CN104254612B - 一种2,4-二羟基丁酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备2,4‑二羟基丁酸(2,4‑DHB)的方法,包括以下连续步骤:将苹果酸,琥珀酰‑辅酶A和/或乙醛酸转化为苹果酰‑辅酶A,将之前获得的苹果酰‑辅酶A转化为苹果酸‑4‑半醛,和使用DHB脱氢酶将苹果酸‑4‑半醛转化为2,4‑DHB。
Description
技术领域
本发明涉及一种由苹果酸和/或乙醛酸和/或琥珀酰-辅酶A生产2,4-二羟基丁酸的新方法,该方法通过实现合成途径将苹果酸和/或乙醛酸和/或琥珀酰-辅酶A转化为苹果酰-辅酶A,将苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛,然后将所述苹果酸-4-半醛转化为2,4-二羟基丁酸(2,4-DHB)。
背景技术
本发明中提及的羧酸在其盐形式(例如2,4-二羟基丁酸盐)或酸形式(例如2,4-二羟基丁酸)下是等同命名的。
2,4-二羟基丁酸(等同于2,4-DHB或DHB)是经济效益很可观的化合物。通过调整适合的pH值,可以在水介质中容易地将DHB转化为α-羟基-γ-丁内酯。α-羟基-γ-丁内酯是生产在动物营养品中有很大市场的蛋氨酸替代物2-羟基-4-(甲硫基)-丁酸酯(HMTB)的重要前体(US2009/318715)。目前,α-羟基-γ-丁内酯通过多阶段反应衍生自γ-丁内酯,所述多阶段反应为γ-丁内酯在α位置的卤化,和随后在碱性介质中以羟基取代卤素原子的反应(US 2009/318715)。
由于油价上涨,需要从可再生资源生产DHB。微生物能够将源自生物质的原料,如糖或有机酸,转化为大量各种不同的化学成分(Werpy & Petersen,2004)。随着生物化学和基因组学信息量的增长,可以修饰微生物以使其能以高产率和产量过量生产自然生成的代谢中间体(Bailey,1991)。生产微生物的优化经常需要合理的代谢网络工程,以确保其中目标代谢物的生物合成所需酶的过量表达,并减轻产物的反馈抑制。另外的可能性是使用能催化目标代谢物生产的新酶***。
代谢工程方法和酶催化需要生化和产生目标代谢物的代谢途径调节方面的详细知识。关于生产DHB的这些信息是无法获得的。仅有少量研究报道了琥珀酸半醛脱氢酶缺乏症患者产生2,4-DHB(Shinka等人2002),然而没有确定2,4-DHB生产中涉及的酶反应。因此,2,4-DHB的发酵或酶生产需要(i)确定能将易得到的前体转化为2,4-DHB的热力学可行途径,(ii)确定或构建途径中能够催化各反应步骤的酶和(iii)在适合的生物生产中,途径酶的功能表达。
本发明目的是为满足这些需求。
发明内容
因此,本发明的一个目标是生产2,4-DHB的方法,包括第一步将苹果酸和/或乙醛酸和/或琥珀酰-辅酶A转化为苹果酰-辅酶A,第二步将苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛,和第三步将苹果酸-4-半醛转化为2,4-DHB。
因此,本发明的一个目标是生产2,4-DHB的方法,其包括第一反应(见图1),其中苹果酸通过与具有苹果酰-辅酶A合成酶活性的酶反应转化成苹果酰-辅酶A[1.1],和/或其中琥珀酰-辅酶A通过与具有琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酰-辅酶A转移酶活性的酶反应转化成苹果酰-辅酶A[1.2],和/或其中乙醛酸通过与具有苹果酰-辅酶A裂解酶活性的酶反应转化成苹果酰-辅酶A[1.3]。在第二反应中[2],苹果酰-辅酶A通过与具有苹果酰-辅酶A还原酶活性的酶反应转化成苹果酸-4-半醛。在第三反应中[3],苹果酸-4-半醛通过与具有DHB脱氢酶活性的酶反应转化成DHB。更确切地说,反应[3]在生物合成路径中被具有苹果酸-4-半醛还原酶活性的酶催化。
在本发明的另一个方面,生产2,4-DHB方法的第一步涉及分别具有苹果酰-辅酶A合成酶(等同于名为苹果酸硫激酶或苹果酸-辅酶A裂解酶(ADP形式)EC 6.2.1.9)、琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.-),或苹果酰-辅酶A裂解酶(EC 4.1.3.24)活性,其分别将苹果酸、琥珀酰-辅酶A、或乙醛酸转化为苹果酰-辅酶A。
所述酶已经在利用丝氨酸循环用于甲醛固定的甲醇营养型细菌中被识别(Chistoserdova等人,2009;Smejkalová等人,2010;Vuilleumier等人,2009);在依赖乙酸盐同化路径的细菌中被识别,该细菌独立于乙醛酸循环和异柠檬酸裂解酶的活性(Meister等人,2005);和在利用3-羟基丙酸酯CO2-固定循环用于自养生长(Zarzycki等人,2009)的细菌中被识别。
与上述酶共用同源的蛋白质也是本发明的一方面,例如功能性突变或功能性片段。
苹果酰-辅酶A合成酶由两个子单元MtkA和MtkB构成。因此,根据本发明,包含苹果酰-辅酶A合成酶活性的蛋白质指明了所有至少30%,优选至少50%和更优选70%与下述蛋白质序列一致的多肽:M.petroleiphilum(YP 001022444和YP 001022445)甲基扭曲杆菌(YP002962851和YP 002962852)的苹果酰-辅酶A合成酶子单元MtkA和MtkB或M.capsulatus(YP 114179和YP 114180)的两个子单元SucC和SucD的蛋白质序列。
苹果酰-辅酶A裂解酶是同源六聚体且在不是利用乙醛酸循环来进行乙酸同化作用的细菌中发现(Meister等人,2005)。因此,根据本发明,包含苹果酰-辅酶A裂解酶活性的蛋白质指明了所有至少30%,优选至少50%和更优选70%与下述蛋白质序列一致的多肽:甲基扭曲杆菌、夹膜红细菌、或天蓝色链霉菌的苹果酰-辅酶A裂解酶、Mcl的蛋白质序列。
本发明的另一方面,本发明的苹果酰-辅酶A裂解酶由SEQ ID No.1或其任何突变所示。
琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶包括两个子单元SmtA和SmtB(Zarzycki等人,2009)(Friedmann等人,2006)。因此,根据本发明,具有琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶活性的蛋白质指明所有至少30%,优选至少50%和更优选70%与下述蛋白质序列一致的多肽:嗜热光合绿丝菌的琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶的子单元SmtA和SmtB的蛋白质序列(由SEQ ID No.191和SEQ ID No.193表示或由SEQ ID No.192和SEQ IDNo.194所编码)。
更普遍地,本发明意义上的两个蛋白质序列的一致性可以通过本领域技术人员已知的方法进行识别。这些方法的例子是使用CLUSTALW(Larkin等人,2007)软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/使用网站所示默认参数)或BLAST校准程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi使用网站所示默认参数)。
术语功能性变异包含的酶与在本申请具体描述的序列相比时,可以表现出基本上的序列修饰而依然保持原有的酶活性。
根据本发明,术语功能性片段是指酶的序列与原始的相比可以包括较少的氨基酸而所述缩短的酶依然保持原有的酶活性。
所述酶的可以通过至少一种突变获得改进,所述突变提高了突变酶分别对苹果酸,琥珀酰-辅酶A,或乙醛酸的活性和/或底物亲和性。
在本发明中,“提高了活性和/或底物亲和性”是指酶在突变前
-不能利用底物,和/或
-合成反应产物的最大特定收率至少低三倍,和/或
-具有对苹果酸,琥珀酰-辅酶A或乙醛酸,苹果酰-辅酶A或苹果酸-4-半醛的亲和性至少低两倍,更优选三倍。
苹果酰-辅酶A合成酶和苹果酰-辅酶A裂解酶的活性可以分别通过(Smejkalová等人,2010)或(Meister等人,2005)描述的酶测试进行测定。琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶的活性可以通过(Friedmann等人,2006)描述的酶测试进行测定。
在更进一步的方面,根据本发明生产2,4-DHB的方法的第二步涉及一种具有苹果酰-辅酶A还原酶活性的酶,特征在于,其将苹果酰-辅酶A转化成苹果酸-4-半醛。
所述酶能够自具有苹果酰-辅酶A还原酶,琥珀酰-辅酶A还原酶,或报道的3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶、肉桂酰-辅酶A还原酶或乙醛脱氢酶活性的酶之间被识别,或它们能够通过修饰所述的酶获得。
丙二酰-辅酶A还原酶(EC 1.2.1.75)和琥珀酰-辅酶A还原酶(EC1.2.1.76)在拥有经修饰的3-羟基丙酸循环来固定二氧化碳的细菌中被发现(Alber等人,2006;Kockelkorn&Fuchs,2009),和在实施厌氧的琥珀酸降解途径的细菌中被发现(Seedorf等人,2008;&Gottschalk,1993)。在真核生物和一些细菌中,HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.38,EC1.1.1.88)是异戊二烯生物合成途径的一部分。肉桂酰-辅酶A还原酶(EC1.2.1.44)是木质素生物合成中涉及的酶(Kawasaki等人,2006)。乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)在大量多种细菌中被发现,且其催化进入乙醇生产途径或乙醛的解毒步骤。
在本法的进一步方面,苹果酰-辅酶A由ID No.7或SEQ ID No.10或其任意突变或任意功能片段所示。
因此,根据本发明,具有丙二酰-辅酶A还原酶活性的蛋白质指明了所有至少30%与超嗜热古菌的丙二酰-辅酶A还原酶,Mcr(SEQ ID No.7)的蛋白质序列一致的多肽。优选它们至少50%和更优选70%一致。
嗜热光合绿丝菌的丙二酰-辅酶A还原酶(SEQ ID No.189经SEQ IDNo.190编码)构成了本发明的另一个方面。至少30%与嗜热光合绿丝菌的蛋白质序列一致的多肽也是本发明的一部分。优选它们至少50%和更优选70%一致。
因此,根据本发明,具有琥珀酰-辅酶A还原酶活性的蛋白质指明了所有至少30%与牙龈卟啉单胞菌的琥珀酰-辅酶A还原酶,SucD(SEQ IDNo.10)或与双官能团的超嗜热古菌的丙二酰-辅酶A和琥珀酰-辅酶A还原酶Mcr(SEQ ID No.7)的蛋白质序列一致的多肽。优选它们至少50%和更优选70%一致。
苹果酰-辅酶A还原酶活性能够通过实施例2(见“酶分析”)描述的酶测试进行测定。
所述酶活性可以通过至少一种酶的突变提高,所述突变提高了突变酶分别对苹果酰-辅酶A的活性和/或底物亲和性或降低了其对天然底物的活性。
本发明也包含具有提高活性的经修饰的苹果酰-辅酶A还原酶。
根据本发明的苹果酰-辅酶A还原酶在具体方面上与超嗜热古菌的丙二酰-辅酶A还原酶一致,与野生型酶相比包括至少一个在下列位点中至少一个位点的突变:P111,L152,T154,L202,G203,D204,Y206,D207,K209,T210,T238,T239,D295,R318,其中在所述位点自然生成的氨基酸被其它19种天然存在的蛋白氨基酸中的任意一种取代,即被丙氨酸,精氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,谷氨酸,谷氨酰胺,甘氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,甲硫氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,或缬氨酸中任意一种取代。
在另一个方面,根据本发明生产2,4-DHB方法的第三步中涉及DHB脱氢酶,特征在于其将苹果酸-4-半醛转化成2,4-DHB,所述酶在生物合成的途径中具有苹果酸-4-半醛还原酶的活性。
已经潜在具有DHB脱氢酶活性的候选DHB脱氢酶可以从作用于C3,C4,或C5化合物的β-羟酸脱氢酶类中选择。
根据本发明再进一步的方面,所述DHB脱氢酶可以是与β-羟酸脱氢酶在结构和机制上相关的酶,如羟基丙二酸半醛还原酶,琥珀酸半醛还原酶,4-羟丁酸脱氢酶,丙二酸半醛还原酶,甲基丁醛还原酶,锌型醇脱氢酶,L-苏氨酸-3-脱氢酶,肉桂醇脱氢酶,醇脱氢酶或高丝氨酸还原酶。
本发明也涉及使用以下酶将苹果酸-4-半醛转化成2,4-DHB:甲基丁醛还原酶或琥珀酸半醛还原酶(等同命名为4-羟基丁酸脱氢酶)、或醇脱氢酶。
在本发明的另一具体方面,DHB脱氢酶与下述酶一致:酿酒酵母的甲基丁醛还原酶(Ypr1)、金属球菌的琥珀酸半醛还原酶、牙龈卟啉菌的4-羟基丁酸脱氢酶(4hbd),大肠杆菌的醇脱氢酶(YqhD)。
在具体的实施方案中,所述甲基丁醛还原酶由SEQ ID No.14表示,所述琥珀酸半醛还原酶由SEQ ID No.16表示,所述4-羟基丁酸脱氢酶由SEQ ID No.187表示,所述醇脱氢酶由SEQ ID No.185表示。DHB脱氢酶的活性可以通过实施例3(见“酶分析”)中描述的酶测试测定。
可以通过酶的至少一种突变增加DHB脱氢酶对于苹果酸-4-半醛的亲和性,所述突变增加了突变酶对苹果酸-4-半醛的活性和/或底物亲和性和/或其对天然底物的活性或亲和性至少降低了两倍。
根据本发明的DHB脱氢酶在具体方面上与金属球菌的琥珀酸半醛还原酶(SEQ IDNo.16)一致,与野生型酶相比包括至少一个在下列位点中至少一个位点的突变:S40,N43,H39T49,F85,Q108,L281和N305,其中在所述位点自然生成的氨基酸被其它19种天然存在的蛋白氨基酸中的任意一种取代,即被丙氨酸,精氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,谷氨酸,谷氨酰胺,甘氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,甲硫氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,或缬氨酸中任意一种取代。
如非排他性实施例中所示,金属球菌的琥珀酸半醛还原酶对(L)-苹果酸-4-半醛的亲和性通过位点专一突变引入双突变H39R N43H,如SEQID No.36表示的。本发明还包含简单H39R突变(SEQ ID No.32)和N43H(SEQ ID No.34)(实施例5)。
DHB脱氢酶能够用于将苹果酸-4-半醛转化成2,4-DHB,其构成了本发明的另一方面。
基因的核苷酸序列可以调整宿主生物的密码子用法,从而增加异源表达蛋白的产量。这构成了本发明的进一步方面。
编码金属球菌琥珀酸半醛还原酶H39R N43H(如SEQ ID No.38所示核苷酸序列被优化用于在大肠杆菌中表达的所述酶)的合成基因的合成也是本发明的进一步方面。
在再进一步方面,本发明也涉及核苷酸,且更具体的涉及分离编码苹果酰-辅酶A合成酶的核苷酸序列。
在再进一步方面,本发明涉及分离编码苹果酰-辅酶A裂解酶的核苷酸序列,更具体的由SEQ ID No.2所示。
在再进一步方面,本发明涉及分离编码苹果酰-辅酶A还原酶的核苷酸序列,更具体的由SEQ ID No.8,SEQ ID No.11,或SEQ ID No.190所示。
在再进一步方面,本发明涉及分离编码如上所述DHB脱氢酶的核苷酸序列。
在另一个方面,所述核苷酸由SEQ ID No.15,SEQ ID No.17,SEQ IDNo.37,SEQ IDNo.186或SEQ ID No.188所示。
根据本发明,“核苷酸序列”是指以单或双链形式的DNA或RNA分子,优选是DNA分子。这里使用的“分离DNA”是指并非天然形成的或原来存在在天然环境中而现在不再存在的DNA,例如在嵌合基因中编码与其它调控因子有关的序列的DNA,转入到另一个宿主细胞中的DNA,或与天然存在的DNA序列相比,具有不同核苷酸序列的人工的、合成的DNA序列。
本发明也涉及嵌合基因,包括功能性相互连接的、在宿主生物中具有功能性的至少一个启动子,编码本发明定义的苹果酰-辅酶A合成酶、苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、丙二酰-辅酶A还原酶、琥珀酰-辅酶A还原酶或DHB脱氢酶活性体中任意一种的多核苷酸,以及在相同宿主生物中具有功能性的终止子元件。首先,嵌合基因可以包含的多种元件调节转录、翻译和蛋白质的形成,例如编码信号肽或转运肽序列的启动子,或构建一个多腺苷酸化信号的终止子元件,以及,其次,多核苷酸编码蛋白质。“功能性相互连接”是指所述嵌合基因的元件以下述方法相互连接,即这些元件中其中一个的功能受到另个一的影响。举例来说,当启动子能够影响编码序列的表达时,启动子功能性的连接所述编码序列。根据本发明,能够使用本领域技术人员的熟知的技术实施嵌合基因的构建和其多种元件的组装。构建嵌合基因的调控元件的选择主要取决于它们必须在其中发挥作用的宿主生物,且本领域技术人员能够选择在给定的宿主生物中具有功能的调控元件。术语“功能性”用来表示给定的宿主生物中能够发挥功能。
根据本发明的嵌合基因可以包含的启动子是可构建或者可诱导的。举例来说,在细菌中用于表达的启动子可以选自下述的启动子。对于在大肠杆菌中的表达,提及可以由以下组成:lac,trp,lpp,phoA,recA,araBAD,prou,cst-l,tetA,cadA,nar,tac,trc,lpp-lac,Psyn,cspA,PL,PL-9G-50,PR-PL,T7,λPL-PT7,T3-lac,T5-lac,T4基因32,nprM-lac,VHb和蛋白质A启动子或Ptrp启动子(WO 99/64607)。对于在革兰氏阳性菌例如棒状杆菌或链霉菌中的表达,提及可以由以下组成:PtipA或PS1和PS2(FR91/09870)启动子或其它在申请EP0629699A2中描述的那些。对于在酵母菌或真菌中的表达,提及可以由以下组成:K.lactis PLAC4启动子或K.lactis Ppgk启动子(专利申请FR 91/05294),Trichodermatef1或cbh1启动子(WO 94/04673),Penicillium his,csl或apf启动子(WO 00/68401)和Aspergillus gla启动子。
根据本发明,嵌合基因也可以包括位于启动子和编码序列之间的其它调控序列,例如转录激活子(增强子)。
同样地,本发明的嵌合基因在具体的实施方案中包括,至少在转录方向上功能性连接:一个在宿主生物中具有功能的启动子调控序列,一个编码本发明的苹果酰-辅酶A合成酶、和/或琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶、和/或苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和DHB脱氢酶,以及一个在所述宿主生物中具有功能的终止子调控序列。
本发明也涉及克隆和/或表达载体,包括本发明的嵌合基因或本发明的核苷酸序列。根据本发明的该载体用于改造宿主生物和在这些微生物中表达任意一种下述酶:苹果酰-辅酶A合成酶、和/或琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶、和/或苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和/或DHB脱氢酶。这样的载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒。优选的,根据本发明的转运载体是质粒。通常,这些载体的主要性质应该是在宿主生物的细胞中能够保持其自身和自我复制物,尤其是凭借存在复制起点,在其中来表达苹果酰-辅酶A合成酶、和/或琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶、和/或苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和/或DHB脱氢酶的任意一种。为了使宿主生物的转化稳定,载体也可以与基因组融为一体。这样载体的选择以及将本发明的嵌合基因嵌入到这些载体中的技术属于本领域技术人员常识部分。有利地,本发明中使用的载体除了本发明的嵌合基因外,也包含编码筛选标记的嵌合基因。这些筛选标记能够选择有效转化的宿主生物,即那些与载体合并的微生物。根据本发明具体的实施方案,能够被转化的宿主生物是细菌、酵母菌、真菌。在这些可以使用的筛选标记中,提及可以由用于抵抗抗生素基因的标记,例如潮霉素转磷酸酶基因,组成。其它标记可以是补充营养缺陷型的基因,例如pyrA,pyrB,pyrG,pyr4,arg4,argB和trpC基因,钼喋呤合成基因或乙酰胺酶基因。在转化的细胞中也可以涉及编码易于识别酶例如GUS酶的基因,或编码颜料或调控颜料生产的酶的基因。这样的筛选标记基因在专利申请WO 91/02071,WO 95/06128,WO 96/38567和WO 97/04103中具体的描述。
本发明也涉及转化的宿主生物,其包含至少一个根据本发明的嵌合基因,该嵌合基因嵌入到其基因组中或在外部染色体遗传元件例如质粒上实施。在本发明更具体的方面,该转化的宿主生物包括本发明编码多肽的核苷酸,所述的多肽具有苹果酰-辅酶A合成酶活性、和/或琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶、和/或苹果酰-辅酶A裂解酶活性,或包括编码多肽核苷酸的嵌合基因,该多肽具有苹果酰-辅酶A合成酶活性、和/或琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶和/或苹果酰-辅酶A裂解酶活性,或包括编码多肽核苷酸的表达载体,该多肽具有苹果酰-辅酶A合成酶活性、和/或琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶和/或苹果酰-辅酶A裂解酶活性,和/或编码具有苹果酰-辅酶A还原酶活性多肽的核苷酸,和/或编码具有苹果酰-辅酶A还原酶活性多肽的核苷酸,或嵌合基因包括编码具有苹果酰-辅酶A还原酶活性多肽的核苷酸,或表达载体包括编码具有苹果酰-辅酶A还原酶活性多肽的核苷酸,和/或编码具有DHB脱氢酶活性多肽的核苷酸,或嵌合基因包括编码具有DHB脱氢酶活性多肽的核苷酸,或表达载体包括编码具有DHB脱氢酶活性多肽的核苷酸。
在宿主生物中异源表达酶的活性通常会受其溶解性差和内涵体形式的限制。因此,本发明也涉及嵌合蛋白,其中功能性酶物理形式的融入其它蛋白质或多肽(等同命名为融合蛋白),来增加在宿主生物中所述酶表达的活性。这样的融合蛋白是本领域已知的,且通常选自下述非排他性例子:麦芽糖结合蛋白,Mbp,硫氧化还原蛋白,ThrX,谷胱甘肽-S-转移酶,Gst,转录终止因子,NusA。
术语“宿主生物”是指任何根据本发明将嵌合基因、核苷酸、或载体可以植入其中来生产2,4-DHB的低等单细胞微生物。优选的宿主生物是微生物,尤其是真菌,例如青霉菌,曲霉菌和更优选黄曲霉菌,金孢子菌或木霉菌属,酵母菌,具体为酵母科、毕赤酵母科或裂殖酵母科,最优选为酿酒酵母,粟酒裂殖酵母,乳酸克鲁维酵母,马克斯克鲁维酵母,杰丁毕赤酵母,树干毕赤酵母或毕赤酵母,细菌,优选肠杆菌科、梭菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科、链球菌科、甲基杆菌科、和棒状杆菌科,最优选为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、丙酮丁醇梭菌、甲基扭曲杆菌、或乳酸乳球菌。
所述宿主生物可以是由糖(例如葡萄糖)天然过度生产苹果酸或琥珀酸的宿主生物,或经工程化为由糖(例如葡萄糖)过度生产苹果酸或琥珀酸的宿主生物,且其中所有的可能的膜转运蛋白已经被去除,该膜转运蛋白促进有机酸例如苹果酸、丙酮酸、琥珀酸和延胡索酸的排出。宿主生物可以是经工程化来过度生产DHB的生物体,且其中所有的可能的膜转运蛋白已经被去除,该膜转运蛋白促进有机酸例如苹果酸、丙酮酸、琥珀酸和延胡索酸的排出。促进苹果酸或其它有机羧酸排出的通透酶例子有:来自粟酒裂殖酵母的Mae1(Camarasa等人,2001)(Grobler等人,1995),来自枯草杆菌的DctA(Groeneveld等人,2010),来自大肠杆菌的Dct 1-4,来自啤酒酵母的Jen1(Akita等人,2000)。对于专家来讲,也可能基于序列号识别大肠杆菌中的候选通透酶。这些构建将用于保持苹果酸或其它有机羧酸在细胞内来使其有利于DHB的生产。
“转化的宿主生物”的表达用于表示宿主生物基因组中或在外部染色体遗传元件例如质粒合并了根据本发明的至少一种嵌合基因,且因此在细胞内部或培养基中生产苹果酰-辅酶A合成酶、苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和/或DHB脱氢酶的任意一种。为了获得根据本发明的宿主生物,本领域技术人员可以使用很多中已知的转化方法。
这些方法中的一种包括将要转化的宿主细胞与聚乙二醇(PEG)和依照本发明的载体相接触。电穿孔是另外一种方法,其包括使要转化的细胞和本发明的载体经受电场。另外的方法包括通过显微注射直接将载体注入细胞或组织。也可以使用“基因枪”方法。其包含以其上吸附有本发明载体的微粒轰击细胞或组织(美国专利号4,945,050)。
文献中描述了用于大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌的几种转化细菌的方法。可以使用接合。对于革兰氏阳性菌,可以使用电穿孔,也可以使用原生质体转化,特别是对于链霉菌属的细菌。
文献中描述了几种转化真菌的方法。EP0260762中描述了用于曲霉菌的以PEG做的原生质体转化,而WO 00/36120中描述了该方法对绳状青霉种的调整方案。通过限制性酶介导整合,或REMI的转化也已知,使用农杆菌属细菌的原生质体转化同样已知。文献中也描述了转化酵母的技术。
在进一步方面,本发明涉及2,4-DHB生产方法,其包括培养转化本发明微生物的步骤。
为生产DHB,各种碳水化合物可以被单独使用或者作为混合物使用,例如葡萄糖,果糖,蔗糖,糖蜜,麦芽糖,赤糖糊,糖蜜,淀粉水解物(葡萄糖,寡糖),乳糖,麦芽糖,淀粉和淀粉水解物,纤维素,纤维素水解物,甘油,乙酸和某些烃,油和脂肪如豆油,葵花籽油,花生油和椰子油,以及脂肪酸,例如棕榈酸,硬脂酸和亚油酸。这些物质可以被单独使用或作为混合物使用。
各种氮源可以被单独或作为混合物使用来进行商业或中试规模生产,包括无机化合物如气态氨和氨水,无机酸或有机酸的铵盐,如硫酸铵,硝酸铵,磷酸铵,氯化铵,乙酸铵和碳酸铵。此外,也可以使用天然含氮有机材料,如大豆水解物,大豆蛋白盐酸水解物(总氮约7%),豆粕,豆饼水解物,玉米浆,酪蛋白水解物,酵母提取物,肉提取物,麦芽提取物,尿素,蛋白胨和氨基酸。
生产过程可以在有氧,厌氧和限制氧条件下进行。其可以作为分批补料过程或按批次过程进行。
可以通过在培养基中培养宿主生物来进行所述2,4-DHB的生产,培养基中单独的或者与能够确保生长的其他碳源一起加入了苹果酸(或者其他的有机酸如丙酮酸,琥珀酸,或延胡索酸)。苹果酸(和其他有机酸)可以被直接加入,或者通过设计两阶段发酵过程加入,两阶段发酵过程中,苹果酸(或其他有机酸)在第一过程阶段中由过量生产苹果酸的微生物产生,而2,4-DHB生产在随后的阶段中由本发明的宿主生物实现。
产物的分离和纯化是非常重要的因素,其极大地影响整个过程的效率和产物成本。产物回收的方法一般包括分别的细胞分离,以及产物纯化,浓缩和干燥步骤。
细胞分离
可以使用超滤和离心来从发酵培养基中分离细胞。高培养基粘度使得从发酵培养基中分离细胞变得复杂。因此,我们可以加入添加剂如无机酸或碱的盐,或者加热培养液以优化细胞分离。
产物回收
多种离子交换色谱方法可以用于在去除生物质之前或之后分离DHB。这些包括依照其等电点使用初级阳离子交换树脂促进产物分离。通常,以溶液填充树脂,而随着洗脱液pH值的增加(如通过加入氢氧化铵),保留的产物被单独洗脱。另外的可能性是以固定的或仿移动的树脂床来使用离子交换树脂。可能需要联合不同的色谱步骤以达到足够的产品纯度。与昂贵的结晶步骤相比上述纯化方法更经济,在终产物形式方面也提供额外的优势和灵活性。
产物浓缩和干燥
纯化过程也可能包括干燥步骤,其可以包含适合的干燥工具如喷雾造粒机,喷雾干燥器,筒式烘干机,回转烘干机,隧道式烘干机。可以通过使用多功能浓缩器或薄膜蒸发器,以130℃蒸汽在减压下加热发酵液来获得浓缩DHB溶液。
通过优化宿主生物代谢网络中的碳通量再分配和通过确保DHB途径三种酶NADPH和ATP的充足供应,可以确保DHB的高效生产。通常通过缺失或者减少竞争的自然发酵途径来促进碳通量引导进入所需的代谢途径以及NAD(P)H辅助因子的供应。非排他性的例子为:
-通过阻碍乙醇的形成(通过缺失丙酮酸脱羧酶)来优化酿酒酵母中苹果酸的生产(Zelle等人,2008;Zelle等人,2010)。
-通过阻碍乳酸的形成(如缺失IdhA),乙酸的形成(如缺失pta,ackA),乙醇的形成(如缺失adhE),甲酸的形成(如缺失pflB,focA),丙酮酸的氧化(如缺失poxB),苹果酸的降解(如缺失maeB和scfA),琥珀酸的形成(如缺失frdBC),甲基乙二醛的形成(缺失mgsA)来优化大肠杆菌中的琥珀酸或苹果酸生产(Jantama等人,2008a)(Jantama等人,2008b)(Lin等人,2005)(Zhang等人,2011)(Sanchez等人,2005a)。
-缺失磷酸葡萄糖异构酶pgi来开通穿过磷酸戊糖途径的碳通量,增加NADPH对于生物合成反应的可用度(Auriol等人,2011)。
增加有机酸生产碳通量和ATP供应的另一种可能方式是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)/丙酮酸/草酰乙酸的分支节点工程化(综述于(Sauer & Eikmanns 2005))。确保从磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸碳通量增加的代谢工程化策略的非排他性例子为:
-通过阻碍丙酮酸激酶的作用和增加PEP羧化激酶的活性来优化酿酒酵母中苹果酸的生产(Zelle等人,2010)。
-通过增加天然或异种表达的PEP羧化酶,PEP羧化激酶,或丙酮酸羧化酶的活性,来优化大肠杆菌中琥珀酸的生产(Millard等人,1996)(Sanchez等人,2005)(Zhang等人,2011)。
在使用PEP消耗磷酸转移酶***(PTS)进行葡萄糖初始磷酸化步骤的大肠杆菌和其他细菌中,增加有机酸生产碳通量和ATP供应的另一种可能方式为缺失PTS***的基本元件(例如ptsl或ptsG)(Lin等人,2005)(Zhang等人,2009)。在携带有PTS***缺失突变的突变体中,为确保进一步的葡萄糖摄入,必须保证另外的葡萄糖摄入***(如GalP)的活性。
增加有机酸生产中进入所需途径的碳通量的另一种可能方式是柠檬酸和乙醛酸循环工程化。非排他性例子为:
-通过增加异柠檬酸裂解酶活性(缺失转录阻遏子iclR)来优化大肠杆菌中琥珀酸的生产(Lin等人,2005)(Sanchez等人,2005a)。
-通过缺失异柠檬酸脱氢酶,和/或琥珀酸脱氢酶来优化琥珀酸的生产(Lin等人,2005)。
增加苹果酸、乙醛酸和乙酰-辅酶A反应基质进入DHB生产途径的另一种可能方式是稀释天冬氨酸转氨酶(aspC,tyrB),延胡索酸酶(fumABC),延胡索酸还原酶(frdBC)苹果酸合成酶(aceB)和乙醛酸还原酶(ghrAB)。
在另一个新陈代谢环境下,仅仅通过克雷伯氏循环和乙醛酸支路生产2,4-DHB前体苹果酸是可能的。这样的环境要求细胞基质和细胞膜限制的苹果酸脱氢酶mdh和mqo分别缺失。该方法主要避免碳通量潜在的流失成天冬氨酸及其衍生物。
增加2,4-DHB生产中进入所需途径的碳通量的另一种可能方式是在生产生物中表达适合的丙酮酸脱氢酶和柠檬酸合成酶。大肠杆菌的天然丙酮酸脱氢酶和柠檬酸合成酶被细胞内高NADH浓度抑制,这使得这些酶在厌氧条件下活力较低。在大肠杆菌中,对NADH不敏感的丙酮酸脱氢酶突变体的表达导致了厌氧条件下乙酰-CoA的过量生产和发酵终产物之间改变的碳通量再分配(乙酸,乳酸,乙醇,甲酸和丙酮酸)(Wang等人2010)。对NADH不敏感的枯草芽孢杆菌柠檬酸合成酶的异种表达增加了工程化的大肠杆菌菌株中琥珀酸的生产(Sanchez等人,2005)。结合上述突变,使用适合的丙酮酸脱氢酶和柠檬酸合成酶(NADH敏感或不敏感的),能调整厌氧和有氧条件下乙醛酸与柠檬酸循环反应和发酵途径之间的碳通量再分配。
增加通过DHB途径的碳通量的另一种可能方式是缺失可能降解途径中间体苹果酰-辅酶A,或4-苹果酸半醛的酶促反应。可能降解苹果酸半醛的候选酶是琥珀酸半醛脱氢酶(sad,gabD),以及其他能以末端醛基氧化短链和中链的碳链分子的脱氢酶。另外,已知苹果酰-辅酶A可以被柠檬酸合成酶降解。
增加宿主生物中2,4-DHB产率的另一种可能方式是缺失降解DHB的代谢反应。DHB是苹果酸酶的竞争性抑制物,因此,具有对该酶的活性位点的竞争性高亲和性(Rognstad&Katz,1979)。因此,2,4-DHB可以被其他酶识别并可能被降解。这些酶可以被识别并从宿主生物中缺失。
当2,4-DHB生产是基于加入苹果酸或其他有机酸时,生产2,4-DHB的微生物应该功能性表达能促进苹果酸(或其他有机酸如丙酮酸,琥珀酸等)摄入的膜输送蛋白。
本发明的转化的宿主生物可以进一步包括额外的合成DHB的途径,所述宿主生物包括至少一个嵌合基因,该基因与基因组融为一体或在外部染色体遗传元件中实施,该嵌合基因例如:编码苹果酸激酶的质粒或包含编码苹果酸激酶核苷酸的嵌合基因或包含编码苹果酸激酶核苷酸的表达载体,和/或编码苹果酸半醛脱氢酶的核苷酸或包含编码苹果酸半醛脱氢酶核苷酸的嵌合基因或包含编码苹果酸半醛脱氢酶核苷酸的表达载体,和/或编码DHB脱氢酶的核苷酸、包含编码DHB脱氢酶核苷酸的嵌合基因或包含编码DHB脱氢酶核苷酸的表达载体。所述酶在国际申请专利WO 2012/056318中描述。
下面的实施例举例说明了本发明。这些实施例仅是为了举例说明的目的,而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1描述了将(L)-苹果酸、琥珀酰-辅酶A或乙醛酸转化为(L)-2,4-二羟基丁酸(2,4-DHB)的反应流程。
图2附图显示了(顶部图表)对苹果酸半醛的活性,(中间图表)对琥珀酸半醛的活性,(底部图表)与野生型酶相比酶特异性的改变,通过对于苹果酸半醛和琥珀酸半醛的突变体活性比除以对于苹果酸半醛和琥珀酸半醛的野生型活性比的对数表示。(正值表示特异性改变偏向于苹果酸半醛)。
图3DHB路径酶以不同的组合培育2mM乙酰-辅酶A、2mM乙醛酸、2mM NADPH后,色谱图显示DHB的存在(反应1:苹果酰-辅酶A裂解酶(150μg/mL Me-Mcl),苹果酰-辅酶A还原酶(100μg/mL St-Mcr),和苹果酸半醛还原酶(100μg/mL Ms-SSAred H39R N43H);反应2:与反应1相同但使用100μg/mL Pg-SucD的苹果酰-辅酶A还原酶;对照1:与反应1相同但不使用苹果酰-辅酶A还原酶;对照2:与反应1相同但不使用苹果酸半醛还原酶)
实施例
实施例1:苹果酰-辅酶A裂解酶活性的演示
含有编码苹果酰-辅酶A裂解酶野生型基因的质粒的构建:在外链甲基杆菌(Arps等人,1993)和荚膜红细菌(Meister等人,2005)中编码苹果酰-辅酶A裂解酶mcl基因的DNA序列使用GENEius软件(Eurofins)优化用于在大肠杆菌中的表达。优化的序列通过Eurofins MWG合成,分别在起始密码子的上游限制性位点添加NheI和EcoRI在终止密码子下游添加mcl,这能够使用T4DNA连接酶(Biolabs)使合成DNA片段的克隆体直接进入pET28a+载体(Novagen)。绑定产品转运入大肠杆菌DH5α细胞中扩充,且使用标准基因协议(Sambrook等人,1989)分离质粒pET28-Mex-mcl(来自外链甲基杆菌表达苹果酰-辅酶A裂解酶)和pET28-Rca-mcl(来自荚膜甲基球菌表达苹果酰-辅酶A裂解酶)。表1中列出了利用mcl蛋白质序列和相应的天然和合成DNA序列的NCBI和Integrated Genomics著录信息。
表1:来自不同标注后的苹果酰-辅酶A裂解酶活性的生物中的蛋白质的著录信息,以及天然和优选的DNA序列的著录信息。
酶的表达:以标准基因协议(Sambrook等人,1989)将适合的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在250mL LB培养基中表达有N-末端六组氨酸标记的酶,在通过向培养基中加入1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白表达之前,LB培养基在OD600为0.1的条件下过夜培养并生长至OD600为0.6。表达蛋白3小时之后,以13000g离心10分钟收集细胞并弃去上层清液。细胞团储存在-20℃下直至进一步的分析。生长和蛋白表达在37℃下进行。培养基含有50μg/L的卡那霉素。
酶的纯化:将冷冻的表达培养物的细胞团块重悬浮在0.5mL破碎缓冲液中(50mMHepe,300mM NaCl,pH 7.5),通过四轮连续声波处理循环(声波间距:20sec,功率输出:30%,超声波仪:Bioblock Scientific,VibraCellTM 72437)破碎开。通过在4℃下13000g离心粗提物15分钟来去除细胞碎片并保留澄清的上层清液。通过加入15mg/mL的链霉素(Sigma)来从提取物中去除RNA和DNA,在4℃下13000g离心样品10分钟并保留上层清液。澄清的蛋白提取物与0.3(0.75mL)(床体积)的TalonTM钴亲和树脂(Clontech)在室温下温育20分钟(4℃下温育1h)。在台式离心机上700g离心悬液并去除上清。在以0.5mL洗脱缓冲液(50mM Hepe,300mM NaCl,500mM咪唑,pH 7.5)洗脱蛋白质之前,以10个床体积的清洗缓冲液(50mM Hepe,300mM NaCl,15mM咪唑,pH 7.5)清洗树脂。用SDS-PAGE分析来判断洗脱的酶的纯度。蛋白质浓度用Bradford方法进行估算。
酶测试:使用取自(Meister等人,2005)的方法分析苹果酰-辅酶A裂解酶活性。苹果酰-辅酶A合成酶通过苹果酰-辅酶A裂解酶结合到柠檬酸合成酶-催化释放的辅酶A上,该辅酶A通过与DTNB的自发反应进行监控。
反应流程:
苹果酰-辅酶A裂解酶:
乙酰-辅酶A+乙醛酸->(L)-苹果酰-辅酶A
柠檬酸合成酶:
(L)-苹果酰-辅酶A->(L)-苹果酸+辅酶A
自发反应:
辅酶A+DTNB->辅酶A酶DTN二硫化物
根据分析1的反应混合物含有50mM MOPS/KOH(pH 7.5),0.25mMDTNB,5mM MgCl2,1mM乙酰-辅酶A,20U/mL柠檬酸合成酶(所有产品来自Sigma),和适量纯化的苹果酰-辅酶A裂解酶或细胞提取物。加入10mM的乙醛酸开始反应。酶分析在37℃下96孔平底微量滴定板中以250μL终体积进行。随后在酶标仪(BioRad 680XR)中检测反应物412nm(εDNTB+CoA=13.6mM-1cm-1)处NADH的特征吸收。
来自外链甲基杆菌的苹果酰-辅酶A裂解酶的特征是具有Vmax为36μmol/(min mgprot)和对于乙醛酸0.5mM的Km值。
实施例2:苹果酰-辅酶A还原酶活性的演示
含有编码苹果酰-辅酶A还原酶和琥珀酰-辅酶A还原酶野生型基因的质粒的构建:在超嗜热古菌str 7(Alber等人,2006)中编码苹果酰-辅酶A还原酶mcr基因的DNA序列使用GENEius软件(Eurofins)优化用于在大肠杆菌中的表达。优化的mcr序列和在牙龈卟啉菌W83中编码琥珀酰-辅酶A还原酶的sucD基因天然DNA序列通过Eurofins MWG合成,分别在起始密码子的上游限制性位点添加NheI和EcoRI,在终止密码子下游添加mcl,这能够使用T4DNA连接酶(Biolabs)使合成DNA片段的克隆体直接进入pET28a+载体(Novagen)。绑定产品转运入大肠杆菌DH5α细胞中扩充,且使用标准基因协议(Sambrook等人,1989)分离质粒,pET28-St-mcr(来自超嗜热古菌表达苹果酰-辅酶A还原酶)和pET28-Pgi-sucD(来自牙龈卟啉菌表达琥珀酰-辅酶A还原酶)。在表2中列出了所用mcr和sucD蛋白质序列,和相应的天然和合成DNA序列NCBI著录信息。
表2:来自不同经标注的苹果酰-辅酶A还原酶或琥珀酰-辅酶A还原酶活性的生物中的蛋白质的著录信息,以及天然和优选的DNA序列的著录信息。
Pg-SucD表达和纯化的实施使用质粒pET28-Pgi-sucD如在实施例1中所述。
使用分别在起始密码子上游在终止密码子下游添加了SacI和BamHI限制性位点和的质粒的启动子的引物5’-TATAATGAGCTCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGATTCTGATGCGCCGT-3’(SEQ ID No.12)和5’-TATAATGGATCCCTCGAATTCTTACTTCTC-3’(SEQ ID No.13)从质粒pET28-St-mcr中扩增St-mcr基因。使用SacI和BamHI限制位点将PCR片段连接进入pACT3表达载体。获得的质粒pACT3-St-Mcr被转运至大肠杆菌MG1655菌株中。获得的表达菌株在37℃的矿质培养基中温育。1升矿质培养基含有20g葡萄糖,18g Na2HPO4*12H2O,3g KH2PO4,0.5g NaCl,2gNH4Cl,0.5g MgSO4*7H2O,0.015CaC12*2H2O,1毫升0.06moI/L的在100倍稀释的浓缩HCl中制备的FeC13储备液,2mL 10mM的HCl硫胺素储备液,20g MOP3,50μg硫酸卡那霉素(必要时有25μg的氯霉素),以及1mL微量元素溶液(每升含0.04g Na2EDTA*2H2O,0.18gCoC12*6H2O,ZnSO4*7H2O,0.04g Na2MoO4*2H2O,0.01g H3BO3,0.12gMnSO4*H2O,0.12gCuCl2*H2O)。调节pH至7并对培养基过滤灭菌。
指数增长的培养基生长至OD(600nm)为0.6时,通过离心(13000x g,10min)收集细胞前添加1mM IPTG且培养基在20℃温育14h。弃去上层清液后将细胞团块储存在-20℃下。
纯化St-Mcr,将冷冻的表达培养物的细胞团块重悬浮在0.5mL破碎缓冲液中(50mMHepe,300mM NaCl,pH 7.5),通过四轮连续声波处理循环(声波间距:20sec,功率输出:30%,超声波仪:Bioblock Scientific,VibraCellTM 72437)破碎开。通过在4℃下13000g离心粗提物15分钟来去除细胞碎片并保留澄清的上层清液。通过在85℃下加热沉淀物30min随后13000xg离心去除大肠杆菌的天然蛋白质。用SDS-PAGE分析来判断制备的蛋白质的纯度,其显示仅一个条带与期望的St-Mcr蛋白质尺寸相符。
酶测试:分别实施测试1和测试2的还原和氧化反应测试苹果酰-辅酶A还原酶活性。
测试1(反应流程):
苹果酰-辅酶A裂解酶:
乙醛酸+乙酰-辅酶A->苹果酰-辅酶A+乙酸
苹果酰-辅酶A还原酶:
(L)-苹果酸-辅酶A+NADPH->(L)-苹果酸半醛+辅酶A+NADP
测试2(反应流程):
(L)-苹果酸半醛+辅酶A+NADP->(L)-苹果酸-辅酶A+NADPH
测试1的反应混合物含有50mM MOPS/KOH(pH 7.5),10mM乙醛酸,4mM乙酰-辅酶A,5mM MgCl2,0.25mM NADPH(所有产品来自Sigma),5U/mL苹果酰-辅酶A裂解酶,和适量纯化的苹果酰-辅酶A还原酶或细胞提取物。加入乙醛酸开始反应。在37℃下96孔平底微量滴定板中以250μL终体积进行酶分析。随后在酶标仪(BioRad 680XR)中检测反应物340nm(εNADPH=6.22mM-1cm-1)处NADH的特征吸收。
测试2的反应混合物含有200mM HEPES(pH 9),5mM MgCl2,1mM NADP,0.5mM辅酶A(所有产品来自Sigma),和适量纯化的苹果酰-辅酶A还原酶。加入5mM(L)-苹果酸-半醛开始反应。在37℃下96孔平底微量滴定板中以250μL终体积进行酶分析。随后在酶标仪(BioRad680XR)中检测反应物340nm(εNADPH=6.22mM-1cm-1)处NADH的特征吸收。酶测试之前通过将稳定的苹果酸半醛衍生物2-[(4S)-2,2-二甲基-5-氧-1,3-二氧戊环-4-基]乙醛(DMODA)(提供)脱保护来刚形成的不稳定苹果酸半醛。通过将适量的DMODA溶解在2M盐酸中,短时加热悬浮液至沸腾,将热的悬浮液在室温下静置15分钟获得苹果酸半醛。在旋转蒸发仪中35℃和50mbar下蒸发释放丙酮。使用碳酸氢钠将苹果酸半醛溶液的pH固定在3.5。
在表3和表4中列举的结果表明苹果酰-辅酶A还原酶对于超嗜热古菌的丙二酰-辅酶A还原酶Mcr,牙龈卟啉菌的琥珀酰-辅酶A还原酶SucD的活性。
表3:反应的还原性动力学参数(丙二酰-辅酶A还原酶和琥珀酰-辅酶A还原酶活性通过向反应混合物中直接加入底物丙二酰-辅酶A和琥珀酰-辅酶A进行评估)。
表4:反应的氧化性动力学参数
实施例3:DHB还原酶活性的演示
为了确定合适的2,4DHB还原酶,测试不同生物源的β-羟基羧酸脱氢酶还原苹果酸半醛的能力。测试的酶有:来自酿酒酵母的甲基丁醛还原酶Ypr1(Ford&Ellis,2002)(SEQID No.14),牙龈卟啉菌的4-羟基丁酸脱氢酶,4hbdh(SEQ ID No.187),大肠杆菌的醇脱氢酶YqhD(SEQ ID no.185),和来自金属球菌的琥珀酸半醛还原酶Ms-Ssr(Kockelkorn&Fuchs,2009)(SEQ ID No.16)。使用表5中列出的引物扩增基因YPR1,4hbdh,yqhD,和Ms-SSR并克隆入载体pET28(限制性内切酶见表5)分别获得质粒pET28-Sce-YPR1,pET28-Pgi-4hbdh,pET28-Eco-yqhd和pET28-Mse-SSR。如实施例1中所述表达和纯化蛋白质。
表5:用于克隆候选β-羟基酸脱氢酶的引物和限制性内切酶
对苹果酸半醛还原酶活性的测试:
反应流程:
(L)-苹果酸半醛+NAD(P)H→(L)-2,4-二羟基丁酸+NAD(P)
分析混合物含有200mM Hepes(pH 7.5),50mM KCl,5mM MgCl2,0,24mM NADH或NADPH,和适量纯化的酶或细胞提取物。加入10mM(L)-苹果酸-半醛开始反应(用于每次测试的苹果酸半醛新鲜制备,见实施例3)。酶分析在30℃下96孔平底微量滴定板中以250μL终体积进行。随后在酶标仪(BioRad 680XR)中检测反应物340nm(εNADPH=6.22mM-1cm-1)处NADH的特征吸收。结果在表6中列出。
表6:所选的β-羟基羧酸脱氢酶对苹果酸半醛的还原活性(结果为至少两组独立实验的平均值)。
来自金属球菌的琥珀酸半醛脱氢酶和来自酿酒酵母的甲基丁醛还原酶具有苹果酸半醛还原酶的活性。对苹果酸半醛的Ms-SSR的Km为4mM.
实施例4:改进的苹果酰-辅酶A还原酶的合理构建
使用表7中列出的寡核苷酸对进行位点专一诱变,且以pET28-Sto-mcr质粒为模板。通过PCR(Phusion 1U,HF缓冲液20%(v/v),dNTPs2.5mM,正向和反向引物每种1μM,模板质粒200ng,水)导入改变氨基酸序列的点突变。在可能的情况下,除了促进突变克隆识别的功能突变外,PCR创建的质粒包含新的限制性位点(使用沉默突变导入)。PCR产物被Dpnl在37℃消化2x 2h以去除模板DNA,并转化入NEB DH 5α感受态大肠杆菌细胞(NEB)。通过限制性位点分析来识别突变的质粒并通过DNA测序判断其携带的目标突变。
表7:用于突变超嗜热古菌的mcr基因的引物对。
使用在实施例2中描述的测试3的氧化反应测试St-Mcr的基因修饰影响。图3显示了将天然Tyr206取代为其它氨基酸减弱了对天然底物、琥珀酸半醛的活性,同时导致对苹果酸半醛活性增加或至少不变。因此,用适当的氨基酸残基取代Tyr206提供了关于Mcr对DHB中间路径特异性的选择性优势。在206位中优选的氨基酸残基为苯丙氨酸,组氨酸,异亮氨酸,赖氨酸,蛋氨酸,甘氨酸,天冬酰胺,脯氨酸,精氨酸,谷氨酰胺,亮氨酸,丝氨酸,色氨酸和苏氨酸。
络氨酸206被脯氨酸残基取代的蛋白质由SEQ ID No.202表示。
实施例5:改进的DHB脱氢酶的合理构建
使用表6中列出的寡核苷酸对进行位点专一诱变,且以pET28-Mse-SSR质粒为模板。通过PCR(Phusion 1U,HF缓冲液20%(v/v),dNTPs2.5mM,正向和反向引物每种1μM,模板质粒200ng,水)导入改变氨基酸序列的点突变。在可能的情况下,除了促进突变克隆识别的功能突变外,PCR创建的质粒包含新的限制性位点(使用沉默突变导入)。PCR产物被Dpnl在37℃消化2x 2h以去除模板DNA,并转化入NEB DH5α感受态大肠杆菌细胞(NEB)。通过限制性位点分析来识别突变的质粒并通过DNA测序判断其携带的目标突变。表8总结了突变的动力学参数。结果显示双突变Ms-SSR H39R N43H(SEQ ID No.38)与野生型酶相比,具有改进的对苹果酸半醛的亲和性。
表8:用于突变金属球菌琥珀酸半醛还原酶(Ms-SSR)的引物对。
表9:金属球菌琥珀酸半醛还原酶(Ms-SSR)突变的动力学参数概况(结果为至少两组独立实验的平均值)。
相应的核苷酸序列由SEQ ID No.17,SEQ ID No.33,SEQ ID No.35和SEQ IDNo.37表示。
使用软件,优化包括突变体H39R和N43H的金属球菌琥珀酸半醛还原酶的编码序列以在大肠杆菌中最大表达。合成基因由基因合成仪(lnvitrogen Life Technologie)生产。Nhel和EcoRI限制性位点被分别引入到起始密码子上游和终止密码子下游,这允许直接克隆到pET28a+(Novagen)中。
得到的pET28-Mse-DHB-Dh-H39R_N43H-opt质粒被分离并以DNA测序显示其包含具有正确序列(SEQ ID No.38)的全长金属球菌SSR H39RN43H基因。
实施例6:通过合成苹果酰-辅酶A路径在体外生产DHB的演示
苹果酰-辅酶A裂解酶(Me-Mcl),苹果酰-辅酶A还原酶(St-Mcr或Pg-SucD),DHB脱氢酶(Ms-SSA-red H39N N43H)的表达和纯化如实施例1、2和3中所述。
通过向含有50mM Hepes(pH 7.5),2mM乙酰-辅酶A,2mMNADPH,100μg/mL DHB脱氢酶,150μg/mL苹果酰-辅酶A裂解酶,和100μg/mL苹果酰-辅酶A还原酶(在St-Mcr(反应1)或Pg-SucD(反应2)中)的反应混合物中加入2mM乙醛酸来演示体外包含苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和DHB脱氢酶路径的DHB的生产。
对照反应含有所有组分但缺少DHB还原酶(对照1)或苹果酰-辅酶A还原酶(对照2)。在37℃温育120分钟之后,通过气相色谱分析反应混合物中DHB的含量[GCMS-QP2010Ultra Shimadzu;装有FID检测器(FID-2010Plus Shimadzu);自动进样器AOC20s(Shimadzu);无分流注射器AOC20i(Shimadzu)(230℃);柱:Zebron ZB-FFAP,30m×0.25mm,df 0.25μm;和衬层:锥形聚焦衬层5x 95x 3.4mm(SGE)。载气为流速25mL/min的氢气。使用空气-氢气混合物进行火焰离子化(流速分别为300mL/min和30mL/min)。检测器温度为240℃。注入的样品体积为1μL。温度程序在表10中提供。
图2中显示的色谱图展示了有DHB的存在包含所有路径酶的反应,和没有DHB仅包含三种路径酶中两种酶的反应样品。
表10:反应混合物的GC分析温度曲线
实施例7:优化的DHB生产菌株的构建
构建用于同时表达苹果酰-辅酶A合成酶、苹果酰-辅酶A还原酶、DHB-脱氢酶的质粒:
通过使用高保真聚合酶Phusion(Fermentas)和包含在起始密码子(下划线的)上游导入SacI限制性位点的正向及反向引物5’-TCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCGGTAATGTCGTTTACCCTGATTCAGCAAGCGACT-3’(SEQ ID No.39)和5’-GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTTATTTGCCGCCCATTGCATCCGCTTTCTG-3’(SEQ IDNo.40)由质粒pET28-Mex-mcl扩增来自外链甲基杆菌的苹果酰-辅酶A裂解酶的编码序列Me-mcl。通过使用包含在终止密码子下游导入BamHI限制性位点的正向及反向引物5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGATTCTGATGCGCCGTACCCTGAAAGCG-3’(SEQ ID No.41)和5’-GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTTACTTCTCGATGTAGCCTTTCTCCACGAG-3’(SEQ ID No.42)由质粒pET28-Sto-mcr扩增来自超嗜热古菌的苹果酰-辅酶A还原酶的编码序列St-mcr。通过使用在终止密码子(下划线的)下游导入BamHI限制性位点的正向及反向引物5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAAGCAGCAGTTCTGCATACCTATAAAGAACCGCTGAGCAT-3’(SEQID No.43)和5’-ATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTACGGAATAATCAGGCTACGAATTGCTTC-3’(SEQ ID No.44)由质粒pET28-Mse-DHB-Dh-H39R_N43H-opt(实施例5)作模板来扩增来自金属球菌的琥珀酸半醛还原酶的编码序列H39R N43H。
导入St-mcr的正向引物和来自金属球菌的琥珀酸半醛还原酶H39RN43H包含rbs修饰基序。使用In-Fusion克隆试剂盒(Clontech)通过同源重组将三个基因同时克隆入pACT3表达载体。
分离所得结果和pACT3-MCL-DHB(SEQ ID No.45)质粒且用DNA序列说明其具有正确的序列。
构建用于同时表达苹果酰-辅酶A合成酶、苹果酰-辅酶A还原酶、DHB-脱氢酶的质粒:
使用GENEius软件(Eurofins)来优化用于编码来自的Methylobacteriumextorquens AM1的苹果酰-辅酶A合成酶两个蛋白质子单元mtkA(YP_00296285)和mtkB(YP_002962852)的DNA序列在大肠杆菌中的表达。优化后的子单元DNA序列通过在外链甲基杆菌基因组中mtkA和mtkB基因之间天然存在的DNA序列(CGAACGGGGGAGGAATCACGCC,SEQ IDNo.46)物理的连接。获得的DNA片段“mtkA基因–连接DNA-mtkB基因”通过Eurofins MWG合成且使用NheI和EcoRI限制性内切酶子克隆到pET28b表达载体中。使用高保真聚合酶Phusion(Fermentas)和包含在起始密码子(下划线的)上游导入SacI限制性位点的正向及反向引物5’-CAGGAAACAGAATTCGAGCTCGGTAATGGATGTGCACGAATATCAGGCGAAAGAACTGCT-3’(SEQ ID No.48)和5’-TACGGCGCATCAGAATCATtacgccgcacgtgctaacacatcggcaac-3’(SEQ IDNo.49)由获得的DNA质粒pET28-Mex-mtkAB(SEQ ID No.47)同时扩增两个编码来自外链甲基杆菌的苹果酰-辅酶A合成酶的密码子优化基因,Me-mtkA和Me-mtkB。使用包含在终止密码子下游导入BamHI限制性位点的正向及反向引物5’-GGCGTAATGATTCTGATGCGCCGTACCCTGAAAGCG-3’(SEQ ID No.50)和5’-CTGCTGCTTTCATTACTTCTCGATGTAGCCTTTCTCCACGAG-3’(SEQ ID No.51)由质粒pET28-Sto-mcr扩增来自超嗜热古菌的丙二酰-辅酶A还原酶的编码序列,St-mcr。使用包含在终止密码子(下划线的)下游导入BamHI限制性位点的正向及反向引物5’-TACATCGAGAAGTAATGAAAGCAGCAGTTCTGCATACCTATAAAGAAC-3’(SEQ ID No.52)和5’-CCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTACGGAATAATCAGGCTACGAATTGCTTCAC-3’(SEQ ID No.53)由质粒pET28-Mse-DHB-Dh-H39R_N43H-opt(实施例5)作为模板扩增来自金属球菌的琥珀酸半醛还原酶的优化的编码序列H39R N43H。
使用In-Fusion克隆试剂盒(Clontech)通过同源重组将三个基因同时克隆入pEXT20表达载体。
分离获得的pEXT20-MCS-DHB(SEQ ID No.54)质粒且用DNA序列说明其具有正确的序列。
构建用于过度表达磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶、PEP羧化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸裂解酶和半乳糖同向转运透性酶的质粒:
使用来自大肠杆菌MG1655的基因DNA作为模板并使用分别为5'TATAATCCCGGGATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC3'(SEQ ID No.56和5'TATAATTCTAGATTACAGTTTCGGACCAGCCG3'(SEQ ID No.57)的正向及反向引物通过扩增pck编码序列来构建拥有大肠杆菌PEP羧激酶编码pck基因的质粒pACT3-pck。用XmaI和XbaI消化DNA片段,使用T4DNA连接酶(Biolabs)连接到pACT3表达载体(Dykxhoorn等人,1996)的对应位点,并转移入大肠杆菌DH5α细胞。在LB固体培养基上选择转化株包含氯霉素(25μg/mL)。得到的质粒被分离并通过测序判断pck基因的正确***。表11中所列引物类似地构建分别拥有aceA,ppc,galP,或pykA(所有大肠杆菌)或乳酸乳球菌pck的质粒pACT3-aceA,pACT3-ppc,pACT3-gaIP,pACT3-pykA和pACT3-pyc。
表11:用于构建基因过量表达质粒的引物。用于克隆到pACT3中的限制性位点加下划线。
可以理解的是,上述质粒的骨架中移除lacI基因和在宿主菌株中缺失lacI基因可以使来自上述质粒的蛋白质表达构建。
构建具有优化的DHB生产的碳通量再分配的菌株
阻断了大肠杆菌菌株MG1655中的数个基因以优化DHB生产的碳通量再分配和辅助元件供应。依照Datsenko等人(Datsenko&Wanner,2000)使用λ红重组酶方法,或取自Miller(Miller,1992)的噬菌体转化方法进行基因缺失。
使用λ红重组酶方法进行基因缺失的方案:使用高保真聚合酶PhusionTM(Finnzymes),并使用pKD4质粒的FRT侧翼卡那霉素抗性基因(kan)作为模板,通过PCR制备缺失盒(Datsenko&Wanner,2000)。正义引物含有对应每个目标基因5’末端的序列(下划线),随后有20bp的对应pKD4的FRT-kan-FRT盒。反义引物含有对应每个目标基因3’末端的序列(下划线),随后有20bp的对应盒。引物在表12中描述。在转化之前,PCR产物被以Dpnl消化并纯化。
通过在LB液体培养基中37℃将细胞培养至OD600为0.6,浓缩细胞100倍并以冰冷的10%甘油清洗两次,大肠杆菌MG1655株系被制成电转感受态。通过电穿孔(2.5kV,200Ω,25μF,在2mm间隙的转化杯中)以质粒pKD46转化细胞(Datsenko&Wanner,2000)。30℃下在氨苄青霉素(100μg/mL)LB固体培养基上选择转化体。
阻断盒被转化入有λ红重组酶表达的质粒pKD46的电转感受态大肠杆菌菌株中。细胞30℃下在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的SOB液体培养基上培养。当培养物的OD600达到0.1时,通过加入10mM***糖诱导λ红重组酶***。在细胞被离心收获,以冰冷的10%甘油清洗两次,并通过电穿孔以阻断盒转化之前,细胞被进一步培养至OD600为0.6。在30℃下LB液体培养基中过夜表型表达之后,细胞被接种在含25μg/mL卡那霉素的固体LB培养基上。培养后在30℃选择转化体。
使用Crimson Taq聚合酶(NEB),以菌落PCR验证基因替换。以侧翼位点特异性引物(见表12)进行第一反应以判断同时的母片段的缺失和新突变特异片段的获得。通过使用一个位点特异性引物和FRT-卡那霉素抗性盒(正义位点引物/k1rev和k2for/反向位点引物)中一个相应测试引物k1rev,或k2for(见表12)完成另外的两个反应。
随后使用有FLP重组酶的质粒pCP20将抗性基因(FRT-kan-FRT)从染色体上切下(Cherepanov&Wackernagel,1995),留下含有一个FRT位点的创痕区域。pCP20是显示温度敏感复制和FLP重组酶合成热诱导的氨苄青霉素和CmR质粒。以pCP20转化卡那霉素抗性突变体,并在30℃下选择氨苄青霉素抗性转化体。随后在固体LB培养基上37℃培养突变体并测试所有抗生素抗性的缺失。使用Crimson Taq聚合酶和侧翼位点特异性引物(表12),以菌落PCR分析FRT-卡那霉素盒的切除。通过重复上述步骤获得多个缺失。
表12:用于基因阻断的引物。与靶基因同源的序列加下划线。
表13:用于验证基因阻断的引物对。
使用噬菌体转导方法进行基因缺失的方案:从Keio菌群(Baba等人,2006)中获得载有期望单独缺失的菌株。通过向包含50μg/mL卡那霉素,2g/L葡萄糖,和5mM CaCl2的10mL的LB培养基中接种100μL过夜的预培养物,制备单独缺失突变的噬菌体裂解酶。随后在37℃下温育1h,添加野生型MG1655菌株制备的200μL噬菌体裂解酶,将培养基再温育2-3h直至完成细胞溶解。添加200μL氯仿后,细胞制备物先用力搅拌,然后在4500x g下离心10min。获得干净的裂解酶且在4℃下储存。
通过在LB培养基37℃下过夜培养物制备用于噬菌体转化的受体菌株。体积为1.5mL的预培养物在1500x g下离心10min。弃去上层清液,细胞团块在包含10mM MgSO4和5mM CaCl2的600μL溶液中重悬。通过将100μL包含受体菌株的溶液与100μL裂解酶混合进行转变,在30℃下培育该混合物30min。随后,添加100μL的1M柠檬酸钠随后用力搅拌。加入1mLLB培养基后,细胞悬浮液在37℃下温育1h,然后将细胞覆盖在包含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养皿中。使用表13列举的引物,通过菌落PCR来确认能够在抗生素的存在下生长的克隆体包含期望的缺失。根据(Cherepanov & Wackernagel,1995)的方法每个基因缺失引入后,抗生素标记如上所述被移除。
共同表达苹果酰-辅酶A合成酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和DHB脱氢酶(pEXT20-MCS-DHB或pACT3-MCS-DHB)的质粒;或共同表达苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和DHB脱氢酶(pEXT20-MCL-DHB或pACT3-MCL-DHB)的质粒;或空白对照质粒(pEXT20或pACT3)单独转化或与质粒pACT3-aceA,pACT3-ppc,pACT3-galP,pACT3-pck或pACT3-pyc共同转化进入优化的宿主菌株中。包括表达DHB途径酶的质粒和表达补缺酶的质粒的转化株在包含氯霉素(25μg/mL)和卡纳霉素(50μg/mL)的LB固体培养基中进行选择。构造菌株的非排他性实施例在表14中列举。
表14:构建用于DHB生产菌株的实施例
实施例8:通过合成苹果酰-辅酶A路径进行DHB发酵生产的演示。
菌株和培养条件:使用由SEQ ID No.203表示的质粒pACT3-MCL-DHB表达DHB途径的菌株ECE69(在该实验中野生型Mcr酶被Mcr Tyr206Pro突变取代)和包含空白质粒pACT3的同基因对照菌株ECE70进行实验。所有的培养在37℃下以170rpm运行的Infors旋转振荡器中进行。过夜培养物(测试管中3mL培养基)从甘油储备物中接种并将500mL摇瓶中培养的100mL生长培养物的初始OD600调整为0.05。当生长培养物中的OD600达到1时,加入1mmol/L浓度的IPTG。生长矿物培养基的成分在实施例2中给出。
通过LC-MS/MS分析来估算DHB浓度:在装有自动洗脱液(KOH)生成***(RFIC,Dionex),和保持样品在4℃下的自动进样器(AS50,Dionex)的Dionex(Sunnyvale,USA)的ICS-3000***上进行液相阴离子交换色谱分析。分析物在被AG11HC(50x 2mm,Dionex)预柱保护的IonPac AS11HC(250x 2mm,Dionex)柱中进行分离。柱温度被保持在25℃,流速设定为0.25mL/min,使用之前公开的KOH梯度冲洗分析物(Groussac E,Ortiz M&Francois J,2000,Improved protocols for quantitative determination of metabolites frombiological samples using high performance ionic-exchange chromatography withconductimetric and pulsed amperometric detection.Enzyme.Microb,Enzyme.Microb.Technol.26,715-723)。样品注入体积为15μL。使用阴离子去除剂ASRSultra II(2mm,外部水模式,75mA)来降低噪音。在ESI模式(***1/3,氮气压力90psi,毛细管电压为3.5kV,探针温度为450℃)运行的质量灵敏检测器(MSQ Plus,Thermo)中量化分析物。
结果:菌株ECE69和ECE70培养24h后的上层清液分别含有0.05mM DHB和0mM DHB,表明DHB生成要经过合成路径。
参考文献
Akita,O.,Nishimori,C.,Shimamoto,T.,Fujii,T.&Iefuji,H.(2000).Transportof pyruvate in Saccharomyces cerevisiae and cloning of the gene encodedpyruvate permease.Biosci Biotechnol Biochem 64,980–984.
Alber,B.,Olinger,M.,Rieder,A.,Kockelkorn,D.,Jobst,B.,Hügler,M.&Fuchs,G.(2006).Malonyl-coenzyme A reductase in the modified3-hydroxypropionate cycle for autotrophic carbon fixation in archaealMetallosphaera and Sulfolobus spp.J Bacteriol 188,8551–8559.Arps,P.J.,Fulton,G.F.,Minnich,E.C.&Lidstrom,M.E.(1993).Genetics of serine pathway enzymes inMethylobacterium extorquens AM1:phosphoenolpyruvate carboxylase and malylcoenzyme A lyase.J Bacteriol 175,3776–3783.
Auriol,C.,Bestel-Corre,G.,Claude,J.-B.,Soucaille,P.&Meynial-Salles,I.(2011).Stress-induced evolution of Escherichia coli points to originalconcepts in respiratory cofactor selectivity.Proc Natl Acad Sci U S A 108,1278–1283.
Baba,T.,Ara,T.,Hasegawa,M.,Takai,Y.,Okumura,Y.,Baba,M.,Datsenko,K.A.,Tomita,M.,Wanner,B.L.&Mori,H.(2006).Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Syst Biol 2,2006.0008.
Bailey,J.E.(1991).Toward a science of metabolic engineering.Science252,1668–1675.
Camarasa,C.,Bidard,F.,Bony,M.,Barre,P.&Dequin,S.(2001).Characterization of Schizosaccharomyces pombe malate permease by expressionin Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol 67,4144–4151.
Cherepanov,P.P.&Wackernagel,W.(1995).Gene disruption in Escherichiacoli:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of theantibiotic-resistance determinant.Gene 158,9–14.
Chistoserdova,L.,Kalyuzhnaya,M.G.&Lidstrom,M.E.(2009).The expandingworld of methylotrophic metabolism.Annu Rev Microbiol 63,477–499.
Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000).One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A97,6640–6645.
Ford,G.&Ellis,E.M.(2002).Characterization of Ypr1p from Saccharomycescerevisiae as a 2-methylbutyraldehyde reductase.Yeast Chichester Engl 19,1087–1096.
Friedmann,S.,Steindorf,A.,Alber,B.E.&Fuchs,G.(2006).Properties ofsuccinyl-coenzyme A:L-malate coenzyme A transferase and its role in theautotrophic 3-hydroxypropionate cycle of Chloroflexus aurantiacus.JBacteriol188,2646–2655.
Grobler,J.,Bauer,F.,Subden,R.E.&Van Vuuren,H.J.(1995).The mae1 geneof Schizosaccharomyces pombe encodes a permease for malate and otherC4dicarboxylic acids.Yeast Chichester Engl 11,1485–1491.
Akita,O.,Nishimori,C.,Shimamoto,T.,Fujii,T.&Iefuji,H.(2000).Transportof pyruvate in Saccharomyces cerevisiae and cloning of the gene encodedpyruvate permease.Biosci Biotechnol Biochem 64,980–984.
Alber,B.,Olinger,M.,Rieder,A.,Kockelkorn,D.,Jobst,B.,Hügler,M.&Fuchs,G.(2006).Malonyl-coenzyme A reductase in the modified3-hydroxypropionatecycle for autotrophic carbon fixation in archaeal Metallosphaera andSulfolobus spp.J Bacteriol 188,8551–8559.
Arps,P.J.,Fulton,G.F.,Minnich,E.C.&Lidstrom,M.E.(1993).Genetics ofserine pathway enzymes in Methylobacterium extorquens AM1:phosphoenolpyruvatecarboxylase and malyl coenzyme A lyase.J Bacteriol 175,3776–3783.
Auriol,C.,Bestel-Corre,G.,Claude,J.-B.,Soucaille,P.& Meynial-Salles,I.(2011).Stress-induced evolution of Escherichia coli points to originalconcepts in respiratory cofactor selectivity.Proc Natl Acad Sci U S A 108,1278–1283.
Baba,T.,Ara,T.,Hasegawa,M.,Takai,Y.,Okumura,Y.,Baba,M.,Datsenko,K.A.,Tomita,M.,Wanner,B.L.&Mori,H.(2006).Construction of Escherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Syst Biol 2,2006.0008.
Bailey,J.E.(1991).Toward a science of metabolicengineering.Science252,1668–1675.
Camarasa,C.,Bidard,F.,Bony,M.,Barre,P.&Dequin,S.(2001).Characterization of Schizosaccharomyces pombe malate permease by expressionin Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol 67,4144–4151.
Cherepanov,P.P.&Wackernagel,W.(1995).Gene disruption in Escherichiacoli:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of theantibiotic-resistance determinant.Gene 158,9–14.
Chistoserdova,L.,Kalyuzhnaya,M.G.&Lidstrom,M.E.(2009).The expandingworld of methylotrophic metabolism.Annu Rev Microbiol 63,477–499.
Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000).One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A97,6640–6645.
Ford,G.& Ellis,E.M.(2002).Characterization of Ypr1p fromSaccharomyces cerevisiae as a 2-methylbutyraldehyde reductase.YeastChichester Engl 19,1087–1096.
Friedmann,S.,Steindorf,A.,Alber,B.E.&Fuchs,G.(2006).Properties ofsuccinyl-coenzyme A:L-malate coenzyme A transferase and its role in theautotrophic 3-hydroxypropionate cycle of Chloroflexus aurantiacus.JBacteriol188,2646–2655.
Grobler,J.,Bauer,F.,Subden,R.E.&Van Vuuren,H.J.(1995).The mae1 geneof Schizosaccharomyces pombe encodes a permease for malate and other C4dicarboxylic acids.Yeast Chichester Engl 11,1485–1491.
Groeneveld,M.,Weme,R.G.J.D.O.,Duurkens,R.H.&Slotboom,D.J.(2010).Biochemical characterization of the C4-dicarboxylate transporter DctA fromBacillus subtilis.J Bacteriol 192,2900–2907.
Jantama,K.,Zhang,X.,Moore,J.C.,Shanmugam,K.T.,Svoronos,S.A.&Ingram,L.O.(2008a).Eliminating side products and increasing succinate yields inengineered strains of Escherichia coli C.Biotechnol Bioeng 101,881–893.
Jantama,K.,Haupt,M.J.,Svoronos,S.A.,Zhang,X.,Moore,J.C.,Shanmugam,K.T.&Ingram,L.O.(2008b).Combining metabolic engineering and metabolicevolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli C thatproduce succinate and malate.Biotechnol Bioeng 99,1140–1153.
Kawasaki,T.,Koita,H.,Nakatsubo,T.,Hasegawa,K.,Wakabayashi,K.,Takahashi,H.,Umemura,K.,Umezawa,T.&Shimamoto,K.(2006).Cinnamoyl-CoAreductase,a key enzyme in lignin biosynthesis,is an effector of small GTPaseRac in defense signaling in rice.Proc Natl Acad Sci U S A 103,230–235.
Kockelkorn,D.&Fuchs,G.(2009).Malonic semialdehyde reductase,succinicsemialdehyde reductase,and succinyl-coenzyme A reductase from Metallosphaerasedula:enzymes of the autotrophic3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cyclein Sulfolobales.J Bacteriol 191,6352–6362.
Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.&other authors.(2007).Clustal Wand Clustal X version 2.0.Bioinforma Oxf Engl 23,2947–2948.
Lin,H.,Bennett,G.N.&San,K.-Y.(2005).Metabolic engineering of aerobicsuccinate production systems in Escherichia coli to improve processproductivity and achieve the maximum theoretical succinate yield.Metab Eng 7,116–127.
Meister,M.,Saum,S.,Alber,B.E.&Fuchs,G.(2005).L-malyl-coenzyme A/beta-methylmalyl-coenzyme A lyase is involved in acetate assimilation of theisocitrate lyase-negative bacterium Rhodobacter capsulatus.J Bacteriol 187,1415–1425.
Millard,C.S.,Chao,Y.P.,Liao,J.C.&Donnelly,M.I.(1996).Enhancedproduction of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvatecarboxylase in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol 62,1808–1810.
Miller,J.H.(1992).A Short Course in Bacterial Genetics:A LaboratoryManual andHandbook for Escherichica coli and Related Bacteria.Plainview(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Rognstad,R.& Katz,J.(1979).Effects of 2,4-dihydroxybutyrate onlipogenesis in rat hepatocytes.J Biol Chem 254,11969–11972.
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.&Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd edn.Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor LaboratoryPress.
Sanchez,A.M.,Bennett,G.N.&San,K.-Y.(2005).Novel pathway engineeringdesign of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli toincrease succinate yield and productivity.Metab Eng 7,229–239.
Sauer,U.&Eikmanns,B.J.(2005).The PEP-pyruvate-oxaloacetate node asthe switch point for carbon flux distribution in bacteria.Fems MicrobiolRev29,765–794.
Seedorf,H.,Fricke,W.F.,Veith,B.,Brüggemann,H.,Liesegang,H.,Strittmatter,A.,Miethke,M.,Buckel,W.,Hinderberger,J.&other authors.(2008).Thegenome of Clostridium kluyveri,a strict anaerobe with unique metabolicfeatures.Proc Natl Acad Sci U S A 105,2128–2133.
Shinka,T.,Inoue,Y.,Ohse,M.,Ito,A.,Ohfu,M.,Hirose,S.&Kuhara,T.(2002).Rapid and sensitive detection of urinary 4-hydroxybutyric acid and itsrelated compounds by gas chromatography-mass spectrometry in a patient withsuccinic semialdehyde dehydrogenase deficiency.J Chromatogr B Anal TechnolBiomed Life Sci 776,57–63.
Smejkalová,H.,Erb,T.J.&Fuchs,G.(2010).Methanol assimilation inMethylobacterium extorquens AM1:demonstration of all enzymes and theirregulation.Plos One 5.
B.&Gottschalk,G.(1993).Purification and characterization of acoenzyme-A-dependent succinate-semialdehyde dehydrogenase from Clostridiumkluyveri.Eur J Biochem Febs 212,121–127.
Vuilleumier,S.,Chistoserdova,L.,Lee,M.-C.,Bringel,F.,Lajus,A.,Zhou,Y.,Gourion,B.,Barbe,V.,Chang,J.&other authors.(2009).Methylobacterium genomesequences:a reference blueprint to investigate microbial metabolism of C1compounds from natural and industrial sources.Plos One 4,e5584.
Wang,Q.,Ou,M.S.,Kim,Y.,Ingram,L.O.&Shanmugam,K.T.(2010).Metabolicflux control at the pyruvate node in an anaerobic Escherichia coli strainwith an active pyruvate dehydrogenase.Appl Environ Microbiol 76,2107–2114.
Werpy,T.&Petersen,G.(2004).Top value added chemicals frombiomass.Results of screening for potential candidates from sugars andsynthesis gas.Washington DC.
Zarzycki,J.,Brecht,V.,Müller,M.&Fuchs,G.(2009).Identifying themissing steps of the autotrophic 3-hydroxypropionate CO2 fixation cycle inChloroflexus aurantiacus.Proc Natl Acad Sci U S A 106,21317–21322.
Zelle,R.M.,de Hulster,E.,van Winden,W.A.,de Waard,P.,Dijkema,C.,Winkler,A.A.,Geertman,J.-M.A.,van Dijken,J.P.,Pronk,J.T.&van Maris,A.J.A.(2008).Malic acid production by Saccharomyces cerevisiae:engineering ofpyruvate carboxylation,oxaloacetate reduction,and malate export.Appl EnvironMicrobiol 74,2766–2777.
Zelle,R.M.,de Hulster,E.,Kloezen,W.,Pronk,J.T.&van Maris,A.J.A.(2010).Key process conditions for production of C(4)dicarboxylic acids inbioreactor batch cultures of an engineered Saccharomyces cerevisiaestrain.Appl Environ Microbiol 76,744–750.
Zhang,X.,Jantama,K.,Shanmugam,K.T.&Ingram,L.O.(2009).ReengineeringEscherichia coli for Succinate Production in Mineral Salts Medium.ApplEnviron Microbiol 75,7807–7813.
Zhang,X.,Wang,X.,Shanmugam,K.T.&Ingram,L.O.(2011).L-malate productionby metabolically engineered Escherichia coli.Appl Environ Microbiol 77,427–434.
Claims (14)
1.一种制备2,4-二羟基丁酸(2,4-DHB)的方法,其包括以下连续步骤:
a)第一步将乙醛酸转化为苹果酰-辅酶A,
b)第二步将之前获得的苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛,
c)第三步用DHB脱氢酶将苹果酸-4-半醛转化为2,4-DHB;
其中步骤a)经酶催化,该酶具有苹果酰-辅酶A裂解酶活性;
其中步骤b)经具有苹果酰-辅酶A还原酶活性的酶催化,所述具有苹果酰-辅酶A还原酶活性的酶选自具有苹果酰-辅酶A还原酶、琥珀酰-辅酶A还原酶、或报道的3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶、肉桂酰-辅酶A还原酶或乙醛脱氢酶活性的酶,或通过修饰所述的酶获得;
其中步骤c)中所述DHB脱氢酶是甲基丁醛还原酶、琥珀酸半醛还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、或醇脱氢酶;
其中所述步骤a)中所述酶由SEQ ID No.1所示,所述步骤b)中所述酶由SEQ ID No.7、SEQ ID No.10和SEQ ID No.202所示,所述步骤c)中所述酶由SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.185和SEQ ID No.187所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述苹果酰-辅酶A还原酶与超嗜热古菌丙二酰-辅酶A还原酶野生型酶相比包括在以下位点的一个突变:Y206,其中在所述位点自然占据的氨基酸被其它19种天然存在的蛋白氨基酸的任意一种取代,即被丙氨酸,精氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,谷氨酸,谷氨酰胺,甘氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,甲硫氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸,色氨酸,或缬氨酸的任意一种取代。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中步骤a),b)和c)通过异体表达至少一种酶的经修饰微生物进行,该酶表现如步骤a),b)和c)中描述的酶活性。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中步骤a),b)和c)在相同的微生物中进行。
5.一种用于提高2,4-DHB生产的经修饰微生物,其中所述微生物表达的基因用于编码酶,该酶是催化权利要求1-3任一项中定义的步骤a),b)和c)必须的,其中步骤a)中的酶由SEQ ID No.1所示,步骤b)中的酶由SEQ ID No.7、SEQ ID No.10和SEQ ID No.202所示,步骤c)中的酶由SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.185和SEQ ID No.187所示。
6.根据权利要求5所述的微生物,所述微生物是细菌或酵母菌。
7.根据权利要求6所述的微生物,其中所述细菌选自肠杆菌科、梭菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科、链球菌科、甲基杆菌科、和棒状杆菌科。
8.根据权利要求6所述的微生物,其中所述细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、丙酮丁醇梭菌、甲基扭曲杆菌、或乳酸乳球菌。
9.根据权利要求6所述的微生物,其中所述酵母菌选自酵母科,毕赤酵母科,和裂殖酵母科。
10.根据权利要求6所述的微生物,其中所述酵母菌为酿酒酵母,粟酒裂殖酵母,乳酸克鲁维酵母,马克斯克鲁维酵母,杰丁毕赤酵母,树干毕赤酵母或毕赤酵母。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的微生物,其中至少一种酶活性的表达增强,该酶选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸裂解酶、丙酮酸羧化酶、和己糖转运体通透酶,和/或至少一种酶活性的表达降低,该酶选自乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰转移酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸裂解酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶、2-氧戊二酸脱氢酶、丙酮酸激酶、苹果酸酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、琥珀酸半醛脱氢酶、糖-运输磷酸转移酶、天冬氨酸转氨酶、乙醛酸还原酶、苹果酸合成酶、或丙酮醛合成酶。
12.根据权利要求11所述的微生物,所述微生物是大肠杆菌,其过度表达至少一种选自以下的基因:大肠杆菌的ppc,pck,aceA,galP;来自构建乳酸乳球菌的pycA,和/或缺失了至少一种选自以下的基因:ldhA,adhE,ackA,pta,poxB,focA,pflB,sad,gabABC,sfcA,maeB,ppc,pykA,pykF,mgsA,frdABCD,sucAB,ptsI,ptsG,pgi,fumABC,aldA,lldD,iclR,aceB,aspC,ghrAB。
13.一种2,4-DHB的生产方法,包括以下步骤:
-在适当的培养基中培养如权利要求5-12中任一权利要求所述的经修饰的微生物,
-在所述培养基中回收2,4-DHB。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述2,4-DHB进一步纯化。
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Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2800341T3 (es) * | 2012-07-11 | 2020-12-29 | Adisseo France Sas | Método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato |
CN103642765B (zh) * | 2013-12-25 | 2015-11-18 | 南京工业大学 | 醇脱氢酶突变体及其应用 |
WO2015155791A2 (en) * | 2014-04-11 | 2015-10-15 | String Bio Private Limited | Production of succinic acid from organic waste or biogas or methane using recombinant methanotrophic bacterium |
WO2016162442A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Metabolic Explorer | A modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxyburyrate with enhanced 2,4-dihydroxybutyrate efflux |
US10415062B2 (en) | 2015-04-07 | 2019-09-17 | Metabolic Explorer | Modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxybutyrate |
BR112017027815B1 (pt) | 2015-06-25 | 2021-12-21 | Dynamic Food Ingredients Corporation | Método de produção de 2,4-dihidroxibutirato |
CN105441372A (zh) * | 2015-10-30 | 2016-03-30 | 清华大学 | 一种重组谷氨酸棒杆菌与应用 |
JP7217700B2 (ja) | 2016-09-13 | 2023-02-03 | アラーガン、インコーポレイテッド | 安定化非タンパク質クロストリジウム毒素組成物 |
CN111778200B (zh) * | 2019-04-04 | 2022-11-01 | 中国科学院微生物研究所 | 生产L-天冬氨酸的平台菌、基于该平台菌构建的生产β-丙氨酸的重组菌及其构建方法 |
CN110713962B (zh) * | 2019-09-06 | 2022-06-21 | 南京农业大学 | 一株高产丙二酰辅酶a的基因工程菌及其构建方法和应用 |
DE102021101004B3 (de) | 2021-01-19 | 2022-03-10 | Technische Universität Dresden, Körperschaft des öffentlichen Rechts | Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat oder L-Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges |
CN115820616A (zh) * | 2022-07-22 | 2023-03-21 | 昆明理工大学 | 一种带荧光标记的噬菌体裂解酶及其应用 |
CN115948482B (zh) * | 2023-02-07 | 2024-02-09 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种2,4-二羟基丁酸生物合成途径的构建方法及应用 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
EP0260762B1 (en) | 1986-09-16 | 1994-01-12 | Gist-Brocades N.V. | Penicillium transformants and methods for their production |
DE69031711T2 (de) | 1989-08-09 | 1998-04-09 | Dekalb Genetics Corp | Methoden und zusammensetzungen für die herstellung von stabil transformierten, fruchtbaren mais pflanzen und zellen dafür |
US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US5693781A (en) | 1991-06-03 | 1997-12-02 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
EP0656943A1 (en) | 1992-08-19 | 1995-06-14 | Alko Group Ltd. | Fungal promoters active in the presence of glucose |
FR2734842B1 (fr) | 1995-06-02 | 1998-02-27 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides |
FR2736926B1 (fr) | 1995-07-19 | 1997-08-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene |
FR2780416B1 (fr) | 1998-06-10 | 2002-12-20 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede |
FR2787121B1 (fr) | 1998-12-11 | 2003-09-12 | Aventis Cropscience Sa | Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie |
WO2000068401A1 (en) | 1999-05-06 | 2000-11-16 | Aventis Animal Nutrition S.A. | Recombinant penicillium funiculosum for homologous and heterologous protein production |
JP3687497B2 (ja) | 2000-06-28 | 2005-08-24 | ダイソー株式会社 | 微生物培養法による光学活性1,2−ジオール類の製造法 |
DE102006025821A1 (de) | 2006-06-02 | 2007-12-06 | Degussa Gmbh | Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd |
CN101506153A (zh) | 2006-08-24 | 2009-08-12 | 赢创德固赛有限责任公司 | 制备d,l-2-羟基-4-烷基硫代丁酸的方法 |
CN1935977B (zh) | 2006-10-19 | 2010-06-09 | 华东理工大学 | 左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法 |
MY195387A (en) | 2009-06-04 | 2023-01-18 | Genomatica Inc | Microorganisms for the Production of 1,4-Butanediol and Related Methods |
US9238829B2 (en) * | 2010-10-28 | 2016-01-19 | Adisseo France S.A.S. | Method of production of 2,4-dihydroxybutyric acid |
-
2013
- 2013-04-25 WO PCT/IB2013/001071 patent/WO2013160762A2/en active Application Filing
- 2013-04-25 EP EP13731871.3A patent/EP2841584B1/en active Active
- 2013-04-25 US US14/397,315 patent/US9890400B2/en active Active
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