JP2022509053A - 血小板放出物を調製するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から血小板放出物を調製するための、ある量の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩及びある量のガラス粒子の使用に関する。ここで、前記ガラス粒子の量は、前記試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gであり、また、前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、前記試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolである。血小板放出物を調製するためのシステム及び方法、ならびにそれから得られる血小板放出物及びin vitro及びin vivoでの応用におけるその使用も開示される。

Description

発明の分野

本発明は、血小板由来製品を調製するためのシステム及び方法、ならびに血小板由来製品を調製するための血小板由来製品の使用に関する。

発明の背景

専門の実験室では、細胞及び/または組織は増殖培地で培養される。増殖培地は、細胞増殖を補助するように特別に設計されており、栄養素とミネラルに加えて、ホルモン、増殖因子、付着因子等の（生体）分子の複雑な混合物も含む。歴史上、血清、特にウシ胎児血清(FBS)は、これらの（生体）分子及び多数の低分子量栄養素を提供し、増殖培地の重要な成分とされてきた。タンパク質医薬品を製造するための工業規模の哺乳類細胞培養の出現により、血清の消費量が大幅に増加した。細胞及び/または組織培養における血清の世界規模の需要を満たすために、毎年100万頭以上のウシ胎児から約80万リットルのFBSが分離されていると推定された。

細胞療法や人工組織移植等の再生医療は、新たな医療分野である。再生医療では、正常な機能を回復または確立するために、ヒト細胞または組織全体が再生または置換される。これらの医学の進歩に伴い、動物由来の製品を欠くヒト細胞のための安全で汚染物質のない培養方法の開発にさらに焦点を当てる必要がある。なぜなら、動物由来の製品が、外来因子に対する免疫反応や種間病原体感染を引き起こす可能性があるからである。

細胞培養培地の成長サプリメントとして従来使用されているFBSを置き換えるための探索において、最近の研究は、血小板濃縮物から溶解によって生成できる血小板溶解物（PL）、または血小板濃縮物から血小板活性化によって生成できる血小板放出物（PR）の応用に焦点を合わせている。PLは、ヒト治療のための細胞のex vivo培養における実行可能なFBSの代替物として提案されている。

現在、血小板由来製品の調製方法は2つの主要なカテゴリーに分類される：(i)（PLを調製するための）凍結融解及び（ii）（PRを調製するための）血小板活性化。前者(i)の方法では、多血小板組成物は、繰り返して凍結／融解のサイクルに供される。これは血小板を効率的に溶解するが、培地でそのまま使用すると、凝固を引き起こす線維素原を除去しない。これらの種類の溶液は現在、凝固を防ぐためにヘパリンの添加を必要とするが、ヘパリン自体は、非ヒト動物に由来し、FBSよりもPLを使用する利点を無効にする。さらに、該方法は時間と労力を要す。（ii）の方法、即ち血小板活性化は、トロンビンのような血小板活性化因子を使用している。しかし、トロンビンの使用は、現在、ヒトにおける下流の臨床使用のために承認されていない。ほとんどの場合、トロンビンは本質的に非ヒト（例えばウシ）でもある。あるいは、血小板は、カルシウム塩1 mlあたり少なくとも15 μmolを添加することによって活性化することができる。しかし、世界的に、血液バンクでは血小板添加剤溶液で補充された多血小板組成物がよく用いられる状況では、これらはリン酸塩沈殿を引き起こすであろう。組織培養は（一般的に）一定したpH 7.4で行われる。これは、加湿され、温度制御された恒温器内の炭酸塩緩衝液システムによって維持される。該pHでは、理論上でカルシウムとリン酸塩の溶解度の合計が1.7 mMである。これは、Ca²⁺とHPO₄ ^2-の両方のイオンが、pH 7.4で溶液中に存在し、濃度が1.7 mM以上の場合では沈殿が生じうることを意味する。また、炭酸塩イオンを含む溶液の中でも沈殿が速く生じうる。先行技術では、多血小板放出物の調製方法では、Ca²⁺が使用され、血小板を活性化させる。典型的な多血小板放出物画分10％（vol/vol）で使用される濃度は、しばしば、最終培地中のCa²⁺の最終濃度が1.7 mMを超える。さらに、最新の血小板添加剤溶液に保存されている血小板濃縮物から該放出物を調製する場合、HPO₄ ^2-濃度も該溶解度基準を超え、沈殿が生じるであろう。このようなカルシウム複合体は、少なくとも15 μmol/mlのカルシウム塩を使用する（ii）の方法、即ち、血小板活性化によって得られたPRを含む培地で培養されたストレス細胞を沈殿させる。

また、カルシウムイオンはシグナル伝達経路で機能することがよく知られており、従って、ほとんど全ての哺乳動物細胞の様々な細胞機能に影響を与える可能性があるため、細胞培養培地におけるイオン化カルシウムの量を制限することが望ましい。カルシウムはまた、多くの酵素の重要な補因子として機能し、細胞分泌に関与している。従って、細胞外Ca²⁺濃度はしっかりと調節されている。ヒト血漿における総カルシウム濃度の正常範囲は、2.2～2.6 mMである。該元素は、様々な血漿タンパク質に結合し、遊離イオン化Ca²⁺濃度が1.1～1.4 mMで、厳密に制御されている。これらの濃度レベルは、狭い範囲幅の内で積極的に維持され、経時的に5％を超える変動はめったにない（Atchison,D.K. & Beierwltes, W.H. European Journal of Physiology, 2013; 465(1)：59-69）。ヒトにおけるCa²⁺濃度の異常は、低カルシウム血症または高カルシウム血症と併発疾患につながる。その結果、理想的には組織培養培地におけるCa²⁺濃度は同様に制御される。例えば、軟骨細胞のex vivo培養は、表現型を維持するためにCa²⁺を注意深く制御する必要がある（Gigout, A.ら、Osteo Arthritis and Cartilage, 2005; 13：1012e1024）。そのため、組織培養培地を供給する業者が、Ca²⁺を添加した基礎培地（例えば、Gibcoカタログ番号11960）及び添加していない基礎培地（例えば、Gibcoカタログ番号21068）を提供する。

従って、血小板由来製品を調製するための迅速かつ臨床に適用できる新規の方法が必要とされている。

本発明の特定の代表的な実施形態を示す実験項目によって裏付けられるように、本発明者らは、期限切れのヒト血小板濃縮物等の被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から、前記試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gのガラス粒子及び前記試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩を用いて、血小板放出物または溶解物を調製できることを見出した。該方法は、最終的なCa²⁺濃度を最大限に低下させる方法を提供する。我々の計算によると、一般的な培地に10％（vol/vol）画分で使用した場合、総血小板放出物（10.0％）における最終Ca²⁺濃度が約0.8 mMであると、リン酸カルシウムの溶解度を下回ったままにすることができる。

また、本発明者らは、血小板放出物または血小板溶解物を調製するための閉鎖型無菌システムを開発した。さらに、本発明者らは、それによって得られた血小板放出物が、ウシ胎児血清(FBS)等の血清添加物の代替物として細胞培養または組織培養に使用できることを見出した。本明細書で教示される血小板放出物は、増殖培地において沈殿を誘発しないことが見出された。さらに、本明細書で教示される血小板放出物または溶解物はまた、硬組織及び軟組織の損傷、炎症性疾患、骨疾患、変性関節疾患、変性椎間板疾患、皮膚状態、円形脱毛症、子宮内膜症、膣萎縮、眼表面疾患、手根チューブ症候群、神経変性障害、末梢動脈疾患、及び疼痛の治療、ならびに皮膚及び／または毛髪の外観の改善に使用できる。

従って、本発明は以下の態様を提供する。

態様１．被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から血小板放出物を調製するための、ある量の１つまたは複数の水溶性カルシウム塩及びある量のガラス粒子の使用。ここで、前記ガラス粒子の量は、前記試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gであり、前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、前記試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolである。

態様２．第1収容空間(1’)を有する第1容器(1)を含む血小板放出物を調製するためのシステム。
ここで、前記第1収容空間(1’)が、
- 第2容器(2)の第2収容空間(2’)に含まれるある量（Q_bc)の多血小板血液組成物を受け取るように構成されていて、
- ある量（Q_gp）のガラス粒子(3)を保持し、かつ、
- ある量（Q_cc) の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持するか、第3容器(5)の第3収容空間(5’)によって保持されたある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を受け取るように構成されている。
ここで、比Q_gｐ：Q_bcは、前記試料1 mlあたり0.010～0.60 gであり、かつ比Q_cc：Q_bcは、前記試料1 mlあたり1.0～12.0 μmolである。

態様３．近位端が第1収容空間(1’)中の第1開口部によって保持され、遠位端が第3収容空間(5’)中の開口部によって保持される第1チューブをさらに含む、態様２によるシステム。ここで、前記チューブは、第1容器(1)を第3容器(5)に接続し、かつ第1収容空間(1’)を第3収容空間(5’)と流体連絡するように配置するように構成されている。

態様４．前記第1チューブが、前記第1収容空間(1’)と前記第3収容空間(5’)との間の流体連絡を可逆的に遮断するための手段を含む、態様３によるシステム。ここで、前記手段が、好ましくは外部のクランプまたは弁である、

態様５．前記第1収容空間(1’)が、さらに
- 第2容器(2)の第2収容空間(2’)の開口部に接続するように構成された第2開口部、及び
- 第4容器の第4収容空間の開口部に接続するように構成された第3開口部（ここで、前記第4収容空間は、前記システムを用いて調製された血小板放出物を受け取る及び／または保持するように構成されている）。
を含む、態様２～４のいずれか１つによるシステム。

態様６．以下をさらに含む、態様５によるシステム。
- 近位端が前記第1収容空間(1’)中の前記第2開口部によって保持され、遠位端が前記第2収容空間(2’)に接続可能である、第2チューブ（ここで、前記第2チューブは、前記第1容器(1)を前記第2容器(2)に接続し、かつ第1収容空間(1’)を第2収容空間(2’)と流体連絡するように配置するように構成されている。）、
- 近位端が前記第1収容空間(1’)中の前記第3開口部によって保持され、遠位端が第4容器の第4収容空間に接続可能である、第3チューブ（ここで、前記チューブは、前記第1容器(1)を前記第4容器に接続し、かつ前記第1収容空間(1’)を前記第4収容空間と流体連絡するように配置するように構成されている。）、及び
- 任意選択で、前記第1収容空間(1’)中の前記第3開口部と前記第4収容空間との間に位置する濾過手段(7)。

態様７．前記第2チューブの遠位端が、前記第2収容空間(2’)に接続可能であり、かつ／または前記第3チューブの遠位端が、溶接によって前記第4収容空間に接続可能である、態様６によるシステム。

態様８．前記比Q_gｐ：Q_bcが、前記試料1 mlあたり0.10～0.40 gであり、かつ前記比Q_cc：Q_bcが、前記試料1 mlあたり3.0～8.0 μmolである、態様２～７のいずれか１つによるシステム。

態様９．態様２～８のいずれか１つによるシステムの、血小板放出物または血小板溶解物を産生するための使用。

態様１０．以下の工程を含む、被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から血小板放出物を調製する方法。
a)前記試料を、該試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gのガラス粒子及び該試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させ、それにより混合物を得る工程;
b)工程a)で得られた混合物を凝固させ、それにより凝固物及び血小板放出物を得る工程、及び、
c)工程b)で得られた血小板放出物を前記混合物から回収する工程。

態様１１．前記試料が、該試料1 mlあたり0.10 g～0.40 gのガラス粒子及び該試料1 mlあたり3.0 μmol～8.0 μmolの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触される、態様１による使用または態様１０による方法。

態様１２．前記ガラス粒子が、1.0 mm～5.0 mm、好ましくは2.0 mm～4.0 mmの平均直径を有する、態様１による使用、態様２～８のいずれか１つによるシステム、または態様１０または１１による方法。

態様１３．前記ガラス粒子が、シリカベースのガラス粒子、好ましくはソーダライムシリカまたはソーダライムガラス粒子、ホウケイ酸ナトリウムガラス粒子、アルミノケイ酸ガラス粒子、酸化鉛ガラス粒子または溶融シリカガラス粒子である、態様１、１１または１２のいずれか１つによる使用、態様２～８または１２のいずれか１つによるシステム、または態様１０～１２のいずれか１つによる方法。

態様１４．前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩が、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、塩素酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム及びグルコン酸カルシウムの混合物からなる群から選択され、好ましくは塩化カルシウムである、態様１または１１～１３のいずれか１つによる使用、態様２～８、１２または１３のいずれか１つによるシステム、または態様１０～１３のいずれか１つによる方法。

態様１５．工程c)において、工程b)で得られた前記血小板放出物が、混合物を少なくとも１つのフィルターに通過させることによって前記混合物から回収される、態様１０～１４のいずれか１つによる方法。

態様１６．工程b)において、前記混合物を1時間～20時間、好ましくは2～6時間、より好ましくは2～4時間凝固させる、態様１０～１５のいずれか１つによる方法。

態様１７．前記多血小板血液組成物が、血小板濃縮物、血漿及び全血から選択され、好ましくは血小板濃縮物である、態様１または１１～１４のいずれか１つによる使用または態様１０～１６のいずれか１つによる方法。

態様１８．得られた凝固物中に存在する血小板及び／または工程b)で得られた血小板放出物を溶解し、それにより血小板溶解物を得る工程をさらに含む、態様１０～１７のいずれか１つによる方法。

態様１９．前記放出物が、好ましくは総血小板放出物（10.0％）において、0.8 mM未満のカルシウムイオン（Ca²⁺）の最終濃度を有する、態様１０～１７のいずれか１つによる方法で得られた血小板放出物。

態様２０．前記放出物が、好ましくは総血小板放出物（10.0％）において、0.8 mM未満のカルシウムイオン（Ca²⁺）の最終濃度を有する、態様１８による方法によって得られた血小板溶解物。

態様２１．態様１９による血小板放出物または態様２０による血小板溶解物を含む、医薬組成物。

態様２２．態様１９による血小板放出物または態様２０による血小板溶解物を含む美容組成物。

態様２３．多血小板血液組成物、前記多血小板血液組成物に存在するCa²⁺イオンに加えて、1.0 mM～12.0 mMのCa²⁺イオン、及び前記多血小板血液組成物1 mlあたり0.010 g～0.60 gのガラス粒子を含む、組成物。

態様２４．態様２３による組成物を含む、容器。

態様２５．医療における使用のための、態様１９による血小板放出物、態様２０による血小板溶解物、または態様２１による医薬組成物。

態様２６．有効量の血小板放出物、血小板溶解物または医薬組成物を被験者に投与することを含む、硬組織及び軟組織の損傷、炎症性疾患、骨疾患、変性関節疾患、変性椎間板疾患、皮膚状態、脱毛症、子宮内膜症、膣萎縮、眼表面疾患、手根チューブ症候群、神経変性障害、末梢動脈疾患、及び疼痛の治療における使用のための、態様１９による血小板放出物、態様２０による血小板溶解物、または、態様２１による医薬組成物。

態様２７．皮膚及び／または毛髪の外観を改善するための、態様１９による血小板放出物、態様２０による血小板溶解物、または態様２２による美容組成物の使用。

態様２８．細胞培養または組織培養における、態様１９による血小板放出物または態様２０による血小板溶解物の使用。

これら及びさらなる本発明の態様及び好ましい実施形態は、以下の項目及び添付の特許請求の範囲に記載されている。添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書に具体的に組み込まれる。

図１
（A)30％(v/v)血漿を含む血小板濃縮物（PC)のCaCl₂との単独またはガラスビーズとの組み合わせによる凝固。（B)15 mM CaCl₂と40 ml PCを組み合わせて得られた凝固物（左パネル）、または10 gガラスビーズ、4 mM CaCl₂、及び40 ml PCを組み合わせて得られた凝固物（右パネル）。

図２
ヒト血小板放出物（hPR）を調製するための閉鎖型システム。（A)PCは、PCバッグ(2)の収容空間(2’)から、ガラスビーズ(3)とCaCl₂(4)を含む移送バッグ(1)の収容空間(1’)に移される。該PCを収容空間(1’)に移した後、該溶液を凝固させる。凝固後に得られた血小板放出物を該ガラスビーズや該凝固物から、そして場合によって、破片や粒子状物質から分離するため、該移送バッグを濾過手段(7)に結合してもよい。該移送バッグを受取部(6)に溶出させてもよい。（B)PCは、PCバッグ(2)の収容空間(2’)から、ガラスビーズ(3)を含む移送バッグ(1)の収容空間(1’)に移される。該移送バッグ(1)の収容空間(1’)は、分離弁によって密封されたCaCl₂(4)を含むポーチ(5)の収容空間(5’)に連結されている。該PCと該ガラスビーズを含む移送バッグ(1)の収容空間(1’)にCaCl₂を移動した後、該溶液を凝固させる。凝固後に得られた血小板放出物をガラスビーズや凝固物から、そして場合によって、破片や粒子状物質から分離するため、該移送バッグを濾過手段(7)に結合してもよい。該移送バッグを受取部(6)に溶出させてもよい。

図３
本明細書で教示される方法で得られた凝固物：（A)移送バッグ中のもの、及び(B)該バッグから取り出されたもの。

図４
様々な重量のガラスビーズ及び様々な濃度のCa²⁺の場合における収縮速度。

図５
（A)様々な重量のガラスビーズ及び様々な濃度のCa²⁺で凝固されたPC（40 ml）における放出物の収率。（B)PC 1 mlあたり15 mM CaCl₂またはPC 1 mlあたり4 mM CaCl₂及び0.20 gのガラスビーズで凝固されたPC（350 ml）における放出物の収率。

図６
凝固が完了した後の、得られた血小板におけるCa²⁺の残留濃度。これは、Ca²⁺イオン選択性電極を使用するガス分析装置で測定した血液中の結果である。

図７
ダルベッコ改良イーグル（DMEM）細胞培養培地へ、ガラスビーズを含まない15 mM CaCl₂を使用した65％血小板添加剤溶液を含む血小板濃縮液から得られた10％(v/v)ヒト血小板放出物を添加した効果（左パネル）またはウシ胎児血清(FBS)を添加した効果（右パネル）。

図８
DMEM細胞培養培地にヒト血小板放出物を添加した効果。（A)15 mM CaCl₂で調製した10％(v/v)hPRを含む増殖培地；（B)hPRを含まない増殖培地;（C)カルシウムなしで調製した10％(v/v)hPRを含む増殖培地;（D）4 mM CaCl₂及び0.20 g/mlガラスビーズで調製した10％(v/v)hPRを含む増殖培地；（E）5 mM CaCl₂及び0.20 g/mlガラスビーズで調製した10％(v/v)hPRを含む増殖培地。

図９
様々な種類のhPRを10％(v/v)で添加したDMEM増殖培地で培養した脂肪組織由来間葉系幹細胞（MSC)の細胞倍増時間。「標準」hPRは、2回の凍結融解サイクルとそれに続く遠心分離によって産生した。「CaCl₂+ガラス」hPRは、PC 1 mlあたり5 mM CaCl₂と0.2 gのソーダライムガラスビーズで調製した。3つの商用競合他社が含まれ、FBSがゴールド標準として含まれていた。

図１０
（A)ガラスビーズを含まない15 mM CaCl₂で調製した10％(v/v)hPR、及び（B)4 mM CaCl₂及び0.20 gガラスビーズ/ml PCで調製した10％(v/v)hPLを添加したDMEM増殖培地で培養されたMSCの顕微鏡画像。

図１１
実施例8の実験条件の概略図及び結果。上の行には様々な濃度のCaCl₂が示され、左の列には様々な重量と濃度のガラス粒子が示されている。3時間未満で収縮がないことは

で示され、3時間未満で収縮が成功したことは

で示されている。

図１２
実施例9の実験条件の概略図及び結果。上の行には様々な濃度のCaCl₂が示され、左の列には様々な重量と濃度のガラス粒子が示されている。収縮がないことは

で示され、3時間未満で収縮が成功したことは

で示されている。◎は、3時間～21時間の間の血餅収縮を示す。

図１３
引用された先行技術に従って調製された血小板放出物中のCa²⁺（イオン化カルシウム）の濃度。対での実験において、本法（TReC)または先行技術文献による方法で添加剤溶液（PAS-血漿）または純粋な血漿（血漿）中の血小板濃縮物を処理した。

図１４
組織培養培地におけるカルシウム（Ca²⁺）との化学リン酸塩（PO₄ ^3-）複合体の沈殿。

発明の詳細な説明

本明細書で使用される単数形「1つ」及び「該」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、単数及び複数の対象物の両方を含む。

本明細書で使用される「含んでいる」、「含む」及び、「からなる」という用語は、「包含している」、「包含する」または「含有している」、「含有する」と同義であり、包括的または自由形式であり、追加の、引用されていな要員、要素、または方法の工程を除外しない。これらの用語はまた、「からなる」及び「本質的にからなる」を含み、これらは、特許用語において確立された意味を有する。

エンドポイントによる数値範囲の列挙には、それぞれの範囲内に含まれる全ての数値と分数、及び列挙されたエンドポイントが含まれる。

パラメーター、量、時間的持続等の測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、そのような変動が開示された発明において実施するのに適切である限り、特定の値の変動（例えば、指定値の±10％以下、好ましくは±5％以下、より好ましくは±1％以下、さらにより好ましくは±0.1％以下の変動等）及びそれからの変動を包含することを意味する。理解されたいこととして、修飾語「約」が指す値は、それ自体も好ましくは具体的に開示される。

「1つまたは複数」または「少なくとも1つ」という用語（要員の群の1つまたは複数の要員または少なくとも1つの要員等）は、それ自体明確であり、さらなる例示により、該用語は、とりわけ、前記要員のいずれか１つ、または前記要員の任意の２つ以上（例えば、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、または7つ以上等）、及び最大で前記全ての要員への言及を包含する。別の例では、「１つまたは複数」または「少なくとも１つ」は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたはそれ以上を指してもよい。

本発明の文脈を説明するために、本明細書では本発明の背景について記載されている。これは、言及された資料のいずれかが、その請求の優先日において公開され、周知され、または任意の国における一般知識の一部であることを認めるものと見なされるべきではない。

本開示を通して、様々な刊行物、特許、及び公開された特許明細書は、識別引用によって参照されている。本明細書に引用されている全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特に、本明細書で具体的に言及されるそのような文献の教示または項目は、参照により組み込まれる。

別段の定義がない限り、技術用語及び科学用語を含む、本発明を開示する際に使用される全ての用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味を有する。さらなるガイダンスによって、本発明の教示をよりよく理解するために用語の定義が含まれている。本発明の特定の態様または本発明の特定の実施形態に関連して特定の用語が定義される場合、そのような含意は、他に定義されない限り、本明細書全体に、即ち、本発明の他の態様または実施形態の文脈においても適用されることを意味する。

以下の節では、本発明の異なる態様または実施形態がより詳細に定義されている。そのように定義された各態様または実施形態は、反対に明確に示されない限り、他の任意の態様または実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された他の任意の特徴と組み合わせることができる。

本明細書全体を通して「1つの実施形態」、「ある実施形態」への言及は、該実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書の様々な場所での「1つの実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すとは限らないが、そうであり得る。また、特定の特徴、構造、または特性は、本開示から当業者に明らかであるように、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれる他の特徴ではなくいくつかの特徴を含むが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあり、当該技術分野の人々によって理解されるように、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、それに記載の実施形態のいずれかを任意の組み合わせで使用することができる。

本発明の特定の代表的な実施形態を示す実験の項で裏付けられるように、本発明者らは、期限切れのヒト血小板濃縮物等の被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から、前記試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gのガラス粒子、及び前記試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩を使用して、血小板放出物を調製できることを発見した。さらに、本発明者らは、それによって得られた血小板放出物が、ウシ胎児血清(FBS)等の血清添加物の代替物として細胞培養または組織培養に使用できることを見出した。本明細書で教示された血小板放出物は、増殖培地において沈殿を誘発しないことが見出された。また、本明細書で教示された血小板放出物は、硬組織及び軟組織の損傷、炎症性疾患、骨疾患、変性関節疾患、変性椎間板疾患、皮膚状態、円形脱毛症、子宮内膜症、膣萎縮、眼表面疾患、手根チューブ症候群、神経変性障害、末梢動脈疾患及び疼痛の治療、ならびに皮膚及び／または毛髪の外観の改善にも使用できる。

従って、最初の態様は、被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から血小板放出物を調製するための、ある量の１つまたは複数の水溶性カルシウム塩及びある量のガラス粒子の使用を提供する。ここで、前記ガラス粒子の量は、前記試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gであり、また、前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、前記試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolである。

本明細書で使用される「血小板放出物」または「血小板セクレトーム」という用語は、１つまたは複数の活性化血小板によって分泌される顆粒状及びエキソソーム内容物を含む溶液を指す。該顆粒及びエキソソーム内容物の非限定的な例には、凝固因子、低い分子、エネルギー等価物、ケモカイン、サイトカイン、接着分子、ホルモン、免疫分子、及び成長の調節因子（または増殖因子）、細胞***、アポトーシス及び/または血管新生、及び付着因子が含まれる。特定の実施形態では、該用語は血小板溶解物を含まない。本明細書で使用される「血小板溶解物」という用語は、１つまたは複数の溶解された血小板の内容物を含む溶液を指す。該用語は、血小板放出物も含んでもよい。血小板溶解物を得るための方法は、当該技術分野で知られており、血小板の凍結融解を含む。

好ましくは、血小板放出物または血小板溶解物は、実質的に細胞を含まない（即ち、血小板放出物または溶解物の1 μｌあたり最大50 000細胞、好ましくは血小板放出物または溶解物の1 μｌあたり最大40 000細胞）。本明細書で使用される「細胞」という用語は、細胞外小胞を包含しない。

特に記載のない限り、「被験者」または「患者」という用語は互換的に使用でき、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物(チンパンジー及びその他の類人猿及びサル種、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ギニアピッグ等)、さらにより好ましくは霊長類(具体的には、ヒト患者、非ヒト哺乳動物、及び霊長類を含む)を指す。好ましい被験者は人間の被験者である。「被験者」または「患者」という用語には、治療を必要とする被験者、より具体的には、ある状態、特に硬組織及び軟組織の損傷、炎症性疾患、骨疾患、変性関節疾患、変性椎間板疾患、皮膚状態、円形脱毛症、子宮内膜症、膣萎縮、眼表面疾患、手根チューブ症候群、神経変性障害、末梢動脈疾患及び疼痛の治療から恩恵を被る被験者が含まれる。そのような被験者には、前記状態と診断された被験者、前記状態を発症する傾向のある被験者、及び／または前記状態が予防されるべき被験者が含まれてもよいが、これらに限定されない。「被験者」または「患者」という用語には、皮膚及び／または髪の外観を改善する必要がある被験者が含まれる。「被験者」または「患者」という用語は、文脈が明確に別段で示さない限り、単一及び複数の被験者または患者の両方を含む。

本明細書で使用される「多血小板血液組成物」という用語は、少なくとも50 000個の血小板/μl、好ましくは少なくとも600 000または少なくとも800 000個の血小板/μlを含む全血に由来する組成物を指す。多血小板血液組成物の非限定的な例は、血小板濃縮物（軟膜由来の血小板濃縮物、アフェレーシス-血小板濃縮物または多血小板血漿由来の血小板濃縮物等）、全血、血漿及び多血小板血漿である。全血から血小板濃縮物、血漿または多血小板血漿を得る方法は、当該技術分野で知られており、分画遠心分離及びHardwick J., Blood Processing. 2008. 3(20)：148-176、特にページ164-75に記載の方法(アフェレーシス、軟膜の貯留または多血小板血漿の産生) を含む。

好ましくは、多血小板血液組成物は、実質的に白血球を含まない（例えば、1μlあたり10未満の白血球、好ましくは１μlあたり5未満の白血球）及び／または１μlあたり4000未満の赤血球を含む。

被験者から得られた（分離された、または除去された）多血小板血液組成物に関して本明細書全体で使用される「試料」または「生体試料」という用語は、被験者から直接的にまたは間接的に得られた（分離された、または除去された）多血小板血液組成物の試料を包含する。間接的に得られた多血小板血液組成物の試料には、多血小板血液組成物に産生するために、被験者から直接に得られる全血を処理（例えば、アフェレーシスまたは遠心分離等で）して得られる試料が含まれる。好ましくは、試料は、被験者からの試料の提供／除去／単離を可能にする、採血（「液体細胞診」）等の低侵襲的方法で容易に得られる。

特定の実施形態では、前記試料は、試料が単一の試料プールから採取されることを意味する、プールされた試料である。ここで、該試料プールは、2人以上の被験者の試料及び／または異なる時点で1人の被験者から採取された試料を含む。

特定の実施形態では、前記試料は、5.0 ml～50 000.0 ml、10.0 ml～10 000.0 ml、10.0 ml～5 000.0 ml、10.0 ml～2 500.0 ml、10.0 ml～1 000.0 ml、50.0 ml～750.0 ml、50.0 ml～500.0 ml、100.0 ml～500.0 ml、150.0 ml～450.0 ml、好ましくは100.0～500.0 mlの容量を有する。

本明細書で使用される「血小板濃縮物」という用語は、1 μlあたり少なくとも50 000個の血小板、好ましくは1 μlあたり少なくとも600 000個の血小板、または1 μlあたり少なくとも800 000個の血小板、及び血漿及び/または1つまたは複数の血小板添加剤溶液（例えば、血小板（SSP+）の保存液）を含む多血小板血液組成物を指す。前記血小板添加剤溶液は、前記血漿の一部（例えば、5.0～95.0％(v/v)）を置き換えるために使用できる。血小板濃縮物は、当該技術分野で知られている血小板濃縮物を調製するための任意の方法で調製できる。例えば、Hardwick J.、血液処理、 2008. 3（20）：148-176、特に164～175頁に記載の方法は、アフェレーシス、軟膜の貯留または多血小板血漿の産生を含む。従って、「血小板濃縮物」という用語は、多血小板血漿も包含する。例えば、血小板添加剤溶液を通常では含まない、濃縮された多血小板血漿等。

好ましくは、前記血小板濃縮物は、実質的に白血球を含まない（例えば、1 μlあたり白血球は10個未満、好ましくは1 μlあたり白血球は5個未満）。

特定の実施形態では、前記多血小板血液組成物は、1 μlあたり少なくとも50 000個の血小板、1 μｌあたり少なくとも100 000個の血小板、1 μｌあたり少なくとも200 000個の血小板、1 μｌあたり少なくとも300 000個の血小板、1 μｌあたり少なくとも400 000個の血小板、1 μlあたり少なくとも500 000個の血小板、1 μlあたり少なくとも600 000個の血小板、1 μlあたり少なくとも700 000個の血小板、1 μlあたり少なくとも800 000個の血小板、1 μlあたり少なくとも900 000個の血小板、または1 μlあたり少なくとも1 000 000個の血小板、好ましくは、1 μlあたり少なくとも600 000個の血小板または1 μlあたり少なくとも800 000個の血小板を含む。例えば、1 μlあたり800 000～1 200 000個の血小板。前記多小板血液組成物は、1 μlあたり100 000～3 000 000個の血小板、1 μlあたり200 000～2 000 000個の血小板、または1 μlあたり200 000～1 500 000個の血小板、好ましくは1 μlあたり200 000～2 000 000個の血小板、より好ましくは1 μlあたり800 000～1 200 000個の血小板を含んでもよい。

特定の実施形態では、前記多血小板血液組成物は、少なくとも5.0％(v/v)、少なくとも10.0％(v/v)、少なくとも15.0％(v/v)、少なくとも20.0％(v/v)、少なくとも25.0％(v/v)、少なくとも30.0％(v/v)、少なくとも35.0％(v/v)、少なくとも40.0％(v/v)、少なくとも45.0％(v/v)、少なくとも50.0％(v/v)、少なくとも55.0％(v/v)、少なくとも60.0％(v/v)、少なくとも65.0％(v/v)、少なくとも70.0％(v/v)、少なくとも75.0％(v/v) または少なくとも85.0％(v/v)、好ましくは少なくとも30.0％(v/v)の血漿を含む。血漿は、通常１つまたは複数の凝固因子を含む。例えば、凝固因子I、凝固因子II、凝固因子III、凝固因子IV、凝固因子V、凝固因子VI、凝固因子VII、凝固因子VIII、凝固因子IX、凝固因子X、凝固因子XI、凝固因子XII及び/または凝固因子XIII等の好ましくは、前記１つまたは複数の凝固因子は、血漿において正常な生理学的レベル（即ち、前記１つまたは複数の凝固因子の健常者の被験者における生理学的濃度）で存在する。

特定の実施形態では、前記多血小板血液組成物は、血小板濃縮物、血漿（多血小板血漿等）及び全血から選択される。より特定の実施形態では、前記多血小板血液組成物は、血小板濃縮物または多血小板血漿、好ましくは血小板濃縮物である。

特定の実施形態では、前記血小板濃縮物は、1 μｌあたり少なくとも600 000個の血小板、1μｌあたり少なくとも700 000個の血小板、1 μlあたり少なくとも800 000個の血小板、1 μlあたり少なくとも900 000個の血小板、または1 μlあたり少なくとも1 000 000個の血小板、好ましくは1 μlあたり少なくとも1 000 000個の血小板を含む。

特定の実施形態では、前記血小板濃縮物は、1 μlあたり600 000～3 000 000個の血小板、1 μlあたり700 000～2 500 000個の血小板、1 μlあたり800 000～2 000 000個の血小板、または1 μlあたり800 000～1 500 000個の血小板を含む。

特定の実施形態では、前記血小板濃縮物は、アフェレーシスまたは軟膜によって得られる血小板濃縮物である。特定の実施形態では、前記血小板濃縮物は、例えば、医師または看護師等の他の臨床医による輸血での使用に調製及び承認された血小板濃縮物である。

本明細書で使用される「血小板添加剤溶液」または「PAS」という用語は、血小板を保存するための電解質溶液を指す。血小板添加剤溶液は、通常、酢酸塩、及び任意選択でカリウム、マグネシウム、及び／またはリン酸塩を含む。血小板添加剤溶液は、血小板貯蔵の有効期間を延長させ、血小板の活性化を低下させ、血小板の機能を改善し、pHを維持し、またアレルギー反応を低減させることがある。前記血小板添加剤溶液は、当該技術分野で知られている任意の血小板添加剤溶液であってもよい。例えば、Tynngardら、血小板濃縮物の調製、保管および品質管理(2009)の表１、及び輸血およびアフェレーシス科学、41:97-104に記載のもの。PASの非限定的な例には、PAS-B（酢酸塩を含む）、PAS-C（酢酸塩及びリン酸塩を含む）、PAS-F（酢酸塩、マグネシウム、及びカリウムを主要成分として含む）、PAS-E（酢酸塩、マグネシウム、カリウム、及びリン酸塩を含む）、またはそれらの組み合わせが含まれる。

特定の実施形態では、前記血小板濃縮物は、少なくとも5.0％(v/v)、少なくとも10.0％(v/v)、少なくとも15.0％(v/v)、少なくとも20.0％(v/v)、少なくとも25.0％(v/v)、少なくとも30.0％(v/v)、少なくとも35.0％(v/v)、少なくとも40.0％(v/v)、少なくとも45.0％(v/v)、少なくとも50.0％(v/v)、少なくとも55.0％(v/v)、少なくとも60.0％(v/v)、少なくとも65.0％(v/v)、少なくとも70.0％(v/v)、少なくとも75.0％(v/v)、または少なくとも85.0％(v/v)、好ましくは少なくとも60.0％(v/v)の１つまたは複数の血小板添加剤溶液を含む。

特定の実施形態では、前記血小板濃縮物は、0.0～95.0％(v/v)、5.0～95.0％(v/v)、10.0～90.0％(v/v)、20.0～80.0％(v/v)、30.0～80.0％(v/v)、40.0～80.0％(v/v)、50.0～80.0％(v/v)、60～80.0％(v/v)、または65.0～75.0％(v/v)、好ましくは60.0～90.0％(v/v)の１つまたは複数の血小板添加剤溶液を含む。

より特定の実施形態では、前記血小板添加剤溶液は、PAS-E溶液であり、少なくとも32.50 mMの酢酸塩、少なくとも5.0 mMのカリウム、少なくとも1.50 mMのマグネシウム、及び少なくとも28.20 mMのリン酸塩を含む。

より特定の実施形態では、前記血小板添加剤溶液は、Na₃-クエン酸塩2H₂O、Na-酢酸塩3H₂O、NaCl、また任意選択でNaH₂PO₄2H₂O、Na₂HPO₄、KCl及び／またはMgCl₂6H₂Oを含む。

さらにより特定の実施形態では、前記血小板添加剤溶液は、PAS-E溶液であり、以下を含む。
- 2.0～4.0 g/L、好ましくは2.90～3.20 g/LのNa₃-クエン酸塩2H₂O、
- 3.0～5.0 g/L、好ましくは4.0～4.50 g/Lの酢酸ナトリウム3H₂O、
- 3.0～8.0 g/L、好ましくは4.0～7.0 g/LのNaCl、
また任意選択で
- 9.0～12.0 g/L、好ましくは1.0～1.10 g/LのNaH₂PO₄2H₂O、
- 2.90～3.20 g/L、好ましくは3.0～3.10 g/LのNa₂HPO₄、
- 0.30～0.45 g/L、好ましくは0.350～0.40 g/LのKCl、及び/または
- 0.250～0.350 g/L、好ましくは0.290～0.310 g/LのMgCl₂6H₂O。
例えば、前記血小板添加剤溶液は、SSP+(Macopharma)またはT-PAS+（TerumoBCT,Inc.)である。

特定の実施形態では、前記多血小板血液組成物は、1 μlあたり少なくとも700 000個の血小板及び60.0～90.0％(v/v)の1つまたは複数の血小板添加剤溶液を含む。

特定の実施形態では、前記多血小板血液組成物は、病原体の不活性化（病原体縮小としても知られている）に供される。全血または血液由来製品の病原体不活性化は当該技術分野で知られており、Intercept Blood System（CERUS、Concord CA)、Mirasol病原体縮小（Terumo BCT、Denver、CO）、またはTheraflex UVC（Macopharma、Tourcoing、FR）を用いて実行できる。

特定の実施形態では、前記多血小板血液組成物は、多血小板血液組成物またはその誘導体が投与される被験者に疾患を引き起こし得る感染性病原体（例えば、細菌、ウイルス及び原生動物を含む微生物）を実質的に含まない。より特定の実施形態では、前記多血小板血液組成物は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、肝炎（例えば、B型肝炎またはC型肝炎）ウイルス、及び梅毒トレポネーマ（即ち、梅毒を引き起こす細菌）を実質的に含まない。

血小板濃縮物は貯蔵の有効期間が短く（例えば、5～7日）、その結果、いつでも輸血用の血小板濃縮物の最小供給を維持するために多くのドナーが必要である。貯蔵の有効期間が短く、血小板濃縮物の需要と供給が変動するため、血液バンクが血小板濃縮物の在庫を管理することは困難である。その結果、提供された血小板濃縮物の3～5％は、輸血に使用できるようになる前に期限切れになり（即ち、ヒトへの輸血には安全と見なされなくなり）、そのため、バイオハザード廃棄物として廃棄される。血小板濃縮物の貯蔵の有効期間は、室温での保存中に病原体が増殖するリスクが高まるため、短く保たれる。これに加えて、血小板機能は、貯蔵中に低下する。これは血小板貯蔵病変としても知られる。血小板濃縮物は高価な製品であるため、期限切れの血小板濃縮物を廃棄するための経済的コストは高い。本発明者らは、期限切れの血小板濃縮物を用いて、本明細書で教示される方法によって血小板放出物を調製できることを見出した。特定の実施形態では、本明細書で教示される方法は、任意選択で、前記多血小板血液組成物中に存在する血小板を溶解し、血小板溶解物を得ることを含む。そのような溶解工程が存在すれば、本明細書で教示される方法は、血小板溶解物を調製するための方法となり、血小板溶解物は、前記血小板放出物から得られる。本発明者らはさらに、前記血小板放出物または血小板溶解物が、細胞培養、硬組織及び軟組織損傷、炎症性疾患、骨疾患、変性関節疾患、変性椎間板疾患、皮膚状態、円形脱毛症、子宮内膜症、膣萎縮、眼表面疾患、手根チューブ症候群、神経変性障害、末梢動脈疾患、及び疼痛の治療、ならびに皮膚及び／または毛髪の外観の改善に使用できることを見出した。

特定の実施形態では、前記血小板濃縮物は、期限切れの血小板濃縮物である。

血小板濃縮物に関して本明細書で使用される「期限切れ」という用語は、もはや輸血に適しているとは見なされない血小板濃縮物を意味する。血小板濃縮物の期限切れの時期及び/または期限切れの条件は、管轄区域によって異なる場合がある。例えば、前記血小板濃縮物は、提供後少なくとも3日、提供後少なくとも4日、提供後少なくとも5日、提供後少なくとも6日、提供後少なくとも7日、提供後少なくとも8日、提供後少なくとも9日、提供後少なくとも10日、提供後少なくとも11日、提供後少なくとも12日、提供後少なくとも13日、提供後少なくとも14日、または提供後少なくとも15日、好ましくは提供後少なくとも10日で期限切れと見なされ得る。

特定の実施形態では、前記血小板濃縮物は、該血小板濃縮物が前記被験者から得られて少なくとも5日、好ましくは少なくとも10日で使用される。

本明細書で使用される「水溶性カルシウム塩」という用語は、好ましくは大気圧１気圧、温度20.0℃、及びpH7.4で測定した場合に、水100 mlあたり少なくとも0.010 gの溶解度を有するカルシウム塩またはカルシウム複合体を指す。好ましくは、前記水は蒸留水である。水溶性カルシウム塩の非限定的な例は、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、塩素酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、及びグルコン酸カルシウムである。カルシウム錯体の非限定的な例には、カルシウムエチレンジアミン四酢酸(EDTA)及びカルシウムペンテト酸またはジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)等が含まれる。

特定の実施形態では、1つまたは複数の水溶性カルシウム塩は、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、塩素酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、及びグルコン酸カルシウム、またはそれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記水溶性カルシウム塩は、塩化カルシウムである。本明細書で使用される「塩化カルシウム」または「CaCl₂」という用語は、CAS番号10043-52-4の塩化カルシウムを指す。

特定の実施形態では、前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩は、in vivoで非毒性である。より特定の実施形態では、前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩は、臭化カルシウムを含まない。

特定の実施形態では、前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、試料1 mlあたり0.010 μmol～20.0 mol、0.050 μmol～20.0 mol、0.10 μmol～15.0 μmol、0.050 μmol～12.0 μmol、1.0 μmol～12.0 μmol、0.050 μmol～10.0 μmol、0.50 μmol～10.0 μmol、1.0 μmol～10.0 μmol、1.0 μmol～9.0 μmol、1.0 μmol～8.0 μmol、1.0 μmol～7.0 μmol、1.0 μmol～6.0 μmol、2.0 μmol～12.0 μmol、2.0 μmol～10.0 μmol、2.0 μmol～9.0 μmol、0.050 μmol～8.0 μmol、2.0 μmol～8.0 μmol、3.0 μmol～8.0 μmol、2.0 μmol～7.0 μmol、3.0 μmol～7.0 μmol、2.0 μmol～6.0 μmol、または3.0 μmol～6.0 μmol/mlであり、より好ましくは、試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolまたは2.0 μmol～10.0 μmolであり、より好ましくは試料1 mlあたり3.0 μmol～8.0 μmolである。例えば、試料1 mlあたり4.0 μmolまたは5.0 μmolである。前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、典型的には、前記多血小板血液組成物にすでに存在しているものではなく、外因的に添加された1つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量を指す。

特定の実施形態では、前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、0.010 mM～20.0 mM、0.050 mM～20.0 mM、0.10 mM～15.0 mM、0.050 mM～12.0 mM、1.0 mM～12.0 mM、0.050 mM～10.0 mM、0.50 mM～10.0 mM、1.0 mM～10.0 mM、1.0 mM～9.0 mM、1.0 mM～8.0 mM、1.0 mM～7.0 mM、1.0 mM～6.0 mM、2.0 mM～12.0 mM、2.0 mM～10.0 mM、2.0 mM～9.0 mM、0.050 mM～8.0 mM、2.0 mM～8.0 mM、3.0 mM～8.0 mM、2.0 mM～7.0 mM、3.0 mM～7.0 mM、2.0 mM～6.0 mM、または3.0 mM～6.0 mMであり、好ましくは1.0 mM～12.0 mMまたは2.0 mM～10.0 mMであり、より好ましくは3.0 mM～8.0 mMである。例えば、4.0 mMまたは5.0 mMである。

特定の実施形態では、前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩は、多血小板血液組成物に添加される前に、水、好ましくは蒸留水に溶解される。特定の実施形態では、前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩が溶解する水の量が、前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩が添加された多血小板血液組成物の体積の最大5.0％(v/v)、最大4.0％(v/v)、最大3.0％(v/v)、最大2.0％(v/v)、または最大1.0％(v/v)であり、好ましくはそれの最大1.0％(v/v)である。

本明細書で使用される「粒子」という用語は、特定の形状、好ましくは対称で均質な形状を有する小さな物体を指す。粒子形状の非限定的な例には、立方体、球体、円柱、円錐、ピラミッド、プリズム、直方体、及び円環体が含まれ、好ましくは球体である。

特定の実施形態では、前記ガラス粒子は、球、立方体、円柱、円錐、ピラミッド、プリズム、直方体、円環体、またはそれらの組み合わせ、好ましくは球である。

特定の実施形態では、前記ガラス粒子は、0.20 mm～40.0 mm、0.50 mm～35.0 mm、0.50 mm～30.0 mm、0.50 mm～25.0 mm、0.50 mm～20.0 mm、0.50 mm～15.0mm、0.50 mm～10.0 mm、1.0 mm～10.0 mm、1.0 mm～9.0 mm、1.0 mm～8.0 mm、1.0 mm～7.0 mm、1.0 mm～6.0 mm、1.0 mm～5.0 mm、または1.0 mm～4.0 mm、好ましくは2.0 mm～4.0 mmの平均粒子サイズまたは平均直径を有する。好ましい実施形態では、前記ガラス粒子は、1.0 mm～5.0 mm、好ましくは2.0 mm～4.0 mmの平均粒子サイズまたは平均直径を有する。

前記粒子サイズは、特定の粒子の表面積に基づいて計算することができる。これは、面積ベースの粒子サイズとしても知られている。面積ベースの粒子サイズは、特定の粒子と同じ表面積を持つ球の直径に等しくなる。当業者は、粒子が球であれば、粒子サイズが該粒子の直径に等しいであることを理解するであろう。

特定の実施形態では、前記ガラス粒子の最大直径は、最大で4.0 cm、最大で3.50 cm、最大で3.0 cm、最大で2.50 cm、最大で2.0 cm、最大で1.50 cm、最大で1.0 cm、または最大で0.50 cmである。

特定の実施形態では、前記ガラス粒子は、ランダムに採取された少なくとも40個のビーズの集団の平均で正規化された標準偏差が20％未満、好ましくは10％未満である均一なサイズ分布を有する。

「均一なサイズ分布」という用語は、本明細書では均一な物理的大きさを指す。

特定の実施形態では、前記ガラス粒子は、多孔性ではなく、及び／または中空ではない。

特定の実施形態では、前記ガラス粒子は、シリカベースのガラスでできている。例えば、ソーダライムシリカガラス（本明細書ではソーダライムガラスとも呼ばれる）、ボロケイ酸ナトリウムガラス、アルミノケイ酸塩ガラス、酸化鉛ガラスまたは溶融シリカガラス等。

好ましい実施形態では、前記ガラス粒子は、ソーダライムガラス粒子である。本発明者らは、本明細書で教示されるソーダライムガラス粒子を使用する方法における凝固時間は、他種のガラスの凝固時間と比べて短縮され得ることを観察した。

特定の実施形態では、ガラス粒子の量は、試料1 mlあたり0.010 g～1.0 g、0.010 g～0.60 g、0.020 g～0.60 g、0.030 g～0.60 g、0.040 g～0.60 g、0.050 g～0.60 g、0.10 g～0.50 g、0.10 g～0.450 g、0.10 g～0.40 g、0.10 g～0.350 g、0.10 g～0.30 g、0.150 g～0.30 gまたは0.20 g～0.30 gであり、好ましくは試料1 mlあたり0.10 g～0.40 gである。例えば、試料1 mlあたり0.25 gのガラス粒子。

特定の実施形態では、ガラス粒子の量は、前記試料1 mlあたり0.10 g～0.40 gであり、１つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、前記試料1 mlあたり2.0 μmol～10.0 μmolまたは3.0 μmol～8.0 μmol、好ましくは前記試料1 mlあたり3.0 μmol～8.0 μmolである。例えば、ガラス粒子の量は、前記試料1 mlあたり0.250 gであり、１つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、前記試料1 mlあたり5.0 μmolである。１つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量が本明細書に開示される範囲の上限に近いであれば、ガラス粒子の量は、本明細書に開示される範囲の下限に近づくことができる。

さらなる態様は、血小板放出物または血小板溶解物を調製するための、第1収容空間(1’)を有する第1容器(1)を含むシステムを提供する。ここで、前記第1収容空間は、ある量（Q_gｐ）のガラス粒子(3)を保持し、第2容器(2)の第2収容空間(2’)によって保持された多血小板血液組成物の量（Q_bc)を受け取るように構成されていて、好ましくは、前記第1収容空間は、ある量（Q_bc)の多血小板血液組成物を保持する第2容器(2)の第2収容空間(2’)に接続するように構成されている。ここで、比Q_gｐ：Q_bcは、0.010～0.60 g/mlである。

特定の実施形態では、
- (i）前記第1収容空間(1’)は、ある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)をさらに保持し、または、
- (ii)前記第1収容空間(1’)は、第3容器(5)の第3収容空間(5’)によって保持されたある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を受け取るように構成されていて、好ましくは、前記第1収容空間(1’)は、ある量（Q_cc)の１つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持する第3容器(5)の第3収容空間(5’)に接続するように構成されていて、より好ましくは、前記第1空間を含む(1’)は、ある量（Q_cc)の１つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持する第3容器(5)の第3収容空間(5’)の開口部に接続するように構成された第1開口部、好ましくは密封可能な開口部を含む。
ここで、（i）または（ii）のいずれにおいても、比Q_cc：Q_bcは、前記多血小板血液組成物1 mlあたり1.0～12.0 μmolである。

好ましい実施形態では、前記第1収容空間(1’)は、ある量（Q_gｐ）のガラス粒子(3)及びある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持し、好ましくは、前記第1収容空間(1’)は、多血小板血液組成物の1 mlあたり0.10 g～0.40 gのガラス粒子及び多血小板血液組成物の1 mlあたり3.0 μmol～8.0 μmolの1つまたは複数の水溶性カルシウム塩を保持する。

前記第1収容空間(1’)と第2収容空間(2’)及び／または第3収容空間(5’)との間の接続は、当該技術分野で知られている任意の方法で得ることができる。例えば、導管の手段（例えば、本明細書の他の場所に記載されている1つまたは複数のチューブ）、ルアーロックによる接続（例えば、前記第2及び/または第3容器が無針注射器の場合）、貫通可能なストッパーを貫通し、または中空の貫通スパイクでカバーする方法（例えば、前記第2及び/または第3容器が中空針付き注射器の場合）、壊れやすい／分離プラグを使用する方法（例えば、WO8101105またはUS5152755Aに記載されているとおり）、またはそれらの組み合わせによる。そのような組み合わせは、以下のようなチューブであってもよい：その近位端が第1収容空間(1’)における開口部に接続可能であり、その遠位端が、第2収容空間(2’)及び／または第3収容空間(5’)における開口部に接続可能であり、ここで、前記遠位端が、メスのルアーロック構成要素（例えば、前記第2及び/または第3容器が無針注射器の場合）を含み、あるいは、前記遠位端が、貫通可能なストッパーまたはカバーで密封されている（例えば、前記第2及び/または第3容器が中空針付き注射器の場合）。

特定の実施形態では、本明細書で教示されるシステムは、第1容器(1)及び第1チューブを含む。
- 前記第1容器(1)は、第1収容空間(1’)を含む。該第1収容空間(1’)が、ある量（Q_gｐ）のガラス粒子(3)及び１つ以上の水溶性カルシウム塩(4)を保持し、第2容器(2)の第2収容空間(2’)によって保持されたある量（Q_ｂc)の多血小板血液組成物を受け取るように構成されている。ここで、前記第1収容空間が、第2容器(2)の第2収容空間(2’)の開口部に接続するように構成された第1開口部、好ましくは密封可能な開口部を含む。また、
- 前記第1チューブの近位端が、前記第1収容空間(1’)における第1開口部によって保持され、その遠位端が、前記第2収容空間(2’)における開口部に接続するように構成されている。ここで、前記第1チューブが、前記第1収容空間(1’)を前記第2収容空間(2’)と流体連絡（例えば、溶接で）するように配置するように構成されている。
ここで、比Q_gｐ：Q_bcは、前記多血小板血液組成物1 mlあたり0.010～0.60 gであり、かつ比Q_cc：Q_bcは、前記多血小板血液組成物1 mlあたり1.0～12.0 μmolである。

特定の実施形態では、前記第1収容空間(1’)の第1開口部は、第1チューブの近位端を保持するように構成されていて、前記第3収容空間(5’)の開口部は、前記第1チューブの遠位端を保持するように構成されている。

特定の実施形態では、本明細書で教示されるシステムは、第1チューブを含み、その近位端が前記第1空間を含む(1’)の第1開口部によって保持され、その遠位端が第3収容空間(5’)における開口部に接続するか、またはそれによって保持されるように構成されている。ここで、該第1チューブは、好ましくは漏れのない方法で前記第1容器(1)を前記第3容器(5)に接続し、前記第1収容空間(1’)を前記第3収容空間(5’)と流体連絡するように配置するように構成されている。

特定の実施形態では、本明細書で教示されるシステムは、第1容器(1)、第3容器(5)、及び第1チューブを含む。
- 前記第1容器(1)が、第1収容空間(1’)を含む。該第1収容空間(1’)が、第2容器(2)の第2収容空間(2’)によって保持されたある量（Q_bc)の多血小板血液組成物を受け取るように構成されたある量（Q_gｐ）のガラス粒子(3)を保持する。ここで、前記第1収容空間が、第3容器(5)の第3収容空間(5’)の開口部に接続するように構成された第1開口部、好ましくは密封可能な開口部を含む。
- 前記第3容器(5)が、ある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持する第3収容空間(5’)を有する。また、
- 前記第1チューブの近位端が、前記第1収容空間(1’)の第1開口部によって保持されていて、その遠位端が、前記第3収容空間(5’)の開口部によって保持されている。ここで、該第1チューブは、前記第1容器(1)を前記第3容器(5)に、好ましくは漏れのない方法で接続し、前記第1収容空間(1’)を前記第3収容空間(5’)と流体連絡するように配置するように構成されている。
ここで、比Q_gｐ：Q_bcは、前記多血小板血液組成物1 mlあたり0.010～0.60 gであり、かつ比Q_cc：Q_bcは、前記多血小板血液組成物1 mlあたり1.0～12.0 μmolである。

特定の実施形態では、前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と前記第3容器(5)の第3収容空間(5’)との間の流体連絡を、当該技術分野で知られている任意の手段で完全に遮断してもよい。例えば、前記第1収容空間(1’)と前記第3収容空間(5’)との間の前記第1チューブに取り外し可能なクランプ（例えば、Halkay/Roberts（登録商標）の340 TCSチュービングクランプのようなチュービングクランプまたはKocherクランプ）を配置することで、前記第1収容空間(1’)と前記第3収容空間(5’)の間の流体連絡を完全に遮断してもよい。あるいは、前記第1収容空間(1’)と前記第3収容空間(5’)との間に弁、好ましくは、前記第1収容空間(1’)と前記第3収容空間(5’)との間の流体連絡を調節できる壊れやすいカニューレ弁を組み込むことで、前記第1収容空間(1’)と第3収容空間(5’)の間の流体連絡を完全に遮断することができる。この弁を用いて、チューブを開閉することができ、それにより、前記第1収容空間(1’)と前記第3収容空間(5’)との間の流体連絡を可能にし、または防止する。前記第1収容空間(1’)と前記第3収容空間(5’)の間の流体連絡を可逆的に遮断するために用いられる弁は、そのような手段に適した当該技術分野で知られている任意の種類の弁であってもよい。例えば、壊れやすいまたは分離可能なカニューレ弁（例えば、WO8101105またはUS5152755Aに記載されている種類）、活栓、加圧／逃がし弁、及び一方向の弁。壊れやすいまたは分離可能なカニューレ弁は、通常、閉じた状態でチューブに取り付けられる。前記弁が開かれると、前記流体連絡は、前記弁によってそれ以上閉じることができない。

特定の実施形態では、近位端が前記第1収容空間(1’)における第1開口部によって保持され、遠位端が前記第3収容空間(5’)における開口部に接続するか、またはそれによって保持されるように構成された第1チューブは、前記第1収容空間(1’)と前記第3収容空間(5’)との間の流体連絡を可逆的に遮断するための手段を含む。例えば、外部クランプまたは弁、好ましくは、本明細書の他の場所で説明されるような、壊れやすいまたは分離可能なカニューレ弁等。

特定の実施形態では、前記第1収容空間は、前記第1収容空間を、ある量（Q_ｂc)の多血小板血液組成物を保持する前記第2容器(2)の第2収容空間(2’)に接続するように構成された第2開口部、好ましくは密封可能な開口部を含む。前記第1収容空間(1’)における第2開口部と前記第2収容空間(2’)における開口部との間の接続は、本明細書の他の場所に記載されるように、当該技術分野で知られている任意の方法で得ることができる。例えば、前記第1収容空間(1’)の第2開口部は、本明細書の他の場所に記載されるように、チューブ等の導管手段を保持するように構成され得る。

特定の実施形態では、本明細書で教示されるシステムは、近位端が前記第1収容空間(1’)における第2開口部によって保持され、遠位端が前記第2収容空間(2’)における開口部に接続するように構成された第2チューブを含む。ここで、該第2チューブは、好ましくは漏れのない方法で、前記第1容器(1)を前記第2容器(2)に接続し、前記第1収容空間(1’)を前記第2収容空間(2’)と流体連絡するように配置するように構成されている。

特定の実施形態では、前記第1収容空間(1’)は、前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)によって保持されたある量の血小板放出物を第4容器の第4収容空間に放出するように構成されている。ここで、前記第4収容空間は、本明細書で教示されるシステムを用いて調製された血小板放出物を受け取る（例えば、収集する）及び／または保持するように構成されている。好ましくは、前記第1収容空間(1’)は、前記第4容器の第4収容空間に接続するように構成されている。

前記第1収容空間(1’)と前記第4収容空間との間の接続は、本明細書の他の場所に記載されるように、当該技術分野で知られている任意の方法で得ることができる。

特定の実施形態では、前記第1収容空間は、該第1収容空間を第4容器の第4収容空間に接続するように構成された第3開口部、好ましくは密封可能な開口部を含む。ここで、前記第4収容空間は、本明細書で教示されるシステムを用いて調製された血小板放出物を受け取る（例えば、収集する）及び／または保持するように構成されている。前記第1収容空間(1’)における第3開口部と前記第4収容空間における開口部との間の接続は、本明細書の他の場所に記載されるように、当該技術分野で知られている任意の方法で得ることができる。例えば、前記第1収容空間(1’)の第3開口部は、本明細書の他の場所で説明されるようなチューブ等の導管手段を保持するように構成されてもよい。

特定の実施形態では、本明細書で教示されるシステムは、近位端が前記第1収容空間(1’)における第3開口部によって保持され、遠位端が第4容器の第4収容空間の開口部に接続するように構成された第3チューブを含む。ここで、該チューブは、好ましくは漏れのない方法で前記第1容器(1)を前記第4容器と接続し、前記第1収容空間(1’)を前記第4収容空間と流体連絡するように配置するように構成されている。

特定の実施形態では、前記第1収容空間(1’)の第1、第2、及び／または第3開口部は、1つの前記第1収容空間(1’)の同じ開口部を指す。前記第1収容空間の該開口部を、第2(2’)、第3(5’)、及び第4収容空間に連続的に接続してもよい。

その近位端が、それぞれ前記第1収容空間における第1、第2及び第3開口部によって保持されている第1、第2及び第3チューブの遠位端を、以下の方法で、それぞれ第3、第2または第4収容空間における開口部に接続してもよい。例えば、ルアーロック接続によって、または一方の収容空間の開口部を他方の収容空間と流体連絡している中空針で密封する貫通可能なストッパーを貫通することで、第1、第2及び第3チューブの遠位端をそれぞれ第3、第2または第4収容空間における開口部に直接接続すること、あるいは、例えば、チューブが互いに流体連絡するようにチューブを互いに溶接する等の無菌のチューブ接続で、第1、第2、及び第3チューブの遠位端を、その近位端がそれぞれ第3、第2、または第4収容空間における開口部によって保持されたチューブの遠位端と相互接続することである。
無菌溶接装置は、切断及び溶接中の無菌性を維持しながら、少なくとも2つのチューブ端部を接続または切断することを可能にする。特定の実施形態では、無菌溶接で少なくとも2つのチューブ端部を切断する場合、該2つのチューブは通常永久に密封され、切断及び／または溶接によってのみ再び開くことができる。

溶接は、チューブを接続または切断するために使用でき、本明細書で教示されるシステムの外部の環境（及び環境に存在しうる病原体）に収容空間またはその内容物をさらすことなく、本明細書に開示される容器の収容空間間の流体連絡を開閉することを可能にする。

特定の実施形態では、前記第1、第2及び第3チューブは、可撓性チューブである。これらのチューブは、プラスチックまたはシリコーン等の可撓性チューブを調製するための当該技術分野で知られている任意の医療級の材料から作製することができる。特定の実施形態では、前記第1、第2、第3チューブは、熱可塑性エラストマーチューブ等のプラスチックで構成されている。例えば、ポリ塩化ビニル（PVC)、ポリウレタン（PU）、フッ化エチレンプロピレン(FEP）、ポリカーボネート（PC)、高密度PE（HDPE）または低密度PE(LDPE)等のポリエチレン(PE)、またはそれらの組み合わせ、好ましくはPVC、PUまたはそれらの組み合わせ等。該プラスチックを、当該技術分野で知られている任意の方法または手段で滅菌してもよい。例えば、該プラスチックを、エチレンオキシドで処理してもよい。

特定の実施形態では、前記システムは、前記ガラス粒子及び／または破片を前記第1容器の第1収容空間内に保持しながら、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物が、前記第1容器の第1収容空間を出て第4容器の第4収容空間に入るのを可能にするように構成された濾過手段(7)をさらに含む。例えば、最小のガラス粒子の粒子サイズまたは直径よりも小さい直径を有する第3開口部を提供することによって、または、最小のガラス粒子の粒子サイズまたは直径よりも小さい細孔径を有するフィルター（例えば、グリッド）を含む第3開口部を提供することによって、前記第3開口部が、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物が前記第1収容空間を出て、前記第4収容空間に入るのを可能にしながら、前記ガラス粒子を前記第1収容空間内に保持するように構成されている場合、前記第1収容空間の第3開口部は、そのような濾過手段(7)として機能し得る。

特定の実施形態では、前記濾過手段(7)は、前記第1容器の第1収容空間及び前記第4容器の第4収容空間と流体連絡している。特定の実施形態では、前記濾過手段(7)は、前記第1容器の第1収容空間における第3開口部と前記第4容器の第4収容空間との間に配置される。例えば、前記濾過手段(7)は、前記第1容器の第1収容空間における第3開口部と前記第4容器の第4収容空間との間の導管手段（例えば、本明細書の他の場所で説明されるチューブ）に存在し得る。

特定の実施形態では、前記濾過手段(7)は、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5またはそれ以上）のフィルターである。特定の実施形態では、前記濾過手段(7)は、3.0 mm未満の孔径等、最小のガラス粒子の粒子サイズまたは直径よりも小さい孔径を有する少なくとも1つのフィルターを含む。より特定の実施形態では、前記濾過手段(7)は、0.20 μｍ未満の孔径を有する少なくとも1つのフィルターを含む。

好ましい実施形態では、本明細書で教示されるシステムは、以下を含む。
- ある量（Q_gｐ）のガラス粒子(3)を保持し、第2容器(2)の第2収容空間(2’)によって保持されたある量（Q_ｂc)の多血小板血液組成物を受け取るように構成された第1収容空間(1’)を有する第1容器(1)；ここで、該第1収容空間は、以下を含む。
- 第3容器(5)の第3収容空間(5’)の開口部に接続するように構成された第1開口部、好ましくは密封可能な開口部。
- 第2容器(2)の第2収容空間(2’)の開口部に接続するように構成された第2開口部、好ましくは密封可能な開口部。
- 第4容器の第4収容空間の開口部に接続するように構成された第3開口部、好ましくは密封可能な開口部。
- ある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持する第3収容空間(5’)を有する第3容器(5)。
- 近位端が前記第1収容空間(1’)における第1開口部によって保持され、遠位端が前記第3収容空間(5’)における開口部によって保持された第1チューブ；ここで、該チューブが、好ましくは漏れのない方法で、前記第1容器(1)を前記第3容器(5)に接続し、前記第1収容空間(1’)を前記第3収容空間(5’)と流体連絡するように配置するように構成されている。
- 近位端が前記第1収容空間(1’)における第2開口部によって保持され、遠位端が前記第2収容空間(2’)に接続可能である第2チューブ；ここで、該第2チューブが、好ましくは漏れのない方法で、前記第1容器(1)を前記第2容器(2)に接続し、前記第1収容空間(1’)を前記第2収容空間(2’)と流体連絡するように配置するように構成されている。
- 近位端が前記第1収容空間(1’)における第3開口部によって保持され、遠位端が第4容器の第4収容空間に接続可能な第3チューブ；ここで、該チューブが、好ましくは漏れのない方法で、前記第1容器(1)を前記第4容器に接続し、前記第1収容空間(1’)を前記第4収容空間と流体連絡するように配置するように構成されている。また、
- 任意選択で、前記第1収容空間(1’)における第3開口部と前記第4収容空間との間に位置する濾過手段(7)。
ここで、比Q_gｐ：Q_bcは、前記多血小板血液組成物1 mlあたり0.010～0.60 gであり、かつ比Q_cc：Q_bcは、多血小板血液組成物1 mlあたり1.0～12.0 μmolである。

特定の実施形態では、比Q_gｐ：Q_bc（g/ml）は、0.010～1.0、0.010～0.60、0.050～0.60、0.10～0.50、0.10～0.450、0.10～0.40、0.10～0.350、0.10～0.30、0.150～0.30、または0.20～0.30であり、好ましくは0.10～0.40であり、例えば、0.20 g/mlである。

特定の実施形態では、比Q_cc：Q_bc（μmol/ml）は、0.010～20.0、0.050～20.0、0.10～15.0、0.050～12.0、1.0～12.0、0.050～10.0、0.50～10.0、1.0～10.0、1.0～9.0、1.0～8.0、1.0～7.0、1.0～6.0、2.0～10.0、2.0～9.0、0.050～8.0、2.0～8.0、3.0～8.0、2.0～7.0、3.0～7.0、2.0～6.0または3.0～6.0であり、好ましくは1.0～12.0または2.0～10.0であり、より好ましくは3.0～8.0であり、例えば、4.0または5.0 μmol/mlである。

特定の実施形態では、Q_bcは100.0 ml～500.0 mlであり、Q_gｐは20.0 g～100.0 gであり、また、Q_ccは2.0 μmol～10.0 μmolである。

特定の実施形態では、前記第1収容空間は、5.0ml～50 000.0 ml、10.0 ml～10 000.0 ml、10.0 ml～5 000.0 ml、10.0 ml～2 500.0 ml、10.0 ml～1 000.0 ml、50.0 ml～750.0 ml、50.0 ml～500.0 ml、100.0 ml～500.0 ml、150.0 ml～450.0 ml、好ましくは100.0～500.0 mlの容積を有する。

特定の実施形態では、前記第3収容空間の体積は、前記第1収容空間の体積の最大5.0％(v/v)、最大4.0％(v/v)、最大3.0％(v/v)、最大2.0％(v/v)、または最大1.0％(v/v)、好ましくは最大1.0％(v/v)である。

特定の実施形態では、前記第3収容空間は、0.10 ml～25.0 ml、0.50 ml～20.0 ml、1.0 ml～15.0 ml、5.0 ml～15.0 ml、5.0 ml～10.0 ml、好ましくは1.0～15.0 mlの容積を有する。

当業者は、本明細書で教示されるように、被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から血小板放出物または溶解物を調製するための使用及び方法に関する特定の実施形態を理解するであろう。例えば、ガラス粒子及び水溶性カルシウム塩の種類に関して、本明細書で教示されるシステムにも適用可能である。

さらなる態様は、血小板放出物または血小板溶解物を生成するための本明細書で教示されるシステムの使用を提供する。

さらなる態様は、以下の工程を含む、被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から血小板放出物を調製するための方法を提供する。
a)前記試料を、前記試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gのガラス粒子及び前記試料1 mlあたり0.10 μmol～20.0 μmolの1つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させ、それにより混合物を得る工程。
b)工程a)で得られた混合物を凝固させ、それにより凝固物及び血小板放出物を得る工程、及び
c)工程b)で得られた血小板放出物を前記混合物から回収する工程。

本明細書で使用される「接触する」または「接触すること」という用語は、第1成分が（可能であれば）第2成分を結合または調節できるような方法、または第2成分が（可能であれば）第1成分を結合または調節できるような方法で、1つまたは複数の第1成分（1つまたは複数の分子、生物学的実体、または材料等）を1つまたは複数の第2成分（1つまたは複数の分子、生物学的実体、または材料等）と一緒にすることを意味する。そのような調節は、直接的に（即ち、該第1成分と第2成分との間の直接的な相互作用の方法で）、または間接的に（例えば、該第1成分が、1つまたは複数のさらなる成分と相互作用または調節する場合、そのうちの1つまたは複数が、該第2成分と相互作用または調節する。またはその逆の場合）起こり得る。「接触すること」という用語は、文脈に応じて、「暴露すること」、「インキュベートすること」、「混合すること」、「反応すること」、「処理すること」等と同義であり得る。

特定の実施形態では、前記試料を、該試料1 mlあたり0.010 g～1.0 g、0.010 g～0.60 g、0.050 g～0.60 g、0.10 g～0.50 g、0.10 g～0.450 g、0.10 g～0.40 g、0.10 g～0.350 g、0.10 g～0.30 g、0.150 g～0.30 g、または0.20 g～0.30 gのガラス粒子、好ましくは、該試料1 mlあたり0.10 g～0.40 gのガラス粒子と接触させる。

特定の実施形態では、前記試料を、該試料1 mlあたり0.010 μmol～20.0 μmol、0.050 μmol～20.0 μmol、0.10 μmol～15.0 μmol、0.050 μmol～12.0 μmol、1.0 μmol～12.0 μmol、0.050 μmol～10.0 μmol、0.50 μmol～10.0 μmol、1.0 μmol～10.0 μmol、1.0 μmol～9.0 μmol、1.0 μmol～8.0 μmol、1.0 μmol～7.0 μmol、1.0 μmol～6.0 μmol、2.0 μmol～10.0 μmol、2.0 μmol～9.0 μmol、0.050 μmol～8.0 μmol、2.0 μmol～8.0 μmol、3.0 μmol～8.0 μmol、2.0 μmol～7.0 μmol、3.0 μmol～7.0 μmol、2.0 μmol～6.0 μmol、または3.0 μmol～6.0 μmolの1つまたは複数の水溶性カルシウム塩、好ましくは、該試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolまたは2.0 μmol～10.0 μmolの1つまたは複数の水溶性カルシウム塩、より好ましくは、該試料1 mlあたり3.0 μmol～8.0 μmolの1つまたは複数の水溶性カルシウム塩、例えば、該試料1 mlあたり4.0 μmolまたは5.0 μmolの1つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させる。

特定の実施形態では、前記試料を、0.010 mM～20.0 mM、0.050 mM～20.0 mM、0.10 mM～15.0 mM、0.050 mM～12.0 mM、1.0 mM～12.0 mM、0.050 mM～10.0 mM、0.50 mM～10.0 mM、1.0 mM～10.0 mM、1.0 mM～9.0 mM、1.0 mM～8.0 mM、1.0 mM～7.0 mM、1.0 mM～6.0 mM、2.0 mM～10.0 mM、2.0 mM～9.0 mM、0.050 mM～8.0 mM、2.0 mM～8.0 mM、3.0 mM～8.0 mM、2.0 mM～7.0 mM、3.0 mM～7.0 mM、2.0 mM～6.0 mM、または3.0 mM～6.0 mMの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩、好ましくは、1.0 mM～12.0 mMまたは2.0 mM～10.0 mMの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩、より好ましくは、3.0 mM～8.0 mMの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩、例えば、4.0 mMまたは5.0 mMの1つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させる。

特定の実施形態では、前記試料を、該試料1 mlあたり0.10 g～0.40 gのガラス粒子及び前記試料1 mlあたり3.0 μmol～8.0 μmolの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させる。例えば、前記試料を、該試料1 mlあたり約0.100～0.300 gのガラス粒子、例えば、試料1 mlあたり約0.150～0.250 gのガラス粒子、例えば、試料1 mlあたり約0.200 gのガラス粒子、及び該試料1 mlあたり4.0～6.0 μmol、例えば、約5.0 μmolの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させる。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法の工程a)（即ち、前記試料をガラス粒子及びカルシウム塩と接触させる工程）は、回転子、攪拌機またはシェーカー（例えば、ロッキングシェーカー）等の混合手段を用いて、前記試料、前記ガラス粒子、及び前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩を混合することを含む。

本明細書で使用される「凝固する」または「血餅」という用語は、全血または全血誘導体から完全に収縮した凝固物または血餅が形成される連続的なプロセスを指す。凝固は、内因性または外因性の凝固経路の活性化によって開始させることができる。両方の経路は、凝固因子Xaの産生をもたらす。凝固因子Xaの活性化は、凝固の一般的な経路を開始させ、最終的には凝固物または血餅の形成をもたらす。前記外因性の経路は、通常、組織因子（TF）への応答によって開始される。これは、血管の外面と内面の間にオープンした接続（血管の破損等）がある場合に発生する可能性がある。TFは第VII因子を活性化させ、第VIIa因子を形成する。これにより、一連の反応が引き起こされ、第Xa因子が急速に生成される。一方、前記内因性の経路は、血管内で発生する損傷によって活性化される。該経路は、第XII因子の活性化によって開始される。第XII因子から第XIIa因子への活性化は、血液が負電荷の表面に接触したとき、例えば、非生物学的マトリックスと接触したときにいつでも発生する可能性がある。前記内因性の経路と前記外因性の経路の間で、交差活性化が発生する可能性がある。例えば、第VIIa因子は、第Xa因子を活性化することに加えて、前記内因性の経路の必要な構成要素である第IX因子を活性化する。第Xa因子の産生は、プロトロンビン（第II因子）のトロンビン（第IIa因子）への切断をもたらす。次に、トロンビンは、フィブリノーゲン（第I因子）の不溶性のフィブリンの長くて粘着性のある糸への変換を触媒する。該フィブリン糸は、血小板、血漿、及び任意選択で血球を捕捉するメッシュを形成する。その後、該フィブリンの網目構造は収縮し、元の液体含有物の少なくとも95％を絞り出す。（これは、血餅収縮とも呼ばれるが、）それにより、凝固物または血餅、及び排出された液体が得られる。

本明細書で教示されるように、1つまたは複数の水溶性カルシウム塩と組み合わせてガラス粒子を使用することにより、安定した凝固物が形成され、ガラス粒子ならびに血小板残留物を捕捉する。該血小板は、該凝固物に捕捉され、該ガラス粒子によって安定化されるので、本法、使用または本明細書で教示される方法で得られた血小板放出物または血小板溶解物は、使用前に濾過をほとんどまたは全く必要としない。

特定の実施形態では、前記ガラス粒子及び1つまたは複数の水溶性カルシウム塩は、本明細書で教示される使用または方法（即ち、FXII等の多血小板血液組成物にすでに存在する潜在的な凝固活性化因子の添加）において使用される唯一の凝固活性剤である。重要なことに、実施形態では、他の血液凝固活性化因子を添加しない。

本明細書で使用される「凝固活性化因子」という用語は、前記内因性及び／または前記外因性の凝固経路によって凝固を開始させることができる物質を指す。凝固活性化因子の非限定的な例には、外因性のヒト精製または組換えトロンビンまたは（凍結乾燥）ウシトロンビン等のトロンビン、外因性ウサギ組織因子または精製または組換えヒト組織因子等の組織因子、アミノリン脂質と組み合わせた合成リン脂質、ラッセルクサリヘビ毒、エカリン、テキスタイル、エラギン酸、カオリン及び他の粘土鉱物が含まれる。

特定の実施形態では、本明細書で教示される使用または方法は、本明細書で定義される1つまたは複数の凝固活性化因子の使用を含まない。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法の工程b)（即ち、前記混合物を凝固させる工程）において、前記混合物を、1時間～20時間、1～18時間、1～16時間、1～14時間、1～12時間、1～10時間、1～8時間、1～6時間、1～4時間、好ましくは2～6時間、より好ましくは2～4時間凝固させる。例えば、前記混合物を3時間凝固させる。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法の工程b)を、5℃～42℃、15℃～40℃、20℃～40℃、15℃～25℃、20～25℃、好ましくは15℃～40℃の温度で実施する。例えば、本明細書で教示される方法の工程b)を、室温または約37℃で実施する。前記多血小板血液組成物をガラス粒子及び1つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させ、工程a)で得られた混合物を凝固させ、それにより凝固物及び血小板放出物を得た後、該血小板放出物のさらなる使用における該ガラス粒子の干渉を防ぐために、好ましくは、（例えば、凝固物に囲まれている）前記ガラス粒子を血小板放出物の全部または一部から除去する。従って、特定の実施形態では、血小板放出物の少なくとも一部、好ましくは実質的に全て（例えば、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％、好ましくは少なくとも95％）を試料から回収し、即ち、（例えば、凝固物に囲まれている）ガラス粒子との物理的接触から除去する。

特定の実施形態では、前記工程c)において、工程b)で得られた前記血小板放出物を、前記放出物を含む液相を単に収集することによって、または遠心分離によって、該混合物から回収する。

特定の実施形態では、前記工程c)において、工程b)で得られた前記血小板放出物を、前記混合物を少なくとも１つのフィルターに通過させることによって、該混合物から回収する。

本明細書で使用される「フィルター」という用語は、その通常の意味を有する。即ち、浮遊不純物または固体粒子を除去するため、及び／または固体を回収するために液体が通過する多孔質物質、装置または膜を指す。

特定の実施形態では、前記フィルターは、微孔性ニトロセルロース、ポリウレタン及び／またはポリエステルフィルム等の膜フィルターである。

「細孔径」という用語は、膜表面またはフィルター上の１つまたは複数の細孔の平均サイズを指す。前記細孔径は、特定のサイズの粒子を濾過して取り除くフィルターの能力にも関係している。例えば、孔径0.50 μmのフィルターは、直径0.50 μm以上の粒子を濾過ストリームから濾過する。細孔径は、走査型電子顕微鏡法、ポロシメトリー、相関分光法、及び／または単一粒子追跡を用いる目視検査等の細孔径を測定するために当業者によって知られている任意の方法によって測定することができる。細孔は、円筒形またはスポンジ状の細孔であり得る。

特定の実施形態では、前記フィルターは、少なくとも１つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上）の細孔を有する。

特定の実施形態では、工程c)において、工程b)で得られた血小板放出物を、前記混合物を少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上）のフィルターに通過させることによって、該混合物から回収する。ここで、前記少なくとも1つのフィルターは、最小のガラス粒子の粒子サイズまたは直径よりも小さい細孔径を有する。前記フィルターは、血小板放出物または血小板溶解物を濾過するための当該技術分野で知られている任意のフィルターであり得る。例えば、MZPシリーズカプセルのMZP（ZenPure、Hitma)、Sartopure
（登録商標） GF Plusフィルター（Sartorius stedim biotech）、及びSartopure
（登録商標）PP3 フィルター（Sartorius stedim biotech）等。

特定の実施形態では、前記工程c)において、工程b)で得られた前記血小板放出物を、前記混合物を少なくとも１つのフィルター（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上）に通過させることによって、該混合物から回収する。ここで、前記少なくとも1つのフィルターは、最小のガラス粒子の粒子サイズまたは直径よりも小さく、0.2 μｍ未満の細孔径を有する。

特定の実施形態では、前記血小板放出物を、当業者に知られている任意の方法で前記フィルターへ通過させることができる。例えば、重力、真空、または圧力で前記血小板放出物を前記フィルターへ通過させてもよい。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物の調製方法は、前記多血小板血液組成物中に存在する血小板を溶解する工程を含まない。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法は、任意選択で、前記多血小板血液組成物中に存在する血小板を溶解し、血小板溶解物を得る工程を含む。そのような溶解工程が存在すれば、本明細書で教示される方法は、血小板溶解物の調製方法になり、また、血小板溶解物は、そのような得られた凝固物及び／または血小板放出物から得られることになる。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法は、任意選択で、前記得られた凝固物に存在する血小板及び／または工程b)で得られた血小板放出物を溶解し、それにより血小板溶解物を得る工程を含む。血小板溶解物は、血小板を溶解するための当該技術分野で知られている任意の方法で得ることができる。それらの方法には、凍結融解サイクル、超音波処理、化学的溶解（例えば、Triton X-100を使用）、機械的破壊、及び液体または高圧均質化が含まれる。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法は、前記凝固物及び／または工程b)で得られた血小板放出物を凍結／融解し、それにより血小板溶解物を得る工程をさらに少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上）含む。前記凝固物及び／または工程b)で得られた血小板放出物の凍結／融解は、血小板を破壊するために多血小板血液組成物を凍結／融解するための当該技術分野で知られている任意の方法によって実施することができる。例えば、Feketeらが、「全血由来のプールされた血小板濃縮物に由来する血小板溶解物、及びヒト骨髄間葉系間質細胞の分離と増殖のためのアフェレーシス由来血小板濃縮物:製造方法、内容物、及び活性成分の識別」、 Cytotherapy 2012; 14(5)：540-54）に記載されているような方法。当業者は、凍結融解サイクルの数を3回以上に増やすことは、血小板溶解物中の増殖因子の濃度をさらに増加させない可能性があることを理解するであろう（Strandbergら、「血小板溶解物からの増殖因子の凍結融解調製の標準化」、Transfusion、2017; 57(4)：1058-65）。さらに、凍結融解サイクルは、しばしば時間がかかり、血小板溶解物を含む容器を損傷する可能性がある。それを考慮して、本明細書で教示される方法は、凍結／融解の工程を、好ましくは最大で3つ、最大で2つ、または最大で1つ、好ましくは最大で1つ含む。

特定の実施形態では、工程a)で得られた前記混合物を、-20℃以下、-25℃以下、-30℃以下、-35℃以下、-40℃以下、-45℃以下、-50℃以下、-55℃以下、-60℃以下、-65℃以下、-70℃以下、-75℃以下、-80℃以下、-100℃以下、-150℃以下、-200℃以下、好ましくは-80℃以下で凍結する。例えば、工程a)で得られた前記混合物を、-80℃の温度または-196℃～210℃の温度で（例えば、液体窒素中で）凍結する。

特定の実施形態では、工程a)で得られた前記混合物を、少なくとも0.5時間、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少なくとも10時間、少なくとも12時間、少なくとも14時間、少なくとも16時間、少なくとも18時間、少なくとも20時間、少なくとも22時間、少なくとも24時間、少なくとも26時間、少なくとも28時間、または少なくとも30時間、好ましくは少なくとも24時間凍結する。例えば、工程a)で得られた前記混合物を24時間凍結する。

特定の実施形態では、工程a)で得られた前記混合物を、少なくとも3℃、少なくとも4℃、少なくとも5℃、少なくとも10℃、少なくとも15℃、少なくとも20℃、少なくとも25℃、少なくとも30℃、少なくとも35℃、少なくとも36℃、または少なくとも37℃の温度で凍結した後に融解する。例えば、工程a)で得られた前記混合物を、4℃（冷蔵庫等）、室温、または37℃（温水浴等）で融解してもよい。

特定の実施形態では、前記少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上）の凍結／融解の工程を工程c)の前に実行する。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物の調製方法は、工程c)で回収された血小板放出物を保存する工程を含む。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物の調製方法は、前記血小板放出物または血小板溶解物を凍結乾燥する工程を含む。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物または溶解物の調製方法は、積極的に非ヒト哺乳動物のポリペプチド、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物または核酸を、前記多血小板組成物、前記ガラス粒子、前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩、前記血小板放出物及び/または血小板溶解物に添加する工程を含まない。例えば、本明細書で教示される血小板放出物または溶解物の調製方法は、積極的にウシまたはブタのヘパリン等の非ヒト哺乳動物に由来するヘパリンを前記多血小板組成物、前記ガラス粒子、前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩、前記血小板放出物及び/または血小板溶解物に添加する工程を含まない。

現在既存の血小板放出物または溶解物の調製方法は、閉鎖系で実施されておらず、血小板放出物または溶解物は周囲の病原体で汚染されるリスクが高まる。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の調製方法は、無菌条件下で実施され、本質的に閉鎖系で実施される。その結果、本明細書で教示される方法で得られた血小板放出物または血小板溶解物は、周囲の病原体（即ち、本明細書で教示される方法を使用し始める前に、前記多血小板血液組成物にまだ存在しなかった病原体）を実質的に含まない。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物の調製方法は、本明細書で教示される血小板放出物を調製するためのシステムを用いて実施される。

好ましい実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物の調製方法は、以下の工程を含む：
- 第1容器(1)の第1収容空間(1’)及び第2容器(2)の第2収容空間(2’)を流体連絡に配置する工程；ここで、前記第1収容空間(1’)は、(i)第2容器(2)の第2収容空間(2’)によって保持されたある量（Q_bc)の多血小板血液組成物を受け取るように構成されていて；（ii）ある量（Q_gp）のガラス粒子(3)及びある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持している。ここで、前記第2収容空間(2’)は、ある量（Q_ｂc)の多血小板血液組成物を保持している。
- 前記多血小板血液組成物が、前記第2収容空間(2’)から前記第1収容空間(1’)に流れるようにする工程；
- 任意選択で、前記第2収容空間(2’)と前記第1収容空間(1’)の間の流体連絡を遮断する工程；
- 前記多血小板血液組成物、前記ガラス粒子(3)、及び前記1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を混合し、それにより混合物を得る工程。
- 得られた該混合物を凝固させ、それにより凝固物及び血小板放出物を得る工程；
- 前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)及び第4容器の第4収容空間を流体連絡に配置する工程；ここで、前記第4収容空間は、前記システムを用いて調製された血小板放出物を受け取る及び／または保持するように構成されている。
- 前記混合物から、工程b)で得られた血小板放出物を回収する工程；及び、
- 任意選択で、前記第4収容空間と前記第1収容空間(1’)の間の流体連絡を遮断する工程。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物の調製方法は、以下の工程を含む：
- -第1容器(1)の第1収容空間(1’)を、第2容器(2)の第2収容空間(2’)と流体連絡するように配置する工程；ここで、前記第2収容空間(2’)は、ある量（Q_bc)の多血小板血液組成物を保持している；ここで、前記第1収容空間(1’)は、（ｉ）第2容器(2)の第2収容空間(2’)に含まれるある量（Q_bc)の多血小板血液組成物を受け取るように構成されていて；（ii）ある量（Q_gp）のガラス粒子(3)を保持し；また、(iii)第3容器(5)の第3収容空間(5’)の開口部に接続するように構成された第1開口部を含む。ここで、前記第3収容空間(5’)は、ある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を含む；
- 前記多血小板血液組成物が、前記第2収容空間(2’)から前記第1収容空間(1’)に流れることを可能にする工程；
- 任意選択で、前記第1収容空間(1’)と前記第2収容空間(2’)の間の流体連絡を遮断する工程；
- ある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持する前記第3容器(5)の第3収容空間(5’)を、前記第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置し、該1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)が、前記第3収容空間(5’)から前記第1収容空間(1’)に流れることを可能にし；また任意選択で、前記第3収容空間(5’)と前記第1収容空間(1’)の間の流体連絡を遮断する工程。
- 前記多血小板血液組成物、前記ガラス粒子、及び前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩を混合し、それにより混合物を得る工程。
- 得られた前記混合物を凝固させ、それにより凝固物及び血小板放出物を得る工程。
- 前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)及び第4容器の第4収容空間を流体連絡に配置する工程。
- 前記混合物から、工程b)で得られた血小板放出物を回収する工程；及び
- 任意選択で、前記第4収容空間と前記第1収容空間(1’)の間の流体連絡を遮断する工程。

特定の実施形態では、前記第2容器(2)の第2収容空間(2’)を前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置すること、前記第3容器(5)の第3収容空間(5’)を前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置すること、及び／または前記第4容器の第4収容空間を前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置することは、当該技術分野で知られているような無菌のチューブ接続によって行われる。

このように、本明細書に開示される方法及びシステムは、血小板放出物または血小板溶解物を調製するための完全に無菌の閉鎖系を提供する。

特定の実施形態では、例えば、前記第3容器が中空針を含む注射器であれば、ある量（Q_cc)の１つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を前記第1容器に注入して、前記第3容器(5)の第3収容空間(5’)を前記第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置してもよい。

特定の実施形態では、前記第2容器(2)の第2収容空間(2’)を前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置すること、及び／または前記第1収容空間(1’)と前記第2収容空間(2’)との間の流体連絡を遮断することは、溶接によって実施してもよい。例えば、当該技術分野で知られているように、前記第2容器(2)の第2収容空間(2’)を前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置するため、該第1収容空間(1’)と流体連絡しているチューブを、該第2収容空間(2’)と流体連絡しているチューブに溶接してもよい。

同様に、特定の実施形態では、前記第3容器(3)の第3収容空間(3’)を前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置することは、溶接によって実施してもよい。例えば、前記第3容器(3)の第3収容空間(3’)を、前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置するために、該第3収容空間(3’)と流体連絡しているチューブを、該第1収容空間(1’)と流体連絡しているチューブに溶接してもよい。

特定の実施形態では、前記第4容器の第4収容空間を前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置すること、及び／または前記第1収容空間(1’)と前記第4収容空間との間の流体連絡を遮断することは、溶接によって実施してもよい。例えば、当該技術分野で知られているように、前記第4容器の第4収容空間を前記第1容器(1)の第1収容空間(1’)と流体連絡するように配置するために、該第1収容空間(1’)と流体連絡するチューブを、該第4収容空間(2’)と流体連絡するチューブに溶接してもよい。

特定の実施形態では、前記溶接は、滅菌チューブ溶接機を使用して実施される。例えば、Terumo^TMのTSCD（登録商標）IIまたはTSCD-Q（登録商標）滅菌チューブ溶接機。当業者は、本明細書で教示される血小板放出物を調製するための使用及びシステムに関する特定の実施形態が、本明細書で教示される多血小板血液組成物の試料から血小板放出物を調製する方法にも適用可能であり、またその逆もまた同様であることを理解するであろう。さらなる態様は、本明細書で教示される方法で得られた血小板放出物を提供する。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法で得られた血小板放出物は、凝固因子、低分子、エネルギー等価物、ケモカイン、サイトカイン、接着分子、ホルモン、免疫分子及び増殖調節因子（または増殖因子）、細胞***、アポトーシス及び/または血管新生、及び/または付着因子を含む。

本明細書で使用される「付着因子」という用語は、付着能力を有し、足場依存性細胞と細胞培養フラスコ等の基質との間の細胞-基質相互作用を増強させる構造タンパク質またはタンパク質様物質を指す。付着因子の非限定的な例には、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンウィルブランド因子、グリコカリシン及びsCD62Pが含まれる。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法で得られたた血小板放出物は、血管内皮増殖因子（VEGＦ）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子-ベータ（TGF-ベータ）、インスリン様増殖因子（IGF）、上皮増殖因子（EGF）、血小板因子4及びアンギオポエチンからなる群から選択される1つまたは複数の増殖因子を含む。前記血小板放出物中のこれらの増殖因子の有無は、当該技術分野で知られている任意の方法で測定できる。例えば、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)、ウエスタンブロット）及びプロテオミクスアッセイ等。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法で得られた血小板放出物は、セロトニン、アドレナリン、ヒスタミン、トロンボキサン、プロスタグランジン、セラミド及びスフィンゴ脂質からなる群から選択される１つまたは複数のホルモンを含む。

さらなる態様は、本明細書で教示される方法で得られた血小板溶解物を提供する。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法で得られた血小板放出物または血小板溶解物は、好ましくは波長680 nmで測定された場合、蒸留水の透過率の少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、 または少なくとも95％の透過率を有する。

特定の実施形態では、本明細書で教示される方法で得られた血小板放出物または血小板溶解物は、好ましくは波長680 nmで測定された場合、蒸留水の透過率の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％、好ましくは少なくとも90％の透過率を有する。ここで、本明細書で教示される方法は、血小板放出物または血小板溶解物を最大で0.2 μmの孔径を有するフィルターに通過させる工程を少なくとも1つ含む。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物は、最大で1.5 mM、最大で1.4 mM、最大で1.3 mM、最大で1.2 mM、最大で1.1 mM、最大で1 mM、最大で0.9 mM、最大で0.8 mM、最大で0.7 mM、最大で0.6 mM、最大で0.5 mM、最大で0.4 mM、最大で0.35 mM、最大で0.34 mM、最大で0.33 mM、最大で0.32 mM、最大で0.31 mM、最大で0.3 mM、最大で0.29 mM、最大で0.28 mM、最大で0.27 mM、最大で0.26 mM、または最大で0.25 mM、好ましくは最大で0.35 mMの凝固後に、Ca²⁺残留濃度を含む。前記血小板放出物または血小板溶解物中のCa²⁺（即ち、カルシウムイオン）濃度は、Ca²⁺イオンを測定するための当該技術分野で知られている任意の方法で測定できる。例えば、内蔵のイオン選択性電極を用いる血液ガス分析等。

特定の実施形態では、前記血小板放出物または血小板溶解物が、ヒトの多血小板血液組成物から得られた場合、本明細書で教示されるように、該血小板放出物または血小板溶解物は、非ヒト哺乳動物に由来するポリペプチド、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物（多糖類等）または核酸を実質的に一切含まない。 非ヒト哺乳動物に由来するポリペプチド、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物（多糖類等）または核酸に関して本明細書で使用される場合の「実質的に含まない」という用語は、非ヒト哺乳動物のポリペプチド、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、または核酸が能動的に添加されていない（即ち、本質的にそこに存在しない）、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物を指す。例えば、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物は、ウシまたはブタのヘパリン等の非ヒト哺乳動物に由来するヘパリンを実質的に含まない。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物は、医薬組成物または美容組成物に含まれてもよい。

特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物は、液体、半固体、または固体である。本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の固体形態は、該血小板放出物または血小板溶解物を凍結乾燥して得ることができる。

さらなる態様は、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物、及び任意選択で1つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

さらなる態様は、本明細書で教示されるような血小板放出物または血小板溶解物、及び任意選択で１つまたは複数の美容上許容される担体を含む美容組成物を提供する。

さらなる態様は、多血小板血液組成物、該多血小板血液組成物中に存在するCa²⁺イオンの他0.10 mM～20.0 mMのCa²⁺イオン、及び前記多血小板血液組成物1 mlあたり0.010 g～0.60 gのガラス粒子を含む組成物を提供する。

特定の実施形態では、本明細書で教示される組成物は、ホルモン、増殖因子、及び／または付着因子を含む。これらのホルモン、増殖因子、及び/または付着因子は、通常、多血小板血液組成物に存在する血小板から放出される。

特定の実施形態では、本明細書で教示される組成物は、血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子-ベータ（TGF-ベータ）、インスリン様増殖因子（IGF）上皮増殖因子（EGF）、血小板第4因子、及びアンジオポエチンからなる群から選択される１つまたは複数の増殖因子を含む。前記組成物におけるこれらの増殖因子の有無は、当該技術分野で知られている任意の方法で測定できる。例えば、イムノアッセイ（例えば、酵素免疫測定法（ELISA)、ウエスタンブロット）及びプロテオミクスアッセイ等。

特定の実施形態では、前記組成物は、容器に、好ましくは医療級の容器に含まれる。適切な容器の非限定的な例には、医療級の移送バッグ、フラスコまたはボトルが含まれる。

従って、本明細書で教示される組成物を含む容器も本明細書で提供される。

特定の実施形態では、前記組成物または該組成物を含む容器は、-210℃～25℃の温度で貯蔵される。例えば、該組成物または容器を、-196℃～210℃までの温度（例えば、液体窒素中）、-80℃の温度（例えば、冷凍庫内）、-20℃の温度（例えば、冷凍庫内）、4℃の温度（例えば、冷蔵庫内）、または室温で貯蔵してもよい。該組成物または容器を室温で貯蔵する場合、貯蔵の前に該組成物を凍結乾燥することが好ましい。該組成物を1年以上（例えば、2年）までの期間で貯蔵してもよい。

さらなる態様は、前記血小板放出物、前記血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む、医薬品として使用するための医薬組成物を提供する。

前記血小板放出物、前記血小板溶解物、または本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物を含む医薬組成物を、リウマチ科、整形外科、皮膚科、歯科、口腔病学、眼科、婦人科、内分泌科、形成外科等の専門分野を含む多くの医療分野で疾患や障害を治療するために使用してもよい。そのような疾患または障害の非限定的な例には、創傷（例えば、慢性または急性の創傷）、硬組織（例えば、骨）及び軟組織損傷、炎症性疾患、骨疾患、骨壊死、眼表面疾患、神経変性障害、末梢動脈疾患、変形性関節症、椎間板変性症、回転子カフ損傷、ハムストリング損傷、転子滑液包炎症候群、関節形成術、手根チューブ症候群、上顆炎、足底筋膜炎、腱障害、白斑、脱毛症、メリスマ、静脈脚潰瘍、やけど、（にきび）瘢痕、歯科インプラント、歯槽裂、歯内治療、顎顔面外科手術、緑内障合併症、神経栄養性角膜潰瘍、重度のドライアイ症候群、苔癬硬化症、子宮内膜疾患、膣萎縮、糖尿病性潰瘍及び術後感染症、腫れ及び疼痛が含まれる。

さらなる態様は、有効量の前記血小板放出物、前記血小板溶解物、または該血小板放出物または血小板溶解物を含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、硬組織及び軟組織損傷、炎症性疾患（例えば、腱炎、歯周炎、足底筋膜炎、転子滑液包炎及び上顆）、骨疾患（例えば、骨壊死）、変性関節疾患（例えば、変形性関節症）、変性椎間板疾患（例えば、椎間板変性症）、皮膚の病状（例えば、硬化性苔癬、白斑や肝斑等の皮膚の色素沈着）、円形脱毛症、子宮内膜症、膣萎縮、眼表面疾患（例えば、重度のドライアイ症候群、ドライアイ等の緑内障の合併症）、手根トンネル症候群、神経変性障害（例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病）、末梢動脈疾患及び疼痛（例えば、術後痛、根治的痛及び腰痛（LBP）、膝痛、足首痛、股関節痛、及び肩痛）の治療に使用するための前記血小板放出物、前記血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む医薬組成物を提供する。

さらなる態様は、有効量の前記血小板放出物、前記血小板溶解物、または本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物を含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、硬組織及び軟組織損傷、炎症性疾患（例えば、腱炎、歯周炎、足底筋膜炎、転子滑液包炎及び上顆）、骨疾患（例えば、骨壊死）、変性関節疾患（例えば、変形性関節症）、変性椎間板疾患（例えば、椎間板変性症）、皮膚状態（例えば、苔癬硬化症、白斑や肝斑等の皮膚色素沈着疾患）、脱毛症、子宮内膜疾患、膣萎縮、眼表面疾患（例えば、重度のドライアイ症候群、ドライアイ等の緑内障合併症）、手根トンネル症候群、神経変性障害（例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病）、末梢動脈疾患及び疼痛（例えば、術後痛、根治的痛及び腰痛（LBP）、膝痛、足首痛、股関節痛及び肩痛）を治療するための方法を提供する。

「治療する」または「治療」という用語は、すでに発症している硬組織及び軟部組織の損傷、炎症性疾患、骨疾患、変形性関節症、椎間板変性症、皮膚状態、円形脱毛症、子宮内膜疾患、膣萎縮、眼表面疾患、手根チューブ症候群、神経変性医学的障害、末梢動脈疾患及び疼痛の治療等、すでに発症している疾患または状態の治療的な処理と、硬組織及び軟組織の損傷、炎症性疾患、骨疾患、変形性関節症、椎間板変性症、皮膚状態、円形脱毛症、子宮内膜疾患、膣萎縮、眼表面疾患、手根チューブ症候群、神経変性医学的障害、末梢動脈疾患及び疼痛の発生及び進行を防ぐような、望ましくない苦痛の発生の可能性を防止または軽減するための、予防的または予防的措置の両方を含む。有益なまたは望ましい臨床結果として、1つまたは複数の症状または1つまたは複数の生物学的マーカーの緩和、疾病の程度の低減、疾病の状態の安定化（即ち、悪化しないこと）、疾病の進行の遅延、疾病の状態の改善または緩和等が含まれ得るが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比べて、生存期間の延長を意味する場合がある。

本明細書で教示される血小板放出物または溶解物の治療的使用に関して本明細書で教示される「有効量」という用語は、被験者の生物学的または医学的反応を誘発し（「治療上有効量」）、及び/または外科医、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求めるように、被験者における障害の発症を阻害し、または遅延させる（治療される疾患または状態の症状の緩和が含まれ得る）（「予防的に有効量」）本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物、または本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物を含む医薬組成物の量を指す。本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物、または本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物を含む医薬組成物の治療的及び／または予防的に有効量の決定方法は、当該技術分野で知られている。

硬組織及び軟組織の損傷の非限定的な例には、潰瘍（例えば、神経栄養性角膜潰瘍、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍、褥瘡及び裂肛）、外科的創傷、火傷及び瘢痕が含まれる。前記血小板放出物、血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む医薬組成物は、骨等の硬組織ならびに皮膚等の軟組織の治癒に使用することができるため、前記血小板放出物、血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む医薬組成物は、回転子カフ損傷、ハムストリング損傷、歯科インプラント、歯槽裂修復、歯内療法、顎顔面外科手術、関節形成術、眼瞼形成術、顔面脂肪充填に起因する組織損傷の治癒に使用してもよい。さらなる態様は、前記血小板放出物、血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む美容組成物の、皮膚及び／または毛髪の外観を改善するための使用を提供する。

特定の実施形態では、皮膚を若返らせ、皮膚及び／または毛髪の外観を改善するための、前記血小板放出物、血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む美容組成物の使用として、しわ（顔のしわ等）や傷跡を減らし、肌のハリと弾力性を高め、肌の質感、肌の色合い、色を改善し、及び/または 髪の成長、髪の毛の数、髪の太さ、および/または髪の周期の成長段階の増すことが含まれる。

特定の実施形態では、皮膚及び／または毛髪の外観を改善するための、前記血小板放出物、血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む美容組成物の使用として、皮膚にある量の前記血小板放出物、血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む美容組成物を局所的に塗布し、または、好ましくはマイクロニードルで、皮膚の表皮、真皮または皮下組織にある量の本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物を注入することが含まれる。

特定の実施形態では、皮膚及び／または毛髪の外観を改善するための、前記血小板放出物、血小板溶解物、または本明細書で教示される該血小板放出物または血小板溶解物を含む美容組成物の使用は、治療方法ではない。

本発明者らは、本明細書で教示される方法が、増殖培地に添加されたときに沈殿物の形成をもたらさない血小板放出物または血小板溶解物を調製することを可能にすることを見出した。

従って、さらなる態様は、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の、in vitroでの細胞培養または組織培養における使用を提供する。

さらなる態様は、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の、in vitroでの細胞または組織を維持するため、及び／またはin vitroでの細胞増殖を改善するための使用を提供する。

特定の実施形態では、細胞の増殖培地における本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の使用は、細胞の増殖培地に同量の血清、特にFBSを添加した場合の細胞増殖と比べて、細胞増殖を約2倍～約5倍に改善することがある。

さらなる態様は、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の、増殖培地中のFBS等の血清の代替物としての使用を提供する。特定の実施形態では、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の、in vitro細胞培養または組織培養における使用、またはin vitroでの細胞または組織を維持するため、及び／またはin vitroでの細胞増殖を改善するための使用は、有効量の本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物を該細胞の増殖培地に添加することを含む。

同様に、さらなる態様は、有効量の本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物を細胞の増殖培地に添加することを含む、in vitroでの細胞または組織を維持するため、またはin vitroでの細胞増殖を改善するためのin vitroでの方法を提供する。

本明細書で教示される血小板放出物または溶解物のin vitroでの使用に関して本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望のin vitro生物学的応答を誘発する、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の量を指す。in vitroでの細胞及び／または組織培養における、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の有効量を決定するための方法は、当該技術分野で知られている。

本明細書で使用される「増殖培地」または「培養培地」という用語は、細胞または組織の増殖を補助するように設計された固体、液体、または半固体を指す。増殖培地は、典型的には、主要栄養素（例えば、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウムまたは硫黄）、微量栄養素（例えば、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン）、ビタミン、アミノ酸、1つまたは複数の糖（例えば、グルコース）、無機塩及び/またはタンパク質（例えば、トランスフェリン）を含む。増殖培地は、当該技術分野で周知であり、培養される細胞または組織の種類、ならびに培養の目的（例えば、分化、増殖または維持）によって変化し得る。増殖培地の非限定的な例には、イーグル最小限必須培地（MEM）、ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、アルファ改良最小限必須培地（アルファ-MEM）、基礎必須培地（BME）、イスコーブ改良ダルベッコ培地（IMDM）、BGJb培地、F-12栄養混合物（Ham）、リーボビッツL-15、DMEM/F-12、改良された必須イーグル培地（EMEM）、RPMI-1640、培地199、Waymouth MB 752/1またはWilliams培地E、間葉系幹細胞基礎培地、及びそれらの改良されたもの及び/または組み合わせたものが含まれる。

特定の実施形態では、前記増殖培地は、CaCl₂、MgSO₄、KCl、NaHCO₃、NaCl、及びそれらのリン酸塩または塩を含む。

特定の実施形態では、前記増殖培地は、DMEMである。例えば、低グルコース及び低ピルビン酸ナトリウムDMEM等。特定の実施形態では、前記増殖培地は、DMEMであり、約0.2 g/LのCaCl₂、約0.1 g/LのMgSO₄、約0.4 g/LのKCl、約3.7 g/LのNaHCO₃、約6.4 g/LのNaCl、及び約0.1 g/LのNa₂HPO₄を含む。

特定の実施形態では、in vitroでの細胞培養または組織培養における、またはin vitroでの細胞増殖を改善するための、本明細書で教示される血小板放出物または血小板溶解物の使用における該血小板放出物または血小板溶解物の有効量は、増殖培地の少なくとも0.5％(v/v)、少なくとも1.0％(v/v)、少なくとも2.0％(v/v)、少なくとも3.0％(v/v)、少なくとも4.0％(v/v)、少なくとも5.0％(v/v)、少なくとも6.0％(v/v)、少なくとも7.0％(v/v)、少なくとも8.0％(v/v)、少なくとも9.0％(v/v)、少なくとも10.0％(v/v)、少なくとも11.0％(v/v)、少なくとも12.0％(v/v)、少なくとも13.0％(v/v)、少なくとも14.0％(v/v)、少なくとも15.0％(v/v)、少なくとも20.0％(v/v)、好ましくは5～15％(v/v)、または8～12％(v/v)、例えば、約10.0％(v/v)である。

特定の実施形態では、前記細胞は、多能性幹細胞(PS)であり、例えば、哺乳動物PS及びヒトPS等、好ましくはヒトPSである。より特定の実施形態では、前記細胞は、誘導されたPSである。

「幹細胞」という用語は、一般に、自己複製でき、即ち、分化することなく増殖でき、また、その子孫が、少なくとも1つの比較的より特殊な細胞型を生じさせることができる、特殊化されていない、または比較的特殊化されておらず、増殖能力のある細胞を指す。該用語は、実質的に無制限の自己複製が可能な幹細胞を含む。即ち、幹細胞またはその少なくとも一部の子孫は、母幹細胞、ならびに限定された自己複製を示す幹細胞の、特殊化されていないまたは比較的特殊化されていない表現型、分化能、および増殖能力を実質的に保持する。即ち、さらなる増殖および／または分化のための子孫またはその一部の能力が、母細胞と比べて明らかに低下している。非限定的な例として、幹細胞は、1つまたは複数の系統に沿って分化し、ますます比較的より特殊化された細胞を生成できる子孫を生み出すことがある。ここで、そのような子孫及び/またはますます比較的より特殊化された細胞は、それ自体が本明細書で定義される幹細胞であってもよく、または最終的に分化した細胞、即ち、有糸***後でもよいが、完全に特殊化された細胞を生成する。

本明細書で使用される場合、修飾子「多能性の」は、生物の3つの胚葉（即ち、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉）の全てに由来する細胞型を生じさせ、及び潜在的に、生物全体に成長することはできないが、生物のありとあらゆる細胞型を生じさせる細胞能力を意味する。

特定の実施形態では、前記細胞は、間葉系幹細胞（MSC)、血液由来幹細胞（BDSC)、臍帯血由来幹細胞（UCBSC)、及び骨髄由来幹細胞（BMSC)からなる群から選択された多能性幹細胞(PS)である。好ましい実施形態では、前記細胞は、MSCである。

本明細書で使用される「間葉系幹細胞」または「MSC」という用語は、例えば、軟骨骨芽細胞（骨及び軟骨）、骨芽細胞（骨）、軟骨芽細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（腱）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）及び間質性（骨髄間質）系統等のような間葉系、典型的には2つ以上の間葉系、より典型的には3つ以上の間葉系の細胞を生成できる成体の中胚葉由来幹細胞を指す。MSCを、生体試料から、好ましくは、例えば、骨髄、小柱骨、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚（真皮）、特に、胎児及び青年期の皮膚、骨膜、歯髄、腱及び脂肪組織等のヒト被験者の生体試料から単離してもよい。

「MSC」という用語はまた、MSCの子孫、例えば、動物またはヒト被験者の生体試料から得られたMSCのin vitroでのまたはex vivoでの増殖（増殖／拡張）で得られた子孫を包含する。

特定の実施形態では、前記増殖培地は、多能性幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞を培養するのに適した増殖培地である。

特定の実施形態では、前記組織は、肝臓組織、脳組織、及び骨組織からなる群から選択される組織である。

本発明を、その特定の実施形態と併せて説明してきたが、明らかなこととして、当業者には、前述の説明に照らして、多くの代替、修正、及び改変が明白である。従って、添付の請求項の趣旨及び広い範囲において、以下のような全ての代替、修正、及び改変を包含することが意図されている。

本明細書に開示される本発明の態様及び実施形態は、以下の非限定的な例によってさらに裏付けられている。

実施例1.本明細書で教示されるヒト血小板放出物の調製方法

1.材料及び方法
血小板濃縮物
ヒト血小板放出物（hPR）の調製に、有効期限が切れた、輸血のために調製され、承認された血小板濃縮物（PC)を使用した。フランダース（ベルギー）では、PCは、提供後5日以内に輸血されない場合、その有効期限が切れる。
調製方法
PC（約62.5％(v/v)の血小板添加剤溶液を含むもの）、CaCl₂、及び/またはソーダライムガラスビーズの4つの異なる組み合わせを調製した。
- 50 mlプラスチックチューブの中で、15 mM CaCl₂を40 mlのPCに加えた（組み合わせ1）、
- 50 mlのプラスチックチューブの中で、4 mM CaCl₂を40 mlのPCに加えた（組み合わせ2）、
- 50 mlのプラスチックチューブの中で、10 gのガラスビーズを40 mlのPCに加えた（組み合わせ3）、及び
- 50 mlのプラスチックチューブの中で、10 gのガラスビーズ及び4 mM CaCl₂を40 mlのPCに加えた（組み合わせ4）。
該4つの組み合わせを全て室温で3時間凝固させた。
前記ソーダライムガラスビーズの直径は3 mmであった。

2.結果
組み合わせ1及び4のみが収縮した凝固物を形成し、血小板放出物が得られた（図1A-B)。組み合わせ2及び3では、凝固は観察されず、血小板放出物は得られなかった（図1A)。
これは、ソーダライムガラスビーズとCaCl₂の組み合わせにより、低濃度のCaCl₂（即ち、4 mM）で血小板放出物を調製できることを示している。

実施例2.閉鎖系における本明細書で教示されるヒト血小板放出物及び血小板溶解物の調製方法

同じ収容空間におけるガラスビーズ及びCaCl ₂
350 mlのPCを含むPCバッグ（約62.5％(v/v)の血小板添加剤溶液を含むもの）を、一次移送バッグが70 gのソーダライムガラスビーズ（直径3 mm）を含むバッグシステムに溶接し（図2A)、1 mlあたり0.2 gのソーダライムガラスビーズと3.5 mLの404 mM CaCl₂水溶液を得た（オートクレーブにより蒸留及び滅菌）。続いて、前記空のPCバッグを溶接で切り離した。該PC、CaCl₂、及びビーズを穏やかに回転/攪拌して混合した。該PC、ガラスビーズ及びCaCl₂を含むバッグシステムを、室温でラベルを下にしてテーブル上に放置し、3時間凝固させた。このプロセスにおいて、血小板は凝固中のトロンビン生成によって活性化され、従って顆粒エキソサイトーシスによって増殖因子を放出した。該凝固物は最終的に収縮し、その時点で流体が凝固物内部から排出され、形成中の血餅から追加の増殖因子が放出された（データは示さず）。従って血小板放出物を得た。血餅収縮が完了すると、通常、長さ9 cm、幅6 cmの安定した凝固物が残され、ガラスビーズと血小板の残骸の両方が閉じ込められた。次に、該バッグシステムを、さらに使用するまでに-80℃で少なくとも24時間保管できる。融解後に血小板溶解物が得られる。

別々の収容空間におけるガラスビーズ及びCaCl ₂
350 mlのPCを含むPCバッグ（約62.5％(v/v)の血小板添加剤溶液を含むもの）を、一次移送バッグが70 gのソーダライムガラスビーズ（直径3 mm）を含むバッグシステムに溶接し（図2B)、1 mlあたり0.2 gのソーダライムガラスビーズを得た。次に、3.5 mLの404 mM CaCl₂水溶液（オートクレーブにより蒸留及び滅菌）を含む溶接サテライトバッグの分離カニューレ弁を開いて、該PC及びガラスビーズを含む移送バッグに内容物を放出した（図2B)。続いて、前記空のPCバッグ及び前記サテライトバッグを溶接で切り離した。該PC、CaCl₂、及びビーズを穏やかに回転/攪拌して混合した。該PC、ガラスビーズ及びCaCl₂を含むバッグシステムを、室温でラベルを下にしてテーブル上に放置し、3時間凝固させた。このプロセスにおいて、血小板は凝固中のトロンビン生成によって活性化され、従って顆粒エキソサイトーシスによって増殖因子を放出した。該凝固物は最終的に収縮し、その時点で流体が凝固物内部から排出され、形成中の血餅から追加の増殖因子が放出された（図3A)。従って血小板放出物を得た。説明のため、該凝固物を前記バッグから取り出し、図3Bに示した。血餅収縮が完了すると、通常、長さ9 cm、幅6 cmの安定した凝固物が残され、ガラスビーズと血小板の残骸の両方が閉じ込められた。次に、該バッグシステムを、さらに使用するまでに-80℃で少なくとも24時間保管できる。融解後に血小板溶解物が得られる。

例3.様々な濃度の塩化カルシウム及びガラス粒子の凝固パラメーター

1.材料及び方法
図5Aに示す結果のために、PC（約62.5％(v/v)の血小板添加剤溶液を含むもの）、CaCl₂、及び/またはソーダライムガラスビーズの8つの異なる組み合わせを調製した。
- 40 mlのPCに5 mM CaCl₂及び2.5 g（組み合わせ1）、5 g（組み合わせ2）、7.5 g（組み合わせ3）、または10 g（組み合わせ4）のガラスビーズを加えた。
- 40 mlのPCに4 mM CaCl₂及び2.5 g（組み合わせ5）、5 g（組み合わせ6）、7.5 g（組み合わせ7）、または10 g（組み合わせ8）のガラスビーズを加えた。
該8つの組み合わせを全て穏やかに反転させて混合し、室温で5時間凝固させた。
図5Bに示す結果のために、次の方法でhPRを調製した。
- 350 mlのPC（約62.5％の血小板添加剤溶液を含むもの）にPC 1 mlあたり15 mM CaCl₂（ガラスビーズなし）を添加、または、
- 350 mlのPC（約62.5％の血小板添加剤溶液を含むもの）にPC 1 mlあたり4 mM CaCl₂及びPC 1 mlあたり0.20 gのガラスビーズを添加。
前記ソーダライムガラスビーズの直径は3 mmであった。
収縮開始までの時間（図4）は、混合から凝固物がフラスコの端から効果的に離れる瞬間までの時間（分単位）を計測することで測定した。容積収率は、凝固前後の液体画分の容積測定により測定した。凝固後の容積を初期容積で割り、100を掛け、該放出物の収率を計算した。
該血小板放出物におけるCa²⁺（即ち、カルシウムイオン）の濃度を、内蔵のイオン選択性電極を用いる血液ガス分析（RapidPoint 500、Siemens Healthcare、エアランゲン、ドイツ）により測定した。

2.結果
2つの低濃度のCa²⁺イオン（即ち、5 mMまたは4 mM CaCl₂）を添加した場合、ガラスビーズの量を増やすことで、凝固物が収縮するまでの時間が大幅に短縮される（図4）。
放出物の収率については、試験した組み合わせ間で違いはない（図5A)。ガラスビーズを含まない高濃度のCa²⁺イオン（即ち、15 mM CaCl₂）と比べて、ガラスビーズと組み合わせた低濃度のCa²⁺イオン（即ち、4 mM CaCl₂）の間で放出物の収率に違いはない（図5B)。
凝固後の残留Ca²⁺濃度は、5 mM Ca²⁺との全ての組み合わせと比べて、4 mM CaCl₂との全ての組み合わせで得られた血小板放出物の方が低くなっている（図6）。また、図6は、該血小板放出物における残留Ca²⁺濃度が、使用されたガラスビーズの量の関数ではないことを示している。

実施例4．本明細書で教示されるヒト血小板放出物の増殖培地における使用

EU、カナダ、及びオーストラリアのほとんどの血液バンクは、添加剤溶液（Macopharma、Tourcoing、FRのSSP+等）を用いて、PCの血漿分画を約70％(v/v)に置き換えている。該添加剤溶液には、リン酸塩及び炭酸塩の陰イオンが含まれている。高濃度のカルシウム（例えば、15 mMのカルシウム塩）を使用する血小板活性化法で調製されたヒト血小板放出物が細胞または組織培養で使用される場合、過剰なCa²⁺イオンは、hPRが添加された増殖培地で多価陰イオンと化学複合体を形成する（図7、左パネル）。これは、その後の細胞または組織培養において問題（例えば、細胞増殖の低下、細胞へのストレス、さらには細胞死）を引き起こす。トロンビンを使用して凝固を引き起こす対照実験は沈殿を引き起こさず、前記複合体へのEDTAの添加はそれらを溶解させた。これは、前記沈殿がカルシウムに依存していることを示している。ウシ胎児血清(FBS)を増殖培地に添加した場合、沈殿は観察されない（図7、右パネル）。

1.材料及び方法
増殖培地の調製
次のいずれかをダルベッコ改良イーグル培地（DMEM、サーモフィッシャーサイエンティフィック）に補充した。
- 10％(v/v)hPR。ここで、該hPRは、ガラスビーズなし、15 mM CaCl₂で調製した。（増殖培地1、陽性対照）
- 0％(v/v)hPR。（増殖培地5、培地（hPRなし））;
- 10％(v/v)ヒト血小板溶解物（hPL）。ここで、該hPLは、標準的な凍結融解サイクル（増殖培地2、凝固なし）で調製した。または、
- 10％(v/v)hPR。ここで、該hPRは、5 mMまたは4 mM CaCl₂及び0.2 gガラスビーズ/mL PCで調製した。（増殖培地3及び4、5 mM CaCl₂及び4 mM CaCl₂）

2.結果
増殖培地1は沈殿物を含んでいたが（図8A)、増殖培地5は沈殿物を含まなかった（図8B)。
増殖培地2は沈殿物を含まなかった（図8C)。しかし、増殖培地2は、細胞培養中に培地全体の凝固を引き起こす。カルシウムが添加されていないため、hPLの調製中に凝固は発生しない。その結果、該hPLが増殖培地（Ca²⁺イオンを含むもの）に添加されると、細胞培養中に自発的な凝固が起こる。増殖培地は、残りの液体ではなく、ゲルとして細胞培養フラスコの底に付着する。従って、その理由は、ほとんどの増殖培地が、37℃及び5％CO₂での凝固を可能にするのに十分な濃度のカルシウムを含むためである。
増殖培地3及び4は沈殿物を含まず（図8D-E）、本明細書で教示される方法で調製されたhPRが、標準的な方法によって調製されたhPRを標準的な増殖培地に添加するときに通常観察されるカルシウム依存性の沈殿の問題を克服することを示す。また、本明細書で教示される方法で調製されたhPRは、標準的な方法で調製されたhPLまたはhPRを標準的な増殖培地に添加するときに通常観察される培地調製後の凝固の問題を克服する。

実施例5．ガラスビーズなし、15 mMを用いて調製されたヒト血小板放出物の増殖培地様溶液に対する影響
標準的な増殖培地（即ち、DMEM）、及び外部から添加されたCaCl₂（表1）と組み合わせた血小板添加剤溶液（即ち、SSP+）の組成物から、カルシウム沈殿に潜在的な役割を果たすイオンを選択した。
表1.

ガラスビーズなし、15 mM CaCl₂で調製したhPRでは、凝固後に1.5 mMの残留Ca²⁺濃度が測定された。hPRが調製された多血小板組成物が70％(v/v)のSSP+を含むと仮定すると、hPRにおける選択されたイオンの濃度の理論値は次のようになる。
4 mM HCO₃ ^-
19.7 mM PO₄ ^3-
1.5 mM Ca²⁺
増殖培地が90％(v/v)のDMEM及び10％(v/v)のhPRから構成されると仮定すると、増殖培地+hPRにおける選択されたイオンの濃度の理論値は次のようになる。
90% (v/v) DMEM + 10% (v/v) hPR:
・39.6 + 0.4 = 40.0 mM HCO₃ ^-
・0.8 + 2.82 = 3.6 mM PO₄ ^3-
・1.62 + 0.15 = 1.77 mM Ca²⁺
細胞培養の条件（5％CO₂及び37℃)で最小のイオン組成物における沈殿を検出するために実験を行った。以下に示すように水中でイオン組成物を調製し、細胞恒温器内でインキュベートした。明視野顕微鏡を用いた視覚的制御で沈殿を検出した。
1. Ca²⁺及び HCO₃ ^- ?
・44 mM NaHCO₃
・2 mM CaCl₂
沈殿は観察されなかった。
2. Ca²⁺及びH₂PO₄ ^- ?
・3.73 mM NaH₂PO₄
・2 mM CaCl₂
沈殿は観察されなかった。
3. Ca²⁺、HCO₃ ^-及びH₂PO₄ ^- ?
・44 mM NaHCO₃
・3.73 mM NaH₂PO₄
・2 mM CaCl₂
沈殿は観察された。
本データは、上記で試験した物理的及び化学的条件において、不溶性カルシウム塩の沈殿には、少なくともリン酸陰イオンと重炭酸陰イオンの両方の存在が必要であることを示している。本データはまた、これらの陰イオンが沈殿を引き起こすのに十分であることを示唆し、これらの陰イオンを含む（少なくとも試験した濃度で）市販の培地は、ガラスビーズなし、15 mM以上のCaCl₂で調製した10％(v/v)のhPRを使用すると、不溶性のカルシウム塩が沈殿することを示している。

実施例6.本明細書で教示されるヒト血小板放出物の細胞増殖に対する影響

1.材料及び方法
10％(v/v)の様々な種類のhPRまたはhPLまたは10％(v/v)のFBSを補充したDMEM増殖培地の中で脂肪組織由来間葉系幹細胞（MSC)を培養した。該様々な種類のhPRまたはhPLには次のものが含まれる。
- 2サイクルの凍結融解とその後の遠心分離で調製したhPL（「標準」）、
- 5 mM CaCl₂とPC 1 mlあたり0.2 gのガラスビーズで調製したhPR（「CaCl₂ +ガラス」）、
- Cook Regentec社（「競合他社1」）のhPL（nLiven PR^TM）、
- EMD Merck Millipore社（「競合他社2」）のhPL（PLTMax^TM; SCM141）、及び
- Macopharma社（「競合他社3」）のhPR（複数の範囲、参照番号BC0190020 /BC0190030）。
血球計数器（Malassezタイプ）で細胞数をカウントし、培養時間の関数として、MSCの細胞倍増時間を測定した。

2.結果
図9は、「CaCl₂ +ガラス」の細胞倍増時間がFBSと比べて約2.4倍速いことを示している。さらに、「CaCl₂ +ガラス」の細胞倍増時間は、「標準」hPR及び3つの競合他社のhPRの細胞倍増時間とほぼ同じである。

実施例7．本明細書で教示されるヒト血小板放出物の細胞ストレスに対する影響

1.材料及び方法
ガラスビーズなし、15 mM CaCl₂で調製した10％(v/v)のhPR、または4 mM CaCl₂及び0.20 gのガラスビーズ/ml PCで調製した10％(v/v)のhPRを補充したDMEM増殖培地の中で脂肪組織由来間葉系幹細胞（MSC)を培養した。
顕微鏡で細胞ストレス及び細胞死への影響を測定した。

2.結果
図10に示されているように、ガラスビーズなし、15 mM CaCl₂で調製した10％(v/v)のhPRを補充したDMEM増殖培地の中で培養されたMSCが細胞ストレス、さらには細胞死に苦しんでいる（図10A)。一方、4 mM CaCl₂及び0.20 gのガラスビーズ/ml PCで調製した10％(v/v)のhPRを補充したDMEM増殖培地の中で培養されたMSCが健康に見える（図10B)。

実施例8.異なる種類のシリカベースの粒子の凝固時間に対する影響
0.20 g/ml、0.15 g/ml、または0.10 g/mlのホウケイ酸ガラスビーズを含むバッグに対でのPC（350 mL、約62.5％(v/v)の血小板添加剤溶液を含む）を加えた。6 mM、5 mM、または4 mMのCaCl₂をPCとガラスビーズの混合物に加えた。収縮を完了するまでの時間を記録した。記録から3時間以上が必要な場合、該PCを「収縮せず」と見なした（図11に「X」で示す）。収縮が成功した場合、図11に「V」で示す。
本データに示されているように、ホウケイ酸ガラスの存在下では、3時間未満で完全に収縮するには4 mMを超えるCaCl₂が必要である。一方、該条件下でソーダライムガラスを使用した場合は、前記20のPC全てでは3時間未満で収縮が成功した。5 mM CaCl₂の条件下では、PCの収縮が成功したと見られたが、等量のソーダライムガラスの存在下（平均2時間30分）よりも時間がかかった（平均3時間）。

実施例9．血小板添加剤溶液を含まない血小板濃縮物から本明細書で教示されるヒト血小板放出物の調製方法
血小板添加剤溶液を添加せずに、100％(v/v)の血漿中で血小板濃縮物を調製した。50 mLのファルコンチューブ内で、0.25 g/ml、0.15 g/ml、または0.05 g/mlのソーダライムガラスビーズ及び10 mM、8 mM、6 mM、4 mM、または2 mMのCaCl₂を40 mlのPCに加えた。凝固収縮時間を21時間監視した。記録から21時間以上が必要な場合、該PCを「収縮せず」と見なした（図12に「X」で示す）。3時間未満で収縮が成功した場合は、図12に「V」で示す。3時間～21時間での血餅収縮は、図12に白丸で示す。
本データは、約35％(v/v)の血漿及び約65％(v/v)の添加剤溶液中で調製された従来のPC試料と比べて、100％(v/v)の血漿の存在下での血餅収縮が、有意に速くないことを示している。

実施例10．本発明に従って産生された血小板放出物及び従来技術の血小板放出物中におけるイオン化カルシウムの最終濃度の比較分析
引用された先行技術に従って調製された血小板放出物におけるCa²⁺（イオン化カルシウム）の濃度
対での実験では、本法（TReC)または先行技術文献（Ming-Li Chouら, 2014, PLOS ONE vol. 9(6), 19 June 2014, page e99145 (D1), WO2013/003356 (D2)及びMartina Bernardiら, 2017, J. of Translatioal Medicine, vol. 15(1) (D3)）の方法で、添加剤溶液（PAS-血漿）または純粋な血漿（血漿）中の血小板濃縮物を処理した。それぞれのCa²⁺初期濃度（即ち、添加されたカルシウムの量）は凡例に示されている。得られた最終生成物について、Ca²⁺濃度を測定し、図13に示す。黒いバーで示されているように、Ca²⁺濃度は、競合の方法D1～D3と比べて、本法の方が大幅に低くなっている。点線は、典型的な組織培養培地組成物中のリン酸カルシウム複合体の沈殿を防ぐために許容される純粋な血小板放出物におけるCa²⁺の最大濃度を表す。
Ming-Li Chouら(2014)の高カルシウムの方法と比べて、本発明の方法は、図14の比較に示されているように、細胞培養培地で使用された場合にリン酸カルシウムの沈殿を起こしにくい血小板放出物をもたらす。組織培養培地中のカルシウム（Ca²⁺）との化学リン酸塩（HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^-及びPO₄ ^3-）複合体の沈殿。組織培養培地（事前にCa²⁺が添加されたDMEM）に、リン酸塩陰イオンの供給源として添加剤溶液を含む血小板濃縮物から調製された10％の血小板放出物を補充した。血小板放出物の調製には、2つの異なる方法を用いた：我々の低Ca²⁺法（A)または先行技術D1の高Ca²⁺法（B)。37℃及びCO₂（pCO₂ 5％）で24時間インキュベートした後、Bの条件のみにおいて、明視野顕微鏡（200X）を用いてリン酸カルシウム複合体が見えた。該培地におけるイオンCa²⁺（黒棒）及びPO₄ ^3-（白棒）の残留濃度をグラフ（下のパネル）に示す。点線は、pH7.4及び理想的な熱力学的条件下でのPO₄ ^3-とのCa²⁺の溶解度の理論値を表している。
本データは、本発明の、血小板放出物の調製方法を使用することの有益な効果を明白に示している。該方法を用いることで、細胞培養培地中で沈殿を得るリスクが低減され、細胞損傷が回避され、また、例えばシグナル伝達経路に対するカルシウムイオンの影響が回避される。

Claims (17)

1. 被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から血小板放出物を調製するための、ある量の１つまたは複数の水溶性カルシウム塩及びある量のガラス粒子の使用であって、ここで、前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩の量は、前記試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolであり、また、前記ガラス粒子の量は、前記試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gである、使用。
2. 第1収容空間(1’)を有する第1容器(1)を含む血小板放出物を調製するためのシステムであって、ここで、前記第1収容空間(1’)が、
   - 第2容器(2)の第2収容空間(2’)に含まれるある量（Q_bc)の多血小板血液組成物を受け取るように構成されていて、
   - ある量（Q_gp）のガラス粒子(3)を保持し、かつ、
   - ある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を保持するか、第3容器(5)の第3収容空間(5’)によって保持されるある量（Q_cc)の1つまたは複数の水溶性カルシウム塩(4)を受け取るように構成されている。
   ここで、比Q_gｐ：Q_bcは、前記多血小板血液組成物1 mlあたり0.010～0.60 gであり、かつ比Q_cc：Q_bcは、前記多血小板血液組成物1 mlあたり1.0～12.0 μmolである、システム。
3. 前記比Q_gｐ：Q_bcが、0.10～0.40であり、かつ前記比Q_cc：Q_bcが、3.0～8.0である、請求項２に記載のシステム。
4. 請求項２または３に記載のシステムの、血小板放出物または血小板溶解物を産生するための使用。
5. 被験者から得られた多血小板血液組成物の試料から血小板放出物を調製するための方法であって、
   a)前記試料を、該試料1 mlあたり0.010 g～0.60 gのガラス粒子及び該試料1 mlあたり1.0 μmol～12.0 μmolの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させ、それにより混合物を得る工程、
   b)工程a)で得られた混合物を凝固させ、それにより凝固物及び血小板放出物を得る工程、及び
   c)前記混合物から工程b)で得られた血小板放出物を回収する工程
   を含む、方法。
6. 前記試料を、該試料1 mlあたり0.10 g～0.40 gのガラス粒子及び該試料1 mlあたり3.0 μmol～8.0 μmolの１つまたは複数の水溶性カルシウム塩と接触させる、請求項１に記載の使用または請求項５に記載の方法。
7. 前記ガラス粒子が、1.0 mm～5.0 mm、好ましくは2.0 mm～4.0 mmの平均直径を有する、請求項１または６に記載の使用、請求項２または３に記載のシステム、または請求項５または６に記載の方法。
8. 前記ガラス粒子が、シリカベースのガラス粒子、好ましくはソーダライムシリカまたはソーダライムガラス粒子、ホウケイ酸ナトリウムガラス粒子、アルミノケイ酸ガラス粒子、酸化鉛ガラス粒子または溶融シリカガラス粒子である、請求項１、６または７のいずれかに記載の使用、請求項２、３または７のいずれかに記載のシステム、または請求項５～７のいずれか1項に記載の方法。
9. 前記１つまたは複数の水溶性カルシウム塩が、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、塩素酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム及びグルコン酸カルシウムまたはそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは塩化カルシウムである、請求項１または６～８のいずれか1項に記載の使用、請求項２、３、７または８のいずれか1項に記載のシステム、または請求項５～８のいずれか1項に記載の方法。
10. 前記多血小板血液組成物が、血小板濃縮物、血漿及び全血から選択され、好ましくは血小板濃縮物である、請求項１または６～９のいずれか1項に記載の使用または請求項５～９のいずれか1項に記載の方法。
11. 前記得られた凝固物中に存在する血小板及び／または工程b)で得られた血小板放出物を溶解し、それにより血小板溶解物を得る工程をさらに含む、請求項５～１０のいずれか1項に記載の方法。
12. 1 mM未満のCa²⁺イオンを含む、請求項５～１０のいずれか1項に記載の方法で得られた、血小板放出物。
13. 1 mM未満のCa²⁺イオンを含む、請求項１１に記載の方法で得られた、血小板溶解物。
14. 請求項１２に記載の血小板放出物または請求項１３に記載の血小板溶解物を含む、医薬組成物または美容組成物。
15. 被験者に有効量の前記血小板放出物、血小板溶解物、または医薬組成物を投与することを含む、医療に使用するための、好ましくは、硬組織及び軟組織損傷、炎症性疾患、骨疾患、変性関節疾患、変性椎間板疾患、皮膚状態、円形脱毛症、子宮内膜症、膣萎縮、眼表面疾患、手根チューブ症候群、神経変性障害、末梢動脈疾患、及び疼痛の治療に使用するための、請求項１２に記載の血小板放出物、または請求項１３に記載の血小板溶解物、または請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 請求項１２に記載の血小板放出物、請求項１３に記載の血小板溶解物、または請求項１４に記載の美容組成物の、皮膚及び／または毛髪の外観を改善するための使用。
17. 請求項１２に記載の血小板放出物または請求項１３に記載の血小板溶解物の、細胞培養または組織培養における使用。
    
    
    
    

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