显示出一种抗体与另一种抗体竞争结合靶抗原的能力的简单的免疫测定中鉴定。抗体的表位还可以通过与其抗原结合以鉴定接触残基的抗体的X射线晶体学来定义。另选地，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有重叠表位。本发明包括与16B5竞争的抗体和/或结合与16B5相同的tau上的表位的抗体。
抗体之间的竞争通过测定来确定，在所述测定中，待测抗体抑制参考抗体(例如16B5)与共同抗原的特异性结合(参见，例如，Junghans等人,Cancer Res.50:1495,1990)。如果过量的测试抗体(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制至少50％但优选75％、90％或99％的参考抗体的结合(如在竞争性结合测定中所测量的)，那么测试抗体与参考抗体竞争。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和结合至与参考抗体结合的表位充分接近以产生位阻的相邻表位的抗体。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
为了将氨基酸取代分为保守或非保守取代，将氨基酸分组如下：第I组(疏水性侧链)：met、ala、val、leu、ile；第II组(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；第III组(酸性侧链)：asp、glu；第IV组(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；第V组(影响链取向的残基)：gly、pro；以及第VI组(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。保守取代包括相同类别的氨基酸之间的取代。非保守取代包括将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别的成员。
用通过Kabat编号惯例最大限度地对齐的抗体序列确定序列同一性百分比。比对后，如果将受试者抗体区域(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域进行比较，受试者抗体区域与参考抗体区域之间的序列同一性百分比是在受试者抗体区域和参考抗体区域中相同氨基酸占据的位置的数目除以两个区域的对齐位置的总数，其中空位不计数，乘以100以转换为百分比。
术语“佐剂”是指当与抗原结合施用时增强和/或重新引导对抗原的免疫应答，但是当单独施用时不产生对抗原的免疫应答的化合物。佐剂可通过若干机制增强免疫应答，包括淋巴细胞募集、B细胞和/或T细胞的刺激、以及巨噬细胞的刺激。
如果与未知患有神经疾病的受试者群体相比，患有疾病的患者群体的脑中tau水平增加、或tau的沉积或包含增加、或脑中存在tau缠结、或脑中tau的磷酸化(每分子tau的磷酸基团的平均数量)增加、或tau的细胞间或细胞内传播异常，那么该疾病与tau相关。如果具有tau基因的变体形式的患者相对于具有野生型(人群体中最常见的变体)tau基因的患者具有增加的发展疾病的风险，那么该疾病也与tau相关。
如果受试者具有至少一个已知的风险因素(例如，遗传、生化、家族史、情境暴露)，从而将具有所述风险因素的个体置于与没有该风险因素的个体相比在统计学上显著更大的发展该疾病的风险中，那么个体患病风险增加。
术语“症状”是指患者感知的疾病的主观证据，诸如步态改变。“体征”是指医生观察到的疾病的客观证据。
统计显著性意指p≤0.05。
具体实施方式
I.概要
本发明提供了与tau结合的抗体。一些抗体特异性结合SEQ ID NO.1的残基23-46内的表位。一些抗体与tau结合，而不管是否为磷酸化状态。本发明的一些抗体用于抑制或延迟与tau相关联的病理和相关联的症状恶化。尽管本发明的实践不要求理解机制，但是由于抗体诱导tau的吞噬、抑制tau的分子间或分子内聚集、阻断细胞至细胞传播、阻断tau与细胞结合、阻断tau摄取、或与其他分子结合、通过稳定非毒性构象、或通过抑制致病性tau形式的细胞间或细胞内传播以及其他机制可发生毒性的降低。本发明的抗体或诱导此类抗体的剂可用于治疗阿尔茨海默病和与tau相关联的其他疾病或实现其预防的方法中。
II.Tau
除非从上下文中另外显而易见，否则对tau的提及意指tau的天然人形式，包括所有同种型，而不管是否存在翻译后修饰(例如，磷酸化、糖化或乙酰化)。在人脑中存在六种主要的tau同种型(剪接变体)。这些变体中最长的具有441个氨基酸，其中起始met残基被切割。根据441同种型对残基编号。因此，例如，对位置404处的磷酸化的提及意指441同种型的位置404，或当与441同种型最大限度地对齐时任何其他同种型的对应位置。同种型的氨基酸序列和Swiss-Prot编号如下文所指示。
对tau的提及包括已知的自然变型，其中约30种列于Swiss-Pro数据库及其排列中，以及与tau病理相关联的突变，所述病理诸如痴呆、皮克氏病、核上性麻痹等(参见，例如，Swiss-Pro数据库和Poorkaj等人,Ann Neurol.43:815-825(1998))。通过441同种型编号的tau突变的一些实例为氨基酸残基257处的赖氨酸至苏氨酸突变(K257T)，氨基酸位置260处的异亮氨酸至缬氨酸突变(I260V)；氨基酸位置272处的甘氨酸至缬氨酸突变(G272V)；氨基酸位置279处的天冬酰胺至赖氨酸突变(N279K)；氨基酸位置296处的天冬酰胺至组氨酸突变(N296H)；氨基酸位置301处的脯氨酸至丝氨酸突变(P301S)；氨基酸位置303处的甘氨酸至缬氨酸突变(G303V)；位置305处的丝氨酸至天冬酰胺突变(S305N)；氨基酸位置335处的甘氨酸至丝氨酸突变(G335S)；位置337处的缬氨酸至甲硫氨酸突变(V337M)；位置342处的谷氨酸至缬氨酸突变(E342V)；氨基酸位置369处的赖氨酸至异亮氨酸突变(K3691)；氨基酸位置389处的甘氨酸至精氨酸突变(G389R)；以及氨基酸位置406处的精氨酸至色氨酸突变(R406W)。
Tau可以在一个或多个氨基酸残基处被磷酸化，所述氨基酸残基包括氨基酸位置18、29、97、310和394处的酪氨酸、氨基酸位置184、185、198、199、202、208、214、235、237、238、262、293、324、356、396、400、404、409、412、413以及422处的丝氨酸；以及氨基酸位置175、181、205、212、217、231和403处的苏氨酸。
III.抗体
A.结合特异性和功能特性
本发明提供了与tau结合的抗体。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:1的残基23-46内的表位。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:1的残基25-44内的表位。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:1的28-41内的表位。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:1的残基30-39内的表位。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:1的残基30-36内的表位。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:1的残基33-39内的表位。一些抗体特异性结合SEQ ID NO:1的残基33-36内的表位。一些抗体特异性结合包括SEQ ID NO:1的以下残基的表位：28-30、28-31、28-32、28-33、28-34、28-35、28-36、28-37、28-38、28-39、28-40、28-41、29-31、29-32、29-33、29-34、29-35、29-36、29-37、29-38、29-39、29-40、29-41、30-32、30-33、30-34、30-35、30-36、30-37、30-38、30-39、30-40、30-41、31-33、31-34、31-35、31-36、31-37、31-38、31-39、31-40、31-41、32-34、32-35、32-36、32-37、32-38、32-39、32-40、32-41、33-35、33-36、33-37、33-38、33-39、33-40、33-41、34-36、34-37、34-38、34-39、34-40、34-41、35-37、35-38、35-39、35-40、35-41、36-38、36-39、36-40、36-41。一些抗体与tau结合，而不管是否为磷酸化状态。一些抗体与不包括经受磷酸化的残基的表位结合。这些抗体可以通过用从天然来源纯化或重组表达的tau多肽免疫来获得。可以筛选结合处于非磷酸化形式以及其中易于磷酸化的一个或多个残基被磷酸化的形式的tau的抗体。与非磷酸化的tau相比，此类抗体优选以不可区分的亲和力或至少在1.5倍、2倍或3倍的系数内结合磷酸化tau(即，是“泛特异性的)。16B5是泛特异性单克隆抗体的实例。本发明还提供了与任何前述抗体结合相同表位例如16B5的表位的抗体。还包括了与任何前述抗体竞争结合tau的抗体，例如与16B5竞争。
其他抗体可以通过编码示例性抗体(诸如16B5)的重链和轻链的cDNA的诱变获得。在成熟重链和/或轻链可变区的氨基酸序列中与16B5至少90％、95％或99％相同且维持其功能特性，和/或与相应抗体的差别在于少量功能上不重要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或***的单克隆抗体也包括在本发明中。还包括具有至少一个且优选所有六个如由Kabat所定义的CDR的单克隆抗体，所述CDR与16B5的对应CDR具有90％、95％、99％或100％的同一性。
C.人源化抗体
人源化抗体是遗传工程化的抗体，其中将来自非人“供体”抗体(例如，16B5)的CDR接枝到人“受体”抗体序列中(参见，例如，Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205 6,881,557；Foote,US 6,881,557)。受体抗体序列可以是，例如，成熟人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的一些或全部CDR，以及完全或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在的话)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个且通常全部三个CDR，以及基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在的话)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个且通常全部三个CDR，以及基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在的话)。除纳米抗体和dAb之外，人源化抗体包括人源化重链和人源化轻链。当相应CDR之间至少85％、90％、95％或100％的对应残基(如由Kabat所定义的)相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的对应CDR。当至少85％、90％、95％或100％的由Kabat定义的对应残基相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别基本上来自人可变区框架序列或人恒定区。
尽管人源化抗体通常掺入来自小鼠抗体的全部六个CDR(优选地如由Kabat所定义的)，但它们也可以用少于来自小鼠抗体的全部CDR(例如，至少3个、4个或5个CDR)制备(例如，Pascalis等人,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等人,Journal of MolecularBiology,320:415-428,2002；Iwahashi等人,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura等人,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。
在一些抗体中，仅需要部分CDR，即结合所需的CDR残基的子集，称为SDR，保持结合在人源化抗体中。可以基于先前的研究(例如，通常不需要CDR H2中的残基H60-H65)从位于Chothia高变环外的Kabat CDR区域(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)中，通过分子建模和/或经验性地，或如Gonzales等人,Mol.Immunol.41:863,2004中所述鉴定不接触抗原且不在SDR中的CDR残基。在此类人源化抗体中，在一个或多个供体CDR残基不存在或省略了整个供体CR的位置处，占据该位置的氨基酸可以是占据受体抗体序列中的对应位置(通过Kabat编号)的氨基酸。CDR中将包括的受体对供体氨基酸的此类取代的数量反映了竞争考虑的平衡。此类取代可能有利于减少人源化抗体中小鼠氨基酸的数量，并且因此降低潜在的免疫原性。然而，取代还可引起亲和力的改变，并且优选避免亲和力的显著降低。CDR内用于取代的位置和用于取代的氨基酸也可经验性地选择。
人受体抗体序列可任选地选自许多已知的人抗体序列，以在人受体序列可变区框架与供体抗体链的对应的可变区框架之间提供高度的序列同一性(例如，65-85％的同一性)。
可以基于它们对CDR构象和/或与抗原的结合的可能影响来选择来自人可变区框架残基的某些氨基酸用于取代。对此类可能影响的研究通过建模、检查特定位置处的氨基酸的特征，或经验观察特定氨基酸的取代或诱变的作用来实现。
例如，当鼠可变区框架残基与选定的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，当合理地预期氨基酸有以下特征时人框架氨基酸可以被来自小鼠抗体的等效框架氨基酸取代：
(1)直接非共价结合抗原，
(2)与CDR区相邻，
(3)或者与CDR区相互作用(例如，在CDR区的约内)，(例如，通过对同源已知免疫球蛋白链的解析结构上的轻链或重链进行建模来鉴定)；以及
(4)参与VL-VH界面的残基。
来自由Queen,US 5,530,101定义的类别(1)-(3)的框架残基有时另选地被称为规范残基和微调残基(vernier residue)。限定确定CDR环的构象的供体CDR环的规范类别的框架残基有时被称为规范残基(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196,901-917(1987)；Thornton&Martin J.Mol.Biol.,263,800-815,1996)。支持抗原结合环构象，在精细调节抗体与抗原的配合中发挥作用的一层框架残基有时被称为微调残基(Foote&Winter,1992,JMol Bio.224,487–499)。其他取代候选是产生潜在糖基化位点的残基。其他取代候选是受体人框架氨基酸，其在该位置对于人免疫球蛋白不常见。这些氨基酸可以被来自小鼠供体抗体的等同位置或来自更典型的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸取代。其他取代候选是受体人框架氨基酸，其在该位置对于人免疫球蛋白不常见。
本发明提供了小鼠16B5抗体的人源化形式。小鼠抗体包含成熟的重链和轻链可变区，其分别具有包含SEQ ID NO.10和16的氨基酸序列。本发明提供了两个示例性人源化成熟重链可变区(H1和H2)和五个示例性人源化成熟轻链可变区(L1、L2、L3、L4和L5)。H1包括四个回复突变。H2包括相同的四个回复突变加上另一个Q1E突变(不是回复突变)以改善稳定性。L1具有3个回复突变，L2具有4个回复突变，L3具有3个回复突变，L4具有5个回复突变(与L2相同，加上D9S以除去蛋白水解位点)，并且L5具有与L4相同的回复突变，不同的是位置L1被D占据。H1L2变体具有与嵌合16B5相同或更好的亲和力和8个回复突变。H1L1和H1L3具有与嵌合16B5相似的亲和力和7个回复突变。H1L4变体、H2L4变体和H2L2变体具有在16B5的2倍内的亲和力并且分别具有9、10或8个突变(所有这些突变都是除H2中的Q1E之外的回复突变)。这些变体具有改善稳定性(来自H2中的Q1E)或除去L4中的蛋白水解位点或两者的益处。所有人源化链与人种系序列具有至少85％的序列同一性，因此满足用于命名为人源化抗体的INN标准。
本发明提供了H1L2人源化16B5抗体的变体，其中人源化成熟重链可变区显示出与SEQ ID NO:15至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性并且人源化成熟轻链成熟可变区显示出与SEQ ID NO:22至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选地，在此类抗体中，保留H1L2中的一些或所有回复突变。换句话说，位置中的至少1、2、3或4个，位置H13被K占据，位置H28被占据，位置H48被M占据，并且位置H91被F占据。优选地至少1、2、3或所有四个位置，位置L1被N占据，位置L4被L占据，位置L36被F占据，并且位置L43被S占据。此类人源化抗体的CDR区优选与H1L2的CDR区(其与小鼠供体抗体的那些相同)相同或基本相同。CDR区可由任何常规定义(例如，Chothia)来定义，但优选如由Kabat所定义的。
本发明提供了H1L4人源化16B5抗体的变体，其中人源化成熟重链可变区显示出与SEQ ID NO:15至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性并且人源化成熟轻链成熟可变区显示出与SEQ ID NO:36至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选地，在此类抗体中，保留H1L4中的一些或所有回复突变。换句话说，以下位置中的至少1、2、3或4个被占据如下：位置H13被K占据，位置H28被P占据，位置H48被M占据，并且位置H91被F占据。优选地至少1、2、3、4或全部5个位置，位置L1被N占据，位置L4被L占据，位置L9被S占据，位置L36被F占据，并且位置L43被S占据。此类人源化抗体的CDR区优选与H1L4的CDR区(其与小鼠供体抗体的那些相同)相同或基本相同。CDR区可由任何常规定义(例如，Chothia)来定义，但优选如由Kabat所定义的。
本发明提供了H2L2人源化16B5抗体的变体，其中人源化成熟重链可变区显示出与SEQ ID NO:35至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性并且人源化成熟轻链成熟可变区显示出与SEQ ID NO:22至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选地，在此类抗体中，保留H2L4中的一些或所有突变。换句话说，以下位置中的至少1、2、3、4或5个被占据如下：位置H1被E占据，位置H13被K占据，位置H28被P占据，位置H48被M占据并且位置H91被F占据。优选地，以下位置中的至少1、2、3或全部4个被占据如下：位置L1被N占据，位置L4被L占据，位置L36被F占据，并且位置L43被S占据。此类人源化抗体的CDR区优选与H2L3的CDR区(其与小鼠供体抗体的那些相同)相同或基本相同。CDR区可由任何常规定义(例如，Chothia)来定义，但优选如由Kabat所定义的。
本发明提供了H2L4人源化16B5抗体的变体，其中人源化成熟重链可变区显示出与SEQ ID NO:35至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性并且人源化成熟轻链成熟可变区显示出与SEQ ID NO:36至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选地，在此类抗体中，保留H2L4中的一些或所有回复突变和其他突变。换句话说，以下位置中的至少1、2、3、4或5个被占据如下：位置H1被E占据，位置H13被K占据，位置H28被P占据，位置H48被M占据，并且位置H91被F占据。优选地，以下位置中的至少1、2、3或全部4个被占据如下：位置L1被N占据，位置L4被L占据，位置L9被S占据，位置L36被F占据，并且位置L43被S占据。此类人源化抗体的CDR区优选与H1L4的CDR区(其与小鼠供体抗体的那些相同)相同或基本相同。CDR区可由任何常规定义(例如，Chothia)来定义，但优选如由Kabat所定义的。
16B5变体的另外变异的一个可能性是可变区框架中的另外的回复突变。人源化mAb中不与CDR接触的许多框架残基可以适应来自供体小鼠mAb或其他小鼠或人抗体的对应位置的氨基酸的取代，并且甚至许多潜在的CDR接触残基也允许取代或甚至CDR内的氨基酸也可以被改变，例如，使用在用于提供可变区框架的人受体序列的对应位置处发现的残基。另外，可以使用另选的人受体序列，例如，用于重链和/或轻链。如果使用不同的受体序列，那么可以不进行上文推荐的一种或多种回复突变，因为在没有回复突变的情况下对应的供体和受体残基已经相同。例如，当使用其中位置H13已被K占据的重链受体序列时，不需要回复突变。
本发明还包括人源化抗体，其中成熟的轻链和重链可变区显示出与人源化16B5H1L1抗体(分别为SEQ ID NO:15和21)或人源化16B5H1L3抗体(分别为SEQ ID NO:15和23)的成熟的轻链和重链可变区至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
本发明还包括人源化抗体，其中成熟的轻链和重链可变区显示出与人源化16B5H2L1抗体(分别为SEQ ID NO:X和21)、人源化16B5H2L2抗体(分别为SEQ ID NO:X和22)或人源化16B5H2L3抗体(分别为SEQ ID NO:X和23)的成熟的轻链和重链可变区至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
F.恒定区的选择
嵌合、人源化(包括饰面)或人抗体的重链和轻链可变区可以与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择部分取决于是否需要抗体依赖性补体和/或细胞介导的细胞毒性。例如，人同种型IgG1和IgG3具有补体介导的细胞毒性，而人同种型IgG2和IgG4具有差的或没有补体介导的细胞毒性。轻链恒定区可以是λ或κ。抗体可以被表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体、单独的重链、轻链、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv，或其中重链和轻链可变区通过间隔物连接的单链抗体。
人恒定区显示出不同个体之间的同种异型变异和同族同种异型变异，即在一个或多个多态性位置，恒定区在不同个体中可以不同。同族同种异型与同种异型的区别在于，识别同族同种异型的血清结合至一个或多个其他同种型的非多态性区域。对人恒定区的提及包括具有任何天然同种异型或占据天然同种异型中的多态性位置的残基的任何排列或用于减小或增加以下所述效应子功能的最多3、5或10个取代的恒定区。
轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸，诸如重链的C末端赖氨酸，可在一部分或全部分子中缺失或衍生。可在恒定区中进行取代以减少或增加效应子功能，诸如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见，例如，Winter等人,美国专利5,624,821；Tso等人,美国专利No.5,834,597；以及Lazar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)，或延长在人体中的半衰期(参见，例如，Hinton等人,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。示例性取代包括位置250处的Gln和/或位置428处的Leu(EU编号在该段中用于恒定区)以用于增加抗体的半衰期。位置234、235、236和/或237中的任一个或所有位置处的取代降低了对Fcγ受体，尤其是FcγRI受体的亲和力(参见，例如，US 6,624,821)。人IgG1的位置234、235和237处的丙氨酸取代优选用于减小效应子功能。任选地，人IgG2中的位置234、236和/或237被丙氨酸取代，并且位置235被谷氨酰胺取代。(参见，例如，US 5,624,821。)
G.重组抗体的表达
嵌合、人源化(包括饰面)和人抗体通常通过重组表达产生。编码抗体的核酸可以进行密码子优化以在期望的细胞类型(例如，CHO或Sp2/0)中表达。编码本文公开的人源化16B5重链和轻链可变区的核酸具有包括或由以下组成的序列：例如SEQ ID NO:25(编码Hu16B5 H1)、SEQ ID NO:26(编码Hu16B5L1)、SEQ ID NO:27(编码Hu16B5 L2)或SEQ ID NO:28(编码Hu16B5L3)。对于包括信号肽的可变区诸如SEQ ID NO.10和16，核酸可在具有或没有信号肽的情况下编码可变区。编码重链和轻链的核酸区段可存在于相同的连续核酸分子上或存在于分开的分子上。重链和轻链可由相同载体或由不同载体表达。通常以分离形式提供核酸。
编码人源化16B5重链可变区的核酸可以连接于编码人IgG1恒定区的例如具有SEQID NO:30的序列的核酸区段。此类核酸还可包括位于编码重链可变区和IgG1恒定区的区段之间(即编码恒定区的区段的5’)的内含子。编码人IgG1恒定区并在其5’端具有小鼠内含子的示例性核酸序列在SEQ ID NO:31中示出。
编码人源化16B5轻链可变区的核酸可以连接于编码人κ恒定区的例如具有SEQ IDNO:33的序列的核酸区段。此类核酸还可包括在编码轻链可变区和κ恒定区的区段之间(即，在κ恒定区的5’)的内含子。编码人κ恒定区并在其5’端具有人内含子的示例性核酸序列在SEQ ID NO:34中示出。
重组多核苷酸构建体通常包括可操作地连接于抗体链的编码序列的表达控制序列，包括天然相关联的或异源的启动子区。优选地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子***。一旦已经将载体掺入适当的宿主中，即将宿主维持在适于核苷酸序列的高水平表达和交叉反应性抗体的收集和纯化的条件下。编码抗体链的一个或多个载体还可包含选择性基因，诸如二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合酶，以允许扩增编码抗体链的核酸的拷贝数。
大肠杆菌是尤其可用于表达抗体，尤其是抗体片段的原核宿主。诸如酵母的微生物也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)是根据需要带有具有表达控制序列、复制起点、终止序列等等的合适载体的优选的酵母宿主。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。
哺乳动物细胞是用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的优选宿主。参见Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。本领域已经开发出许多能够分泌完整的异源蛋白质的合适的宿主细胞系，并且包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞，以及非抗体产生性骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0。优选地，细胞是非人的。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子、增强子(Queen等人,Immunol.Rev.89:49(1986))和必要的加工信息位点诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛***瘤病毒等的启动子。参见Co等人,J.Immunol.148:1149(1992)。
已经将编码抗体重链和轻链的一种或多种载体引入细胞培养物中，可以在无血清培养基中针对生长率和产品质量对细胞库进行筛选。最佳产量的细胞库随后可进行基于FACS的单细胞克隆以产生单克隆系。每个细胞每天50pg或100pg以上的比生产率是优选的，其对应于大于7.5g/L培养物的产物滴度。由单细胞克隆产生的抗体还可以进行浊度、过滤特性、PAGE、IEF、UV扫描、HP-SEC、碳水化合物-寡糖映射、质谱和结合测定(诸如ELISA或Biacore)的测试。选定的克隆可随后存储在多个小瓶中并且冷冻储存，以备后用。
一旦被表达，抗体可根据本领域的标准程序进行纯化，包括蛋白A捕获、柱色谱法(例如，疏水相互作用或离子交换)、用于病毒失活的低pH等等(通常参见Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,NY,1982))。
可以使用商业生产抗体的方法，包括密码子优化、启动子、转录元件和终止子的选择、无血清单细胞克隆、细胞建库、使用用于拷贝数扩增的选择标志物、CHO终止子、无血清单细胞克隆、蛋白质滴度的改善(参见，例如，US 5,786,464、US 6,114,148、US 6,063,598、US 7,569,339、WO2004/050884、WO2008/012142、WO2008/012142、WO2005/019442、WO2008/107388和WO2009/027471、以及US 5,888,809)。
IV.活性免疫原
用于主动免疫的剂用于在患者中诱导和与结合以上被动免疫所描述的相同类型的抗体。用于主动免疫的剂可以是用于在实验室动物中生成单克隆抗体的相同类型的免疫原，例如，来自tau的对应于SEQ ID NO:1的残基23-46、25-44、28-41或30-39的区域的3-15或3-12或5-12、或5-8个连续氨基酸的肽，诸如，例如，包括SEQ ID NO:1的残基28-30、28-31、28-32、28-33、28-34、28-35、28-36、28-37、28-38、28-39、28-40、28-41、29-31、29-32、29-33、29-34、29-35、29-36、29-37、29-38、29-39、29-40、29-41、30-32、30-33、30-34、30-35、30-36、30-37、30-38、30-39、30-40、30-41、31-33、31-34、31-35、31-36、31-37、31-38、31-39、31-40、31-41、32-34、32-35、32-36、32-37、32-38、32-39、32-40、32-41、33-35、33-36、33-37、33-38、33-39、33-40、33-41、34-36、34-37、34-38、34-39、34-40、34-41、35-37、35-38、35-39、35-40、35-41、36-38、36-39、36-40、36-41的肽。为了诱导与16B5结合相同或重叠表位的抗体，可以对这些抗体的表位特异性作图(例如，通过测试与跨越tau的一系列重叠肽的结合)。然后可以使用由该表位组成或包括该表位或与该表位重叠的tau的片段作为免疫原。此类片段通常以非磷酸化的形式使用。
如果使用的话，异源载体和佐剂可以与用于生成单克隆抗体的相同，但也可以针对在人中使用的更好的药物适用性进行选择。合适的载体包括血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素或来自其他致病细菌诸如白喉(例如，CRM197)、大肠杆菌、霍乱或幽门螺杆菌的类毒素或减毒的毒素衍生物。T细胞表位也是合适的载体分子。一些缀合物可以通过将本发明的剂连接于免疫刺激性聚合物分子(例如，三棕榈酰基-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)、甘露聚糖(甘露糖聚合物)或葡聚糖(β1→2聚合物))、细胞因子(例如，IL-1、IL-1α和β肽、IL-2、γ-INF、IL-10、GM-CSF)和趋化因子(例如，MIP1-α和β和RANTES)来形成。免疫原可以连接于载体，并且具有或不具有间隔氨基酸(例如，gly-gly)。另外的载体包括病毒样颗粒。病毒样颗粒(VLP)，也称为假型病毒或病毒衍生颗粒，代表由能够在体内自组装成具有限定的球形对称性的VLP的病毒衣壳和/或包膜蛋白质的多个拷贝组成的亚单位结构。(Powilleit等人,(2007)PLoS ONE 2(5):e415。)另选地，肽免疫原可以连接于至少一个人工T细胞表位，所述表位能够结合大部分的MHC II类分子，诸如pan DR表位(“PADRE”)。PADRE描述于US 5,736,142、WO 95/07707和Alexander J等人,Immunity,1:751-761(1994)中。活性免疫原可以多聚体形式存在，其中免疫原和/或其载体的多个拷贝作为单个共价分子存在。
片段通常与药学上可接受的佐剂一起施用。相对于单独使用肽的情况，佐剂增加诱导抗体的滴度和/或诱导抗体的结合亲和力。多种佐剂可与tau的免疫原性片段组合使用以引发免疫应答。优选的佐剂增强对免疫原的固有应答，而不导致影响应答的定性形式的免疫原构象变化。优选的佐剂包括铝盐诸如氢氧化铝和磷酸铝、3De-O-酰化的单磷酰基脂质A(MPLTM)(参见GB 2220211(RIBIImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Montana,现为Corixa的一部分))。StimulonTM QS-21是从在南美洲发现的皂皮树(Quillaja SaponariaMolina)的树皮中分离的三萜糖苷或皂草苷(参见Kensil等人,在Vaccine Design:TheSubunit and Adjuvant Approach(Powell&Newman编辑，Plenum Press，NY，1995中)；US 5,057,540)，(Aquila BioPharmaceuticals,Framingham,MA；现为Antigenics Inc.,NewYork,NY)。其他佐剂是水包油乳剂(诸如角鲨烯或花生油)，任选地组合免疫刺激剂，诸如单磷酰基脂质A(参见Stoute等人,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))、普罗尼克(pluronic)聚合物以及杀死的分枝杆菌。Ribi佐剂是水包油乳液。Ribi含有用含有吐温80的盐水乳化的可代谢油(角鲨烯)。Ribi还含有充当免疫刺激剂的精制的分枝杆菌产品和细菌单磷酰基脂质A。另一种佐剂是CpG(WO 98/40100)。佐剂可以作为治疗组合物的组分与活性剂一起施用，或可以在施用治疗剂之前、同时或之后单独施用。
还可以使用诱导针对tau的抗体的tau的天然片段的类似物。例如，一种或多种或所有的L-氨基酸可以被此类肽中的D氨基酸取代。氨基酸的顺序也可以逆转(逆向肽(retropeptide))。任选地，肽包括相反顺序的所有D-氨基酸(逆反肽(retro-inverso peptide))。肽和其他化合物不一定与tau肽具有显著的氨基酸序列相似性，但仍然充当tau肽的模拟物并诱导相似的免疫应答。还可以使用针对如上所述的tau的单克隆抗体的抗独特型抗体。此类抗Id抗体模拟抗原并且产生针对所述抗原的免疫应答(参见Essential Immunology,Roit编辑,Blackwell Scientific Publications,Palo Alto,CA第6版,第181页)。
肽(和任选地与肽融合的载体)也可以以编码肽的核酸的形式施用并且在患者体内原位表达。编码免疫原的核酸区段通常连接于调控元件，诸如启动子和增强子，其允许DNA区段在患者的预期靶细胞中表达。为了在血细胞中表达，如免疫应答的诱导所希望的，来自轻链或重链免疫球蛋白基因或CMV主要立即早期启动子和增强子的启动子和增强子元件适于指导表达。通常将连接的调控元件和编码序列克隆到载体中。抗体也可以以编码抗体重链和/或轻链的核酸的形式施用。如果重链和轻链均存在，那么链优选作为单链抗体连接。用于被动施用的抗体也可以例如通过亲和色谱从用肽免疫原处理的患者的血清中制备。
DNA可以以裸露的形式(即，没有胶体或包封材料)递送。另选地，可以使用许多病毒载体***，包括逆转录病毒***(参见，例如，Lawrie and Tumin,Cur.Opin.Genet.Develop.3,102-109(1993))；腺病毒载体{参见，例如，Bett等人,J.Virol.67,591 1(1993))；腺相关病毒载体{参见，例如，Zhou等人,J.Exp.Med.179,1867(1994))、来自痘科的病毒载体(包括牛痘病毒和禽痘病毒)、来自α病毒属的病毒载体诸如衍生自新培斯病毒(Sindbis Viruse)和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Viruse)的那些(参见，例如，Dubensky等人,J.Virol.70,508-519(1996))、委内瑞拉马脑炎病毒(参见US5,643,576)和弹状病毒诸如水疱性口炎病毒(参见WO 96/34625)以及***瘤病毒(Ohe等人,Human Gene Therapy 6,325-333(1995)；Woo等人，WO 94/12629以及Xiao&Brandsma,Nucleic Acids.Res.24,2630-2622(1996))。
编码免疫原的DNA或含有其的载体可以包装到脂质体中。合适的脂质和相关类似物由US 5,208,036、US 5,264,618、US 5,279,833和US 5,283,185描述。载体和编码免疫原的DNA还可以被吸附至微粒载体或与其相关联，其实例包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚乳酸以及聚(丙交酯-共-乙交酯)，(参见，例如，McGee等人，J.Micro Encap.1996)。
V.筛选方法
可以如上所述针对预期结合特异性对抗体进行初始筛选。同样可以针对诱导具有这种结合特异性的抗体的能力对活性免疫原进行筛选。在这种情况下，使用活性免疫原对实验室动物进行免疫，并针对适当的结合特异性对所得血清进行测试。
然后可以在细胞和动物模型中测试具有期望的结合特异性的抗体。用于这种筛选的细胞优先为神经元细胞。已经报道了tau病理的细胞模型，其中用任选地具有与tau病理相关联的突变的tau的四重复结构域转染神经母细胞瘤细胞(例如，δK280，参见Khlistunova,Current Alzheimer Research 4,544-546(2007))。在另一模型中，通过添加强力霉素在神经母细胞瘤N2a细胞系中诱导tau。细胞模型使得能够研究在可溶或聚集状态中tau对细胞的毒性、开启tau基因表达后tau聚集体的出现、再次关闭基因表达后tau聚集体的溶解和抗体在抑制tau聚集体的形成或使其解聚方面的功效。
还可以在与tau相关联的疾病的转基因动物模型中筛选抗体或活性免疫原。此类转基因动物可包括tau转基因(例如，人同种型中的任一种)和任选的尤其人APP转基因，诸如磷酸化tau、ApoE、早老素或α突触核蛋白的激酶。此类转基因动物被设置用于发展与tau相关联的疾病的至少一种体征或症状。
示例性的转基因动物是K3系小鼠(Itner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(41):15997-6002(2008))。这些小鼠具有人tau转基因，所述人tau转基因具有K 369I突变(该突变与皮克氏病相关联)和Thy1.2启动子。该模型显示出快速的神经变性、运动缺陷以及传入纤维和小脑粒细胞的变性的过程。另一种示例性动物是pR5系小鼠。这些小鼠具有人tau转基因，所述人tau转基因具有P301L突变(该突变与额颞叶痴呆相关联)和Thy1.2启动子(Taconic,Germantown,N.Y.,Lewis等人,Nat Genet.25:402-405(2000))。这些小鼠具有更渐进的神经变性过程。小鼠在几个脑区域和脊髓中发展神经原纤维缠结，其据此整体以引用方式并入)。这是研究缠结发展的后果以及可抑制这些聚集体产生的筛选疗法的优秀模型。这些动物的另一个优点是病理的相对早发。在纯合系中，至少早在3个月就可以观察到与tau病理相关联的行为异常，但动物至少在8月龄之前都保持相对健康。换句话说，在8个月时，动物走动、给自己喂食，并且可以充分良好地执行行为任务以允许监测治疗效果。使用-AI wI KLH-PHF-1对这些小鼠进行6-13个月的主动免疫产生约1,000的滴度，并且相对于未处理的对照小鼠显示出较少的神经原纤维缠结、较少的pSer422和减少的体重减轻。
抗体或活性剂的活性可通过各种标准评估，包括总tau或磷酸化tau的量的减少、其他病理特征诸如Aβ的淀粉样蛋白沉积物的减少，以及抑制或延迟或行为缺陷。还可以针对血清中抗体的诱导对活性免疫原进行测试。可以针对抗体穿过血脑屏障进入转基因动物的脑中对被动和主动免疫原进行测试。还可以在天然地或通过诱导发展以tau为特征的疾病的症状的非人灵长类动物中测试抗体或诱导抗体的片段。对抗体或活性剂的测试通常与对照结合执行，其中进行平行实验，不同的是不存在抗体或活性剂(例如，通过媒介物替换)。然后可以相对于对照评估可归因于待测的抗体或活性剂的疾病体征或症状的减少、延迟或抑制。
VI.适合治疗的患者
已经在几种疾病中发现了神经原纤维缠结的存在，包括阿尔茨海默病、唐氏综合征、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞叶痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质性tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)、进行性核上性麻痹(PSP)。本发明的方案也可用于治疗或预防这些疾病中的任一种。由于神经疾病和病状与tau之间的广泛关联，本发明的方案可用于治疗或预防与没有神经疾病的个体中的平均值相比显示出升高水平的tau或磷酸化tau(例如，在CSF中)的任何受试者。本发明的方案还可用于治疗或预防在与神经疾病相关联的tau中具有突变的个体的神经疾病。本发明的方法特别适用于治疗或预防阿尔茨海默病，尤其是在患者中。
适合治疗的患者包括有患病风险但未显示出症状的个体，以及目前显示出症状的患者。有患病风险的患者包括具有已知的疾病遗传风险的那些。此类个体包括具有经历过该疾病的亲属的那些个体，以及通过遗传或生化标志物分析确定其风险的那些个体。风险的遗传标志物包括tau中的突变，诸如上面讨论的那些，以及与神经疾病相关联的其他基因中的突变。例如，杂合和甚至尤其纯合形式中的ApoE4等位基因与阿尔茨海默病的风险相关联。阿尔茨海默病风险的其他标志物包括APP基因中的突变，具体是位置717以及位置670和671处的突变(分别称为Hardy和Swedish突变)、早老素基因PS1和PS2中的突变、AD的家族史、高胆固醇血症或动脉粥样硬化。目前患有阿尔茨海默病的个体可以通过PET成像、由特征性的痴呆以及如上所述的风险因素的存在来识别。此外，许多诊断测试可用于鉴定患有AD的个体。这些包括CSF tau或磷酸化-tau以及Aβ42水平的测量。升高的tau或磷酸化-tau和降低的Aβ42水平意味着AD的存在。一些突变与帕金森病相关联。Ala30Pro或Ala53或与帕金森病相关联的其他基因诸如富含亮氨酸重复片段的激酶PARK8中的突变。根据DSM IV TR的标准，个体也可以被诊断患有上文提及的任何神经疾病。
在无症状患者中，治疗可以在任何年龄开始(例如，10、20、30)。然而，通常，在患者达到40、50、60或70岁之前不必开始治疗。通常需要在一段时间内进行多剂量的治疗。可以通过测定随时间推移的抗体水平对治疗进行监测。如果应答下降，表明需要加强剂量。在潜在的唐氏综合征患者的情况下，可以通过向母亲施用治疗剂在出生前开始治疗或在出生后不久开始治疗。
VII.药物组合物和治疗方法
在预防性应用中，抗体或用于诱导抗体的剂或其药物组合物以有效降低风险、减轻严重性，或延迟该疾病的至少一个体征或症状的发作的方案(剂量、频率和施用途径)施用至易患疾病(例如，阿尔茨海默病)或有患病风险的患者。具体地讲，该方案优选地有效抑制或延迟脑中的tau或磷酸化-tau和由其形成的成对丝，和/或抑制或延迟其毒性作用和/或抑制/或延迟行为缺陷的发展。在治疗性应用中，抗体或诱导抗体的剂以有效改善或至少抑制疾病(例如，阿尔茨海默病)的至少一个体征或症状的进一步恶化的方案(剂量、频率和施用途径)施用至疑似患有或已经患有该疾病的患者。具体地，该方案优选地有效减少或至少抑制与毒性和/或行为缺陷相关联的tau、磷酸化tau或由其形成的成对丝的水平的进一步增加。
如果个体治疗的患者达到的结果比不通过本发明的方法治疗的对比患者的对照群体中的平均结果更有利，或如果经治疗患者的结果相对于对照临床试验(例如，II期、II/III期或III期试验)中的对照患者被证明更有利，在p<0.05或0.01或甚至0.001的水平，那么方案被认为是治疗或预防有效的。
有效剂量随许多不同的因素而变化，所述因素诸如施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是否为ApoE载体、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。
抗体的示例性剂量范围为约0.01至100mg/kg，且更通常为0.01至5mg/kg或0.1至3mg/kg或0.15-2mg/kg或0.15-1.5mg/kg患者体重。抗体可以每天、隔日、每周、每两周、每月、每季度或根据通过实证分析决定的任何其他时间表施用此类剂量。示例性的治疗需要长期施用多种剂量，例如至少六个月。另外的示例性治疗方案需要每两周施用一次、或一月施用一次或每3至6个月施用一次。
对于人施用，用于主动施用的剂的量在每个患者0.1-500μg，且更通常在每次注射1-100或1-10μg变化。注射的时间可以从一天一次至一年一次至十年一次显著变化。典型的方案由免疫，然后以诸如6周间隔或两个月的时间间隔进行加强注射组成。另一种方案由免疫，然后在1、2和12个月后进行加强注射组成。另一种方案需要两月一次终身注射。另选地，加强注射可以如通过免疫应答的监测所指示的不规律地进行。
抗体或用于诱导抗体的剂优选通过外部途径(即施用的或诱导的抗体穿过血脑屏障到达脑部中的预期部位的途径)施用。施用途径包括局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内、眼内、鞘内或肌内。抗体施用的优选途径是静脉内和皮下。主动免疫的优选途径是皮下和肌内。这种类型的注射最通常在手臂或腿部肌肉中进行。在一些方法中，将剂直接注射到积聚沉积物的特定组织中，例如颅内注射。
用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌且基本上等渗并在GMP条件下制造的。药物组合物可以单位剂型(即，用于单次施用的剂量)提供。可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂配制药物组合物。配方取决于所选择的施用途径。对于注射，抗体可在水溶液，优选在生理相容的缓冲液诸如汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水或乙酸盐缓冲液中(以减少注射部位的不适)中配制。溶液可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，抗体可以是冻干形式，以在使用前用合适的媒介物(例如，无菌的无热原水)复原。
本发明的方案可以与有效治疗或预防正在治疗的疾病的另一种剂组合施用。例如，在阿尔茨海默病的情况下，本发明的方案可以与针对Aβ的免疫疗法(WO/2000/072880)、胆碱酯酶抑制剂或美金刚(memantine)组合，或在帕金森病的情况下，本发明的方案可以与针对α突触核蛋白的免疫疗法WO/2008/103472、左旋多巴、多巴胺激动剂、COMT抑制剂、MAO-B抑制剂、金刚烷胺或抗胆碱能剂组合。
VIII.体内成像、诊断方法和优化免疫疗法
本发明提供了在患者体内对tau蛋白沉积物(例如，神经原纤维缠结和tau内含物)成像的方法。该方法通过向患者施用试剂诸如结合tau的抗体(例如，小鼠、人源化、嵌合或饰面的16B5抗体)，然后在其结合后检测该剂来工作。结合氨基酸24至46内的tau表位的抗体是优选的。在一些方法中，抗体结合氨基酸25至44内或氨基酸30至39内的表位。通过使用缺乏全长恒定区的抗体片段，诸如Fab，可以避免或减少对所施用抗体的清除应答。在一些方法中，相同的抗体可以用作治疗和诊断试剂两者。
诊断试剂可以通过静脉内注射施用到患者体内，或通过颅内注射或通过在颅骨上钻孔直接施用到脑部中。试剂的剂量应在与用于治疗方法相同的范围内。通常，对试剂进行标记，但在一些方法中，对tau具有亲和力的主要试剂未标记并且第二标记剂用于结合主要试剂。标记的选择取决于检测手段。例如，荧光标记适用于光学检测。顺磁性标记的使用适用于无需外科手术干预的断层摄影检测。也可使用PET或SPECT检测放射性标记。
tau蛋白沉积物的体内成像方法可用于诊断tau蛋白病(诸如阿尔茨海默病、额颞叶变性、进行性核上性麻痹和皮克氏病)或确认其诊断或对这种疾病的易感性。例如，该方法可用于表现出痴呆症状的患者。如果患者具有异常的神经原纤维缠结，那么患者可能患有阿尔茨海默病。另选地，如果患者具有异常的tau内含物，那么取决于内含物的位置，患者可能患有额颞叶变性。该方法还可用于无症状患者。异常tau蛋白沉积物的存在表明对未来症状性疾病的易感性。该方法还可用于在先前已被诊断患有tau相关疾病的患者中监测疾病进展和/或对治疗的应答。
可以通过将标记基因座的数量、大小和/或强度与对应的基线值相比较来进行诊断。基线值可代表未患病个体的群体的平均水平。基线值还可代表在同一患者中确定的先前水平。例如，可以在开始tau免疫疗法治疗之前在患者中确定基线值，然后将测量值与基线值进行比较。相对于基线的值的减小传达了对治疗的阳性应答的信号。
在一些患者中，可以通过进行PET扫描来辅助tau蛋白病的诊断。可以使用例如常规的PET成像器和辅助设备进行PET扫描。扫描通常包括通常已知与tau蛋白沉积物相关联的一个或多个脑部区域以及其中通常存在很少(如果有的话)沉积物以用作对照的一个或多个区域。
在PET扫描中检测到的信号可以表示为多维图像。多维图像可以是表示穿过脑部的横截面的二维、表示三维脑部的三维或表示三维脑部随时间的变化的四维。可以使用具有不同颜色的色标，从而指示不同的标记量并且推测性地指示所检测到tau蛋白沉积物。扫描结果还可以利用与检测到的标记量以及因此tau蛋白沉积物的量相关的数字以数字方式呈现。存在于已知与特定tau蛋白病(例如，阿尔茨海默病)的沉积物相关联的脑部区域中的标记可与存在于已知与沉积物无关的区域中的标记进行比较，以提供指示前一个区域内的沉积物程度的比率。对于相同的放射性标记的配体，此类比例提供了不同患者之间的tau蛋白沉积物及其变化的可比较的度量。
在一些方法中，PET扫描与MRI或CAT扫描同时或在同一次患者就诊时进行。MRI或CAT扫描提供比PET扫描更多的脑部解剖细节。然而，来自PET扫描的图像可以叠加在MRI或CAT扫描图像上，从而更精确地指示相对于脑部的解剖结构PET配体的位置并由此推出tau沉积物的位置。一些机器可以执行PET扫描和MRI或CAT扫描，而无需患者在扫描之间改变位置，从而有利于图像的叠加。
合适的PET配体包括本发明的放射性标记的抗体(例如，小鼠、人源化、嵌合或饰面的16B5抗体)。所使用的放射性同位素可以是，例如，C11、N13、O15、F18或I123。施用PET配体与进行扫描之间的间隔可取决于PET配体，且具体地是其在脑部的摄取和清除速率，以及其放射性标记的半衰期。
PET扫描还可以作为预防措施在无症状患者中或在有轻度认知障碍症状但尚未被诊断患有tau蛋白病但发展tau蛋白病的风险高的患者中进行。对于无症状患者，扫描尤其适用于由于家族史、遗传或生化风险因素或中老年而被认为患tau蛋白病的风险高的个体。例如在45与75岁之间的患者年龄就可以开始预防性扫描。在一些患者中，在50岁时进行第一次扫描。
预防性扫描可以以例如介于六个月与十年，优选地介于1至5年的间隔进行。在一些患者中，一年一次进行预防性扫描。如果作为预防措施进行的PET扫描指示异常高的tau蛋白沉积物水平，那么可以开始免疫疗法并且随后进行PET扫描，就像在被诊断患有tau蛋白病的患者中那样。如果作为预防措施进行的PET扫描指示tau蛋白沉积物的水平在正常水平内，那么可以像之前一样以介于六个月与10年之间、且优选地1至5年的间隔，或响应于tau蛋白病或轻度认知障碍的体征或症状的出现而进行另外的PET扫描。如果且当检测到高于正常水平的tau蛋白沉积物时，通过将预防性扫描与tau定向免疫疗法的施用组合，可以将tau蛋白沉积物的水平降低至或接近正常水平，或至少抑制进一步增加，并且与没有接受预防性扫描和tau定向免疫疗法相比，患者可以保持更长时间不患tau蛋白病(例如，至少5年、10年、15年或20年，或患者的余生)。
tau蛋白沉积物的正常水平可以通过未被诊断患有特定tau蛋白病(例如，阿尔茨海默氏病)且不被认为处于发展这种疾病的高风险的普通群体中的个体的代表性样本(例如，50岁以下无疾病个体的代表性样本)的脑部神经原纤维缠结或tau内含物的量来确定。另选地，如果已知其中发展了tau蛋白沉积物的脑部区域中的根据本方法的PET信号不同于(在测量的准确度内)来自其中已知此类沉积物通常不发展的脑部区域中的信号，那么可以在个体患者中识别正常水平。通过与正常水平(例如，外部平均值和标准偏差的方差)进行比较，或者仅仅由与不被已知与沉积物相关联的区域相比与tau蛋白沉积物相关联的脑部区域中超出实验误差的升高的信号，可以识别个体中的升高水平。为了比较个体和群体中tau蛋白沉积物的水平，tau蛋白沉积物应优选在脑部的一个或多个相同区域中确定，这些区域包括已知形成与特定的tau蛋白病(例如，阿尔兹海默病)相关联的tau蛋白沉积物的至少一个区域。具有升高水平的tau蛋白沉积物的患者是开始免疫疗法的候选者。
在开始免疫疗法后，可首先将tau蛋白沉积物水平的降低视为治疗具有期望效果的指示。观察到的降低可以是，例如，在基线值的1-100％、1-50％或1-25％的范围内。此类效果可以在已知沉积物在其中形成的脑部的一个或多个区域中测量，或可以由此类区域的平均值测量。治疗的总效果可以通过将相对于基线的减少百分比与平均未治疗患者中将可能存在的tau蛋白沉积物的增加相加来近似计算。
tau蛋白沉积物在大约恒定水平的维持或甚至tau蛋白沉积物的少量增加也可以指示对治疗的应答，尽管是非最佳应答。可以将此类应答与未接受治疗的具有特定tau蛋白病(例如，阿尔茨海默病)的患者中的tau蛋白沉积物水平的时间过程进行比较，以确定免疫疗法是否具有抑制tau蛋白沉积物进一步增加的作用。
tau蛋白沉积物的变化的监测允许响应于治疗调整免疫疗法或其他治疗方案。PET监测提供了对治疗的应答的性质和程度的指示。然后，可以确定是否调整治疗，并且如果需要，可以响应于PET监测来调整治疗。因此，PET监测允许在其他生物标志物、MRI或认知测量已经可检测地响应之前调整tau定向免疫疗法或其他治疗方案。显著变化意指治疗后的参数值相对于基线的比较提供了治疗已经或尚未产生有益效果的一些证据。在一些情况下，患者自身中参数值的变化提供了治疗已经或尚未产生有益效果的证据。在其他情况下，将患者中的值的变化(如果有的话)与未进行免疫疗法的患者的代表性对照群体中的值的变化(如果有的话)进行比较。特定患者的应答与对照患者的正常应答的差异(例如，平均值加标准偏差的方差)也可以提供免疫疗法方案在患者中实现或未实现有益效果的证据。
在一些患者中，监测指示了tau蛋白沉积物的可检测下降，但是tau蛋白沉积物的水平仍保持高于正常水平。在此类患者中，如果没有不可接受的副作用，那么治疗方案可以按原样继续，或甚至增加施用频率和/或剂量(如果尚未达到最大推荐剂量的话)。
如果监测指示患者中tau蛋白沉积物的水平已经降低至tau蛋白沉积物的正常或接近正常水平，那么免疫治疗方案可以从诱导的方案(即，降低tau蛋白沉积物的水平)调整为维持的方案(即，将tau蛋白沉积物维持在大致恒定的水平)。这种方案可通过减少施用免疫疗法的剂量和/或频率实现。
在其他患者中，监测可指示免疫疗法具有一些有益效果但是非最佳效果。最佳效果可以定义为在开始疗法后在给定时间点进行免疫疗法的tau蛋白病患者的代表性样本所经历的tau蛋白沉积物的变化的上半部分或四分点之内的tau蛋白沉积物水平的百分比减少(在整个脑部或已知tau蛋白沉积物在其中形成的其代表性区域中测量或计算)。经历较小降低的患者或其tau蛋白沉积物保持恒定或甚至增加但程度小于在不存在免疫疗法的情况下所预期的程度(例如，如从不施用免疫疗法的患者的对照组所推断的那样)的患者可被归类为经历阳性但非最佳的应答。此类患者可以任选地进行方案调整，其中增加了剂的剂量和或施用频率。
在一些患者中，tau蛋白沉积物可以与不接受免疫疗法的患者中的tau沉积物类似或更大的方式增加。如果此类增加持续一段时间，诸如18个月或2年，甚至在剂的频率或剂量的任何增加之后，那么可以根据需要停止免疫疗法，以有利于其他治疗。
诊断、监测和调整tau蛋白病的治疗的以上描述主要集中在使用PET扫描。然而，可以使用用于可视化和/或测量适于本发明的tau抗体(例如，小鼠、人源化、嵌合或饰面的16B5抗体)的使用的tau蛋白沉积物的任何其他技术代替PET扫描来执行此类方法。
实施例
实施例1.抗体16B5的生成
产生泛抗体16B5(识别tau，无论其是否被磷酸化)以纯化tau，并基于其在ELISA测定中的高亲和力捕获特性进行选择。
实施例2.抗体16B5的克隆和测序
使用Trizol LS(Invitrogen)从表达16B5抗体的球团化细胞中提取RNA。使用Quant-IT试剂盒(Invitrogen)测量RNA浓度。
使用Smart RACE试剂盒(Clontech)用5’-RACE扩增IgG mRNA的5′端。将约1μg的RNA用于RT反应，并使用与Smart RACE试剂盒一起提供的通用引物和在ExonBIO设计的基因特异性引物(GSP)对cDNA库进一步扩增。
引物序列：
通用引物：CTAATACGACTCACTATAGGGC(SEQ ID NO：7)
GSP：
IgG1和IgG2a：CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC(SEQ ID NO：8)
IgG2b：CTC AAG TTT TTT GTC CAC CGT GGT GC(SEQ ID NO：9)
将PCR产物凝胶纯化并克隆到pSUPER-平端载体(Adexon，www.adexonbiotech.com)中。对于重链，小量制备15个集落并测序。对于轻链，进行集落PCR以区分内源性异常轻链，并且仅对未从集落PCR扩增的克隆进行测序。在NTI vector上分析测序结果。在图谱上标出衔接子和GSP引物序列。衔接子与GSP序列之间的区域是IgG重链序列，其包含前导序列、信号肽和V区，以及恒定区的一部分。在图谱上标出ORF。
实施例3.抗体16B5的表位作图
通过肽片段分析进行的表位的鉴定。使具有4个微管结合重复序列且没有N末端***物并且含有P301L突变的人tau序列(rTau)在大肠杆菌中表达并纯化。tau的这种形式具有SEQ ID NO：3的序列，其中位置243(基于tau的最长同种型，使用编号惯例，其对应于P301L)处的亮氨酸被脯氨酸取代。使用四种不同蛋白酶中的一种进行200ug的tau的酶消化：胰蛋白酶(在精氨酸和赖氨酸的羧基端切割)、胰凝乳蛋白酶(主要在酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的羧基端切割)、LysC(在赖氨酸的羧基端切割)或GluC(在谷氨酸残基后切割且很少在天冬氨酸残基后切割)。所有蛋白酶均从Thermo Scientific获得，并且消化在37℃下进行16h。将所得的肽片段与10μg的16B5一起孵育，并使用Protein G磁珠(NEB)沉淀。将沉淀物在包含300mM NaCl和0.5％NP-40的PBS中彻底洗涤，然后用在100mM甘氨酸中的1M NaCl(pH 2.8)洗脱。将洗脱液真空干燥并重悬于0.1％三氟乙酸(TFA)中。将重悬的洗脱液上样到4.6x50mm C18柱上，然后使用乙腈的线性梯度与0.075％TFA通过HPLC(Agilent1260Infinity***)进行分级。收集峰级分，干燥并重悬于蒸馏水中。通过MALDI-TOF/TOF确定肽质量和身份。在LysC MS谱中鉴定与SEQ ID NO:1的残基25-44相对应的峰。在胰蛋白酶MS谱中鉴定与SEQ ID NO:1的残基25-44和24-44相对应的峰。从胰凝乳蛋白酶和GluC消化物中没有获得信号，表明一些表位可包含SEQ ID NO:1的残基29和/或SEQ ID NO:1的残基37。
通过突变分析进行的表位的鉴定。使用通过肽片段分析(如上所述)确定的结果，使用标准分子生物学方法通过全质粒扩增进行rTau的缺失诱变。在小体积的细菌培养物中表达蛋白质，并且将等体积的澄清细菌裂解物电泳、印迹并用16B5抗体染色。为了控制样品上样，使用对tau的C末端区域(C末端表位)具有特异性的抗体Tau46来染色一式两份印迹。两种抗体均以0.2μg/mL的浓度使用。使用Licor Odyssey荧光扫描仪捕获图像。制备了以下tau缺失突变体并以此方式进行分析：Δ5-24、Δ23-32、Δ25-44、Δ30-39和Δ37-46。如图1和2所示，通过16B5抗体未检测到tau的Δ25-44和Δ30-39缺失突变体，提供了由16B5识别的表位位于那些残基内的证据。用16B5仅可轻微检测到tau的Δ37-46缺失突变体，提供了37-46内的一些残基(例如，残基37)可在16B5与tau的结合中起作用的证据。16B5抗体对tau的Δ23-32缺失突变体的染色程度小于Δ5-24，并且大于Δ25-44和Δ30-39缺失突变体，提供了16B5也可与包含残基33-36、30-36、33-37、30-37或33-39的肽结合的证据。总的来说，从tau缺失突变体获得的数据表明，16B5识别的表位可包含SEQ ID NO:1的残基23-32中的一些或全部和SEQ ID NO:1的残基37-46中的一些或全部。例如，16B5可识别SEQ ID NO:1的残基32-38或28-41内的表位。
通过丙氨酸扫描进行的表位的鉴定。接下来使用PCR诱变将tau的跨越残基30-42的区域内的单个残基突变为丙氨酸。表达突变的蛋白质，并且将裂解物通过电泳解析并使用16B5抗体或Tau46抗体进行印迹，如上文所述。该分析的结果如图3所示。所分析的特定点突变体，包括T30A、M31A、H32A、Q33A、D34A、Q35A、E36A、G37A、D38A、T39A、D40A、A41L和G42A，在印迹图上方列出。在每个印迹图上将特别感兴趣的残基框在框中。16B5的可检测的结合被Q33A tau突变体完全消除并且被G37A tau突变体显著减少，提供了残基33和较小程度上的残基37可以是由16B5识别的表位的重要组分的证据。其他残基可以是在Biacore分析中由16B5识别的表位的重要组分。
实施例4.tau蛋白病的hTau.P301L转基因小鼠模型中的被动免疫
免疫。使用具有FVB/N遗传背景的3月龄hTau.P301L-Tg雌性小鼠进行本研究。腹膜内执行10mg/kg的测试和对照抗体的施用，每周一次。处理持续时间为约5个月。在23次注射后，以处死小鼠结束研究。表1描述了本研究中施用的测试和对照抗体。
表1
表1
过早死亡是在转基因鼠tau蛋白病模型中观察到的表型。本研究中使用的具体模型在6月龄时患上过度磷酸化的Tau，但具有发作的高变性。小鼠还患有运动缺陷，如后肢抱握和一般性活动减少，并在8-11月龄时过早死亡(reMYND未公布的数据，Terwel等人,2005)。将出现末期疾病症状(其特征在于存在抱握表型和体重减轻)的小鼠处死。数量高得出人意料的小鼠过早死亡，而没有出现这些症状。这种情况下的死亡原因被认为与晚期tau蛋白病或测试抗体无关，相反被认为与近交FVB/N背景有关。
表2示出研究过程中所有小鼠的总体存活的概况。
表2
*在研究开始时，必须替换K组中的一只小鼠。可以用也可以不用这只替换小鼠来分析数据。
处死后，将小鼠解剖并且使用波特型机械匀浆器(VOS14S40，速率750rpm；VWR)在10重量-体积的冰冷的Tris-蛋白酶-磷酸酶-抑制剂缓冲液(TPPI-缓冲液)中将脑干和中脑匀浆，所述缓冲液包含：20mM Tris-HCl(pH 8.1)；150Mm NaCl；1mM乙二胺四乙酸(EDTA，Merck)；1mM乙二醇四乙酸(EGTA，Sigma-Aldrich)；5mM焦磷酸钠(Sigma)；30mM氟化钠(Sigma-Aldrich)；1mM PMSF(Sigma)；2mM钒酸钠(Sigma)；10mM 1,10-邻菲咯啉一水合物(Sigma-Aldrich)；5μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂；5μg/ml胃酶抑素；以及蛋白酶抑制剂的混合物(CPI，Roche Diagnostics GmbH,Germany)。将相应的140μl和100μl的固定体积的脑干和中脑匀浆(TotH)(大约总体积的一半)在4℃下以136000xg离心60min(TLA-55转子，OptimaTMTLX Ultracentrifuge，Beckman Coulter)以产生Tris可溶性级分(SF)，总匀浆的其余部分储存于-80℃。由于离心支架的数量有限(N＝12)，将样品随机化以使离心机平衡并划分不同的治疗组经历不同的离心过程。
将上清液(S1，也称为“可溶性级分”或“SF”)与球团(P1)分离，等分并储存于-80℃。将P1球团溶解于10重量体积的高盐溶液(0.85M含有NaCl的TPPI缓冲液)中，并在4℃下以20000xg离心30min。将所得的高盐球团(P2)储存于-80℃。用十分之一的10％Sarkosyl使上清液(S2)达到1％Sarkosyl并在顶置式(top-over-top)旋转滚筒中在室温下孵育60min，然后在4℃下以136000xg离心60min。Sarkosyl可溶性上清液(S3)储存在-80℃下，并且Sarkosyl不溶性球团(P3，也被称为“不溶性级分”或“IF”)重悬于30μl的TPPI缓冲液中并等分。通过上述分级方案产生的总匀浆(TotH)、Tris-可溶性(SF)和Sarkosyl-不溶性(IF)脑干级分用于随后的聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹。为了应用于常规SDS-PAGE和蛋白质印迹，样品通过在95℃下孵育10min变性并还原，然后在7.5％的Tris-HCl凝胶(标准XT预制凝胶，26孔梳，15μl，1.0mm；Biorad)上分离。干电转移(iBlotTM Invitrogen)至PVDF-膜(iBlotTMGel Transfer Stacks，PVDF，Regular，Invitrogen)后，将膜在0.4％PFA中洗涤30min，然后在Tris-缓冲盐水中洗涤。接下来将膜在含有5％(w/v)脱脂奶粉和0.1％(v/v)吐温20的Tris-缓冲盐水(TBS，pH 7.6)中孵育1小时。以表3所示的工作浓度用各种抗-tau一抗孵育印迹过夜。用抗-小鼠或抗-兔HRP-缀合的二抗(山羊-抗-小鼠或山羊-抗-兔IgG，DAKO)洗涤并孵育后，通过ECL检测***(SuperSignal West Femto Maximum SensitivitySubstrate，产品34096，Thermo Scientific)将印迹显影。以不同的暴露时间数字化地记录图像(VisionWorks Acquisition，UVP)，并用专用软件(VisionWorks Analysis，UVP)进行印迹的分析。为了作比较，将凝胶间(inter-gel)参考凝胶与待比较的在每个凝胶上跑胶的四个级分的等分试样一起跑胶。用于检测的抗-tau单克隆一抗包括AT100(磷酸化-Tau，Thermo Scientific；稀释度1:250)、AT8(磷酸化-Tau，Thermo Scientific；稀释度1:500)、HT7(泛Tau，Pierce；稀释度1:1000)以及1F5(对于测试设施来说表位未知，Neotope，稀释度3:500)。用抗-GAPDH(Abcam 9485；稀释度1:2500)作为上样对照对印迹进行再次检测。泛Tau抗体对于磷酸化-Tau没有特异性。
表3
用于生化分析的抗体的汇总
*IgG2b同种型，JH131-1F5.4.1杂交瘤，批号NB-0081
如图4所示，与用6F10对照抗体处理的动物相比，在来自用16B5抗体处理的动物的sarkosyl不溶性脑干级分中观察到tau的量的统计学上显著的降低。使用Student的t检验评估统计学显著性，p<0.05。用磷酸化-tau特异性抗体(AT8，左上图；AT100，左下图；1F5，右上图)和泛tau抗体(HT7，右下图)观察到这种降低。当用磷酸化特异性抗体检测时，相对于用6F10抗体处理的对照动物，在16B5处理的动物中，总匀浆的蛋白质印迹也指示磷酸化-tau与总tau的比率显著降低。参见图5，左图(示出了用AT8抗-磷酸化-tau抗体检测的信号除以用HT7泛tau抗体检测的信号)。与此相反，与用6F10抗体处理的对照动物相比，在16B5处理的动物的总匀浆中，总tau与GAPDH水平的比率没有显著变化。参见图5，右图(示出了用HT7泛tau抗体检测的信号除以用GAPDH抗体检测的信号)。这些数据提供在匀浆中磷酸化-Tau而不是总tau的水平发生降低的证据。
组织学分析。在底丘脑核附件未定带(STH/ZI)和小脑的间位核、前部和后部、附件侧小脑核(IntA/P/LAT)中进行使用抗-磷酸化-tau抗体的免疫组织化学分析。将弧形振动切片机切片(40μm)在4℃储存于具有0.1％叠氮化钠的PBS中，直至使用。将每只小鼠的所指示的前囟处的八个切片用mAb AT8、AT100或1F5自由浮动地染色。选择切片以使用如在下表4中所列出的所指示的抗体进行染色。对所选的用于特定染色的所有动物的切片进行随机染色和盲定量。
在NetwellsTM中孵育自由浮动的切片。然后将切片在PBS中洗涤两次，并在PBS和甲醇(1:1)的1.5％过氧化氢中孵育20分钟以除去内源性过氧化物酶活性。在含有0.1％Triton X100(PBST)的PBS中洗涤切片三次后，将切片在PBST中的10％胎牛血清(FCS)中封闭30min，接着在具有10％FCS的PBST中，与分别使用0.4μg/ml和0.05μg/ml的浓度的一抗AT8、AT100(Thermo scientific)一起孵育过夜。漂洗后，将切片与山羊抗-小鼠过氧化物酶标记的(GAMPO)二抗(DAKO，在PBST中的1/500，10％FCS)一起孵育，并且使信号用3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB，每10ml Tris-HCl 1片且每10ml的3μl H2O2)显影。将切片用Mayer氏苏木精共染色，在五个梯度的乙醇(50、70、95和2x100％)和二甲苯(Merck Eurolab)中脱水，并固定在Depex(Depex固定介质，BDH Laboratory)中。
表4
用于免疫组织化学分析的抗体的汇总
mAb 供应商 特异性 宿主 储液浓度 工作浓度
AT8 Thermo Scientific 人 小鼠 200μg/ml 0.4μg/ml
AT100 Thermo Scientific 人 小鼠 200μg/ml 0.05μg/ml
使用配备有Color view II Olympus相机的Olympus BX41显微镜获取图像，并用计算机使用AnalySIS Five–Cell^D软件进行分析。在整个图像获取过程中，显微镜的光强度和聚光器设置保持恒定。所有获取的图像经受相同的计算机子例程，以使研究者偏差最小化。在整个分析中一致地应用密度切片阈值。
选择如下所定义的感兴趣区域以用于一个或多个染色信号的自动定量。底丘脑核和未定带分别通过大脑脚腹侧和白质背侧并基于细胞密度的差异描绘(弓形小脑切片前囟1,32-1,92)。小脑的间位核、前部和后部、以及侧面小脑核通过白质和细胞密度的变化以及第三脑室描绘(矢状小脑切片，用于LAT的前囟1,92-2,64和用于IntA/P的0,84-1,8)。对于各染色而言，在分析中每个小鼠有6个含有STH/ZI的脑切片和16个含有IntA/P/LAT的切片。
如图6所示，相比于用6F10抗体处理的对照动物的相同结构中检测的磷酸化-tau的量，在用16B5抗体处理的动物的小脑核和底丘脑区域中检测到的磷酸化-tau的量显著降低。使用Student的t检验评估统计学显著性，p<0.05。
实施例5.16B5的人源化
序列分析表明，16B5抗体具有可变的κ(Vk)结构域，所述κ(Vk)结构域具有SEQ IDNO:16的序列，其属于小鼠Kabat第1亚组，并对应于人的Kabat第4亚组。Kabat CDR用下划线标出。16B5抗体的可变重(Vh)结构域具有SEQ ID NO:10的序列，其属于小鼠Kabat第2b亚组，并对应于人Kabat第1亚组(Kabat等人(1991),Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版；NIH出版号91-3242)。Kabat CDR用下划线标出。
16B5 Vk结构域包括17残基CDR-L1序列(KSSQSLLNSRTRKNYLA，SEQ ID NO:17)、7残基CDR-L2序列(WASTRES，SEQ ID NO:18)以及8残基CDR-L3(KQSYTLRT，SEQ ID NO:19)。CDR-L1序列属于规范类别3，并且CDR-L2和CDR-L3序列属于类别1(Martin&Thornton(1996),J.Mol.Biol.263:800-15)。
16B5 Vh结构域包括基于Kabat编号的5残基CDR-H1序列(YHGMD，SEQ ID NO:11)或基于组合的Kabat和Chothia编号的10残基CDR-H1序列(GYPFTYHGMD，SEQ ID NO:24)、17残基CDR-H2序列(WINTYSGVPTYADDFKG，SEQ ID NO:12)以及8残基CDR-H3序列(RRDFTMDF，SEQID NO:13)。CDR-H1序列属于规范类别1并且CDR-H2序列属于类别2(Martin&Thornton(1996),J.Mol.Biol.263:800-15)。CDR-H3序列没有规范类别，但根据Shirai等人(1999),FEBS Lett.455:188-97的规则可能具有扭结的碱基。
在Vk和Vh结构域之间的界面的残基是在小鼠这些位置的常见残基。
对PDB数据库中的蛋白质序列进行了搜索(Deshpande等人(2011),J.Virol.85:1820-33)，以寻找将提供16B5抗体的粗略结构模型的结构。抗-霍乱毒素抗体Fab片段Te33(pdb代码1ZEA_H)的结构用于具有1.78A的分辨率的VL。它保留了与16B5相同的规范环结构。Dsbb-Fab复合物(pdb代码2ZUQ_B)中的Fab晶体结构用于16B5的VH结构域的模型。它解决了3.3A的分辨率并含有与CDR-H1和CDR-H2相同的规范结构，以及相同长度的具有扭结碱基的CDR-H3。BioLuminate程序用于对16B5Fv的粗略结构建模。
具有CDR“X”的16B5Fv序列的来自NCBI的非冗余蛋白质序列数据库的搜索允许选择合适的人框架，其中接枝了鼠CDR。对于Vk，选择具有NCBI登录号ACJ71718.pro的人κ轻链(SEQ ID NO:20)。该人κ轻链序列具有与CDR-L2和L3相同的规范类别。对于Vh，选择人Ig重链BAC02002.1(SEQ ID NO:14)。它共享16B5CDR-H1和H2的规范形式，并且H3为8个残基长，具有预测的扭结碱基。
基于这些人框架的人源化的重链和轻链设计以及回复突变分别在表5和表6中示出。
设计了具有SEQ ID NO:15的序列的人源化16B5可变重链(H1)。该设计包括四个回复突变：R13K；S28P、V48M；以及Y91F。选择位置13处的K，因为它在人中比R更加频繁。选择位置S28处的P，因为它位于Chothia CDR区域内。选择位置48处的M，因为它在人中比V更加频繁。选择位置98处的F，因为它位于界面处，使得有希望保留小鼠残基。
设计了具有SEQ ID NO:35的序列的人源化16B5可变重链(H2)。该设计包括四个回复突变：R13K；S28P、V48M；以及Y91F。这些突变中的每一个的基本原理与H1相同。该设计还包括Q1E突变，以潜在提高稳定性。
设计了四个人源化16B5可变轻链序列：型式1(L1)具有SEQ ID NO:21的序列并包括三个回复突变：D1N；M4L；以及Y36F。选择位置1处的N，因为它与HCDR2中的N61形成潜在氢键。选择位置4处的L，因为它接触LCDR3中的K96、Q97和S98；它还接触界面残基F104。选择位置36处的F，因为Y可以与HCDR3中的D106氢键合，而F不能。氢键将构成可能影响HCDR3功能的额外的相互作用，因此优选避免。
型式2(L2)具有SEQ ID NO:22的序列并包括四个回复突变：D1N；M4L；Y36F；以及P43S。D1N、M4L和Y36F的基本原理与型式1相同。选择位置43处的S，因为S与VH中的Q110形成氢键，其接近HCDR3。
型式3(L3)具有SEQ ID NO:23的序列并包括三个回复突变：M4L；Y36F；以及P43S。这些突变中的每一个的基本原理与型式1和2相同。
型式4(L4)具有SEQ ID NO:36的序列并且包括型式2的四个回复突变，加上D9S。包括D9S以除去蛋白水解位点。
型式5(L5)具有SEQ ID NO:39的序列并且包括型式4的回复突变，不同的是位置L1被D占据。
表5
用于16B5重链的人源化的序列
表5
用于16B5重链的人源化的序列
表5
用于16B5重链的人源化的序列
表5
用于16B5重链的人源化的序列
表6
人源化16B5轻链可变区的序列
表6
人源化16B5轻链可变区的序列
表6
人源化16B5轻链可变区的序列
表6
人源化16B5轻链可变区的序列
实施例6.人源化16B5抗体的Tau亲和力
具有H1L2、H1L4、H2L2、H2L4设计的人源化16B5抗体的结合数据在下表7中示出。为了比较，还示出了嵌合16B5的结合数据。使用Biacore仪器生成数据。
使用Biacore T200(GE Lifesciences)进行表面等离子共振测量。所有实验均使用30μl/min的10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl和0.05％吐温20的流动相在通过胺偶联抗-小鼠或抗-人捕获抗体制备的CM5传感器芯片上进行。16B5(嵌合或人源化形式)结合至固定的捕获抗体，并且将不同浓度的重组纯化hTau-P301L连续迭代地施加至抗体复合物。用高盐或低pH再生步骤分开迭代步骤。用抗体和抗原的不同制剂重复实验。用机载的Biacore软件进行分析。H1L1形式具有为嵌合抗体的约1/3的解离常数。如表7中所示，其他形式具有与嵌合抗体相当或至少在其2倍之内的解离常数。
表7
k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) K<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
H1L2 4.47E7 1.31E-4 2.94E-12
H1L4 4.36E7 1.37E-4 3.15E-12
H2L2 4.85E7 1.38E-4 2.86E-12
H2L4 4.34E7 1.71E-4 3.95E-12
Chi16B5 2.32E-12
实施例7.使用人源化16B5抗体进行的Tau的免疫沉淀检测
来自Braak得分为6的阿尔茨海默病患者的额皮质的尸检样品依次在增溶强度增大的缓冲液中提取，顺序如下：(i)高盐缓冲液(20mM Tris、5mM EDTA、1mM DTT、10％蔗糖、7500mM NaCl，pH 7.4)，(ii)Triton缓冲液(20mM Tris、5mM EDTA、1mM DTT、10％蔗糖、1％Triton X100、500mM NaCl，pH 7.4)以及(iii)Sarkosyl缓冲液(10mM Tris、5mM EDTA、1mMDTT、10％蔗糖、500mM NaCl、1％Sarkosyl，pH 7.4)。
对于每个样品，将200微克的高盐可溶性级分或20微克的sarkosyl不溶性级分稀释到400微升的免疫沉淀缓冲液(10mM Tris、150mM NaCl、0.5％Triton X100、1mM EGTA、1mM EDTA，pH 7.4)中。将样品用蛋白G磁珠(New England Biolabs)预澄清，并向每个管中添加5微克的抗体。所用抗体包括：1)小鼠非免疫IgG抗体(mIgG)，作为对照；2)人非免疫IgG抗体(hIgG)，作为对照；3)嵌合16B5抗体(Chi16B5)；4)人源化16B5，型式H1L2(h16B6-H1L2)；以及人源化16B5，型式H1L3(h16B6-H1L3)。将预澄清的裂解物和抗体在4℃下孵育2小时。通过使用蛋白G磁珠沉淀抗体/抗原复合物，并用PBS/350mM NaCl彻底洗涤沉淀物。用Laemmli缓冲液洗脱后，通过SDS-PAGE解析洗脱液并使用多克隆tau抗体(DAKO)进行印迹。
如图7所示，嵌合16B5和人源化16B5H1L2和H1L3识别来自阿尔茨海默病脑的可溶性和不溶性级分中的tau。
实施例8.小鼠和人源化16B5tau抗体在阿尔茨海默病脑上的免疫组织化学表征
鼠单克隆抗-tau抗体16B5及其两个人源化变体(h16B5-H1L2和h16B5-N1D)还在来自阿尔茨海默病供体和非患病的老年对照的人脑皮质的新鲜冷冻切片上进行免疫组织化学测试。
方法：
人脑组织
额皮质获自Sun Health Research Institute。案例包括被诊断患有阿尔茨海默病且在尸检神经病理学评估时证实的6名患者(平均年龄86.8±0.40SEM)，以及3名未患病的老年对照(平均年龄77±9.7SEM)。案例的人口统计学资料在下表8中列出。在轻度丙酮固定的10um载玻片包埋的冷冻切片上进行免疫组织化学。
表8
进行免疫组织化学检查的案例的人口统计学资料
案例 诊断 死亡年龄(岁) 性别 尸检间隔(h)
11-21 AD 88 F 2.28
03-34 AD 88 F 3.3
08-06 AD 86 M 2.66
03-52 AD 86 M 2.2
01-16 AD 87 M 3
01-18 AD 86 M 3
10-63 对照 79 M 3
10-39 对照 93 M 3
10-22 对照 59 F 3.2
免疫组织化学
免疫过氧化物酶法是主要检测体系，其由过氧化物酶标记的、与山羊抗-小鼠免疫球蛋白缀合的聚合物(EnVision+System HRP标记的聚合物；DakoK4001)或用于直接生物素化人源化抗体的Vector ABC扩增***(ABC Elite Standard；PK-6100；VectorLaboratories)组成。用DAB色原(液体DAB+底物色原体系；DakoK3468)使染色可视化，其产生了棕色沉积物。
阴性对照由用IgG同种型对照抗体或省略一抗在相邻切片上执行整个免疫组织化学程序组成。
免疫荧光标记
进行双重免疫荧光染色以确定抗体的鼠和人源化变体、识别各种磷酸化表位的其他tau抗体、以及淀粉样蛋白β之间的关系。用抗体混合物平行地进行组织切片染色，所述抗体混合物含有生物素化的或FITC标记的人源化16B5变体(1ug/mL)和鼠抗体(单克隆16B5(1ug/mL)、AT8(1:1000)、AT100(1:1000)或3D6(1ug/mL)。用缀合至488或635荧光团(Invitrogen)的山羊抗-小鼠二抗检测鼠抗体。用链霉抗生物素蛋白635检测生物素化的人源化抗体。
预吸附
为了评估抗体对其靶抗原的特异性，在4℃下，用50ug/mL纯化的人P301L tau或野生型突触核蛋白(synuclein)(不相关蛋白)预吸附1ug/mL的16B5抗体过夜。然后将抗体应用于组织并如上所概述进行免疫组织化学程序。
图像分析
使用Olympus BX61显微镜、Olympus Nanozoomer 2.0HT或Leica SPE光谱共焦***中的任一个对载玻片成像。图像被收集为TIFF文件。
结果
如下表9所示，小鼠单克隆抗体16B5和人源化变体均显示出对于阿尔茨海默病组织的反应性，染色主要在神经纤维网线、一些神经原纤维缠结(主要是球状的)以及一些tau阳性神经炎性斑。大多数16B5AD-纤维状病理仅限于灰质，但在白质中也检测到了一些反应性。相反，非患病对照组织显示出弥漫背景反应性，但是对在AD组织中发现的任何病理为阴性。
用16B5的鼠单克隆型式并且用(1)两种人源化变体，(2)在各种磷酸化的表位识别tau的抗体，以及(3)β淀粉样蛋白进行双标记实验，以进一步表征由抗体变体识别的病理。
利用在AD-纤维状病理结构上的高度一致性将h16B5-H1L2和h16B5-N1D与单克隆16B5抗体共定位。H16B5-H1L2还检测到被显示对各种磷酸化tau表位具有免疫反应性的病理，所述表位包括丝氨酸202和苏氨酸205(AT8)、丝氨酸212和苏氨酸214(AT100)、以及丝氨酸396(内部专有抗体，20H1)。最后，用淀粉样蛋白β双标记识别N末端氨基酸序列的抗体(3D6；氨基酸1-5)和16B5在淀粉样蛋白斑上显示出非常少的Aβ与16B5免疫反应性结构之间的共定位。
当16B5免疫反应性与充分表征的可商购获得的单克隆抗-tau抗体(Dako)相比较时，两者都使纤维状AD病理染色，所述病理包括tau阳性神经炎性斑、神经纤维网线以及神经原纤维缠结。
通过用纯化的重组P301L tau预吸附来评估抗体的特异性。当用P301L tau预吸附16B5时，观察到染色衰减，但是当用不相关的蛋白(野生型突触核蛋白)以相同摩尔浓度预吸附抗体时，染色没有受到影响。
IgG同种型对照抗体和一抗省略切片对于测试的所有组织染色是阴性的。
表9
免疫组织化学表征的16B5抗体
抗体 批号 染色AD组织 浓度
鼠16B5 NB-0174A 是 1ug/mL
嵌合16B5 061512 是 1ug/mL
h16B5-H1L2 NB-0248 是 1ug/mL
H16B5-N1D 011113 是 1ug/mL
实施例9.热稳定性分析
高热稳定性是诸如抗体的治疗性分子在体内是否有用的重要因素。因此，使用差示扫描量热法(DSC)分析H1L2、H1L4和H2L4的热稳定性。
如图9和下表10所示，H1L2、H1L4和H2L4全部显示出足够的热稳定性，其中H1L4最高(即，>75℃)。
表10
实施例10.聚集可能性分析
聚集是治疗性抗体的长期储存稳定性的一个问题。因此，使用动态光散射(DLS)分析H1L2、H2L2、H1L4和H2L4的聚集可能性。如下表11所示，H1L2、H2L2、H1L4和H2L4的聚集可能性没有显著不同。
表11
所有引用的公布(包括GenBank登录号、UniProtKB/Swiss-Prot登录号等)、专利和专利申请都出于所有目的全文以引用方式并入本文中，其程度如同每个单独的出版物、专利和专利申请被明确和单独指示出于所有目的全文以引用方式并入一样。在与Genbank和UniProtKB/Swiss-Prot登录号等相关的序列存在任何变化的情况中，本申请是指与截止本申请的有效申请日之前的引用登录号相关的序列，所述有效申请日是指公开相关登录号的优选权申请的实际申请日或更早的日期。除非另外具体指明，否则本发明的任何特征、步骤、要素、实施方式或方面可以与任何其他组合使用。虽然出于清楚和理解的目的，已经通过说明和举例的方式对本发明进行了相当详细的描述，但很显然，可在所附权利要求的范围内实践某些变化和修改。
序列表
SEQ ID NO:1TAU P10636-8
SEQ ID NO:2TAU P10636-7
SEQ ID NO:3 TAU P10636-6
SEQ ID NO:4 TAU P10636-5
SEQ ID NO:5 TAU P10636-4
SEQ ID NO:6TAU P10636-2
SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10-16B5-HC
SEQ ID NO:11-16B5CDR-H1(Kabat编号)
SEQ ID NO:12-16B5CDR-H2
SEQ ID NO:13-16B5CDR-H3
SEQ ID NO:14-Hu VH受体FR(登录号BAC02002.1)
SEQ ID NO:15–16B5重链人源化设计v1(R13K、S28P、V48M、Y91F)
SEQ ID NO:16-16B5-LC
SEQ ID NO:17-16B5-LC CDR-L1
SEQ ID NO:18-16B5-LC CDR-L2
SEQ ID NO:19-16B5-LC CDR-L3
SEQ ID NO:20-Hu VL受体Fr(登录号ACJ71718.1)
SEQ ID NO:21-16B5轻链人源化设计v1(D1N、M4L、Y36F)
SEQ ID NO:22-16B5轻链人源化设计v2(D1N、M4L、Y36F、P43S)
SEQ ID NO:23-16B5轻链人源化设计v3(M4L、Y36F、P43S)
SEQ ID NO:24-16B5CDR-H1(组合的Kabat和Chothia编号)
SEQ ID NO:25–编码16B5重链人源化设计v1的核酸
SEQ ID NO:26–编码16B5轻链人源化设计v1的核酸
SEQ ID NO:27–编码16B5轻链人源化设计v2的核酸
SEQ ID NO:28–编码16B5轻链人源化设计v3的核酸
SEQ ID NO:29–人IgG1恒定区(C末端赖氨酸可省略)
SEQ ID NO:30–人IgG1恒定区cDNA
SEQ ID NO:31–具有5’内含子的人IgG1恒定区cDNA
SEQ ID NO:32–人κ恒定区
SEQ ID NO:33–人κ恒定区cDNA
SEQ ID NO:34–具有5’内含子的人κ恒定区cDNA
SEQ ID NO:35–16B5重链人源化设计v2
SEQ ID NO:36–16B5轻链人源化设计v4
SEQ ID NO:37–编码16B5重链人源化设计v2的核酸
SEQ ID NO:38–编码16B5轻链人源化设计v4的核酸
SEQ ID NO:39–16B5轻链人源化设计v5
SEQ ID NO:40–来自图8的轻链majority序列
SEQ ID NO:41–来自图8的重链majority序列
SEQ ID NO:42–来自图8的Chi 16B5重链序列
SEQ ID NO:43–来自图8的Chi 16B5轻链序列
序列表
<110> PROTHENA BIOSCIENCES LIMITED
<120> TAU免疫疗法
<130> 057450/497106
<140>
<141>
<150> US 62/330,786
<151> 2016-05-02
<160> 43
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
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Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
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Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
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Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
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Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
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<212> PRT
<213> 智人
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Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
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Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
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Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
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Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
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Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
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Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
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Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser
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Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro
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Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys
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Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly
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Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
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Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
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260 265 270
Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe
275 280 285
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Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
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Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
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100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser
245 250 255
Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp
275 280 285
Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu
305 310 315 320
Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
325 330 335
Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser
340 345 350
Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu
355 360 365
Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 6
<211> 352
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
165 170 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
180 185 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
210 215 220
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
225 230 235 240
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
245 250 255
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
260 265 270
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
275 280 285
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
290 295 300
Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser
305 310 315 320
Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu
325 330 335
Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
340 345 350
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成引物
<400> 7
ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成引物
<400> 8
ctcaattttc ttgtccacct tggtgc 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成引物
<400> 9
ctcaagtttt ttgtccaccg tggtgc 26
<210> 10
<211> 225
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 10
Met Asp Trp Val Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe
35 40 45
Thr Tyr His Gly Met Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Trp Gly Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Val Gly
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Arg Asp Phe Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
130 135 140
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
210 215 220
Ser
225
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 11
Tyr His Gly Met Asp
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 12
Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 13
Arg Arg Asp Phe Thr Met Asp Phe
1 5
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Arg Gly Gln Asn Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Tyr His
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Asp Phe Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 230
<212> PRT
<213> 小鼠属
<400> 16
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asn Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp
165 170 175
Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
195 200 205
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
210 215 220
Thr Ser Thr Ser Pro Ile
225 230
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 17
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 18
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 19
Lys Gln Ser Tyr Thr Leu Arg Thr
1 5
<210> 20
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 21
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 21
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 22
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 22
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 23
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 23
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 24
Gly Tyr Pro Phe Thr Tyr His Gly Met Asp
1 5 10
<210> 25
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸
<400> 25
caggtccagt tggtgcagtc tggatctgag ctgaagaagc ctggagcctc cgtcaaggtg 60
tcctgcaagg cttctgggta tcccttcaca taccatggaa tggactgggt gcgtcaggct 120
cctggtcagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat 180
gctgatgact tcaagggacg atttgtgttc tctttggaca cctctgtctc tactgcctat 240
ttgcagatct cttctctcaa agccgaggac acggccgtgt atttttgtgc aagacggcgt 300
gattttacaa tggacttctg gggtcaagga accaccgtga ccgtctcctc a 351
<210> 26
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸
<400> 26
aacatcgtgc tgacccagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcagga ccaggaagaa ctacctggcc 120
tggttccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180
gagagcggcg tgcccgatag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggatgtggcc gtgtactact gcaagcagag ctacaccctg 300
agaaccttcg gcggcggcac caaggtggaa attaaacgt 339
<210> 27
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸
<400> 27
aacatcgtgc tgacccagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcagga ccaggaagaa ctacctggcc 120
tggttccagc agaagcccgg ccagagcccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180
gagagcggcg tgcccgatag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggatgtggcc gtgtactact gcaagcagag ctacaccctg 300
agaaccttcg gcggcggcac caaggtggaa attaaacgt 339
<210> 28
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸
<400> 28
gacatcgtgc tgacccagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcagga ccaggaagaa ctacctggcc 120
tggttccagc agaagcccgg ccagagcccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180
gagagcggcg tgcccgatag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggatgtggcc gtgtactact gcaagcagag ctacaccctg 300
agaaccttcg gcggcggcac caaggtggaa attaaacgt 339
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (330)..(330)
<223> 可以或可以不存在
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 31
<211> 1343
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
ggtgagtgga tccgcggccg ctaaactctg agggggtcgg atgacgtggc cattctttgc 60
ctaaagcatt gagtttactg caaggtcaga aaagcatgca aagccctcag aatggctgca 120
aagagctcca acaaaacaat ttagaacttt attaaggaat agggggaagc taggaagaaa 180
ctcaaaacat caagatttta aatacgcttc ttggtctcct tgctataatt atctgggata 240
agcatgctgt tttctgtctg tccctaacat gccctgtgat tatccgcaaa caacacaccc 300
aagggcagaa ctttgttact taaacaccat cctgtttgct tctttcctca gcctccacca 360
agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg 420
ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag 480
gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact 540
ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca 600
acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aaatcttgtg 660
acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct 720
tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat 780
gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg 840
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc 900
gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt 960
gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag 1020
ggcagccccg agaaccacag gtgtacacgc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga 1080
accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt 1140
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 1200
acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 1260
acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc 1320
tctccctgtc cccgggtaaa tga 1343
<210> 32
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 33
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 33
acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgt 318
<210> 34
<211> 671
<212> DNA
<213> 智人
<400> 34
cgtgagtgga tccgcggccg ctaaactctg agggggtcgg atgacgtggc cattctttgc 60
ctaaagcatt gagtttactg caaggtcaga aaagcatgca aagccctcag aatggctgca 120
aagagctcca acaaaacaat ttagaacttt attaaggaat agggggaagc taggaagaaa 180
ctcaaaacat caagatttta aatacgcttc ttggtctcct tgctataatt atctgggata 240
agcatgctgt tttctgtctg tccctaacat gccctgtgat tatccgcaaa caacacaccc 300
aagggcagaa ctttgttact taaacaccat cctgtttgct tctttcctca ggaactgtgg 360
ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct 420
ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg 480
ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca 540
gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag 600
tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca 660
ggggagagtg t 671
<210> 35
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Tyr His
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Asp Phe Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 36
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 37
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸
<400> 37
gaggtccagt tggtgcagtc tggatctgag ctgaagaagc ctggagcctc cgtcaaggtg 60
tcctgcaagg cttctgggta tcccttcaca taccatggaa tggactgggt gcgtcaggct 120
cctggtcagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat 180
gctgatgact tcaagggacg atttgtgttc tctttggaca cctctgtctc tactgcctat 240
ttgcagatct cttctctcaa agccgaggac acggccgtgt atttttgtgc aagacggcgt 300
gattttacaa tggacttctg gggtcaagga accaccgtga ccgtctcctc a 351
<210> 38
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸
<400> 38
aacattgttt tgacgcagtc tccatcctcc ctggctgtgt cactaggaga gagggccact 60
atcaactgca aatccagtca gagtctgctc aatagtagaa cccgaaagaa ttacttggct 120
tggtttcagc agaagccagg gcagtctcct aaattgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcagcggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtc tgcaggctga agacgtggca gtttattact gcaagcaatc ttatactctt 300
cggacgttcg gtggaggcac caaggtggaa atcaaacgt 339
<210> 39
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 39
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 40
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 40
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 41
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Tyr His
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Asp Phe Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 42
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Tyr His
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Trp Gly Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Val Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Asp Phe Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 43
Asn Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg

Claims (77)

1.一种抗体，其包含具有与SEQ ID NO:15至少90％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和与SEQ ID NO:22至少90％相同的成熟轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包含SEQ ID NO:15的三个Kabat CDR和SEQ ID NO:22的三个Kabat CDR。
3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91中的至少一个分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少一个分别被N、L、F和S占据。
4.根据权利要求3所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少两个分别被N、L、F和S占据。
5.根据权利要求4所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少三个分别被N、L、F和S占据。
6.根据权利要求5所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43分别被N、L、F和S占据。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含具有与SEQ ID NO:15至少95％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和与SEQ ID NO:22至少95％相同的成熟轻链可变区。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，条件是来自SEQ ID NO:15和22的所述成熟重链可变区和所述成熟轻链可变区的CDR的任何差异分别位于位置H60-H65。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有命名为SEQID NO:15的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有命名为SEQ ID NO:21、22或23的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有命名为SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有命名为SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与重链恒定区融合，并且所述成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相对于所述天然人恒定区，所述突变形式与Fcγ受体的结合减少。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的抗体，其中所述重链恒定区属于IgG1同种型，任选地SEQ ID NO:29，条件是C末端赖氨酸可以缺失并且所述轻链恒定区为κ，优选地SEQID NO:32。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合于细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab片段。
16.一种核酸，其编码如权利要求1-15中所述的抗体的所述重链和/或轻链。
17.一种治疗阿尔茨海默病或实现阿尔茨海默病的预防的方法，包含施用如权利要求1-15中任一项所定义的抗体的有效方案，从而治疗阿尔茨海默病或实现阿尔茨海默病的预防。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述患者是ApoE4载体。
19.一种治疗与tau相关联的疾病或实现与tau相关联的疾病的预防的方法，包括施用如权利要求1-15中任一项所定义的抗体的有效方案，从而治疗所述疾病或实现所述疾病的预防。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。
21.一种减少tau的异常传播的方法，包括施用如权利要求1-15中任一项所定义的抗体的有效方案，并且从而减少tau的传播。
22.一种诱导tau的吞噬的方法，包括施用如权利要求1-15中任一项所定义的抗体的有效方案，并且从而诱导tau的吞噬。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。
24.一种抑制tau聚集或沉积的方法，包括施用如权利要求1-15中任一项所定义的抗体的有效方案，从而抑制tau聚集或沉积。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。
26.一种抑制tau缠结的形成的方法，包括施用如权利要求1-15中任一项所定义的抗体的有效方案。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。
28.一种核酸，其包含编码具有SEQ ID NO:15的序列的重链可变区的区段。
29.根据权利要求28所述的核酸，还包含编码IgG1恒定区的区段。
30.根据权利要求29所述的核酸，其中所述IgG1恒定区是人IgG1恒定区。
31.根据权利要求30所述的核酸，其中所述IgG1恒定区具有SEQ ID NO:29的序列，条件是可以省略C末端赖氨酸。
32.根据权利要求31所述的核酸，其中编码所述IgG1恒定区的所述区段具有SEQ IDNO:30的核苷酸序列。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的核酸，还包含连接编码所述重链可变区和所述IgG1恒定区的所述区段的内含子。
34.根据权利要求33所述的核酸，其中编码所述IgG1恒定区的所述区段具有SEQ IDNO:31的核苷酸序列。
35.一种或多种核酸，其编码SEQ ID NO:15的重链可变区和/或SEQ ID NO:21、22或23的轻链可变区。
36.一种抗体，其包含具有与SEQ ID NO:35至少90％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:39至少90％相同的成熟轻链可变区，条件是位置H1为E和/或位置L9为S。
37.根据权利要求36所述的抗体，其包含SEQ ID NO:15的三个Kabat CDR和SEQ ID NO:22的三个Kabat CDR。
38.根据权利要求36或37所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91中的至少一个分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少一个分别被N、L、F和S占据。
39.根据权利要求38所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少两个分别被N、L、F和S占据。
40.根据权利要求39所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43中的至少三个分别被N、L、F和S占据。
41.根据权利要求40所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43分别被N、L、F和S占据。
42.根据权利要求40所述的抗体，条件是位置H13、H28、H48和H91分别被K、P、M和F占据，并且位置L1、L4、L36和L43分别被D、L、F和S占据。
43.根据权利要求36-42中任一项所述的抗体，其中位置H1被E占据。
44.根据权利要求36-43中任一项所述的抗体，其中位置L9被S占据。
45.根据权利要求36-44中任一项所述的抗体，其包含具有与SEQ ID NO:35至少95％相同的氨基酸序列的成熟重链可变区和与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:39至少95％相同的成熟轻链可变区。
46.根据权利要求36-45中任一项所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与重链恒定区融合，并且所述成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。
47.根据权利要求36-46中任一项所述的抗体，其中所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相对于所述天然人恒定区，所述突变形式与Fcγ受体的结合减少。
48.根据权利要求36-47中任一项所述的抗体，其中所述重链恒定区属于IgG1同种型，优选地SEQ ID NO:20，并且所述轻链恒定区是κ轻链，优选地SEQ ID NO:32。
49.根据权利要求36-48中任一项所述的抗体，条件是来自SEQ ID NO:15和22的所述成熟重链可变区和所述成熟轻链可变区的CDR的任何差异分别位于位置H60-H65。
50.根据权利要求36-49中任一项所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有命名为SEQ ID NO:35的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有命名为SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
51.根据权利要求36-50中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合于细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
52.根据权利要求36-51中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab片段。
53.一种核酸，其编码如权利要求36-49中所述的抗体的所述重链和/或轻链。
54.根据权利要求53所述的核酸，还包含编码IgG1恒定区的区段。
55.根据权利要求54所述的核酸，其中所述IgG1恒定区是人IgG1恒定区。
56.根据权利要求34所述的核酸，其中所述IgG1恒定区具有SEQ ID NO:29的序列，条件是可以省略C末端赖氨酸。
57.根据权利要求56所述的核酸，其中编码所述IgG1恒定区的所述区段具有SEQ IDNO:30的核苷酸序列。
58.根据权利要求53-57中任一项所述的核酸，还包含连接编码所述重链可变区和所述IgG1恒定区的所述区段的内含子。
59.根据权利要求58所述的核酸，其中编码所述IgG1恒定区的所述区段具有SEQ IDNO:31的核苷酸序列。
60.根据权利要求53-59中任一项所述的核酸，还包含编码κ恒定区的区段。
61.根据权利要求60所述的核酸，其中所述κ恒定区是人κ恒定区。
62.根据权利要求61所述的核酸，其中所述κ恒定区具有SEQ ID NO:32的序列。
63.根据权利要求62所述的核酸，其中编码所述κ恒定区的所述核酸具有SEQ ID NO:33的序列。
64.根据权利要求63所述的核酸，还包含将编码所述轻链可变区的所述区段连接至编码所述κ恒定区的所述区段的内含子。
65.根据权利要求64所述的核酸，其中编码所述κ恒定区的所述区段具有SEQ ID NO:34的序列。
66.一种药物组合物，其包含根据权利要求36-52中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
67.一种治疗阿尔茨海默病或实现阿尔茨海默病的预防的方法，包括施用如权利要求36-52中任一项所定义的抗体的有效方案，从而治疗阿尔茨海默病或实现阿尔茨海默病的预防。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述患者是ApoE4载体。
69.一种治疗与tau相关联的疾病或实现与tau相关联的疾病的预防的方法，包括施用如权利要求36-52中任一项所定义的抗体的有效方案，从而治疗所述疾病或实现所述疾病的预防。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。
71.一种减少tau的异常传播的方法，包括施用如权利要求36-52中任一项所定义的抗体的有效方案，并且从而减少tau的传播。
72.一种诱导tau的吞噬的方法，包括施用如权利要求36-52中任一项所定义的抗体的有效方案，并且从而诱导tau的吞噬。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。
74.一种抑制tau聚集或沉积的方法，包括施用如权利要求36-52中任一项所定义的抗体的有效方案，从而抑制tau聚集或沉积。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。
76.一种抑制tau缠结的形成的方法，包括施用如权利要求36-52中任一项所定义的抗体的有效方案。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述疾病是神经疾病。
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