CN109293780B

CN109293780B - 一种人组织因子凝血复合物及其制备方法

Info

Publication number: CN109293780B
Application number: CN201811028594.1A
Authority: CN
Inventors: 刘刚; 李文岗; 苗逢霖; 林惠荣
Original assignee: Xiamen Hong Pu Fu Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Xiamen Hong Pu Fu Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2038-09-04
Also published as: CN109293780A

Abstract

本发明公开了一种人组织因子凝血复合物及其制备方法。该复合物具有局部快速止血功能，并有伤口感染预防、促进伤口愈合等作用，具有不同于传统局部凝血剂的复合效果。本发明体系制备简单，应用于术中散在或局部、已知或未知出血点及外伤导致的表皮或组织表层伤口的快速止血，抗菌及促伤口愈合，并且在肝脏损伤、关节软骨损伤、眼部损伤、糖尿病、血友病等情况的应用中更具优势。

Description

一种人组织因子凝血复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种人组织因子凝血复合物。

背景技术

出血是人们日常生活和医疗过程尤其是手术中极为常见的情况，术中止血是否快速有效直接影响患者的预后，而糖尿病、血友病等特殊病人的医疗过程中的出血问题尤为棘手，所以非常有必要开发更有效的、功能更多样化的止血药物。术中出血的止血策略主要有机械性止血、全身应用止血药物、局部止血药物等。

机械性止血是临床上应用最广泛的也是最简单的方法，主要包括结扎、缝合、电凝、填塞等方法，但除纱布填塞外，须明确出血点方可操作，对于一些广泛的实质脏器创面渗出，纱布填塞可有效减少创面渗血，但也增加了感染风险，并且对于何时取出填塞的纱布尚无明确定论，取出过迟则感染风险大，过早取出则止血效果不佳，可能引发再次出血，甚至仍须填塞。

全身应用止血药物常见的有巴曲酶、氨甲苯酸、维生素K1以及重组人活化凝血因子Ⅶ等，除重组人活化凝血因子Ⅶ外，其它药物的止血效果不够理想，多是术前的辅助措施，而静注使用的重组人活化凝血因子Ⅶ成本较高，剂量和成本的获益率有待商榷。

局部止血药物分为被动性止血药物和主动性止血药物两种。被动性局部止血材料包括胶原、纤维素和明胶等。它们的作用机制均是通过提供一个物理结构让血小板聚集，从而使血栓形成。被动性止血材料的优点在于其在出血较重的情况下也可应用，因为它们可吸附自身重量数倍的液体。其另外一个优点是可制成任何需要的形状、大小和形式。但其缺点在于会引起一些并发症，如周围为骨骼或其他坚硬组织时可压迫神经，甚至有压迫脊髓的报道，且被动性局部止血材料对湿的组织黏附力不强，血管活动性出血时效果不佳。此外，由于止血材料的残留，会干扰影像学诊断，有时很难与肿瘤等占位性病变相鉴别。残留材料也有引起异物反应、慢性炎症及感染等可能。

主动性止血药物中较常用的是凝血酶，凝血酶是一种具有很强专一性的丝氨酸蛋白水解酶,在调节血小板凝集和血液凝固的止血作用中发挥了重要作用,其作用机制为水解血纤维蛋白原的4个Arg-Gly肽键,产生不溶性的血纤维蛋白,促进血管破损处的血小板凝聚和血小板血栓的形成。主动性局部止血材料具有起效迅速的优点,对于广泛创面渗血,可局部喷洒进行止血,无需压迫填塞，但凝血酶功能单一，无凝血因子的级联放大效应，缺乏凝血途径中必要的细胞因子分泌和血小板募集的作用。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种tTF-PHLIP融合蛋白,其序列如SEQ ID NO：1所示。该融合蛋白表达于真核细胞膜后，可以获得人体相容性好的人组织因子凝血复合物。

本发明的另一目的，在于提供编码前述的tTF-PHLIP融合蛋白的序列，其序列如SEQ ID NO 2所示。

本发明的再一目的，在于提供一种人体相容性好的人组织因子凝血复合物，它属于主动性止血材料，能有效激活外源性凝血途径并引起凝血因子级联放大效应，达到快速止血的效应。

所述的人组织因子凝血复合物，包括囊泡结构，所述的囊泡结构中具有tTF(人组织因子)-PHLIP(酸响应肽)融合蛋白，所述的囊泡结构为真核细胞形成。所述的tTF-PHLIP融合蛋白固定于真核细胞质膜上并形成二次跨膜结构。

本发明的人组织因子凝血复合物具有局部快速止血功能，以及伤口感染预防、促进伤口愈合、防止组织黏连等作用。由真核哺乳动物细胞表达产出，具有接近天然蛋白的结构和功能，同时稳定于囊泡结构表面后，具备高效的凝血活性。

本发明的再一目的，在于提供该人组织因子凝血复合物在制备凝血药物中的用途。

本发明的再一目的，在于提供一种凝血制剂，其包括前述的人组织因子凝血复合物。

优选地，所述的凝血制剂，还包括唾液酸。唾液酸和人组织因子凝血复合物之间的摩尔比例范围可以为0.0001-10:1。本发明的凝血复合物中，具有酸性响应肽，该多肽可在PH6.5左右或更低的酸性环境下有效促进膜融合，从而有效帮助囊泡内容物进入伤口处细胞。唾液酸是一种生物相融性的9-碳单糖的衍生物，该分子可作为配体结合于细胞膜表面，有效抑制细菌粘附，起到预防感染的特性，同时其水溶液为弱酸性，能够为所述酸性响应肽的功能发挥提供环境。

本发明的再一目的，在于提供一种人组织因子凝血复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成SEQ ID NO：2所示的序列，并转染真核细胞；

(2)获取稳定表达tTF(人组织因子)-PHLIP(酸响应肽)融合蛋白的真核细胞并培养；

(3)细胞培养会合度达90％以上时，用缓冲液洗下细胞，离心后去上清并再重复用缓冲液清洗，最后加入缓冲液重悬；

(4)上步所得细胞悬液加入蛋白酶抑制剂，处理细胞，使囊泡结构充分形成；

(5)将上述悬液差速离心去沉淀，其中每次离心小于1万g，时间小于30min；再次离心，10000-150000g，0.5-3h，去上清，所得沉淀即人组织因子凝血复合物。

优选地，步骤(1)的方法包括，

a、转染16小时前，调整真核细胞密度，使转染时细胞贴壁，汇合度60％～80％；转染前将细胞培养基更换为无血清培养基；

b、用无血清培养基稀释慢病毒包装质粒与转染试剂以质粒：转染试剂＝1:1-3ug/ul进行混合，在室温下温育10-30分钟，再将质粒：转染试剂混合液转移至真核细胞的培养容器中，混匀，培养；获得慢病毒溶液；

c、用慢病毒溶液和等体积完全培养基，培养汇合度70％～80％的HEK293T细胞，并加入终浓度为5-10μg/ml的聚凝胺，正常条件下培养；

d、在转染48h后，使用终浓度2-3μg/ml的嘌呤霉素，对转染的真核细胞进行筛选，2-3星期后获得多个团状细胞群，将其挑出，通过有限稀释法获得稳定表达抗原的单克隆细胞株。

优选地，步骤b采用的慢病毒包装质粒包括PLV、PAX2、PMD2.0，其摩尔比为4-6：1-3：1。

优选地，步骤b中，真核细胞和慢病毒包装质粒的比例为，每孔六孔板中，添加2-5ug质粒。

优选地，步骤(4)中，悬液依次进行500g离心5min去沉淀、5000g离心15min去沉淀、100000g离心1h去上清，所得沉淀即人组织因子凝血复合物。

本发明方法将人组织因子(tTF)基因构建于慢病毒表达载体中，经过筛选后获得稳定表达细胞株,再通过差速离心等的方法，获得具有局部快速止血功能的高效凝血复合物。真核表达修饰后的tTF-PHLIP融合蛋白固定于细胞质膜上并形成二次跨膜结构，再经过上述方法，获得具有局部快速止血功能，以及伤口感染预防、促进伤口愈合、防止组织黏连等作用的高效凝血复合物。

本发明提供的人组织因子凝血复合物，人体相容性好，属于主动性止血材料，能有效激活外源性凝血途径并引起凝血因子级联放大效应，达到快速止血的效应。与现有技术相比，本发明人组织因子凝血复合物具有止血效率高，副作用小，操作简便，功能全面等优点。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1:通过激光共聚焦显微镜确定tTF-PHLIP融合蛋白的细胞膜定位

图2:使用血浆体外验证tTF的生物学活性。

图3：利用膜染料，通过激光共聚焦显微镜验证phlip的体外活性

图4：利用膜染料，通过流式细胞仪验证phlip的体外活性；

图5：融合蛋白序列示意图。

具体实施方式

以下通过具体的制备例和实施例可使本发明得到更清楚的说明，但本发明的整体构思并不局限于该实施例，本领域的专业技术人员可以通过同样的思路对实验中的某一步进行替换，但本发明的整体思路仍受保护：

以下合成步骤中的所使用的试剂为市售商品。

(1)通过Pubmed数据库中查找tTF、G蛋白偶联受体蛋白跨膜区与胞内段、phlip多肽的编码序列，利用现有的融合蛋白构建技术，按照信号肽、tTF蛋白(含跨膜区)、G蛋白偶联受体蛋白的一个胞内段(HRSRRTQSTTN)与跨膜区(YFVVSMACADLLISVASTPFVLL)、蛋白LINKER(GGGSGGGSGGGS)、PHLIP的顺序构建目的片段(见图5)，通过全基因合成的方式构建于慢病毒表达载体(PLV)上，获得含有融合蛋白编码序列的重组质粒。

该融合蛋白的完整序列为(SEQ ID NO：1)：

MTQFNIPVTMSSSLSIILVILVSLRTALSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREIFYIIGAVVFVVIILVIILAISLHRSRRTQSTTNYFVVSMACADLLISVASTPFVLLGGGSGGGSGGGSAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLELALLVDADEGT.

该融合蛋白对应的完整碱基序列为(SEQ ID NO：2)：atgactcaattcaatatcccagtaaccatgtcttcaagcttaagcataattttggtcattcttgtatctttgagaactgcactctcatcaggcactacaaatactgtggcagcatataatttaacttggaaatcaactaatttcaagacaattttggagtgggaacccaaacccgtcaatcaagtctacactgttcaaataagcactaagtcaggagattggaaaagcaaatgcttttacacaacagacacagagtgtgacctcaccgacgagattgtgaaggatgtgaagcagacgtacttggcacgggtcttctcctacccggcagggaatgtggagagcaccggttctgctggggagcctctgtatgaaaactccccagagttcacaccttacctggagacaaacctcggacagccaacaattcagagttttgaacaggtgggaacaaaagtgaatgtgaccgtagaagatgaacggactttagtcagaaggaacaacactttcctaagcctccgggatgtttttggcaaggacttaatttatacactttattattggaaatcttcaagttcaggaaagaaaacagccaaaacaaacactaatgagtttttgattgatgtggataaaggagaaaactactgtttcagtgttcaagcagtgattccctcccgaacagttaaccggaagagtacagacagcccggtagagtgtatgggccaggagaaaggggaattcagagaaatattctacatcattggagctgtggtatttgtggtcatcatccttgtcatcatcctggctatatctctacataggagtaggaggactcagtctaccaccaactactttgtggtctccatggcatgtgctgaccttctcatcagcgttgccagcacgcctttcgtcctgctcggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcgccgagcagaaccccatctactgggccagatacgccgactggctgttcaccacacccctgctgctgctggagctggccctgctggtggacgccgacgagggcacc。

(1)转染16小时前将HEK293T细胞种于六孔板中，调整细胞密度，使转染时细胞贴壁，汇合度60％～80％。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。转染前1h将细胞培养基更换为无血清培养基。

(2)用无血清培养基稀释慢病毒包装质粒(PLV、PAX2、PMD2.0,5：2：1)与转染试剂Lipofectamine 2000,以质粒(ug)：转染试剂(ul)＝1:2进行混合，在室温下温育20分钟，再将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至HEK293T细胞的六孔板中(每孔3ug质粒)，混匀，于37℃,5％CO₂的细胞培养箱中培养。培养12h后吸出含有转染混和物的培养基，换上新鲜培养基，培养48h后，收集293T细胞的上清液，含慢病毒的上清液经过离心和0.45μm滤器过滤处理后，即获得了较纯的慢病毒产物。

(3)用慢病毒溶液和等体积完全培养基培养汇合度70％～80％的HEK293T细胞，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene(聚凝胺)，正常条件下培养。

(4)在转染48h后，使用终浓度2-3μg/ml的嘌呤霉素，对转染的真核细胞进行筛选，2-3星期后可获得多个团状细胞群，将其小心挑出，通过有限稀释法在96孔板中获得稳定表达抗原的单克隆细胞株。

(5)取稳定表达tTF(人组织因子)-PHLIP(酸响应肽)融合蛋白的HEK293T细胞，用含10％的胎牛血清和适量抗生素的DMEM培养基培养。

(6)显微镜下观察细胞培养汇合度达90％以上时，吸出培养基，用PBS洗去残余培养基，吸出清洗液，用PBS将细胞吹打脱壁，将细胞液离心后去上清再加入PBS清洗一遍，离心后去上清，加入一定量PBS重悬。

(7)上步所得细胞悬液加入PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride,苯甲基磺酰氟)蛋白酶抑制剂，于冰中低功率超声1min，冰上静置15min，使囊泡结构充分形成。

(8)将上述悬液依次进行500g离心5min去沉淀、5000g离心15min去沉淀、100000g离心1h去上清，最后一步离心所得沉淀用适量PBS重悬，于-80℃保存，或将沉淀冷冻干燥，制成干粉低温保存。

实施例1：

(1)tTF-PHLIP融合蛋白在细胞中的细胞膜定位检测：取稳定表达tTF-PHLIP融合蛋白的HEK293T细胞，用含10％的胎牛血清和适量抗生素的DMEM培养基培养在共聚焦皿中，待细胞贴壁且汇合度达到50％左右，吸出培养基，用PBS小心清洗一遍，用4％多聚甲醛固定细胞15min，PBS浸洗3次；0.5％Triton X-100室温通透20min,PBS浸洗3次；滴加足够量的稀释好的兔来源抗组织因子一抗，37℃孵育1小时，PBS浸洗3次；滴加足够量的稀释好的荧光偶联的抗兔抗体二抗，37℃孵育1小时，PBS浸洗3次；滴加DAPI(4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)避光孵育5min，对标本进行染核，PBS浸洗4次洗去多余的DAPI；滴加少量PBS,在荧光显微镜下观察采集图像。结果如图1，可以看到tTF-PHLIP融合蛋白主要定位于细胞膜表面。

(2)使用血浆体外验证tTF的生物学活性：取一次性采血管(内置肝素钠)取小鼠新鲜血浆，分组加入EP管中备用，每组分别加入不同量的复合物与生理盐水，观察凝血复合物的凝血效果。如图2,3min后40ul凝血复合物组已形成大量的纤维蛋白复合物，20ul凝血复合物组形成少量纤维蛋白复合物，10ul凝血复合物组形成微量纤维蛋白复合物，而对照组未见纤维蛋白复合物形成。

(3)利用膜染料，通过激光共聚焦显微镜验证phlip的体外活性：取普通HEK293T细胞，用含10％的胎牛血清和适量抗生素的DMEM培养基培养在共聚焦皿中待用。取提取的凝血复合物制品，用DIL膜染料，即DiLC₁₈(3)细胞膜红色荧光染料，常温下孵育30分钟，离心去除上清，将沉淀用PBS清洗两遍，所得沉淀用适量PBS重悬待用；去除种有HEK293T细胞的共聚焦皿中的培养基，PBS清洗一遍，吸出清洗液，分别加入2毫升PH6.5和PH7.5的PBS,分别加入等量DIL染色的凝血复合物制品，37℃孵育30min，去除染液，PBS清洗三遍，用4％多聚甲醛固定细胞15min，PBS浸洗3次；滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBS浸洗4次洗去多余的DAPI；滴加少量PBS,在荧光显微镜下观察采集图像。如图3所示，PH6.5的条件下凝血复合物可以有效与细胞融合。

(4)利用膜染料，通过流式细胞仪验证phlip的体外活性：0.25％胰蛋白酶消化普通HEK293T细胞1分钟，清除胰酶后用PBS重悬置于EP管中待用；取提取的凝血复合物制品，用DIL膜染料常温下孵育30分钟，离心去除上清，将沉淀用PBS清洗两遍，所得沉淀用适量PBS重悬待用；去除EP管中的PBS，分别加入2毫升PH6.5和PH7.5的PBS,分别加入等量DIL染色的凝血复合物制品，37℃孵育30min，去除染液，PBS清洗三遍，沉淀用少量PBS重悬，进行流式细胞仪检测。如图4所示，PH6.5的条件下凝血复合物可以有效与细胞融合。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种人组织因子凝血复合物及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Gln Phe Asn Ile Pro Val Thr Met Ser Ser Ser Leu Ser Ile

1 5 10 15

Ile Leu Val Ile Leu Val Ser Leu Arg Thr Ala Leu Ser Ser Gly Thr

20 25 30

Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe

35 40 45

Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr

50 55 60

Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr

65 70 75 80

Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val

85 90 95

Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val

100 105 110

Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu

115 120 125

Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser

130 135 140

Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg

145 150 155 160

Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe

165 170 175

Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser

180 185 190

Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val

195 200 205

Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser

210 215 220

Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly

225 230 235 240

Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile Gly Ala Val

245 250 255

Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile Ser Leu His

260 265 270

Arg Ser Arg Arg Thr Gln Ser Thr Thr Asn Tyr Phe Val Val Ser Met

275 280 285

Ala Cys Ala Asp Leu Leu Ile Ser Val Ala Ser Thr Pro Phe Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Glu Gln

305 310 315 320

Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe Thr Thr Pro

325 330 335

Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp Glu Gly Thr

340 345 350

<210> 2

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgactcaat tcaatatccc agtaaccatg tcttcaagct taagcataat tttggtcatt 60

cttgtatctt tgagaactgc actctcatca ggcactacaa atactgtggc agcatataat 120

ttaacttgga aatcaactaa tttcaagaca attttggagt gggaacccaa acccgtcaat 180

caagtctaca ctgttcaaat aagcactaag tcaggagatt ggaaaagcaa atgcttttac 240

acaacagaca cagagtgtga cctcaccgac gagattgtga aggatgtgaa gcagacgtac 300

ttggcacggg tcttctccta cccggcaggg aatgtggaga gcaccggttc tgctggggag 360

cctctgtatg aaaactcccc agagttcaca ccttacctgg agacaaacct cggacagcca 420

acaattcaga gttttgaaca ggtgggaaca aaagtgaatg tgaccgtaga agatgaacgg 480

actttagtca gaaggaacaa cactttccta agcctccggg atgtttttgg caaggactta 540

atttatacac tttattattg gaaatcttca agttcaggaa agaaaacagc caaaacaaac 600

actaatgagt ttttgattga tgtggataaa ggagaaaact actgtttcag tgttcaagca 660

gtgattccct cccgaacagt taaccggaag agtacagaca gcccggtaga gtgtatgggc 720

caggagaaag gggaattcag agaaatattc tacatcattg gagctgtggt atttgtggtc 780

atcatccttg tcatcatcct ggctatatct ctacatagga gtaggaggac tcagtctacc 840

accaactact ttgtggtctc catggcatgt gctgaccttc tcatcagcgt tgccagcacg 900

cctttcgtcc tgctcggcgg cggcagcggc ggcggcagcg gcggcggcag cgccgagcag 960

aaccccatct actgggccag atacgccgac tggctgttca ccacacccct gctgctgctg 1020

gagctggccc tgctggtgga cgccgacgag ggcacc 1056

Claims

1.一种人组织因子凝血复合物，其特征在于：包括囊泡结构，所述的囊泡结构为真核细胞来源，具有tTF-PHLIP融合蛋白；tTF-PHLIP融合蛋白固定于真核细胞质膜上并形成二次跨膜结构，其中，所述的tTF-PHLIP融合蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.tTF-PHLIP融合蛋白，其序列如SEQ ID NO：1所示。

3.编码如权利要求2所述的tTF-PHLIP融合蛋白的序列，其序列如SEQ ID NO 2所示。

4.如权利要求1所述的一种人组织因子凝血复合物在制备凝血药物中的用途。

5.一种凝血制剂，其包括权利要求1所述的人组织因子凝血复合物。

6.如权利要求5所述的凝血制剂，其特征在于，还包括唾液酸。