CN112870228B - 一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法与应用。其制备方法包括以下步骤：(1)获得脂肪来源的间充质干细胞，进行消化后获取原代细胞进行继代培养，取继代培养后的脂肪干细胞备用；(2)取脂肪来源的间充质干细胞，置于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，采用超速离心法提取间充质干细胞释放的外泌体；(3)取巯基‑聚乙二醇溶解于脂肪干细胞外泌体中，然后将AgNO3水溶液经稀释后与其混合，形成透明的多功能微环境保护外泌体水凝胶。本发明的多功能微环境保护外泌体水凝胶与现有报道相比表现出更佳的修复效果，能够促进新生血管形成和子宫内膜组织再生，更好的帮助恢复生育能力，提高妊娠和出生率。

Description

一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于薄型子宫内膜修复技术领域，具体涉及一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
成功妊娠需要优质的胚胎、容受性良好的子宫内膜以及二者同步、协调的相互作用。子宫内膜的厚度对子宫内膜容受性有一定的影响，并影响胚胎的成功着床。由于***水平低、感染、炎症、妊娠期宫腔操作史(如药流后清宫、人工流产、产后清宫)及***等，子宫内膜受到损伤、厚度变薄，降低了子宫内膜容受性，从而导致胚胎着床失败或妊娠后早期流产，严重影响女性的生育能力。薄型子宫内膜症状已导致长期不育和负面的家庭结局。
关于薄型子宫内膜治疗的报道很多，但目前仍无一种特效方法。阿司匹林被认为可增加子宫及卵巢血流灌注，从而提高胚胎种植率及临床妊娠率而被广泛应用于临床，然而其疗效仍存在争议，近年来亦有研究发现阿司匹林并不能提高临床妊娠率、活产率、及减少流产率等，且患者孕期服用阿司匹林有引起出血等不良反应。近年来研究还发现枸橼酸西地那非片能降低子宫内膜血流阻力，使子宫内膜血管计数增加，从而改善子宫内膜血流灌注，促进子宫内膜生长，有利于胚胎着床，提高临床妊娠率，然而临床应用枸橼酸西地那非片可出现头痛、面色潮红、消化不良、鼻塞和视觉功能异常等不良反应，且尚无临床证据证明其是否对胎儿造成不利影响，而且使用枸橼酸西地那非片的患者仍有一部分疗效不满意。虽然目前的激素治疗能够改善一些妇女的生育效果，但由于复杂的子宫内膜微环境的损害和感染，这些反应仍然不令人满意。因此探索一种效果可靠、副作用小的改善薄型子宫内膜的治疗方法是近年临床应用中较为迫切的需求。
已有研究表明，间充质干细胞具有强大增殖及多向分化能力、免疫调节、促进血管新生等潜能。由于骨髓源性干细胞(BMSCs)和脂肪源性干细胞(ADSCs)具有分化为子宫内膜上皮细胞和基质细胞的能力，已被研究作为再生子宫内膜的方法。干细胞疗法在再生医学和内膜修复领域有很大的应用前景，然而多项临床前瞻性研究发现干细胞移植远期临床效果欠佳。其中脂肪干细胞移植效率低下、存活率低等问题是制约临床干细胞移植应用的瓶颈。另外研究发现干细胞移植可能存在微血管栓塞、体内成瘤等安全问题亦限制其临床应用。目前干细胞治疗受到以下限制：对表型稳定细胞的持续来源的要求，对受管细胞的免疫介导排斥的风险，这些过程的高成本和技术困难，以及癌症或异位组织发育的潜在风险。
近来脂肪干细胞分泌的膜性微囊泡外泌体引起了学者们的广泛关注和重视，成为干细胞研究领域的热点。脂肪干细胞外泌体可以模拟间充质干细胞生物学功能，发挥其促进血管新生、改善缺血组织的血流灌注、组织修复、免疫调节等作用。而且外泌体不具备细胞核结构，在宿主体内不能扩增，无异倍体性风险，脂肪干细胞外泌体能够穿过质膜，并且发生免疫排斥的可能性更小，在临床应用过程中具有较好的安全性，且不会像脂肪干细胞那样容易堵塞微血管，突破了脂肪干细胞治疗存在的较多问题，具有更广阔的临床应用前景。
最近的研究表明，外泌体作为子宫内膜再生的介质具有明确的作用。干细胞来源的外泌体可以向近端或远端细胞传递蛋白质、mRNA、miRNAs和其他分子，从而有效地传播干细胞诱导的再生信号。虽然功能上类似于干细胞，但这些外泌体不太可能在接受治疗的宿主中诱导免疫反应，从而将排斥的风险降到最低。因此，基于外泌体的治疗方法有望成为推动子宫内膜再生的理想手段。然而，动物实验证实直接宫腔注射外泌体只能在宫腔停留数分钟到数小时，研究显示通过静脉注射途径少于5％的干细胞能到达损伤部位，大部分的干细胞在给药后的几个小时内凋亡，即使到达靶组织的干细胞中只有少量长期停留在损伤部位。由于子宫内膜再生是一个漫长的过程，需要持续的组织生长，因此设计一种新型的生物相容性支架，能够支持外泌体在子宫腔内的持续释放，从而延长其生物活性，加速子宫内膜再生，成为该领域研究的新方向。
水凝胶是一种生物材料，通常用于组织修复应用，因为它们是生物相容性和可调的解决方案，可以模拟细胞外基质的结构，以提供更适合细胞增殖和再生的支架。水凝胶还可以在组织修复中介导药物的持续释放，使其成为一种很有前途的外泌体子宫内膜修复应用的候选药物。然而，一些因素限制了水凝胶在这个临床背景下的使用。其一，随着时间的推移，构成性组织活动可能导致水凝胶磨损。此外，将外泌体与水凝胶基质交联的不同方式(包括化学交联、醛交联、热交联、光交联)也会损害这些外泌体，从而降低其治疗效果。水凝胶注射也会增加局部细菌感染的风险，从而抑制组织再生。
在上述背景下，如何设计一种新型多功能水凝胶，以实现一种利用温和的以协调为基础的外泌体交联方法，并表现出有益的自愈合、抗菌和载药性能，以期用于更好的修复治疗薄型子宫内膜，恢复生育能力和提高妊娠及出生率，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用。本发明提供的多功能微环境保护外泌体水凝胶，与已有报道的采用脂肪干细胞外泌体直接用于促进子宫内膜再生和恢复生育相比，以及与将脂肪干细胞水凝胶用于修复相比，表现出更佳的修复效果，其促进新生血管形成和子宫内膜组织再生的能力与现有技术相比更优，能够更好的帮助恢复生育能力，提高妊娠和出生率。
本发明的目的之一是提供一种多功能微环境保护外泌体水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)从动物组织样本中分离获得脂肪来源的间充质干细胞，进行消化后获取原代细胞进行继代培养，取继代培养后的脂肪干细胞备用；
(2)取脂肪来源的间充质干细胞，将其置于DMEM培养基中培养一段时间，然后采用超速离心法提取间充质干细胞释放的外泌体，将获得的外泌体稀释后进行使用；
(3)取巯基-聚乙二醇溶解于步骤(2)的脂肪干细胞外泌体中得到混合物，所述巯基-聚乙二醇与脂肪干细胞外泌体的质量体积比为30mg：100μL，然后将AgNO3水溶液采用脂肪干细胞外泌体稀释后再加入到上述混合物中，数秒钟后形成透明的多功能微环境保护外泌体水凝胶。
本发明的上述方法设计了一种多功能微环境保护外泌体水凝胶，通过采用原位显微注射促进子宫内膜再生和生育能力恢复。该外泌体水凝胶是通过制定Ag+—S之间的动态协调与脂肪干细胞外泌体的融合产生出一个注射制剂，并大幅度减少感染的风险，同时拥有脂肪干细胞的抗原和旁分泌信号活动的细胞，能够促使子宫内膜微环境的再生。在体外，该外泌体水凝胶具有显著的促新生血管作用，使人脐静脉内皮细胞增殖和血管形成，能够分别增加1.87倍和2.2倍。在体内，该微环境保护外泌体水凝胶也显示出促进新生血管和组织再生，同时抑制局部组织纤维化。重要的是，再生的子宫内膜组织更容易孕育胚胎并生出健康的新生儿。这种微环境保护的外泌体水凝胶***为修复薄子宫内膜和恢复生育能力提供了一种方便、安全、无创的方法。
进一步的是，步骤(2)中所述DMEM培养基中含10％胎牛血清和1％的链霉素/青霉素。
进一步的是，步骤(2)中培养的条件为37℃下培养2周。
进一步的是，步骤(2)中所述超速离心法的步骤为：将收集的培养基上清800×g离心5分钟，2000×g二次离心10分钟，过滤上清，100000×g，4℃离心90分钟。
进一步的是，步骤(2)中将所述外泌体稀释至10μg/mL进行使用。
进一步的是，步骤(3)中所述巯基-聚乙二醇的分子量范围为1000-2000Da。
进一步的是，步骤(3)中所述AgNO3水溶液的浓度为0.1mol/L。
进一步的是，步骤(3)中所述AgNO3水溶液与脂肪干细胞外泌体的体积体为3:4。
本发明的目的之二是提供由上述方法制备得到的一种多功能微环境保护外泌体水凝胶。该水凝胶表现出优异的促进子宫内膜再生和生育恢复能力，与现有技术相比大大提升。
本发明的目的之三是提供上述多功能微环境保护外泌体水凝胶的应用，是将该外泌体水凝胶用于促进子宫内膜再生和生育能力恢复方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一种多功能微环境保护外泌体水凝胶，可通过采用原位显微注射促进子宫内膜再生和生育能力恢复；
(2)本发明的外泌体水凝胶具有显著的促新生血管作用，使人脐静脉内皮细胞增殖和血管形成，能够分别增加1.87倍和2.2倍，且与现有的采用脂肪干细胞外泌体直接用于促进子宫内膜再生和恢复生育相比，以及与将脂肪干细胞水凝胶用于修复相比，表现出更佳的修复效果；
(3)本发明提供的微环境保护的外泌体水凝胶***在修复薄子宫内膜和恢复生育能力方面具备方便、安全且无创的优点，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的多功能微环境保护外泌体水凝胶的合成示意图；
图2为脂肪干细胞和脂肪干细胞外泌体的特性表征结果。(A)对脂肪干细胞(ADSCs)进行免疫荧光染色图，标尺：50μm；(B)流式细胞术分析ADSCs结果；(C)脂肪干细胞外泌体(ADSC-exo)的粒径值；(D)脂肪干细胞外泌体的SEM图像(标尺：200nm)；(E)流式细胞仪检测脂肪干细胞外泌体对CD63和CD9结果图；(F)Westernblotting检测脂肪干细胞外泌体对CD63和CD9结果图；(G)脂肪干细胞外泌体从PEG-Ag水凝胶中释放结果图；(H)PEG-Ag水凝胶的脂肪干细胞外泌体日释放曲线；数据以平均SD表示(每组n＝3)。
图3为脂肪干细胞外泌体水凝胶的鉴定结果。(A)自愈和可注射机制；(B)四臂巯基聚乙二醇、AgNO3和脂肪干细胞外泌体的混合物；(C)水凝胶和脂肪干细胞外泌体水凝胶制剂的SEM图像；(D)水凝胶进入蒸馏水后的图像；(E)水凝胶和脂肪干细胞外泌体水凝胶的体外降解曲线；(F)对PEG-Ag水凝胶储存模量(G’和G”分别对应弹性模量和损失模量)的应变扫描测量，以kPa表示；(G)ADSCs-exo@hydrogel存储模量的应变扫描测量；(H)测量的粘度参数与时间的关系，以秒为单位，应变剪切速率在0.05％～500％之间，剪切时间为100s；(I)经过两次1000％阶梯应变循环后，各种水凝胶的G’恢复率；(J)Ag离子从水凝胶和脂肪干细胞水凝胶的释放行为；(K)脂肪干细胞外泌体水凝胶的体外细胞毒性和活细胞在1、3和5天的定量分析结果。
图4为游离的脂肪干细胞外泌体(ADSCs-exo)或水凝胶混合干细胞外泌体组(AgNO3+ADSCs-exo)对HUVEC增殖、迁移和管形成的影响。(A)免疫荧光染色检测Ki67作为衡量HUVEC增殖的指标在指定的治疗组(标尺：50μm)；(B)对指定组的Ki67阳性细胞数量进行定量；(C)各处理组HUVECs进行Transwell迁移实验(比例尺：200μm)；(D)Transwell实验中迁移的HUVECs数量被量化，表明ADSCs-exo或AgNO3+ADSCs-exo处理后迁移增强；(E)在指定的治疗组中使用HUVEC细胞体外试管形成试验；(F)对每个视场的管数进行了量化，表明在ADSCs-exo或AgNO3+ADSCs-exo处理后，HUVEC管的形成得到了改善(标尺：200μm)；误差的计算基于三个样本(*P<0.05，**P<0.01)。
图5为相关治疗的子宫形态学改变评估结果。(A)用于建立子宫角损伤大鼠模型的手术方法，即在子宫角上作一个腹部正中切口，然后将无水乙醇注入子宫；(B)子宫标本，箭头指示子宫内膜损伤后的子宫，子宫组织样本进行H&E染色刻度条：1000μm、200μm；(C)各组子宫内膜厚度；(D)各组腺体的数量；数据为平均标准误差，n＝5，*P<0.05，**P<0.01。
图6为使用ADSCs-exo或AgNO3+ADSCs-exo促进子宫内膜新生血管形成、子宫肌再生和减少子宫内膜胶原沉积的结果图。(A)免疫组织化学染色显示治疗组CD31-内皮细胞的血管可视化结果(比例尺：100μm)，而α-SMA蛋白质染色用来检测平滑肌评估子宫肌层的再生(比例尺：100μm)和Masson三色染色用来评估子宫内膜纤维化(蓝色，疤痕形成一致)显示治疗组(比例尺：100μm)。(B、C、D)定量检测CD31、-SMA和胶原蛋白表达水平。数据为三次样本的平均标准误差，*P<0.05，**P<0.01。
图7为水凝胶体内抗菌活性评价。(A)金黄色葡萄球菌免疫荧光染色(红色)；(B)各处理组金黄色葡萄球菌的定量测试；数据为平均标准误差，n＝5，*P<0.05，**P<0.01。
图8为水凝胶移植对子宫内膜容受性和血管生成标志物表达的影响。(A)qRT-PCR方法用于评估子宫内膜容受性标记物(HOXA-1，LIF，ER，PR，整合素β3，IGF-1)和血管生成(VEGF，bFGF)的表达，β-actin作为正常化对照；(B)Westernblotting检测各组中LIF、VEGF、IGF-1蛋白的表达情况；(C)不同治疗组的LIF、VEGF、IGF-1水平的Western blotting数据；数据为平均标准误差，n＝5，*P<0.05，**P<0.01。
图9为水凝胶处理对生育力恢复的影响。(A)术后8周不同治疗组(未损伤组、模型组、水凝胶组、干细胞外泌体组、水凝胶混合干细胞外泌体组)妊娠；(B)水凝胶混合干细胞外泌体组SD大鼠胚胎及新生儿发育正常，与未损伤组大鼠发育一致。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)脂肪干细胞的分离和培养：
取4周龄C57BL/6小鼠，实验过程中对动物的处置遵守2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》，将小鼠脱颈处死后放入乙醇浸泡10分钟后，取其腹股沟皮下脂肪组织样本，分离脂肪组织来源的间充质干细胞(ADSCs)，剪碎后放入0.2％胶原酶NB4和0.05％中性蛋白酶混合液中消化获取原代后继续培养传代，取第3代脂肪干细胞备用。
实施例2
(2)脂肪干细胞外泌体的获得：
外泌体来源于4周龄C57BL/6小鼠脂肪组织中的间充质干细胞，将脂肪间充质干细胞置于含10％胎牛血清和1％的链霉素/青霉素的低葡萄糖DMEM培养基中在37℃下培养2周，采用超速离心法提取小鼠间充质干细胞释放的外泌体，将收集的培养基上清800×g离心5分钟，2000×g二次离心10分钟，过滤上清，4℃下100000×g离心90分钟，然后将获得的外泌体稀释至10μg/mL。
实施例3
(3)脂肪干细胞外泌体-AgNO3-水凝胶(多功能微环境保护外泌体水凝胶)的制备：
称取30mg巯基-聚乙二醇(分子量1000-2000Da，批号：TZQ09095，Creative PEGWorks Co.，Ltd.)，溶解于100μL脂肪干细胞外泌体中，然后将75μLAgNO3(批号20170808，国药化学试剂有限公司)溶于水溶液中(AgNO3浓度为0.1mol/L)，用100μL脂肪干细胞外泌体稀释，并与巯基-聚乙二醇外泌体溶液混合，几秒钟后混合物形成透明的脂肪干细胞外泌体-AgNO3-水凝胶。
实验例1
动物模型的建立：
所有实验均按照国家卫生研究所《实验动物护理和使用指南》(NIH出版物第80-23号)并经上海交通大学机构动物护理和使用委员会批准进行。选择8周龄的SD大鼠(体重为200-250克)，安置在一个气候可控的实验室里，免费提供食物和水，通过向子宫内注射95％无水乙醇损伤大鼠双侧子宫构建大鼠薄型子宫内膜损伤模型。实验组动物在造模后再次手术，夹住子宫一端，另一端用注射器将脂肪干细胞外泌体水凝胶制剂注入到大鼠子宫腔内，在水凝胶注射后经过3个发情周期后，大鼠被安乐处死，***组织进行切片或冷冻以进行下游分析。
实验例2
分组设计和治疗实验：
将50只大鼠随机分为5个治疗组(每组10只)：(1)未损伤组(Sham operation)，在子宫角内注射PBS(200μL)；(2)自然修复组，按上述方法给予子宫角注射95％乙醇；(3)干细胞外泌体组(ADSCs-exo)，在乙醇介导的损伤诱导后30分钟，通过子宫角注射脂肪干细胞外泌体(20μg，200μLPBS)；(4)水凝胶组(hydrogel)，在乙醇诱导损伤后30min注射200μL的AgNO3-水凝胶(0.1mol/L)；(5)水凝胶混合干细胞外泌体组(ADSCs-exo@hydrogel)，在乙醇诱导损伤后30分钟，以200μL单次注射脂肪干细胞外泌体(20μg)和200μLAgNO3-水凝胶。在水凝胶注射后经过3个发情周期后，安乐处死大鼠，***组织进行切片或冷冻以进行下游分析。
测试例(一)水凝胶理化特性测试
TRPS(可调电阻脉冲传感)分析用于评估外泌体颗粒的大小；脂肪干细胞外泌体-AgNO3-水凝胶的粘弹性使用AR2000流变仪(TA Instruments，DE，USA)进行评估；水凝胶的弹性模量(G’)和损失模量(G”)值在37℃和1Hz下进行测试；振荡应变测试在0.1％～100％进行两个循环。
称取0.5mL水凝胶，加入5mLPBS，37℃下150rpm搅拌孵育，用于研究水凝胶的可生化性。水凝胶的剩余重量(Wt)每2天称量一次，生物降解程度由Wt/W0方程确定(W0为水凝胶的初始重量)。另外，用PBS法检测水凝胶中Ag+的释放量。将200L水凝胶置于2000L的PBS中，37℃下浸泡，每隔一定时间(2，4，6，8，10，12天)取出200L溶液，采用电感耦合等离子体质谱法(NexION 2000，美国)测定Ag+的释放量。
(二)扫描电镜分析
取水凝胶和外泌体样品，经冷冻干燥，用扫描电子显微镜(SU-8010，日立，日本)进行分析，在3kV的加速电压下，样品装载安装在SEM测试的导电胶带上，并使用适当的仪器(克瑞辛顿科学仪器，沃特福德，英国)进行涂金60秒。
(三)试管试验
使用体外血管生成试剂盒(in vitro angiogenesis kit,Kurabo)评价脂肪干细胞外泌体-AgNO3-水凝胶诱导血管生成。将内皮细胞与AgNO3-水凝胶、脂肪干细胞外泌体或两者结合孵育12天，然后使用抗CD31(Abcam)对内皮管进行染色，然后进行二次碱性磷酸酶结合目标抗小鼠IgG(Abcam)染色。然后通过显微镜对符合试剂盒禁止标准的内皮管数量进行量化，所有实验独立进行三次。
(四)qRT-PCR荧光测试
用TRIzol试剂盒从子宫组织样品中分离总RNA，然后用PrimeScript RT试剂(TaKaRa Biotech,Japan)制备cDNA，然后根据所提供的指示通过3’RACE(rapidamplification ofcDNA ends)PCR扩增，用于扩增的引物见表S1，在评估基因相对表达时，使用磷酸脱氢酶(GAPDH)作为标准化对照。
表S1
Figure BDA0002908038880000131
Figure BDA0002908038880000141
(五)人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、管腔形成
人脐静脉内皮细胞(HUVECs；从ATCC购买)在共培养***中使用Transwell分析过滤器(孔径8μm，美国康宁)评估增殖、迁移和管形成能力。下腔加入HUVECs(4×104)，上腔加入AgNO3水凝胶200μL和/或20μg脂肪干细胞外泌体进行增殖和成管实验。
Ki67免疫荧光染色评价HUVECs的增殖。细胞用4％多聚甲醛固定，用0.1％TritonX-100渗透，用抗Ki67染色(1:2000)；然后用AF488结合二抗(Abcam)检测，采用DAPI进行核反染，使用ImageJ软件检测Ki67阳性细胞数量。
在迁移实验中，HUVECs(4×104)被添加到Transwell实验过滤器的上室，100μL的AgNO3-水凝胶，10μg的脂肪干细胞外泌体，或两者的组合添加到下室。然后细胞在37℃下培养18h，之后将上室膜上的细胞固定，用0.5％结晶紫染色，然后显微镜定量。
为了评估脂肪干细胞外泌体对HUVEC管形成的影响，将HUVEC用生长因子还原基质(BD Biosciences,USA)在24孔板(1×104个细胞/孔)中培养，使用AgNO3-水凝胶或脂肪干细胞外泌体混合水凝胶培养16小时。然后通过显微镜对五个随机视野中的管进行评估，并使用血管生成分析仪进行ImageJ分析。
在薄型子宫内膜动物模型中，腹腔注射青霉素3-5天以防止细菌感染。然而，在模型大鼠中，术前和术后都没有使用这些抗生素。术后1周，采用金黄色葡萄球菌免疫荧光染色法检测Ag+的抗菌活性。该分析表明，相对于使用脂肪干细胞外泌体处理的动物(每个斑点51.5个细菌)，使用AgNO3混合脂肪干细胞外泌体处理的动物显示出细菌的大幅度减少(每个斑点6±1个细菌)。
(六)生育能力测试
子宫内膜容受性是根据子宫内膜允许受精卵着床和为发育中的胎儿提供适当营养的能力来评估的。采用***涂片法评估大鼠的发情周期状态。术后8周，雌性大鼠(上述5个治疗组各20只)在发情当天以1:1的比例与性成熟雄性大鼠交配，并在第二天上午评估是否有***栓，在18天后观察***栓外观，评估每组的胎儿数量、大小和重量，以及胚胎位置。
(七)组织和免疫组织化学染色
首先将切除的组织切片在4％多聚甲醛中过夜固定，然后用16％乙二胺四乙酸脱盐，嵌入到OCT，评估子宫内膜纤维化情况。切片根据所提供的说明进行H&E和Masson三色染色。通过免疫组织化学染色评估子宫内膜纤维化和血管生成水平。用5％BSA阻断20μm厚的切片，然后在4℃与兔抗CD31(1:100；Abcam)和兔抗α-SMA(1:100)孵化过夜。PBS洗3次，加入第二兔抗IgG室温孵育1h。此外，用金黄色葡萄球菌免疫荧光染色来测定制备的AgNO3混合脂肪干细胞水凝胶的抗菌性能。新鲜子宫内膜组织样品也在-80℃保存，然后进行qRT-PCR和Westernblotting分析。
(八)免疫印迹
裂解缓冲液(200μL)裂解细胞后，每个样品用10％SDS-PAGE分离20mg蛋白，转移到PVDF膜上。然后用特异性的脂肪干细胞外泌体抗体(CD63,CD9)或子宫内膜容受性和血管生成的生物标志物，包括兔抗LIF(1:5000；Abcam)，兔抗IGF-1(1:1000；Abcam)，兔抗VEGF(1:500；Abcam)。其次，用第二兔抗(1:5000；Abcam)进行检测，以兔抗β-肌动蛋白(1:5000；Abcam)进行控制。ImageJ软件(美国国立卫生研究院)用于蛋白质带的密度分析。
(九)流式细胞术
将脂肪干细胞外泌体重悬于分离缓冲液中，与CD9免疫磁珠混合10分钟，4℃孵育过夜，室温孵育1小时。然后利用磁铁分离未结合的外泌体。剩余的珠状外泌体在200μL的分离缓冲液中洗涤两次，然后在200μL的分离缓冲液中重悬。与抗-CD63和抗-CD9(Abcam)室温孵育30分钟，8000×g离心1分钟。然后丢弃上清，将标记的外泌体重悬于PBS中，然后用合适的AF488共轭二抗(Abcam)标记。然后样品在8000×g下再旋转1分钟，然后丢弃上清，再用100L PBS重悬两次PBS洗涤，然后使用FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)评估外泌体染色。
(十)统计分析
数据采用±SD(标准差)，使用SPSS 22.0进行评估。数据采用单因素方差分析进行比较，然后采用图基多重比较检验，P＜0.05表示差异显著。
结果例(一)脂肪干细胞外泌体的表征
首先从腹股沟脂肪组织样本中分离脂肪间充质干细胞，观察到分离的脂肪间充质干细胞迅速扩张，呈纺锤形，成纤维细胞样生长模式(如图2A)。免疫荧光染色显示90％的脂肪间充质干细胞表现出SOX2多能性标记ECM标记物纤维连接蛋白和层粘连蛋白呈阳性。流式细胞术分析显示，这些标志物CD90(99.7％±4.3％)、CD105(95.8％±4.7％)和CD44(98％±5.3％)均为阳性(如图2B)，而CD11b、CD31、CD34、CD83、CD133和MHC-II均为阴性(数据未显示)。
然后采用差速离心法分离来自这些脂肪间充质干细胞的外泌体，通过扫描电镜(SEM)、免疫印迹法(Westernblotting)、流式细胞术(FCM)和可调电阻脉冲传感(TRPS)对这些外泌体进行表征。TRPS测量显示，这些脂肪干细胞外泌体大小为50-100nm(如图2C)，SEM显示其外貌为杯状或圆形，大小为50-100nm(如图2D)，与TRPS的结果一致。FCM证实这些外泌体高度纯净，外泌体表面标记物CD63和CD9均呈阳性(如图2E)，Western blotting同样显示出外泌体对CD9和CD63的高水平表达(如图2F)。这些数据表明，已经成功制备了脂肪干细胞外泌体。此外，还建立了外泌体释放谱(图2G-H)，并证明这些生物活性外泌体被有效地包裹在PEG水凝胶中，促进脂肪干细胞外泌体持续释放14天，释放率达到95％。
(二)水凝胶的表征
PEG-Ag水凝胶的制备如图3A所示。将PEG通过Ag-S配位与Ag+交联获得可注射的PEG-Ag，其能够负载脂肪干细胞外泌体。由于巯基-聚乙二醇溶液具有良好的流动性(图3B)，当巯基-聚乙二醇、AgNO3和外泌体溶液混合时，它们形成了包含脂肪干细胞外泌体的复合凝胶，巯基-聚乙二醇与AgNO3混合后形成了S和Ag之间的共价键，这种键合同时产生了Ag和Ag之间的相互作用，诱导了水凝胶的形成。在强烈的外部剪切力作用下，这些键被破坏，但这些力被移除后又重新生成交联网络。因此，我们假设这些水凝胶能够在注射后进行自我修复。通过SEM对水凝胶表面进行评估(图3C)，发现含有和不含脂肪干细胞外泌体的水凝胶之间没有显著差异，表明脂肪干细胞外泌体和PEG水凝胶成功结合。我们还证实，这些制备的水凝胶可以注射，并能够在去离子水(DI)溶液中保持其形状(图3D)。在PBS溶液中，外泌体水凝胶在4天内可以保持稳定，第4天外泌体水凝胶降解速度加快，10天后只有10％的质量在水平以下(图3E)。这种降解行为为脂肪干细胞外泌体在体内促进损伤子宫内膜组织再生和调节局部微环境提供了一种稳定的结构。
进一步评估了制备的脂肪干细胞外泌体水凝胶承受外部张力的能力。损耗模量(G”)能够承受接近60％的压力增加，而弹性模量(G’)持续下降(图3F和G)。采用流变仪来评估水凝胶的可恢复性，结果表明脂肪干细胞外泌体水凝胶能够保持胶体状态，在高剪切率之前能够保持粘度为7.5×105Pa·s，在高剪切率下，水凝胶的结构被破坏，粘度下降到0.7×105Pa·s。然而，在高剪切速率去除后的几秒钟内，水凝胶恢复到与施加剪切力之前类似的状态(图3H)。经过两步应变循环，这些PEG水凝胶的G’显著下降，而制备的ADSC-exo水凝胶的G’基本没有变化(图3I)。在图3J中，ADSCs-exo@hydrogel组累积释放Ag+在第2天为46.2±5.13％，在第12天增加到97.5±11.31％，高于PEG-Ag水凝胶组在12天时对Ag+的释放比例(89.7±7.49％)。同时，与ADSCs-exo水凝胶共培养1、3、5天后，进行活/死检测和CCK-8检测。如图3K所示，活/死染色显示，培养5天后，不同时间段的干细胞几乎都是活的，只有少量的死细胞，活细胞在1、3、5天的定量分析中没有显著差异。
(三)体外评估脂肪干细胞外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生物相容性
血管生成是指内皮细胞增殖、迁移和管形成形成新的血管以支持组织修复的过程。在此，我们评估了制备的脂肪干细胞外泌体水凝胶在3天治疗期后，基于免疫荧光Ki67染色，在体外影响HUVECs增殖的能力。分析显示，在脂肪干细胞外泌体水凝胶和脂肪干细胞外泌体处理组中，大多数细胞呈现Ki67阳性，而在其他处理组中Ki67阳性细胞较少(图4A)，相对于其他处理组，脂肪干细胞外泌体水凝胶组Ki67阳性最高(图4B)。因此，这些数据证实了脂肪干细胞外泌体水凝胶制剂能够促进体外内皮细胞的持续增殖，强调了它们在促进体内血管生成方面的潜力。
评估了用脂肪干细胞外泌体(25、50、75或100μg/mL)治疗HUVECs后的增殖情况。Ki67试验显示HUVEC增殖以剂量依赖的方式增加，在100μg/mL脂肪干细胞外泌体处理后增殖最显著。因此，对于临床应用脂肪干细胞外泌体的患者，同样的脂肪干细胞外泌体剂量可以作为一个单一的治疗单位使用。为了减少潜在副作用的风险，最初只使用了1/5的脂肪干细胞外泌体。由于未观察到副作用，单位剂量逐渐增加，以促进子宫内膜恢复。
进一步评估了脂肪干细胞外泌体水凝胶或外泌体预处理对HUVECs体外迁移和成管活性的影响。Transwell迁移化验显示脂肪干细胞外泌体治疗显著增强HUVEC迁移，这一效果能够进一步加强脂肪干细胞外泌体水凝胶治疗细胞(图4C和D)。与这些结果一致，最大管形成和更完整的管状结构观察脂肪干细胞外泌体水凝胶治疗HUVECs相对于其他测试治疗组(图4E和F)。总的来说，这些数据表明，随着时间的推移，PEG水凝胶介导的脂肪干细胞外泌体持续释放能够促进HUVECs的血管生成反应。
(四)子宫内膜厚度和腺体增生的体内分析
通过直接向子宫角注射无水乙醇建立大鼠子宫内膜损伤的体内模型。经过三个发情周期后，子宫内膜损伤通过适当的组织学分析进行评估。受损的子宫组织显示子宫内膜层明显变薄，在某些区域与子宫肌层难以区分。然而，在注射了脂肪干细胞外泌体水凝胶制剂的大鼠中，观察到显著的子宫内膜再生，证明细胞分布均匀，新生血管更为明显(图5A)。此外，基质组织在治疗动物中组织良好，具有适当的上皮和分泌腺组织。未损伤组子宫内膜厚度为500μm，自然修复组子宫内膜厚度明显降低至170μm。所有试验处理组的厚度都有所增加，尽管所有病例的最终厚度都小于未损伤组，但水凝胶混合干细胞外泌体组处理的大鼠最大厚度为410m，表明这种水凝胶制剂的强大再生潜力(图5C)。内皮组织内腺体数量的变化趋势与不同治疗组子宫内膜厚度的变化趋势一致。具体来说，平均有12.5腺体在大鼠水凝胶混合干细胞外泌体组，该值达到未损伤组的80％，并且是自然修复组的625％(图5D)，表明本发明的外泌体水凝胶能够极大促进组织再生。
据目前报道所知，对于大鼠，子宫内外泌体注射只能在腹部切口形成后进行，使用间充质干细胞来源的外泌体治疗子宫内膜较薄的人类患者将是一种简单的、非侵入性的程序。本发明的脂肪干细胞外泌体水凝胶能够通过软尖端导管向子宫颈注射，然后轻轻地放入子宫。在注射过程中超声引导可以看到导管在子宫内膜腔内的运动，从而最大限度地降低子宫内膜损伤的风险，未来有必要进行大规模的临床试验来评估这种治疗方法的疗效。
(五)水凝胶制剂体内血管生成和再生活性的评估
考虑到子宫内膜再生依赖于血管生成，以便为再生组织提供适当的氧气和营养供应，研究体外观察到的脂肪干细胞外泌体水凝胶水凝胶介导的新生血管(图3)是否与体内子宫内膜血管生成有关。为此，对子宫内膜组织进行内皮细胞标志物CD31染色，发现与自然修复组相比，干细胞外泌体组和水凝胶混合干细胞外泌体组的子宫内膜组织样品CD31染色明显升高(图6A)，其中以水凝胶混合干细胞外泌体组染色最高。相应的免疫组化染色结果同样表明，本发明的脂肪干细胞外泌体水凝胶明显增强了体内新生血管(图6A)。
为了评估子宫肌层再生，采用抗α-SMA染色组织切片(图6A)。虽然干细胞外泌体组在术后3个发情周期有明显的薄而连续的环状肌纤维层，但自然修复组或水凝胶组并非如此。相比之下，与水凝胶混合干细胞外泌体组相比，干细胞外泌体组动物的肌肉束数量显著增加(图6B)。定量显示，水凝胶混合干细胞外泌体组a-SMA染色面积明显高于干细胞外泌体组(图6B)。子宫角正常肌纤维形态如图5B所示。总之，这些结果表明，本发明的脂肪干细胞外泌体水凝胶能够促进子宫肌层的愈合和再生。
进一步进行了Masson三色染色来评估分离子宫切片内的胶原沉积，发现脂肪干细胞外泌体显著减轻子宫内膜纤维化和纤维化，而不是促进子宫内膜和肌纤维生长。这些数据还表明，根据各组胶原沉积的百分比，与水凝胶混合干细胞外泌体组处理相比，干细胞外泌体组抗纤维化活性显著降低。这表明本发明的脂肪干细胞外泌体水凝胶可以通过介导脂肪干细胞源性外泌体的持续释放，有效抑制炎症和纤维化，从而在大鼠子宫内膜损伤的情况下促进血管增殖和腺体增生。
(六)水凝胶制剂体内抗菌活性评价
既往资料提示宫内粘连(IUA)通常是由感染引起的，提示我们的脂肪干细胞外泌体水凝胶也可以减轻宫内感染。为了评估该水凝胶的抗菌活性，进行了金黄色葡萄球菌免疫荧光染色(图7A)。用干细胞外泌体组处理的动物，每个斑点显示出51±5个细菌，而用水凝胶混合干细胞外泌体组处理的动物，每个斑点显示出6±1个细菌，表现出更优异的抗菌性能。
(七)评估制备的水凝胶促进体内子宫内膜再生的能力
评估了与子宫内膜再生密切相关的ER和PR的表达，以及bFGF和VEGF的表达，通过介导血管通透性促进新生血管和内皮细胞的增殖，优化胚泡着床。在mRNA水平上，ADSCs-exo处理与VEGF、LIF、avβ3和IGF-1表达显著升高相关(图8A)，而ADSCs-exo@hydrogel处理组这些标志物的表达进一步升高。VEGF和IGF-1蛋白水平在这些治疗组中也观察支相同的趋势(图8B和C)。
评估了该外泌体水凝胶治疗子宫内膜再生的影响，每个小组在妊娠18天和20天收集胚胎植入率(图9)。未损伤组妊娠和着床率最高，而干细胞外泌体组和水凝胶混合干细胞外泌体组妊娠和着床率均显著升高(图9A)。这说明我们的脂肪干细胞外泌体水凝胶能够很好促进子宫内膜的功能再生，有利于生育能力的恢复。水凝胶混合干细胞外泌体组胚胎和新生儿发育正常，说明该治疗组子宫内膜形态和功能正常(图9B)。
对比例1
考查水凝胶的制备对其性能的影响，具体将实施例3中巯基-聚乙二醇(分子量3000Da)与脂肪干细胞外泌体的质量体积比调整为30mg：50μL，将制备的水凝胶作为水凝胶混合干细胞外泌体组对照1考查其对着床和妊娠实验结果的影响。
对比例2
考查水凝胶的制备对其性能的影响，具体将实施例3中巯基-聚乙二醇(分子量5000Da)与脂肪干细胞外泌体的质量体积比调整为30mg：150μL，将制备的水凝胶作为水凝胶混合干细胞外泌体组对照2考查其对着床和妊娠实验结果的影响。
对各处理组以及对比例的着床和妊娠数据进行统计，其结果如表1所示。从表1可以看出本发明获得的水凝胶是一种多功能水凝胶，能够促进控制外泌体释放，介导子宫内膜再生。
表1
Figure BDA0002908038880000241

Claims (4)

1.一种多功能微环境保护外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从动物组织样本中分离获得脂肪来源的间充质干细胞，进行消化后获取原代细胞进行继代培养，取继代培养后的脂肪干细胞备用；
（2）取脂肪来源的间充质干细胞，将其置于DMEM培养基中，于37℃下培养2周，然后采用超速离心法提取间充质干细胞释放的外泌体，所述超速离心法的步骤为：将收集的培养基上清800×g离心5分钟，2000×g二次离心10分钟，过滤上清，再于4 ℃下，100000×g离心90分钟；将获得的外泌体稀释至10 μg/mL后进行使用；
（3）取巯基-聚乙二醇溶解于步骤（2）的脂肪干细胞外泌体中得到混合物，所述巯基-聚乙二醇的分子量范围为1000-2000 Da，巯基-聚乙二醇与脂肪干细胞外泌体的质量体积比为30mg：100 μL；然后将浓度为0.1mol/L的AgNO3水溶液采用脂肪干细胞外泌体进行稀释，所述AgNO3水溶液与脂肪干细胞外泌体的体积比为3:4，再加入到上述混合物中，数秒钟后形成透明的多功能微环境保护外泌体水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述DMEM培养基中含有10%的胎牛血清和1 %的链霉素或青霉素。
3.一种如权利要求1或2所述方法制备得到的多功能微环境保护外泌体水凝胶。
4.一种如权利要求3所述的多功能微环境保护外泌体水凝胶的应用，其特征在于，是将其用于制备促进子宫内膜再生和生育能力恢复方面的药物。
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