CN111505145A - 采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法，采用藁本内酯作为内参物进行一测多评，建立藁本内酯与阿魏酸、洋川芎内酯I之间的相对校正因子(f)，通过所述相对校正因子(f)计算阿魏酸、洋川芎内酯I的含量，采用液相色谱法进行测定。本发明实用性强、操作简单、测试快速、准确、节约成本，方法重复性好、稳定性好、耐用性好，为建立当归丸(浓缩丸)的质量评价提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及中成药的质量检测技术领域，具体涉及采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)中多种成份的方法。
背景技术
当归丸(浓缩丸)现收载于《***中药成方制剂第十五册》，其质量控制手段较单一，只规定了一个粉末显微鉴别和浸出物测定，而缺少当前中国药典中常见的药物成份含量测定质控方法；当归药材最早记载于《神农本草经》，被称为“血家之圣药”，当归丸(浓缩丸)功能与主治为养血活血，调经止痛，用于血虚萎黄所致的***，行经腹痛，为妇科临床常用之非处方药物(OTC)，用量较大；为了人民用药安全、有效，2019年国家药典委员会将其列入质量标准提高修订品种，专门立项研究增加其所含药物成份的质控方法。
当归含有挥发油、有机酸、多糖、黄酮等多种类型的化学成份。其药理作用广泛，涉及机体多个***。当归的“补血”作用主要作用于造血***，通过刺激与造血相关的细胞、分子等来发挥对造血***的作用，从而达到“补血”的效果。当归的“活血”作用主要作用于循环***，通过抑制血小板凝聚等作用来达到“活血”的效果。当归中含有多种有机酸类化合物，其代表为阿魏酸。阿魏酸能对抗血栓素A2(TXA2)的生物活性，增加前列环素(PGI2)的生物活性，使PGI2/TXA2的值升高，从而抑制血小板凝聚。具有抗动脉粥样硬化的作用，阿魏酸治疗塞性动脉粥样硬化症也具有显著疗效。当归中的苯酞类化合物是当归挥发油中的主要成份，包括Z-藁本内酯、E-藁本内酯、洋川芎内酯A、E-丁烯基苯酞、Z-丁烯基苯酞等成份,当归及其挥发油具有调节血管生成、抑制心肌细胞肥大和抗心律失常的作用。
中药质量控制和评价的难题在于中药多成份的复杂性，由于单一成份份或指标评价难以表征中药的质量，而多成份质量控制的方法需要较多的对照品。由于中药化学成份对照品分离难度大或单体不稳定、难以供应、成本高等因素，使得多成份质量控制的实施存在诸多困难。
为解决以上问题，人们积极寻找替代性方法。研究人员发现，不同物质在紫外检测器中的响应-浓度比的比值是一个常数，并将该常数定义为相对校正因子。在样品检测过程中，使用外标法测定A化合物的峰面积并获得其含量，同时测定B化合物的峰面积，便可以根据以上信息和A/B物质间相对校正因子，计算获得B化合物的含量。该替代对照品法被命名为一测多评法(即QAMS法)。由于大大减少了对照品的用量，并降低了检测试验的操作难度，一测多评质量控制方法得到迅速的推广和应用。
目前还没有文献公开将一测多评方法用于当归丸(浓缩丸)的成份检测中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法，针对现有单一成份和多指标含量测定方法的不足，本发明提供一种实用性强、操作简单、节约成本的针对当归丸(浓缩丸)中阿魏酸、洋川芎内酯I和藁本内酯三种成份的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法，其采用藁本内酯作为内参物进行一测多评，建立藁本内酯与阿魏酸、洋川芎内酯I之间的相对校正因子(f)，通过所述相对校正因子(f)计算阿魏酸、洋川芎内酯I的含量，采用液相色谱法进行测定，所述方法包括以下步骤：
步骤S1：色谱条件与***适应性试验
色谱柱：C18色谱柱；
流动相A：乙腈；
流动相B：0.1％甲酸；
梯度洗脱程序：
0～10min，流动相A：20％→58％；
10～25min，流动相A：58％→68％；
25～33min，流动相A：68％→68％；
33～40min，流动相A：68％→95％；
40～41min，流动相A：95％→20％；
41～50min，流动相A:20％→20％；
检测波长：280nm；
进样量：20μL；
柱温：30℃；
步骤S2：对照品溶液的制备
分别精密称取阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯，置于容量瓶中，分别加甲醇配制成含藁本内酯、洋川芎内酯I、阿魏酸的储备液，备用；分别吸取阿魏酸储备液，洋川芎内酯I储备液及藁本内酯储备液置于容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为混合对照品溶液，备用；
步骤S3：供试品溶液的制备
精密称定一定量的当归丸(浓缩丸)样品粉末，置于容量瓶内，用甲醇溶液溶解并定容，然后超声滤过，获得当归丸(浓缩丸)的供试品溶液，备用；
步骤S4：相对校正因子f的计算
取步骤S2制备得到的混合对照品溶液，进样1、2、5、8、10、15、25μL，注入高效液相色谱仪，按步骤S1的色谱条件测定，记录各成份的峰面积，以藁本内酯为内参物，按公式f＝(Wk×Am)/(Wm×Ak)(式中Ak为内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度，Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量或浓度)，计算阿魏酸、洋川芎内酯I与内参物的f；
步骤S5：供试品中成份的测定
取步骤S3制备得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，获得色谱图，按以下公式分别计算出阿魏酸、洋川芎内酯I的质量或浓度；
所述公式为：Wm＝(Wk×Am)/(f×Ak)，式中Ak内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度；Am为被测组分的峰面积，Wm为被测组分的质量或浓度，f为阿魏酸、洋川芎内酯I的相对校正因子。
上述各个步骤的标号S1至S5并不代表先后顺序，本领域技术人员能够根据需要对上述顺序进行变换而并不离开本发明的保护范围。
在所述步骤S2中，分别精密称取阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯对照品7.82、4.34、21.8mg分别置25mL、25mL、20mL量瓶中，分别加甲醇配制成含藁本内酯、洋川芎内酯I、阿魏酸质量浓度分别为309.9、170.8、1090μg/mL的储备液，备用；分别吸取阿魏酸储备液0.1、0.1、0.1、0.2、0.4、0.3mL，洋川芎内酯I储备液0.25、0.25、0.25、0.5、1、0.75mL及藁本内酯储备液1、1、1、2、4、3mL，置50mL、25mL、10mL、10mL、10mL、5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液，备用。
在所述步骤S3中，取当归丸(浓缩丸)粉末1g，精密称定，置于150mL具塞锥形瓶中，精密加75％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，并用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即获得供试品溶液。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用以藁本内酯作为内参物的一测多评法(即QAMS法)，获得当归丸(浓缩丸)中阿魏酸、洋川芎内酯I和藁本内酯三种成份含量，实用性强、操作简单、测试快速、准确、节约成本。
2、本发明的方法简单便于操作，且测定结果准确，方法重复性好、稳定性好、耐用性好，为建立当归丸(浓缩丸)的质量评价提供依据。
3、本发明选用对照品相对易得且化合物性质相对稳定的藁本内酯为内参物，实用性和可行性更好。
附图说明
图1为本发明采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法的对照品溶液的高效液相色谱图；
图2为本发明采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法的供试品溶液的高效液相色谱图。
图中附图标记分别是：
色谱峰归属：1-阿魏酸；2-洋川芎内酯I；3-藁本内酯。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
本发明采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法，其采用藁本内酯作为内参物进行一测多评，建立藁本内酯与阿魏酸、洋川芎内酯I之间的相对校正因子(f)，通过所述相对校正因子(f)计算阿魏酸、洋川芎内酯I的含量，采用液相色谱法进行测定，所述方法包括以下步骤：
步骤S1：色谱条件与***适应性试验
色谱柱：
CSHTMC18(4.6×250mm，5μm)；
流动相A：乙腈；
流动相B:0.1％甲酸(B)；
梯度洗脱程序：
0～10min，A：20％→58％；
10～25min，A：58％→68％；
25～33min，A：68％→68％；
33～40min，A：68％→95％；
40～41min，A：95％→20％；
41～50min，A:20％→20％；
柱温：30℃；检测波长280nm；进样量20μL。
步骤S2：对照品溶液的制备
分别精密称取去阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯对照品7.82mg、4.34mg、21.8mg分别置25mL、25mL、20mL容量瓶中，分别加甲醇配制成含藁本内酯、洋川芎内酯I、阿魏酸质量浓度分别为309.9μg/mL、170.8μg/mL、1090μg/mL的储备液，备用。分别吸取阿魏酸储备液0.1mL、0.1mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.3mL，洋川芎内酯I储备液0.25mL、0.25mL、0.25mL、0.5mL、1mL、0.75mL及藁本内酯储备液1mL、1mL、1mL、2mL、4mL、3mL，置50mL、25mL、10mL、10mL、10mL、5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液(分别标记为1～6号)，备用。
步骤S3：供试品溶液的制备
取当归丸(浓缩丸)粉末约1g，精密称定，置150mL具塞锥形瓶中，精密加75％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，并用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得当归丸(浓缩丸)的供试品溶液，备用。
步骤S4：相对校正因子f的计算
分别精密吸取步骤S2制得的4号(当然也可以选择其他号的样品)混合对照品溶液1μL、2μL、5μL、8μL、10μL、15μL、25μL，注入高效液相色谱仪，按上述步骤S1的色谱条件测定，结果表明，在上述色谱条件下，各组分分离度良好，色谱图见图1所示，图中A表示混合对照品溶液。记录各成份的峰面积，以藁本内酯为内参物，按公式f＝(Wk×Am)/(Wm×Ak)(式中Ak为内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度，Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量或浓度)，计算阿魏酸、洋川芎内酯I与内参物的f；结果表明，以藁本内酯为内参物，阿魏酸、洋川芎内酯I的f的RSD(相对标准偏差)均小于5％，表明色谱仪即色谱柱对相对校正因子的测定没有明显影响，见表1。
表1：当归丸(浓缩丸)中2种成份的f：
步骤S5：供试品中成份的测定
取步骤S3制备得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，获得色谱图,在步骤S1的色谱条件下，各组分分离度良好，色谱图见图2所示，图中B表示供试品溶液。按以下公式分别计算出阿魏酸、洋川芎内酯I的质量或浓度；所述公式为：Wm＝(Wk×Am)/(f×Ak)，式中Ak内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度；Am为被测组分的峰面积，Wm为被测组分的质量或浓度，f为阿魏酸、洋川芎内酯I的相对校正因子。
步骤S6：标准曲线的绘制
分别精密吸收步骤S2制得的混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以进样质量浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明3种成份在相应范围内与峰面积线性关系良好，见表2。
表2当归丸(浓缩丸)中3种成份的回归方程与线性范围：
步骤S7：精密度试验
精密吸取同一混合对照品溶液(4号)连续进样6次，记录藁本内酯、洋川芎内酯I、阿魏酸峰面积积分值，计算RSD，结果各成份峰面积的RSD分别为1.11％、1.28％和1.18％。表明仪器精密度良好。
步骤S7：重复性试验
取同一批当归丸(浓缩丸)(批号190101)粉末约1g，共6份，精密称定，分别按步骤S3下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样测定，测得阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯平均含量分别为0.267、0.288、9.121mg/g，RSD分别为1.61％、1.56％、1.91％。结果表明该方法重复性良好。
步骤S8：稳定性试验
取同一供试品溶液(批号190101)，分别于0、2、4、8、12、24h，在步骤S1的色谱条件下测定，并记录峰面积，结果表明阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯峰面积的RSD分别为0.89％、0.89％、0.59％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
步骤S9：加样回收率试验
取已测知含量的供试品(批号190102)约1g，精密称定，分别加入一定量的对照品溶液，按步骤S3下的方法制备供试品溶液，在步骤S1的色谱条件下测定，计算加样回收率。结果表明当归丸(浓缩丸)中上述3种成份的平均加样回收率分别为90.79％、94.95％、95.25％，RSD分别为1.69％、1.63％、1.27％，表明方法的准确度良好。
上述各个步骤的标号S1至S5并不代表先后顺序，本领域技术人员能够根据需要对上述顺序进行变换而并不离开本发明的保护范围。
以下，对本发明的QAMS法的耐用性和***适应性进行评价(一)不同色谱柱及不同仪器对f的影响
取步骤S2下制备的混合对照品溶液(4号)，考察Waters 2695高效液相色谱仪和Agilent 1260高效液相色谱仪2种高效液相色谱仪***和
CSHTMC18(4.6×250mm，5μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)2种色谱柱的f，结果表明，f之间无显著性差异，RSD均小于5％，见表3。
表3不同仪器和不同色谱柱测得的f：
(二)不同柱温对f的影响
实验中采用Waters 2695高效液相色谱***，
CSHTMC18柱，分别在不同柱温(25、30、35、40℃)条件下对阿魏酸和洋川芎内酯I的f的影响，结果表明各成份之间f重复性良好，无显著性差异，RSD均小于5％，见表4。
表4不同柱温对f的影响：
(三)待测组分的色谱峰定位
取步骤S2下制备的混合对照品溶液，考察Waters 2695高效液相色谱仪和Agilent1260高效液相色谱仪2种高效液相色谱仪***和
CSHTMC18(4.6×250mm，5μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)2种色谱柱的相对保留时间和保留时间差。结果表明，各成份的相对保留时间波动较小，RSD均小于5％，见表5，故采用相对保留时间对色谱峰进行定位。
表5不同仪器和不同色谱柱测得的相对保留时间：
(四)QAMS法与外标法(ESM)的数据比较
取6批当归丸(浓缩丸)样品，首先采用ESM计算其中藁本内酯的含量，然后采用ESM和QAMS分别计算样品中洋川芎内酯I和阿魏酸的含量，并将2种方法的结果进行比较，用相对误差来表示2种方法的差异性，以验证一测多评法的可行性，见表6。相对误差(RE％)＝(CQAMS－CESM)/CESM(CQAMS为QAMS测得的含量，CESM为ESM测得的含量)，结果可知相对误差绝对值均小于5％，见表6，提示建立的QAMS有较好的准确性与可行性。
表6 ESM和QAMS测定6批当归丸(浓缩丸)中藁本内酯、洋川芎内酯I和阿魏酸的含量：
值得一提几点是：
(1)本发明内参物的选择及色谱峰的定位
由于藁本内酯为《中国药典》2015年版规定的山茱萸质量控制指标性成份，性质稳定、市场流通性强、较易得到。因此，选择藁本内酯为内参物。
(2)流动相及柱温的考察
比较甲醇和乙腈作为有机相、不同浓度的甲酸水溶液和磷酸水溶液作为无机相的梯度洗脱效果，结果发现乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱分离效果较好，达到基线分离，所以选择乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱***为流动相。同时还对4种不同的柱温(25、30、35和40℃)进行了考察，根据其对分离效果的影响及对色谱柱寿命的影响，选择柱温为30℃，此温度下，各成份分离效果和峰形良好。
(3)供试品溶液的提取溶剂及提取时间的考察
分别考察了25％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、75％甲醇水溶液、甲醇4种提取溶剂，结果表明75％甲醇作为提取溶剂时提取效果最好；然后对超声提取的时间进行了考察，分别超声提取10、20、30、45min，结果表明，超声提取20min时，提取完全。
上述实验采用的仪器与材料具体如下：
Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Empower工作站；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Agilent chemstation工作站；METTLER TOLEDOXPE205电子天平；KQ-00VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水***(美国Millipore公司)；色谱柱：
CSHTMC18(4.6×250mm，5μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱。对照品：阿魏酸(KL2510EW phenchem公司，含量99.09％)、洋川芎内酯I(WK190409-10Stanford analytical chemicals Inc.含量98.40％)、藁本内酯(111737-201608中国食品药品检定研究院，含量100％)；当归饮片(亳州市永刚饮片厂有限公司，批号：18061501)，当归丸(浓缩丸)(仲景宛西制药股份有限公司，批号190101、190102、180201、180202、180401、180402)。乙腈、甲酸均为色谱纯，水为超纯水。
“一测多评法”(QAMS)是指在多指标质量评价时，以其中某一成份(有对照品供应者)为内标，建立该成份与其他成份之间的相对校正因子，通过该校正因子计算其他成份的含量。本发明选用对照品相对易得且化合物性质相对稳定的藁本内酯为内参物，建立了该成份与当归丸(浓缩丸)中洋川芎内酯I和阿魏酸的f。并通过对6批不同厂家样品的测定，验证了当归丸(浓缩丸)中藁本内酯、洋川芎内酯I和阿魏酸QAMS测定的准确性，为当归丸(浓缩丸)的质量控制提供了参考方法。
Claims (3)
1.采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法，其特征在于，采用藁本内酯作为内参物进行一测多评，建立藁本内酯与阿魏酸、洋川芎内酯I之间的相对校正因子(f)，通过所述相对校正因子(f)计算阿魏酸、洋川芎内酯I的含量，采用液相色谱法进行测定，所述方法包括以下步骤：
步骤S1：色谱条件与***适应性试验
色谱柱：C18色谱柱；
流动相A：乙腈；
流动相B：0.1％甲酸；
梯度洗脱程序：
0～10min，流动相A：20％→58％；
10～25min，流动相A：58％→68％；
25～33min，流动相A：68％→68％；
33～40min，流动相A：68％→95％；
40～41min，流动相A：95％→20％；
41～50min，流动相A:20％→20％；
检测波长：280nm；
进样量：20μL；
柱温：30℃；
步骤S2：对照品溶液的制备
分别精密称取阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯，置于容量瓶中，分别加甲醇配制成含藁本内酯、洋川芎内酯I、阿魏酸的储备液，备用；分别吸取阿魏酸储备液，洋川芎内酯I储备液及藁本内酯储备液置于容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为混合对照品溶液，备用；
步骤S3：供试品溶液的制备
精密称定一定量的当归丸(浓缩丸)样品粉末，置于容量瓶内，用甲醇溶液溶解并定容，然后滤过，获得当归丸(浓缩丸)的供试品溶液，备用；
步骤S4：相对校正因子f的计算
取步骤S2制备得到的混合对照品溶液，进样1、2、5、8、10、15、25μL，注入高效液相色谱仪，按步骤S1的色谱条件测定，记录各成份的峰面积，以藁本内酯为内参物，按公式f＝(Wk×Am)/(Wm×Ak)(式中Ak为内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度，Am为被测组分m的峰面积，Wm为被测组分m的质量或浓度)，计算阿魏酸、洋川芎内酯I与内参物的f；
步骤S5：供试品中成份的测定
取步骤S3制备得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，获得色谱图，按以下公式分别计算出阿魏酸、洋川芎内酯I的质量或浓度；
所述公式为：Wm＝(Wk×Am)/(f×Ak)，式中Ak内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度；Am为被测组分的峰面积，Wm为被测组分的质量或浓度，f为阿魏酸、洋川芎内酯I的相对校正因子。
2.根据权利要求1所述的采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法，其特征在于，
所述步骤S2中，分别精密称取阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯对照品7.82、4.34、21.8mg分别置25mL、25mL、20mL量瓶中，分别加甲醇配制成含藁本内酯、洋川芎内酯I、阿魏酸质量浓度分别为309.9、170.8、1090μg/mL的储备液，备用；分别吸取阿魏酸储备液0.1、0.1、0.1、0.2、0.4、0.3mL，洋川芎内酯I储备液0.25、0.25、0.25、0.5、1、0.75mL及藁本内酯储备液1、1、1、2、4、3mL，置50mL、25mL、10mL、10mL、10mL、5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液，备用。
3.根据权利要求1所述的采用一测多评法测定当归丸(浓缩丸)成份的方法，其特征在于，
所述步骤S3中，取当归丸(浓缩丸)粉末1g，精密称定，置于150mL具塞锥形瓶中，精密加75％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，并用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即获得供试品溶液。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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