CN109311891B - 作为jak抑制剂的吡咯并嘧啶化合物的结晶 - Google Patents

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Abstract

本申请属于医药化学领域。具体而言，本申请涉及作为JAK抑制剂的吡咯并嘧啶化合物(式I)的结晶A和结晶B，还涉及结晶A和结晶B的制备方法、包含结晶A或结晶B的结晶组合物、包含结晶A或结晶B或其结晶组合物的药物组合物以及它们的医药用途。本申请的结晶A和结晶B具有纯度高、结晶度高、稳定性好等优点。

Description

作为JAK抑制剂的吡咯并嘧啶化合物的结晶
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年06月16日向中国国家知识产权局提交的第201610435947.4号中国专利申请的优先权和权益，所述申请公开的内容通过引用整体并入本文中。
技术领域
本申请属于医药化学领域。具体而言，本申请涉及作为JAK抑制剂的吡咯并嘧啶化合物(3R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈的结晶、晶体组合物、药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
两面神激酶(Janus kinase，JAK)是一类非受体型酪氨酸激酶(PTK)，其存在于细胞内，通过JAK-STAT通路传导细胞因子刺激信号。JAK-STAT通路将细胞外的化学信号经细胞膜传导入位于细胞核内DNA上的基因启动子上，最终影响细胞中DNA转录与活性水平发生改变。JAK-STAT通路由三个主要部分组成：1)受体；2)两面神激酶(JAK)和3)信号转导和转录激活蛋白(STAT)。所述受体可由干扰素、白细胞介素、生长因子或其它化学信使激活，激活导致JAK自身磷酸化；接下来STAT蛋白与磷酸化受体结合，使得STAT被JAK磷酸化；然后磷酸化STAT蛋白从受体上分离、二聚并易位到细胞核中，以结合到特异性DNA位点并改变转录(Scott，M.J.，C.J.Godshall et al.(2002).“Jaks，STATs，Cytokines，and Sepsis”ClinDiagn Lab Immunol 9(6)：1153-9)。
JAK家族在涉及免疫应答的细胞增殖和功能性细胞因子依赖性调节中产生作用。目前，有四种已知的哺乳动物JAK家族成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2(Tyrosine kinase 2)。JAK蛋白的大小范围在120-140kDa，其包含7个保守的JAK同源性(JH)结构域；其中之一为功能性催化激酶结构域，而另一个为假性激酶(pseudokinase)结构域，其有效地发挥调节功能和/或作为STAT的停靠位点起作用(Scott，Godshall et al.2002，supra)。
目前，已有多种两面神激酶的抑制剂的报道，其中申请日为2014年12月16日、申请号为201410784461.2的中国专利申请中公开了多个JAK抑制剂(在此全文引入作为参考)，其中包括如下式I所示的(3R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈化合物：
Figure GPA0000254631960000021
除了治疗效力外，药物研发者试图提供具有作为药物的性质的活性分子的适合形式。从获得一种商业上可行的生产方法的角度或者从生产含有活性化合物的药用组合物的角度出发，活性成分的化学稳定性、固态稳定性和储存期限均是非常重要的因素。因此，提供具有所需性质的形式对药物研发至关重要。
发明概述
本申请一方面提供式I所示化合物的结晶A，
Figure GPA0000254631960000031
式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射(XRD)图谱具有2θ为9.35°±0.2°、11.93°±0.2°、16.32°±0.2°、21.23°±0.2°、23.13°±0.2°和25.58°±0.2°的衍射角。
本申请另一方面提供式I所示化合物的结晶A的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)使式I所示化合物溶于结晶溶剂中，所述结晶溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇单甲醚、***、异丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六环、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、二氯甲烷、氯仿、水或上述溶剂中任意两种或两种以上的混合溶剂；以及
2)析晶。
本申请另一方面提供了结晶组合物，其中式I所示化合物的结晶A占所述结晶组合物重量的50％以上，较好的是80％以上，更好的是90％以上，最好的是95％以上。
本申请的另一方面提供了药物组合物，该药物组合物中包含有效量的式I所示化合物的结晶A、或者包含式I所示化合物的结晶A的结晶组合物。
本申请的另一方面提供了式I所示化合物的结晶A、或上述结晶组合物或上述药物组合物在制备治疗或预防两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。
本申请再一方面提供了式I所示化合物的结晶B：
Figure GPA0000254631960000032
式I所示化合物的结晶B的X-射线衍射(XRD)图谱具有2θ为8.97°±0.2°、9.39°±0.2°、12.90°±0.2°、17.70°±0.2°、20.31°±0.2°和23.63°±0.2°的衍射峰。
本申请另一方面提供式I所示化合物的结晶B的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)使式I所示化合物溶于乙腈中；以及
2)析晶。
本申请另一方面提供了结晶组合物，其中式I所示化合物的结晶B占所述结晶组合物重量的50％以上，较好的是80％以上，更好的是90％以上，最好的是95％以上。
本申请的另一方面提供了药物组合物，该药物组合物中包含有效量的式I所示化合物的结晶B、或者包含式I所示化合物的结晶B的结晶组合物。
本申请的另一方面提供了式I所示化合物的结晶B、或上述结晶组合物或上述药物组合物在制备治疗或预防两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。
附图说明
图1为式I所示化合物的结晶A(实施例2方法1)的XRD图谱。
图2为式I所示化合物的结晶A(实施例2方法1)的DSC图谱。
图3为式I所示化合物的结晶A(实施例2方法2，乙醇-乙酸乙酯(4∶1))的XRD图谱。
图4为式I所示化合物的结晶A(实施例2方法3)的XRD图谱。
图5为式I所示化合物的结晶B(实施例3)的XRD图谱。
图6为式I所示化合物的结晶B(实施例3)的DSC图谱。
发明详述
本申请一方面提供了式I所示化合物的结晶A：
Figure GPA0000254631960000041
式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射(XRD)图谱具有2θ为9.35°、11.93°、16.32°、21.23°、23.13°和25.58°±0.2°的衍射峰；典型地具有2θ为9.35°、11.93°、16.32°、18.82°、20.54°、21.23°、23.13°和25.58°±0.2°的衍射峰；更典型地具有2θ为9.35°、10.93°、11.93°、14.46°、16.32°、18.82°、20.54°、21.23°、21.66°、23.13°、25.58°和26.34°±0.2°的衍射峰；进一步典型地具有2θ为9.35°、10.93°、11.93°、14.46°、16.32°、17.28°、18.82°、19.25°、20.54°、21.23°、21.66°、22.15°、23.13°、24.09°、25.58°和26.34°±0.2°的衍射峰。
在本申请的部分实施方式中，本申请的式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射(XRD)图谱中，相对强度最大的峰出现在2θ为11.93°、16.32°或21.23°±0.2°的衍射峰位置；优选地，相对强度最大的峰出现在2θ为11.93°±0.2°的衍射峰位置。
在本申请的部分实施方式中，本申请的式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射(XRD)图谱中，相对强度前三位的峰出现在2θ为9.35°、11.93°、16.32°、21.23°、23.13°或25.58°±0.2°的衍射峰位置。
在本申请的部分实施方式中，本申请的式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射峰具有如下特征：
序号 2θ±0.2(°) 相对强度(％) 序号 2θ±0.2(°) 相对强度(％)
1 9.35 43.1 11 20.54 41.6
2 10.82 16.0 12 21.23 75.9
3 10.93 17.0 13 21.66 38.1
4 11.93 100.0 14 22.15 26.9
5 13.65 15.8 15 23.13 55.5
6 14.46 18.6 16 23.47 14.5
7 16.32 58.1 17 24.09 23.5
8 17.28 13.9 18 25.58 54.3
9 18.82 40.9 19 26.34 33.8
10 19.25 22.3 20 30.02 15.8
在本申请的部分实施方式中，所述式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射图谱如图1所示。
在本申请的部分实施方式中，所述式I所示化合物的结晶A的DSC图谱如图2所示。
在本申请的部分实施方式中，所述式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射图谱如图3所示。
在本申请的部分实施方式中，所述式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射图谱如图4所示。
本申请另一方面提供式I所示化合物的结晶A的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)使式I所示化合物溶于结晶溶剂中，所述结晶溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇单甲醚、***、异丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六环、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、二氯甲烷、氯仿、水或上述溶剂中任意两种或两种以上的混合溶剂；以及
2)析晶和任选地过滤、洗涤和/或干燥。
在本申请的部分实施方式中，制备式I所示化合物的结晶A的结晶溶剂为乙醇、异丙醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、水或上述溶剂中任意两种或两种以上的混合溶剂；优选乙醇、乙醇-乙酸乙酯混合溶剂、乙醇-水混合溶剂、乙醇-异丙醚混合溶剂、丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷。
在本申请的部分实施方式中，制备式I所示化合物的结晶A的结晶溶剂优选乙醇或包含乙醇的混合溶剂；更优选地，所述包含乙醇的混合溶剂中的其他溶剂选自甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇单甲醚、***、异丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六环、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、二氯甲烷、氯仿或水。
在本申请的部分实施方式中，制备式I所示化合物的结晶A时，式I所示化合物(以重量单位g计)相比结晶溶剂的使用量(以体积单位mL计)的比例选自1∶5～1∶50，优选1∶7.5、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45或1∶50，更优选1∶7.5～1∶30。
在本申请的部分实施方式中，当制备式I所示化合物的结晶A的结晶溶剂选自包含乙醇的混合溶剂时，乙醇的含量(以体积计算)为10％～90％；优选10％、20％、25％、30％、33％、40％、50％、60％、66％、70％、75％、80％或90％。
在本申请的部分实施方式中，当制备式I所示化合物的结晶A的结晶溶剂选自包含乙醇的混合溶剂时，乙醇与其他溶剂的比(以体积计算)为9∶1～1∶9；优选9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8或1∶9。
在本申请的部分实施方式中，可以通过降温进行析晶，例如，降温至0-5℃析晶。在本申请的部分实施方式中，可以通过减压浓缩进行析晶。
本申请另一方面提供了包含式I所示化合物的结晶A的结晶组合物。在本申请的部分实施方式中，式I所示化合物的结晶A占结晶组合物重量50％以上，较好的是80％以上，更好的是90％以上，最好的是95％以上。
本申请的另一方面提供了包含式I所示化合物的结晶A的药物组合物，该药物组合物中包含有效量的式I所示化合物的结晶A、或者包含式I所示化合物的结晶A的结晶组合物。此外，该药物组合物还可以含有或不含有药学上可接受的载体、赋形剂和/或介质。
本申请的另一方面提供了式I所示化合物的结晶A、或上述结晶组合物或上述药物组合物在制备治疗或预防两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。
本申请的另一方面提供了治疗或预防两面神激酶介导的疾病的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗有效量的上述式I所示化合物的结晶A，或上述晶体组合物，或上述药物组合物。
本申请的另一方面提供了用于治疗或预防两面神激酶介导的疾病的上述式I所示化合物的结晶A，或上述晶体组合物，或上述药物组合物。
本申请再一方面提供了式I所示化合物的结晶B：
Figure GPA0000254631960000061
式I所示化合物的结晶B的X-射线衍射(XRD)图谱具有2θ为8.97°、9.39°、12.90°、17.70°、20.31°和23.63°±0.2°的衍射峰；典型地具有2θ为8.97°、9.39°、12.90°、16.54°、17.70°、19.20°、20.31°、22.78°和23.63°±0.2°的衍射峰；更典型地具有2θ为8.97°、9.39°、11.24°、12.90°、14.56°、16.54°、17.70°、19.20°、20.31°、22.23°、22.78°、23.63°和25.55°±0.2°的衍射峰。
在本申请的部分实施方式中，本申请的式I所示化合物的结晶B的X-射线衍射(XRD)图谱中，相对强度最大的峰出现在2θ为9.39°、17.70°或23.63°±0.2°的衍射峰位置；优选地，相对强度最大的峰出现在2θ为17.70°±0.2°的衍射峰位置。
在本申请的部分实施方式中，本申请的式I所示化合物的结晶B的X-射线衍射峰具有如下特征：
序号 2θ±0.2(°) 相对强度(％) 序号 2θ±0.2(°) 相对强度(％)
1 8.97 40.7 11 20.31 36.1
2 9.39 47.4 12 20.41 24.3
3 11.24 17.9 13 21.03 21.3
4 12.90 34.4 14 21.96 18.6
5 12.96 32.8 15 22.23 18.9
6 14.56 14.4 16 22.78 23.1
7 16.54 22.1 17 23.50 46.9
8 17.15 40.4 18 23.63 65.0
9 17.70 100.0 19 25.55 17.3
10 19.20 24.4 ---- ---- ----
在本申请的部分实施方式中，所述式I所示化合物的结晶B的X-射线衍射图谱如图5所示。
在本申请的部分实施方式中，所述式I所示化合物的结晶B的DSC图谱如图6所示。
本申请所述式I所示化合物的结晶B是式I所示化合物的乙腈合物，其中式I所示化合物与乙腈的摩尔量之比选自1∶0.5～1∶2.0，优选为1∶0.5、1∶1、1∶1.5或1∶2.0。
本申请另一方面提供式I所示化合物的结晶B的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)使式I所示化合物溶于乙腈中；以及
2)析晶和任选地过滤、洗涤和/或干燥。
在本申请的部分实施方式中，制备式I所示化合物的结晶B时，式I所示化合物(以重量单位g计)相比结晶溶剂乙腈的使用量(以体积单位mL计)的比例选自1∶5～1∶50，优选1∶7.5、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45或1∶50，更优选1∶10～1∶25。
在本申请的部分实施方式中，可以通过降温进行析晶，例如，降温至0-5℃析晶。
本申请另一方面提供了包含式I所示化合物的结晶B的结晶组合物。在本发明的部分实施方式中，式I所示化合物的结晶B占结晶组合物重量的50％以上，较好的是80％以上，更好的是90％以上，最好的是95％以上。
本申请的另一方面提供了包含式I所示化合物的结晶B的药物组合物，该药物组合物中包含有效量的式I所示化合物的结晶B、或者包含式I所示化合物的结晶B的结晶组合物。此外，该药物组合物还可以含有或不含有药学上可接受的载体、赋形剂和/或介质。
本申请的另一方面提供了式I所示化合物的结晶B、或上述结晶组合物或上述药物组合物在制备治疗或预防两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。
本申请的另一方面提供了治疗或预防两面神激酶介导的疾病的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗有效量的上述式I所示化合物的结晶B，或上述晶体组合物，或上述药物组合物。
本申请的另一方面提供了用于治疗或预防两面神激酶介导的疾病的上述式I所示化合物的结晶B，或上述晶体组合物，或上述药物组合物。
本申请中，X-射线衍射图谱采用下述方法测定：仪器：Bruker D8 ADVANCE X-射线衍射仪；方法：靶：Cu：K-Alpha；波长
Figure GPA0000254631960000081
管压Voltage：40kV；管流Current：40mA；扫描范围：4～40°；扫描速度：每步0.1秒，每步0.02°。
本申请中，差示扫描量热分析(DSC)采用下述方法测定：仪器：梅特勒DSC-1差示扫描量热仪；方法：取样品(～5mg)置于DSC铝锅内进行测试，方法为：30℃-300℃，升温速率10℃/min。
需要说明的是，在X-射线衍射光谱中，由结晶化合物得到的衍射谱图对于特定的晶型往往是特征性的，其中谱带(尤其是在低角度)的相对强度可能会因为结晶条件、粒径和其它测定条件的差异而产生的优势取向效果而变化。因此，衍射峰的相对强度对所针对的晶型并非是特征性的，判断是否与已知的晶型相同时，更应该注意的是峰的相对位置而不是它们的相对强度。此外，对任何给定的晶型而言，峰的位置可能存在轻微误差，这在晶体学领域中也是公知的。例如，由于分析样品时温度的变化、样品移动、或仪器的标定等，峰的位置可以移动，2θ值的测定误差有时约为±0.2°。因此，在确定每种晶型结构时，应该将此误差考虑在内。在XRD图谱中通常用2θ角或晶面距d表示峰位置，两者之间具有简单的换算关系：d＝λ/2sinθ，其中d代表晶面距，λ表入射X射线的波长，θ为衍射角。对于同种化合物的同种晶型，其XRD谱的峰位置在整体上具有相似性，相对强度误差可能较大。还应指出的是，在混合物的鉴定中，由于含量下降等因素会造成部分衍射线的缺失，此时，无需依赖高纯试样中观察到的全部谱带，甚至一条谱带也可能对给定的晶体是特征性的。
需要说明的是，DSC测定当晶体由于其晶体结构发生变化或晶本熔融而吸收或释放热时的转变温度。对于同种化合物的同种晶型，在连续的分析中，热转变温度和熔点误差典型的在约5℃之内，当我们说一个化合物具有某一给定的DSC峰或熔点时，这是指该DSC峰或熔点±5℃。DSC提供了一种辨别不同晶型的辅助方法。不同的晶体形态可根据其不同的转变温度特征而加以识别。
本申请所述的两面神激酶介导的疾病包括但不限于肿瘤(例如，淋巴瘤、白血病)。本申请所述的淋巴瘤可以包括但下限于霍奇金病(Hodgkins disease)或非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma)，所述非霍奇金淋巴瘤包括但不限于B-细胞淋巴瘤(B-celllymphoma)或T-细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)。本申请所述的白血病包括但不限于急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(Chroniclymphocyticleukemia)、急性粒细胞白血病(Acute myeloid leukemia)、慢性粒细胞白血病(Chronic myelocytic leukemia)。
本申请中，术语“药物组合物”是指一种或多种本申请的化合物与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体(例如人)的载体、赋形剂和/或介质的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本申请的化合物。
术语“载体”定义为有利于将化合物引入细胞或组织的化合物。例如二甲亚砜(DMSO)通常用作载体，这是因为它易于将某些有机化合物引入生物体的细胞或组织中。
“药物可接受的载体”包括但不限于任何被国家药品管理机构批准为可接受用于人或家畜的佐剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等张剂、溶剂或乳化剂。
“治疗有效量”是指本申请化合物的量，当其被给予哺乳动物，优选为人时，足以如下文定义地在哺乳动物，优选为人中实现对病毒感染的治疗。构成“治疗有效量”的本申请化合物的量，根据化合物、疾病状态及其严重性、给药方式以及要治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可常规地由本领域一般技术人员根据其自有知识及本公开内容而决定。
本文中使用的“治疗”涵盖对患有病毒感染的哺乳动物，优选为人中的病毒感染的治疗，且包括：
(i)抑制病毒感染，即阻止其发展；
(ii)缓解病毒感染，即引起病毒感染的复原；或
(iii)缓解由病毒感染引发的症状。
本申请所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。反应一般是在惰性氮气下、无水溶剂中进行的。
在本申请中，质子核磁共振数据记录在BRUKER AVANCE III HD 500M分光仪上，化学位移以四甲基硅烷低场处的(ppm)表示；质谱是在Waters ACQUITY UPLC+XEVO G2 QTof测定。质谱仪配备有一个正或负模式下操作的电喷雾离子源(ESI)。
本申请提供的式I所示化合物的结晶A和结晶B具有纯度高、结晶度高、稳定性好等优点；同时，本申请提供的式I所示化合物结晶A和结晶B的制备方法简单，溶剂价廉易得，结晶条件温和，适合工业化生产。
以下实施例对本申请技术方案作进一步非限制性的详细说明。它们不应该被认为是对本发明范围的限制，而只是本发明的示例性说明和典型代表。本申请中使用的溶剂、试剂和原料等均为市售化学纯或分析纯产品。
实施例1 (3R)-3-{3-氨基-4-{7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-环戊基丙腈(I)
Figure GPA0000254631960000101
步骤A：3-环戊基丙烯酸
Figure GPA0000254631960000102
室温下，向盛有5M丙二酸(312g，3.0mol，1.0eq.)吡啶溶液中滴加环戊基甲醛(344.4g，3.51mol，1.17eq.)，加毕搅拌10分钟，缓慢滴加哌啶(6.2g，0.075mol，0.025eq.)，加毕室温下搅拌反应1小时。升温至70～80℃搅拌反应8小时，减压浓缩蒸去溶剂，余物浓盐酸调pH至3.0，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，2.5M氢氧化钠溶液洗涤五次，水层浓盐酸调pH至3.0，乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，水洗三次，饱和食盐水洗，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得3-环戊基丙烯酸(391.2g，收率：93％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：7.08(dd，J＝15.6，8.1Hz，1H)、5.81(dd，J＝15.6，1.1Hz，1H)、11.25(s，1H)、2.64(m，1H)、1.63(m，2H)、1.42(m，2H)、1.86(m，2H)、1.72(m，2H)；HRMS(ESI)calcd.for C8H12O2[M-H]-139.0765；Found：139.0760。
步骤B：5-环戊基吡唑烷-3-酮
Figure GPA0000254631960000103
室温搅拌下，80％水合肼(253.5g，4.05mol，1.5eq.)滴加至环戊基丙烯酸(378g，2.7mol，1.0eq.)中，升温至70～80℃搅拌反应6小时，降温至0～10℃搅拌析晶，过滤，滤饼水洗两次，45℃鼓风干燥12小时得5-环戊基吡唑烷-3-酮(292.5g，68％收率)。
步骤C：R-5-环戊基吡唑烷-3-酮-D-酒石酸盐
Figure GPA0000254631960000104
室温搅拌下，D-酒石酸(135g，0.9mol，0.5eq.)加入到5-环戊基吡唑烷-3-酮(278g，1.8mol，1.0eq.)丙酮溶液中，搅拌反应2小时后析晶，过滤，滤饼丙酮打浆5次，50℃鼓风干燥得R-5-环戊基吡唑烷-3-酮-D-酒石酸盐(241g，88％收率，99.5％ee值)。
步骤D：R-5-环戊基吡唑烷-3-酮
Figure GPA0000254631960000105
室温搅拌下，R-5-环戊基吡唑烷-3-酮-D-酒石酸盐(228g，0.75mol，1.0eq.)加入到4M氢氧化钠(52.2g，2.61mol，1.74eq.)溶液中，二氯甲烷萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得R-5-环戊基吡唑烷-3-酮(100.6g，85.2％收率，99.5％ee值)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ8.93(s，1H)、5.15(s，1H)、1.89(m，1H)、1.67(m，2H)、1.55(m，2H)、1.47(m，2H)、1.26(m，1H)、1.14(m，1H)；HRMS(ESI)calcd.for C8H14N2O[M+H]+155.1179；Found：155.1183。
步骤E：4-氯-7-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶
Figure GPA0000254631960000111
冰浴下向4-氯吡咯并[2，3-d]嘧啶(200g，1.3mol，1.0eq.)N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入60％NaH(62.4g，1.56mol，1.2eq.)，加毕室温下搅拌反应1小时，冰浴冷却下缓慢滴加2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基氯(SEMCl，260g，1.56mol，1.2eq)。加毕，冰浴下搅拌反应1小时，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得余物，硅胶柱层析纯化得4-氯-7-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(312.2g，91.8％收率)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.64(s，1H)、7.38(d，J＝3.6Hz，1H)、6.65(d，J＝3.6Hz，1H)、5.64(s，2H)、3.52(t，J＝8.2Hz，2H)、0.90(t，J＝8.2Hz，2H)、-0.07(s，9H)；HRMS(ESI)calcd.for C12H18N3OSi[M+H]+284.0980；Found：284.0995。
步骤F：2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯
Figure GPA0000254631960000112
室温搅拌下，碳酸钾(207g，1.5mol，3.0eq.)加入到4-氯-7-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(142g，0.5mol，1.0eq.)和氰基乙酸乙酯(85g，0.75mol，1.5eq)DMF溶液中，升温至120℃搅拌反应4小时，降至室温，加水淬灭，搅拌析晶，过滤，滤饼水洗50℃鼓风干燥得2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯(167g，92.6％收率)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ13.46(s，1H)、8.45(s，1H)、7.56(d，J＝3.6Hz，1H)、7.18(d，J＝3.6Hz，1H)、5.56(s，2H)、4.32(q，J＝7.1Hz，2H)、3.52(t，J＝8.2Hz，2H)、1.27(t，J＝7.1Hz，3H)、0.83(t，J＝8.2Hz，2H)、-0.08(s，9H)；HRMS(ESI)calcd.for C17H24N4O3Si[M+H]+361.1690；Found：361.1699。
步骤G：2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}乙腈
Figure GPA0000254631960000113
室温下搅拌下，氯化钠(263g，4.5mol，10eq.)加入到2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯(162.2g，0.45mol，1.0eq.)N-甲基吡咯烷酮和水的混合溶液中，升温至160～170℃搅拌反应30小时。加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机层饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩所得余物，硅胶柱层析纯化得2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)乙腈(98.6g，76％收率)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.18(s，1H)、7.77(d，J＝3.4Hz，1H)、6.83(d，J＝3.4Hz，1H)、5.65(s，2H)、4.56(s，2H)、3.52(t，J＝7.6Hz，2H)、0.82(t，J＝7.6Hz，2H)、-0.10(s，9H)；HRMS(ESI)calcd.forC14H20N4OSi[M+H]+289.1479；Found：289.1498。
步骤H：3-(二甲氨基)-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}丙烯腈
Figure GPA0000254631960000121
DMF-DMA(119g，1.0mol，3.0eq.)加入到2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}乙腈(95g，0.33mol，1.0eq.)DMF溶液中，升温至回流反应2小时，降至室温，加水搅拌析晶，过滤，滤饼水洗，50℃鼓风干燥，得3-(二甲氨基)-2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)丙烯腈(106.5g，94％收率)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.50(s，1H)、8.38(s，1H)、7.26(d，J＝3.7Hz，1H)、7.18(d，J＝3.7Hz，1H)、5.56(s，2H)、3.49(t，J＝8.4Hz，2H)、3.43(s，3H)、3.23(s，3H)、0.87(t，J＝8.4Hz，2H)、-0.10(s，9H)；；HRMS(ESI)calcd.for C17H25N5OSi[M+H]+344.1901；Found：344.1907。
步骤I：(R)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸
Figure GPA0000254631960000122
室温搅拌下，乙酸钾(1.5eq)加入到3-(二甲氨基)-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}丙烯腈(68.7g，0.2mol，1.0eq.)和R-5-环戊基吡唑烷-3-酮(37.0g，0.24mol，1.2eq.)N-甲基吡咯烷酮溶液中，升温至120～130℃搅拌反应12小时。加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机层水洗三次，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得余物经硅胶柱层析纯化，得(R)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸(37.6g，40.1％收率，ee值99.8％)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.74(s，1H)、7.96(s，1H)、7.32(d，J＝3.4Hz，1H)、6.67(d，J＝3.4Hz，1H)、5.63(m，2H)、4.19(t，J＝8.2Hz，2H)、3.52(m，1H)、3.52(t，J＝8.4Hz，2H)、3.09(dd，J＝16.7，8.2Hz，1H)、2.87(d，J＝16.7Hz，1H)、2.41(m，1H)、1.87(m，1H)、1.69(m，1H)、1.60(m，2H)、1.51(m，2H)、1.15(m，1H)、0.91(t，J＝8.4Hz，2H)、-0.06(s，9H)；HRMS(ESI)calcd.for C17H25N5OSi[M+H]+471.2534；Found：471.2538。
步骤J：(R)-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸
Figure GPA0000254631960000131
室温搅拌下，向0.2M(R)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]-1H-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸(35.0g，74.3mmol，1.0eq.)甲苯溶液中加入丁二酸酐(10.4g，104mmol，1.4eq.)，氮气保护下升温至回流反应(分水)14小时。减压浓缩蒸去溶剂，余物中加入乙酸乙酯溶解，水洗，饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，乙酸乙酯层加入无水硫酸钠及活性炭搅拌干燥脱色，过滤，减压浓缩得(R)-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸(39g，70.6mmol，95％收率)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.65(s，1H)、8.28(s，1H)、7.28(d，J＝3.7Hz，1H)、6.62(d，J＝3.7Hz，1H)、5.59(d，J＝11.1Hz，1H)、5.53(d，J＝11.1Hz，1H)、4.44(td，J＝9.9，3.2Hz，1H)、3.48(m，2H)、3.02(dd，J＝16.8，10.0Hz，1H)、2.83(m，1H)、2.43(m，1H)、1.78(m，1H)、1.69(m，1H)、1.61(m，1H)、1.52(m，1H)、1.51(m，1H)、1.50(m，2H)、1.14(m，1H)、0.88(m，2H)、-0.07(s，9H)；HRMS(ESI)calcd.for C27H36N6O5Si[M+H]+553.2589；Found：553.2603。
步骤K：(R)-3-环戊基-3-[3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙酰胺
Figure GPA0000254631960000132
冰浴，氮气保护搅拌下，向0.18M(R)-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸(35.0g，63.3mmol，1.0eq.)二氯甲烷溶液中滴加草酰氯(20.0g，158mmol，2.5eq.)，加毕，滴加DMF(0.1g，1.3mmol，0.02eq.)，室温下搅拌反应1小时，减压浓缩蒸去溶剂，加入钠丝干燥重蒸THF溶解，滴加至2M氨水(20.0，0.32mol，5.0eq.)THF溶液中，冰浴下搅拌反应30分钟，减压浓缩蒸去THF，冰浴降温析晶2小时，过滤，滤饼水洗，50℃鼓风干燥得(R)-3-环戊基-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙酰胺(29.8g，85.5％收率)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.65(s，1H)、8.24(s，1H)、7.32(d，J＝3.7Hz，1H)、6.63(d，J＝3.7，1H)、6.12(s，1H)、5.60(d，J＝11.1Hz，1H)、5.56(d，J＝11.1Hz，1H)、5.44(s，1H)、4.40(td，J＝10.6，3.2Hz，1H)、3.47(dd，J＝9.1，7.5Hz，2H)、2.99(dd，J＝14.4，11.0Hz，1H)、2.91(s，4H)、2.67(dd，J＝14.4，3.3Hz，1H)、2.48(m，1H)、1.84(m，1H)、1.66(m，1H)、1.58(m，2H)、1.57(m，1H)、1.50(m，1H)、1.31(m，1H)、1.21(m，1H)、0.88(dd，9.1，7.5，2H)、-0.08(s，9H)；；HRMS(ES)calcd.for C27H37N7O4Si[M+H]+552.2749；Found：552.2759。
步骤L：(R)-3-环戊基-3-[3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈
Figure GPA0000254631960000141
冰浴搅拌下向，0.2M(R)-3-环戊基-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙酰胺(25g，45.3mmol，1.0eq)二氯甲烷溶液中滴加三氯氧磷(27.8g，181mmol，4.0eq.)，加毕室温下搅拌反应2小时，加水淬灭，有机层水洗，加入无水硫酸镁及活性炭搅拌干燥、脱色。过滤，减压浓缩除去溶剂得(R)-3-环戊基-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙腈(22.2g，41.7mmol，92％收率)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.70(s，1H)、8.35(s，1H)、7.35(d，J＝3.7Hz，1H)、6.66(d，J＝3.7Hz，1H)、5.62(d，J＝10.8Hz，1H)、5.58(d，J＝10.8Hz，1H)、4.30(m，1H)、3.50(m，2H)、3.09(dd，J＝16.8，4.3Hz，1H)、3.01(dd，J＝16.8，4.3Hz，1H)、2.94(s，4H)、2.62(m，1H)、1.96(m，1H)、1.69(m，2H)、1.60(m，1H)、1.58(m，2H)、1.27(m，2H)、0.90(t，J＝8.3Hz，2H)、-0.06(s，9H)；HRMS(ESI)calcd.for C27H35N7O3Si[M+H]+534.2643；Found：534.2657。
步骤M：(R)-3-环戊基-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{(7-羟甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙腈
Figure GPA0000254631960000142
冰浴搅拌下，向0.2M(R)-3-环戊基-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙腈(20g，37.5mmol，1.0eq.)二氯甲烷溶液中滴加47％三氟化硼***溶液(34g，112.5mmol，3.0eq.)，加毕室温搅拌反应4小时。加水淬灭，10％NaOH溶液调pH至6～7，乙酸乙酯萃取，有机层水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁搅拌干燥。过滤，减压浓缩得(R)-3-环戊基-3-[3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-羟甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(14.4g，88.5％收率)
1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.54(s，1H)、8.31(s，1H)、7.31(d，J＝3.7Hz，1H)、6.52(d，J＝3.7Hz，1H)、5.68(d，J＝10.9Hz，1H)、5.61(d，J＝10.9Hz，1H)、4.32(m，1H)、3.13(dd，J＝17.2，7.9Hz，1H)、3.03(dd，J＝17.2，4.3Hz，1H)、2.94(s，4H)、2.62(m，1H)、1.98(m，1H)、1.74(m，1H)、1.65(m，1H)、1.64(m，2H)、1.30(m，1H)、1.29(m，2H)；HRMS(ESI)calcd.forC22H23N7O3[M+H]+434.1935；Found：434.1944。
步骤N：(R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈(I)
Figure GPA0000254631960000151
室温搅拌下，向0.2M(R)-3-{3-(2，5-二氧代吡咯-1-基)-4-{(7-羟甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-环戊基丙腈(12g，27.7mmol，1.0eq.)甲醇溶液中滴加80％水合肼(8.7g，138mmol，5.0eq.)，加毕升温至回流反应8小时，减压浓缩蒸去溶剂，余物乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥过夜。过滤，减压浓缩得(R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈(I)(7.7g，收率87％，ee值99.8％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ11.73(s，1H)、8.79(s，1H)、8.06(s，1H)、7.32(d，J＝3.5Hz，1H)、6.62(d，J＝3.5Hz，1H)、5.03(s，2H)、4.05(td，J＝9.5，3.5Hz，1H)、3.12(dd，J＝17.1，8.9Hz，1H)、2.91(dd，J＝17.1，3.6Hz，1H)、2.54(m，1H)、1.74(m，1H)、1.63(m，4H)、1.27(m，1H)、1.26(m，2H)；HRMS(ESI)calcd.for C17H19N7[M+H]+322.1775；Found：322.1783。
实施例2 式I化合物结晶A
方法1
取实施例1得到的式I化合物2.0g，加入24mL无水乙醇升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2mL无水乙醇淋洗，50℃减压干燥得产物1.62g，81％收率。
方法2
取实施例1得到的式I化合物2.0g共4份，分别加入20mL无水乙醇-乙酸乙酯(4∶1、2∶1、1∶1、1∶4)混合溶剂升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2mL乙酸乙酯淋洗，50℃减压干燥得产物1.34g、1.06g、1.00g、1.60g，收率67％、53％、50％、80％。
方法3
取实施例1得到的式I化合物2.0g，加入20mL无水乙醇-水(4∶1)混合溶液升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2mL无水乙醇淋洗，50℃减压干燥得产物1.6g，80％收率。
方法4
取实施例1得到的式I化合物2.0g，加入15mL丙酮升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2ml丙酮淋洗，50℃减压干燥得产物1.22g，61％收率。
方法5
取实施例1得到的式I化合物2.0g，加入50mL乙酸乙酯升温至回流溶清，减压浓缩蒸去溶剂得产物1.98g，99％收率。
方法6
取实施例1得到的式I化合物2.0g，加入60ml二氯甲烷升温至回流溶清，减压浓缩蒸去溶剂得产物2.0g，100％收率。
方法7
取实施例1得到的式I化合物2.0g，加入24mL无水乙醇升温至回流溶清，滴加异丙醚120mL，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2mL异丙醚淋洗，50℃减压干燥得产物1.56g，78％收率。
式I化合物结晶A的典型的XRD图谱和DSC图谱分别如图1和图2所示(实施例2方法1)。
式I化合物结晶A的另一典型的XRD图谱如图3所示(实施例2方法2，乙醇-乙酸乙酯(4∶1))。
式I化合物结晶A的又一典型的XRD图谱如图4所示(实施例2方法3)。
实施例3 式I化合物结晶B
取实施例1得到的式I化合物2.0g，加入25mL乙腈升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2ml乙腈淋洗，50℃减压干燥得产物1.82g，91％收率。
式I化合物结晶B是其乙腈合物，其典型的XRD图谱和DSC图谱分别如图5和图6所示。
实施例4 稳定性实验
将实施例2方法1得到的结晶A和实施例3得到的结晶B置于开口洁净容器中，60℃下放置，分别于第5和10天取样检测，检测结果与第0天的初始检测结果进行比较，试验结果见下表所示：
Figure GPA0000254631960000161
实施例5 生物活性实验
1.化合物酶学活性(IC50)检测
采取匀相时间分辨荧光(HTRF)方法建立了JAK2(野生型)的激酶活性检测平台，进行化合物活性的测定。将化合物从1mM开始用100％DMSO进行3倍的梯度稀释(共11个浓度)，每个浓度取4μL加入到96μL的反应缓冲液中(50mM HEPES，pH7.4，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.01％Tween-20，0.005％BAS，2mM DTT)混匀，然后取2.5μL加入到384孔板(OptiPlate-384，购买于PerkinElmer)，然后加入5μL的JAK2激酶(购买于Cama)，离心混匀，再加入2.5μL的ATP(终浓度为相应的Km值)与TK peptide(
Figure GPA0000254631960000171
KinEASETM-TK，购买于Cisbio)混合物启动反应(总反应体积为10μL)。将384孔板放于孵育箱中23℃反应120分钟，然后加入5μL的Eu3+cryptate-labled anti-phosphotyrosine antibody(购买于Cisbio)，5μL的Streptavidin-XL-665(
Figure GPA0000254631960000172
KinEASETM-TK，购买于Cisbio)停止反应。在孵育箱中孵育1小时后，在Envision(购买于PerkinElmer)上读取荧光值(320nm激发，检测665nm与620nm的发射光，二者比值为酶活性)。在11个浓度下测定酶的活性，使用GraFit6.0软件(ErithacusSoftware)计算数据，得到式I化合物的IC50值。结果可知，式I化合物和对照Ruxolitinib的IC50值都＜20nM。
2.在小鼠皮下异种移植瘤模型中有效性的测定
SPF级Balb/c裸鼠，雌性，5-6周龄。将无血清培养基混悬的Ba/F3-JAK2V617F细胞悬液0.1mL(含1×107cells，50％MatriGel)皮下注射于每只小鼠右侧面。待平均肿瘤体积达到约500mm3时，处死荷瘤鼠，无菌摘取肿瘤组织，剪成小块，植入Balb/c裸鼠左右两侧皮下，待平均肿瘤体积达到约100mm3时，将各鼠按流水号标记，分别测量其肿瘤大小及体重，按肿瘤体积从小到大随机分组，并适当调整使各组动物的平均体重亦处于同一水平。5组分别为阴性对照组、阳性对照组、低、中及高剂量组，每组5只小鼠，分组当天开始给药，每天给药2次，连续给药14天，期间每周测量肿瘤体积及体重2次。实验结束时处死小鼠，分离脾脏并称重。
试验过程中测量肿瘤最长径(L)和垂直方向的最大横径(W)，计算肿瘤体积(V)，V(mm3)＝L×W2/2。肿瘤生长抑制率TGI(％)＝100％×(1-(Tt-T0)/(Vt-V0))，Tt为治疗组每次测量的平均肿瘤体积，T0治疗组分组时的平均肿瘤体积，Vt为对照组每次测量的平均肿瘤体积，V0为对照组分组时的平均肿瘤体积。
结果如下表所示：
Figure GPA0000254631960000173
由表中数据可见，在Ba/F3-JAK2V617F荷瘤小鼠模型中，测定了式I化合物的盐酸盐在动物体内的肿瘤抑制效果，发现其对Ba/F3-JAK2V617F肿瘤生长呈现剂量依赖性的抑制作用，抑瘤效果非常显著。口服每天两次给药式I化合物的盐酸盐(100mg/kg)14天之后，对肿瘤生长的抑制率(TGI)达到85.8％，而同等条件下的阳性对照品Ruxolitinib(100mg/kg)对肿瘤生长的抑制率(TGI)仅为64.5％。50mg/kg的式I化合物的盐酸盐肿瘤抑制效果也很明显，TGI达到68.4％，与100mg/kg的阳性对照品Ruxolitinib的肿瘤抑制效果相当。
3.成年雄性/雌性SD大鼠中药代动力学的测定
健康成年雌性SD大鼠来源于北京维通利华实验动物技术有限公司，将大鼠分2组，每组3只，分别口服单次灌胃给予待测样品混悬液(30mg/kg)。动物在实验前禁食过夜，禁食时间从给药前10小时至给药后4小时。给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、和24小时采血。使用小动物麻醉机经异氟烷麻醉后通过眼底静脉丛采取0.4mL全血，放于肝素抗凝管中，样品于4℃、4200rpm离心5min，血浆转移至离心管中，并放于-80℃保存直到分析。血浆中样品使用蛋白质沉淀法萃取，萃取液通过LC/MS/MS分析。
Figure GPA0000254631960000181
附注：a.数据来自于美国食品药品监督管理局FDA公开的药理学综述。
大鼠(30mg/kg PO)的PK显示，式I化合物的数据优于Ruxolitinib。
4.成年比格犬中药代动力学的测定
研究使用4只健康成年比格犬，来源于北京玛斯生物技术有限公司。研究分为两次：第一次，动物(雌雄各2只)单次静脉注射给药，剂量为5mg/kg；第二次，一周后同一组动物(雌雄各2只)单次灌胃给药，剂量为10mg/kg。灌胃给药的动物在实验前禁食过夜，禁食时间从给药前10小时至给药后4小时。静脉给药组的动物无食物限制。静脉给药组在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时采血；灌胃给药组在给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时采血。动物通过异氟烷浅麻醉，用玻璃采血管于眼眶静脉丛采血约0.4mL全血，放于肝素抗凝管中，样品于4℃、4200rpm离心5min，血浆转移至离心管中，并放于-80℃保存直到分析。血浆中样品使用蛋白质沉淀法萃取，萃取液通过LC/MS/MS分析。
Figure GPA0000254631960000182
附注：a.数据来自于美国食品药品监督管理局FDA公开的药理学综述。
狗(10mg/kg PO，5mg/kg IV)的PK显示，式I化合物IV给药后AUC与阳性对照Ruxolitinib相当，但口服给药的生物利用度更优(114％vs 57％)。

Claims (20)

1.式I所示化合物的结晶A：
Figure FDA0002480660580000011
所述式I所示化合物的结晶A的X-射线衍射图谱具有2θ为9.35°±0.2°、11.93°±0.2°、16.32°±0.2°、18.82°±0.2°、20.54°±0.2°、21.23°±0.2°、23.13°±0.2°和25.58°±0.2°的衍射峰。
2.如权利要求1所述的式I所示化合物的结晶A，X-射线衍射图谱具有2θ为9.35°±0.2°、10.93°±0.2°、11.93°±0.2°、14.46°±0.2°、16.32°±0.2°、18.82°±0.2°、20.54°±0.2°、21.23°±0.2°、21.66°±0.2°、23.13°±0.2°、25.58°±0.2°和26.34°±0.2°的衍射峰。
3.如权利要求1所述的式I所示化合物的结晶A，X-射线衍射图谱具有2θ为9.35°±0.2°、10.93°±0.2°、11.93°±0.2°、14.46°±0.2°、16.32°±0.2°、17.28°±0.2°、18.82°±0.2°、19.25°±0.2°、20.54°±0.2°、21.23°±0.2°、21.66°±0.2°、22.15°±0.2°、23.13°±0.2°、24.09°±0.2°、25.58°±0.2°和26.34°±0.2°的衍射峰。
4.权利要求1所述式I所示化合物的结晶A的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)使式I所示化合物溶于结晶溶剂中，所述结晶溶剂选自乙醇、异丙醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、水或上述溶剂中任意两种或两种以上的混合溶剂；以及
2)析晶、过滤、洗涤、干燥。
5.如权利要求4所述的制备方法，其中所述结晶溶剂为乙醇、乙醇-乙酸乙酯混合溶剂、乙醇-水混合溶剂、乙醇-异丙醚混合溶剂、丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷。
6.结晶组合物，其中如权利要求1所述的式I所示化合物的结晶A占所述结晶组合物重量的50％以上。
7.如权利要求6所述的结晶组合物，其中如权利要求1所述的式I所示化合物的结晶A占所述结晶组合物重量的80％以上。
8.如权利要求6所述的结晶组合物，其中如权利要求1所述的式I所示化合物的结晶A占所述结晶组合物重量的90％以上。
9.如权利要求6所述的结晶组合物，其中如权利要求1所述的式I所示化合物的结晶A占所述结晶组合物重量的95％以上。
10.药物组合物，其包含有效量的如权利要求1所述的式I所示化合物的结晶A或者如权利要求6所述的结晶组合物。
11.如权利要求1所述的式I所示化合物的结晶A、如权利要求6所述的结晶组合物、或者如权利要求10所述的药物组合物在制备治疗或预防两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。
12.式I所示化合物的结晶B：
Figure FDA0002480660580000021
所述式I所示化合物的结晶B的X-射线衍射图谱具有2θ为8.97°±0.2°、9.39°±0.2°、12.90°±0.2°、16.54°±0.2°、17.70°±0.2°、19.20°±0.2°、20.31°±0.2°、22.78°±0.2°和23.63°±0.2°的衍射峰；
所述结晶B是乙腈合物。
13.如权利要求12所述的式I所示化合物的结晶B，X-射线衍射图谱具有2θ为8.97°±0.2°、9.39°±0.2°、11.24°±0.2°、12.90°±0.2°、14.56°±0.2°、16.54°±0.2°、17.70°±0.2°、19.20°±0.2°、20.31°±0.2°、22.23°±0.2°、22.78°±0.2°、23.63°±0.2°和25.55°±0.2°的衍射峰。
14.权利要求12所述的式I所示化合物的结晶B的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)使式I所示化合物溶于乙腈中；以及
2)析晶、过滤、洗涤、干燥。
15.结晶组合物，其中如权利要求12所述的式I所示化合物的结晶B占所述结晶组合物重量的50％以上。
16.如权利要求15所述的结晶组合物，其中如权利要求12所述的式I所示化合物的结晶B占所述结晶组合物重量的80％以上。
17.如权利要求15所述的结晶组合物，其中如权利要求12所述的式I所示化合物的结晶B占所述结晶组合物重量的90％以上。
18.如权利要求15所述的结晶组合物，其中如权利要求12所述的式I所示化合物的结晶B占所述结晶组合物重量的95％以上。
19.药物组合物，其包含有效量的如权利要求12所述的式I所示化合物的结晶B或者如权利要求15所述的结晶组合物。
20.如权利要求12所述的式I所示化合物的结晶B、如权利要求15所述的结晶组合物、或者如权利要求19所述的药物组合物在制备治疗或预防两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。
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