CN112089847A - 一种融合pnv靶向缺血心肌血管的干细胞药物及制备方法 - Google Patents

一种融合pnv靶向缺血心肌血管的干细胞药物及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，包含心血管前体干细胞，心血管前体干细胞表面融合了血小板膜纳米囊泡PNV。本发明利用人体血小板膜糖蛋白受体天然向缺血心肌及粥样病变缺血血管靶向归巢的生物学特性，制备了血小板膜纳米囊泡PNV，并利用PNV包被心血管前体干细胞，制成干细胞药物。PNV不仅保留了血小板膜上的糖蛋白受体，可感知多种危险信号分子，且PNV不具有触发激活凝血的机制，是一种天然安全的靶向导航物质，可携带血管前体干细胞靶向归巢缺血病变心肌血管，实现对受损心肌血管精准修复的目的。本发明进一步采用Flk‑1+细胞、动脉外膜周细胞(APC)两种血管前体细胞及配合WJMSCs，能直接分化成具有血液灌注功能的血管。

Description

一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物及制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物及制备方法。
背景技术
血管病变所致的缺血性疾病如：冠心病、脑梗塞、肢体缺血性坏死，乃至眼缺血性失明...等，迄今为止，一直是世界死亡、致残原因之首。现代医学以药物、介入、手术、器官移植等手段均未能根本改善其预后。21世纪干细胞再生医学虽带来了新机。但遗憾的是，由于移植的细胞能够到达病变器官组织的很少，存留时间短，24h存留不及5-10％，这对干细胞修复心肌再生血管的实现产生极大障碍。
如何将移植的干细胞靶向归巢于缺血的心脏及血管，又能创伤小、安全适用于临床，是当前医学所面临的难题。国际上开展的干细胞靶向心肌的研究方法已有多种，如：早期应用双面抗体连接心肌损伤时短暂表达的肌球蛋白轻链(anti-MLC1)，及anti-CD90连接MSCs。但由于抗体FC存在，很容易在体内被免疫细胞吞噬，故效果差，易激发免疫反应。此外，还有研究采用外加磁场引导干细胞归巢的方法又受限于环境条件等。最近的基因修饰方法表达单链抗体连接的方式，仍存在因基因导入DNA导致DNA突变的风险。因此，迄今为止，尚没有安全可靠的方法可以解决外源输入的干细胞靶向归巢到缺血心肌血管的问题。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其所含干细胞为经血小板膜纳米囊泡(Platelet Nanovesicles，PNV)包覆的心血管前体细胞，该血小板膜纳米囊泡为心血管前体细胞提供了导航作用，携带着干细胞靶向归巢缺血病变心肌血管。此外，由于制备的血小板膜纳米囊泡(PNV)表面表达CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)受体，去掉了血小板膜内的凝血信号***。因此，不会触发及激活血小板介导的凝血机制，无促血栓形成等不良反应及风险。无凝血触发机制，但保留了血小板膜上糖蛋白受体，能感知多种危险信号分子，因而构成了安全且天然生物导航***，促进移植的细胞靶向归集到缺血病变心肌血管，促成干细胞修复心肌再生血管。
本发明还进一步包括上述融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物的制备方法。需要说明是，所述干细胞药物为任何能够保证干细胞活性并达到病变器官组织的剂型，包括但不限于注射剂。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其包括：心血管前体干细胞，所述心血管前体干细胞表面包被了血小板膜纳米囊泡PNV；
其中，所述血小板纳米囊泡保留了血小板膜上糖蛋白受体，去掉了血小板膜内的凝血信号***。
根据本发明较佳实施例，其中：所述心血管前体干细胞包含华通胶间充质干细胞WJMSCs、动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞。
根据本发明较佳实施例，其中：所述动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞是以新生儿遗弃的脐带为材料来源，从脐动脉外膜中提取的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和人脐带动脉外膜周细胞APC。
根据本发明较佳实施例，其中：在所述心血管前体干细胞中，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1∶40-60∶80-120混合。
优选地，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1∶50∶100进行混配。
根据本发明较佳实施例，其中：所述血小板纳米囊泡为从新生儿脐带血血小板中提取。
根据本发明较佳实施例，其中：所述药物为注射液，所述注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2％～0.25％。
根据本发明较佳实施例，所述注射液的规格为2mL/管，每管中细胞总数量为(1.5～2.5)×107。
根据本发明较佳实施例，所述注射液还含有生理盐水，生理盐水为注射液的溶剂。
另一方面，本发明还提供一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物的制备方法，其包括如下步骤：
S1：血小板纳米囊泡(PNV)的制备；
S2：心血管前体细胞CVPSCs的制备；
S3：采用步骤S1制备的血小板纳米囊泡(PNV)融合步骤S2制备的心血管前体细胞CVPSCs，得到PNV-CVPSCs；
S4：以该PNV-CVPSCs制成干细胞药物。
需要说明的是，步骤S1-S2的顺序并不限制，只要完成血小板纳米囊泡PNV的制备、心肌血管前体细胞CVPSCs的制备即可。
根据本发明较佳实施例，其中：步骤S1中，血小板纳米囊泡(PNV)的制备过程如下：
S1-1：以新生儿脐带血为材料来源，先采用离心方法除去红细胞，制备富血小板血浆，再加入EDTA和***素E1(PGE1)的PBS溶液，再次离心，沉淀分离血小板，向血小板加入EDTA的PBS溶液，并与蛋白酶抑制剂混合，-80℃下储存；
S1-2：室温解冻血小板3500-4500g离心，用含蛋白酶抑制剂PBS溶液洗涤三次，用水重悬，使用水浴超声波仪在42kHz的频率和100W的功率超声处理4-6分钟后得到血小板纳米囊泡(PNV)，冻存。
根据本发明较佳实施例，其中：在步骤S1-1和步骤S1-2之间还包血小板表面标志检测：对步骤S1-1的产物采用流式细胞术检测血小板表面标志CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)的表达。
根据本发明较佳实施例，其中：在步骤S1-2之后还包括对PNV的形态学检查，蛋白质印迹分析(Western blot analysis)和免疫组化检测；具体地，对步骤S1-2的产物使用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)，根据形态学检查结果表征PNV的存在；蛋白质印迹分析PNV的CD42b(GPIbα)，PNV CD41(GPIIb/IIIa)表达水平；免疫组化检测PNV表面标志CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)。通过前述检测，确认PNV表面表达CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)受体，表征着PNV制备成功。
根据本发明较佳实施例，其中：所述心血管前体细胞CVPSCs包含华通胶间充质干细胞WJMSCs、动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞；更优选地，其中动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞是从脐动脉外膜中提取的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和人脐带动脉外膜周细胞APC。
其中，当心血管前体细胞CVPSCs是由华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞按比例混合组成时，其制备方法如下：
S2-1：人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的制备，其包括按顺序进行的如下步骤：从新生儿新鲜脐带中提取人脐带动脉外膜Flk-1+细胞，经纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养，以完成低氧培养后的Flk-1+细胞备用；
S2-2：人脐带动脉外膜周细胞APC的制备，其包括按顺序进行的如下步骤：从新生儿新鲜脐带中提取人脐带动脉外膜周细胞APC、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养，完成低氧培养后，保留CD140和CD146双阳性细胞备用；
S2-3：华通胶间充质干细胞WJMSCs的制备，其包括按顺序进行的如下步骤：从新生儿新鲜脐带中提取WJMSCs、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养，以完成低氧培养后的第二代或第三代WJMSCs备用。
优选地，步骤S2-1、S2-2、S2-3还分别包括一个细胞冻存步骤，即将完成了低氧培养的细胞，洗涤后，加入含8-12％DMSO的完全细胞培养基中充分混匀，细胞浓度为1.5×107～2.5×107/mL，使用程序降温仪以0.5～1.5℃/min的速度降温，当温度降至-80℃时，将细胞放入液氮冻存，以备需要时取用。
根据本发明较佳实施例，其中：所述步骤S2还包括S2-4，即预混合培养步骤：将步骤S2-1至S2-3制备的人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三种细胞按比例混合培养，混合细胞数量比为1∶40-60∶80-120；优选是按1∶50∶100进行混合培养。
根据本发明较佳实施例，其中：步骤S3的方法为：
S31：将冷冻保存的血小板纳米囊泡反复冻融2次以上，15000-16500g离心4-10分钟，弃去上清，收获PNV纳米囊泡，加入PBS，形成PNV悬液；
S32：将混合培养且汇合度达到90％以上的FLK-1+细胞、APC、WJMSCs细胞混合物，加入胰酶消化细胞，待细胞收缩后，加入无血清细胞培养基终止消化，离心收集细胞，用PBS重悬细胞，制备成心血管前体细胞CVPSCs混悬液；
S33：将CVPSCs混悬液贴壁缓缓加入PNV悬液中，将混合后的PNV和CVPSCs混悬液在室温900-1200rpm离心，弃去上清，加入聚乙二醇凝胶，温和吹打重悬，然后将其置于37-37.5℃中孵育4-8min，加入无血清细胞培养基终止融合，室温900-1200rpm离心，弃去上清，沉淀即为血小板纳米囊泡融合的心血管前体细胞PNV-CVPSCs。
优选地，对上述步骤S3的处理结果的检测指标包括：采用免疫荧光鉴定PNV-CVPSCs融合细胞情况，流式细胞仪检测PNV-CVPSCs表达PNVCD42b(GPIbα)、PNVCD41(IIb/IIIa)，Western blot检测PNV-CVPSCs表达PNVCD42b(GPIbα)，PNVCD41(IIb/IIIa)，CCK8法检测PNV包被细胞增殖力，ELISA测定分泌生长因子、VEGF、FGF-2、IL-6、TGF-β，体内PNV-CVPSCs归巢心脏检测。
根据本发明较佳实施例，其中：步骤S4中，所述干细胞药物为注射剂，配制方法为：加入生理盐水和人血白蛋白，配制成细胞浓度为(0.75-1.25)×107个/ml的注射液，人血白蛋白的质量浓度为0.2％～0.25％。上述注射液，按照单管规格分装密封，优选以2ml为一个包装单位，于液氮中低温保存备用，或4-8℃运输即刻应用。
(三)有益效果
本发明的有益效果包括：
(1)本发明利用了人体血小板膜糖蛋白受体天然向缺血心肌及粥样病变缺血血管靶向归巢的生物学特性，制备成血小板膜纳米囊泡(Platelet Nanovesicles，PNV)，并利用该PNV包被心血管前体干细胞，制成可治疗缺血性心肌血管病变的干细胞药物。该血小板膜纳米囊泡保留了血小板膜上的糖蛋白受体，能够感知各种危险信号分子，是一种天然的向缺血心肌及粥样病变缺血血管靶向归巢的导航物质，可以携带着干细胞靶向归巢缺血病变心肌血管，促进心血管前体干细胞靶向集中到缺血的心脏及血管，实现利用干细胞精准修复损伤的心肌血管的目的。
(2)本发明使用的血小板膜纳米囊泡(Platelet Nanovesicles，PNV)，保留了血小板膜上的糖蛋白受体，能够特异性感知血管内皮受损暴露的内皮下胶原、纤连蛋白、粘附分子、血管性假血友病因子(vWF)...等多种危险分子，利用血小板膜上的糖蛋白受体((GP)VI，GPIV，GPIb，GPIX，GPV GPIIb/IIIa))与这些危险分子的特异性相互作用关系，使PNV大量归巢到缺血心肌血管；与此同时，该血小板膜纳米囊泡PNV还去掉了血小板膜内的凝血信号***(经实验验证不存在增加凝血的风险)，不具有触发激活凝血的机制，因而不存在促血栓形成等不良反应的风险。
(3)优选地，本发明的血小板膜纳米囊泡取材于新生儿遗弃的脐带血中的血小板，具体是从新生儿脐带中收集脐带血，取材安全较容易，避免自体静脉取材困难及有创性的问题。新生儿脐带来源的血小板及由血小板制备的PNV为低免疫源性，排异反应小，可异体应用。
(4)本发明的由PNV包被的心血管前体干细胞包含动脉外膜Flk-1+细胞、动脉外膜周细胞(APC)、和华通胶中提取的间充质干细胞(WJMSCs)三种细胞按一定比例混合培养制备的心肌血管前体细胞(CVPSCs)。其中，Flk-1+细胞、APC为血管再生提供了直接的、特有的两种前体细胞，再通过WJMSCs补充、更新及构成的新生血管的细胞外基质成分，进一步形成血管再生信号***调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境，使心肌血管前体细胞(CVPSCs)具有向心肌血管分化成“能够传送血液的小动脉/微血管”的功能。本发明使用的心肌血管前体细胞(CVPSCs)的特定组成，突破了现有成体干细胞不能成功分化得到具有血液灌注功能小血管的障碍。
上述三种细胞组成的心肌血管前体细胞(CVPSCs)，不仅实现了胚胎干细胞、诱导型多能干细胞等才能达到的再生血管功能，而且避开了ESC，iPS难以应用于临床的缺陷。
(5)更进一步地，其中Flk-1+细胞、APC、WJMSCs是从新生儿脐带内动脉中提取的人脐Flk-1+细胞、人脐APC、人脐WJMSCs，其均仅表达HLA-ABC，不表达HLA-II类抗源HLA-DR，且因协同刺激抗源CD80和CD86而表达HLA-G，故为低免疫源性，排异反应小，可异体应用，可规模制备，可制成生物“注射剂药品”加以推广应用。
本发明优选从新生儿遗弃的脐带中提取人脐Flk-1+细胞、人脐APC、人脐WJMSCs，避免了自体静脉取材困难及有创性的问题。更重要的是，从脐带动脉外膜分离的高纯度周细胞APC、Flk1+细胞，其细胞活力和分化潜能(0.81±0.07，CCK8法OD值)、增殖力(0.76±0.08，24h增殖力，CCK8法OD值)远远强于自体大隐静脉来源周细胞及骨髓来源Flk-1+细胞。
(6)本发明首次采用具有导航功能的血小板纳米囊泡(PNV)与具有修复功能的心肌血管前体细胞(CVPSCs)相融合，制成细胞注射液，PNV与CVPSCs不是简单的混合，而是具有纳米结构的血小板纳米囊泡(PNV)结合到心肌血管前体细胞(CVPSCs)上，以PNV为导航***携带心肌血管前体细胞(CVPSCs)靶向受损的心肌和血管，提高干细胞修复受损心血管的效率。
附图说明
图1中，a为对照组CVPSCs孵育抗CD41、CD42b后的流式检测散点图；b为对照组CVPSCs孵育抗CD41、CD42b后的流式检测直方图；c为实验组PNV-CVPSCs孵育抗CD41后的流式检测散点图；d为实验组PNV-CVPSCs孵育抗CD41后的流式检测直方图；e为实验组PNV-CVPSCs孵育抗CD42b后的流式检测散点图；f为实验组PNV-CVPSCs孵育抗CD42b后的流式检测直方图。
图2中，a为对照组CVPSCs细胞核DAPI染色；b为对照组CVPSCs抗CD42b免疫荧光检测低表达；c为对照组CVPSCs抗CD42b与细胞核DAPI染色二种荧光重合低表达；d为实验组PNV-CVPSCs细胞核DAPI染色；e为实验组PNV-CVPSCs抗CD42b免疫荧光检测高表达；f为实验组PNV-CVPSCs抗CD42b与细胞核DAPI染色二种荧光重合高表达。
图3为细胞活力检测，其中a为对照组CVPSCs经Calcein-AM染色后活细胞着色绿色；b为实验组PNV-CVPSCs经Calcein-AM染色后活细胞着色绿色；c为对照组CVPSCs经PI染色后死亡细胞着色红色；d为实验组PNV-CVPSCs经PI染色后死亡细胞着色红色。
图4为CCK8检测细胞增殖力检测，其中a为经CCK8检测，PNV-CVPSCs吸光度值与CVPSCs比较无差异，CVPSCs在经PNV融合后增殖能力未减弱；b为计算PNV-CVPSCs与CVPSCs活细胞比率，两者无差异。
图5为PNV-CVPSCs和CVPSCs移植小鼠一个月后处死小鼠，小鼠心肌进行免疫荧光染色，进行共聚焦显微镜检测结果；其中a为PNV-CVPSCs移植组中归巢细胞激发的绿色荧光，b为PNV-CVPSCs移植组中归巢PNV染色激发的浅蓝色荧光；c为PNV-CVPSCs移植组中染CVPSCs的绿色荧光和染PNV的浅蓝色荧光重合；d为CVPSCs移植组中细胞激发的绿色荧光；e为CVPSCs移植组中细胞核染色激发的蓝色荧光；f为CVPSCs移植组中染色的绿色荧光和染细胞核的蓝色荧光重合。
图6为PNV-CVPSCs和CVPSCs移植小鼠一个月后处死小鼠，小鼠心肌进行TTC染色，测量心肌梗死面积结果；其中a为CVPSCs移植组心肌纵切面TTC染色后图，灰白色区域为心肌梗死瘢痕组织；b为PNV-CVPSCs移植组心肌纵切面TTC染色后图，灰白色区域为心肌梗死瘢痕组织。
具体实施方式
本发明的整体技术方案构思为：利用人体血小板膜糖蛋白受体天然向缺血心肌及粥样病变缺血的血管靶向归巢的生物学特性，制备出由血小板膜纳米囊泡(PlateletNanovesicles，PNV)，利用PNV融合心血管前体干细胞，使心血管前体干细胞在PNV的导航作用下，向缺血心肌及粥样病变缺血的血管靶向集中，提高心血管前体干细胞集中到达缺血心肌及粥样病变缺血的血管的量，以实现对受损的心肌和血管的精准高效的修复。
其中，制备的血小板膜纳米囊泡(Platelet Nanovesicles，PNV)有三大特性。第一、天然性。血小板膜纳米囊泡来自血小板。相比现有技术应用双面抗体连接心肌损伤时短暂表达的肌球蛋白轻链所带来的体内被免疫细胞吞噬，易激发免疫反应的问题，也避免了基因修饰方法存在基因导入DNA导致DNA突变的风险。第二、精准导航性。血小板膜纳米囊泡PNV保留了血小板膜上的糖蛋白受体，能够感知各种危险信号分子，因而其保留了血小板膜受体的靶向性，可携带着心血管前体干细胞靶向归巢缺血病变心肌血管。第三、安全性。血小板膜纳米囊泡PNV，去掉了血小板膜内的凝血信号***，不具有触发激活凝血的机制，不存在促血栓形成等不良反应的风险。据实验验证，PNV融合的心血管前体细胞PNV-CVPSCs未增加凝血风险。
血小板是从骨髓中成熟巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。血管内皮则提供循环血小板、血细胞与内皮下胶原之间的天然屏障。当心肌及血管受到病毒细菌侵袭或缺血性损伤时，内皮受损暴露了内皮下胶原、纤连蛋白、粘附分子、血管性假血友病因子(vWF)...等多种危险分子，这些危险分子因与血小板膜上的糖蛋白(GP)VI，GPIV，GPIb，GPIX，GPV GPIIb/IIIa)等多种受体可相互作用，故能够募集大量血小板归巢到缺血心肌血管。
血小板膜纳米囊泡的制备是应用水浴超声波仪在频率为42kHz、功率为100W的超声条件下处理5分钟。通过使用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)，根据形态学检查结果来验证PNV的存在。应用Western blot、免疫组化、流式细胞仪鉴定CD42b(GPIbα)，CD41(IIb/IIIa)受体存在。
本发明的更优的技术方案构思为：为了实现有效血管再生及心肌修复，直接选用了两种心血管前体细胞(APC，Flk-1+)，并为血管再生提供了特有微环境(WJMSCs)，即细胞外基质成分，从而构成了血管再生信号***调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境。在体外研究发现，在血管内皮生长因子、骨肽蛋白、成纤维生长因子的条件下，形成了以内皮细胞为血管内膜，周细胞***内皮细胞周围与其整合，并与外层基底膜、及周细胞分化来源的平滑肌细胞共同形成了具有传送血液功能的小血管。这一方法不仅实现了胚胎干细胞、诱导性多能干细胞等才能达到的再生血管效应，同时还避开了ESC，iPS难以应用于临床的缺陷。
在上述方案的基础上，进一步优化使PNV、动脉外膜周细胞APC，动脉外膜Flk-1+细胞的材料来源均为新生儿遗弃的脐带血和脐带。一方面，制备PNV时从新生儿脐带中收集脐带血，取材安全较容易，避免自体静脉取材困难及有创性的问题。新生儿脐带来源的血小板及由血小板制备的PNV为低免疫源性，排异反应小，可异体应用。另一方面，从新生儿脐带内动脉中提取的人脐Flk-1+细胞、人脐APC、人脐WJMSCs，均仅表达HLA-ABC，不表达HLA-II类抗源HLA-DR，且因协同刺激抗源CD80和CD86而表达HLA-G，为低免疫源性，排异反应小，可异体应用。再一方面，从脐带动脉外膜分离的高纯度周细胞APC、Flk1+细胞，其细胞活力和分化潜能(0.81±0.07，CCK8法OD值)、增殖力(0.76±0.08，24h增殖力，CCK8法OD值)远远强于自体大隐静脉来源周细胞及骨髓来源Flk-1+细胞，可缩短心血管再生周期。
以下为本发明的具体实施例。
实施例1
本实施例的融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物具体为一种注射剂。以下结合本实施例，说明本发明融合PNV靶向缺血心肌血管的注射液的制备过程和功效特点。
以新生儿遗弃的脐带血和脐带为材料来源，从脐带血中提取血小板制备血小板膜纳米囊泡PNV。从脐动脉外膜中分别提取Flk-1+细胞和脐带动脉外膜周细胞APC，从脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织中提取华通胶来源的WJMSCs，将这三种干细胞按比例混合培养，得到心血管前体干细胞CVPSCs，再用PNV融合CVPSCs制备成PNV-CVPSCs，利用血小板膜糖蛋白受体天然向缺血心肌及粥样病变缺血的血管靶向归巢的生物学特性，血小板膜纳米囊泡保留了血小板膜受体靶向性，构成了安全天然生物导航***，携带CVPSCs胞靶向归巢缺血病变心肌血管，PNV-CVPSCs制备成注射剂，用于靶向精准治疗缺血性心脏病、缺血性血管病等疾病。
为了制备上述PNV-CVPSCs干细胞注射剂，需要预先制备PNV和三种干细胞，最后将PNV-CVPSCs分散于生理盐水中，配制得到注射液，PNV-CVPSCs的制备过程如下：
(一)血小板膜纳米囊泡PNV的制备方法，其过程为：
1、血小板提取及表面标志鉴定，无菌收取产妇废弃的脐带全血，将脐带全血分装至50ml离心管中，200g离心18min，取上清液，并进一步以200g离心5min除去剩余的红细胞，收取上清液即为富血小板血浆PRP，将终浓度为1mM EDTA和2mM***素E1(PGE1)加入到PRP中，使血小板失活，800g离心15min使血小板沉淀，除去上清液后，将血小板重悬于1ml含有1mM EDTA的PBS中，并与蛋白酶抑制剂混合(终浓度为1×)，置于-80℃储存。
流式细胞术检测血小板表面标志CD41(GPIIb/IIIa)及CD42(GPIba)，将洗涤的血小板加入PBS充分混匀，800g离心力离心15min，弃上清，将血小板沉淀，加入PBS使血小板重悬，将细胞平均分成4管，每管0.5ml并将血小板悬液放置于流式管中，在其中2管细胞悬液中分别加入荧光标记抗体(CD41(GPIIb/IIIa)及CD42(GPIba))25ul孵育30分钟，此为检测组。在另外2管血小板悬液中加入PBS 25ul孵育30分钟，此为空白组。再将以上各管以800g离心力离心10min，弃上清，每管中加入0.5mL PBS重悬血小板，流式细胞仪分别检测CD41(GPIIb/IIIa)及CD42(GPIba)血小板百分比。
流式细胞术检测结果如图1所示。a为对照组CVPSCs孵育抗CD41、CD42b后的流式检测散点图；b为对照组CVPSCs孵育抗CD41、CD42b后的流式检测直方图；c为实验组PNV-CVPSCs孵育抗CD41后的流式检测散点图；d为实验组PNV-CVPSCs孵育抗CD41后的流式检测直方图；e为实验组PNV-CVPSCs孵育抗CD42b后的流式检测散点图；f为实验组PNV-CVPSCs孵育抗CD42b后的流式检测直方图。
流式细胞检测PNV-CVPSCs与CVPSCs比较CD41阳性率为34.30％，PNV-CVPSCs与CVPSCs比较CD42b阳性率为37.16％(融合率)，表明血小板纳米囊泡成功融合到CVPSCs上，且融合率超过10％，具有实际实施应用的前景。
2、血小板纳米囊泡(PNV)制备及鉴定：室温下解冻血小板，4000g离心3分钟沉淀血小板，充上清，再加入含蛋白酶抑制剂PBS溶液充分混匀，4000g离心3分钟沉淀血小板，充上清，此为洗涤血小板，再重复洗涤血小板二次，用水重悬，使用水浴超声波仪以42kHz的频率和100W的功率超声处理5分钟，制备血小板纳米囊泡PNV，置于-80℃储存。
通过使用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)，根据形态学检查结果来验证PNV的存在，使用NanoSigh分析仪和荧光显微镜，进行纳米颗粒跟踪分析验证PNV的存在；使用免疫印迹分析(Western blot analysis)技术检测PNVCD42b(GPIbα)，PNVCD41(IIb/IIIa)表达水平；使用免疫组化检测法检测PNV表面标志PNVCD42b(GPIbα)、PNVCD41(IIb/IIIa)表达。
图2中，a为对照组CVPSCs细胞核DAPI染色；b为对照组CVPSCs抗CD42b免疫荧光检测低表达；c为对照组CVPSCs抗CD42b与细胞核DAPI染色二种荧光重合低表达；d为实验组PNV-CVPSCs细胞核DAPI染色；e为实验组PNV-CVPSCs抗CD42b免疫荧光检测高表达；f为实验组PNV-CVPSCs抗CD42b与细胞核DAPI染色二种荧光重合高表达。
免疫荧光检测PNV-CVPSCs较CVPSCs高表达CD42b，表明血小板纳米囊泡成功融合到CVPSCs。
(二)脐带动脉外膜Flk-1+细胞制备方法，其过程为：
1、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的提取：取新鲜脐带，PBS漂洗，洗去脐带残留的血液，沿脐动脉的走向剪开华通胶，沿脐带动脉腔将脐动脉纵向剪开，其断面处由外到内仅两层，分别为外膜和内膜，用带齿镊子在剪开的脐动脉断面处撕除内膜后，再撕取脐动脉的外膜，将撕取的脐动脉外膜放于无菌皿中剪成尽可能细小的碎沫状。
将剥离下来的脐动脉外膜碎片放入无菌细胞培养瓶中，在培养瓶中加入无血清细胞培养基，将培养瓶放入36-37℃、体积浓度为5％二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。待细胞贴壁后将细胞培养瓶中培养基更换为改良的内皮细胞(EC)生长培养基，以后每2-5天更换细胞培养基，显微镜下观察细胞生长情况，至细胞铺满瓶底的80％以上。
2、Flk-1+细胞纯化：
制成单细胞悬液：弃细胞培养瓶中的培养基，加入PBS冲洗瓶底，弃冲洗液，加入浓度为0.08％-0.15％的胰蛋白酶，并均匀地铺满瓶底，此为此为消化细胞步骤；1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩，加入细胞培养基中止消化，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液。
洗涤细胞：将单细胞悬液移到离心管中，加入PBS混匀，(100-200)g离心10-20min，弃上清液，此为洗涤细胞，再重复前述步骤把细胞洗涤一遍。
分选：弃上清后，加入细胞分选缓冲液，调整细胞浓度为2×107/mL，加入一抗Flk1、CD34抗体，每1×106细胞加入0.25μg，4℃孵育30min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心4-10分钟洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，调整细胞浓度为2×107/mL；加入二抗包被的磁珠，每1×106细胞加入5μL二抗包被的磁珠，8-15℃孵育10-15min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀得到细胞悬液，加入分选缓冲液的量为500μL/108个细胞；预先用缓冲液冲洗分离柱，把柱子安装到磁场中，把细胞悬液加入到柱子中，用缓冲液冲洗柱子三遍，将柱子移开磁场到一新的离心管中，用少量缓冲液用力冲洗，把细胞冲洗到离心管中，收获的细胞，即为Flk-1+脐动脉外膜细胞。
3、3D培养：将Flk-1+细胞加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为(0.8-1)×105细胞/mL，此为水凝胶细胞悬液，在新的培养瓶中加入水凝胶细胞悬液，使每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×106细胞，在培养瓶中加入交联剂，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。
4、3D传代培养：3D培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入36-37℃PBS 10mL并放置于36-37℃水浴中，待水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入离心管中，(100-200)g离心力离心10-20min，弃上清，再加入水凝胶混匀，加入培养瓶中，使每个培养瓶中细胞数量为(0.8-1)×106细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1mL，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入无血清细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况，取第二、三代Flk-1+细胞进入下一工序。
5、低氧培养：取第二代Flk-1+细胞洗涤后，加入完全细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×105/mL，取10mL加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)x106，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养至60％融合时，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后进入下一工序。通过低氧培养，提高细胞耐性、活性和生存能力。
(三)脐带动脉外膜周细胞APC的制备方法，其过程为：
1、人脐带动脉外膜周细胞APC的提取：取剖腹产新鲜脐带，PBS漂洗2-4遍，洗去脐带残留的血液，洗去残留的血液，将其剪成小段，沿脐带动脉的走向剪开脐带，用有齿镊夹取脐动脉一端，撕取脐带两根动脉外膜层，撕取脐带动脉外膜层后，放入无菌平皿中，用PBS漂洗2-4遍从脐带动脉撕下来的脐动脉外膜。
把撕取下来的脐带动脉外膜移到离心管中，加入比脐动脉内膜体积量多5倍的浓度为0.2％～0.25％的II型胶原酶，把离心管密封，放置于水浴中，调整水浴的温度为36-37℃，此步骤为消化；消化60-90分钟后，加入与离心管中消化液同体积的无血清细胞培养基，用移液管充分混匀，(100-200)g离心8-20min，弃上清液，此为洗涤细胞；重复上述洗涤步骤，把细胞再洗涤2-4遍，弃上清，加入无血清细胞培养基充分混匀，形成细胞悬液，取一新的离心管，管口放置70μm过滤器，将细胞悬液通过过滤器将细胞过滤至新的离心管中。
计数过滤后的细胞悬液中的细胞，用无血清细胞培养基把细胞悬液配成(0.8-1)×105/mL的浓度，取10mL细胞悬液加入到细胞培养瓶中，再加入无血清细胞培养基，使细胞培养瓶中的总液体量为15mL，细胞总数为(0.8-1)×106，把细胞培养瓶放置于36-37℃，5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中，每天观察细胞，每三天半量更换细胞培养瓶中的培养基，待细胞融合度达90％以上，进入下一工序。
2、周细胞APC纯化：
制成单细胞悬液：弃细胞培养瓶中的培养基，加入PBS冲洗瓶底，弃冲洗液，加入浓度为0.08％-0.15％的胰蛋白酶，并均匀地铺满瓶底，此为消化细胞的步骤；放置1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩成圆形时加入无血清细胞培养基中止消化反应，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液。
洗涤细胞：将单细胞悬液移到离心管中，加入PBS混匀，(100-200)g离心10-20min，弃上清液，此为洗涤细胞，再重复前述步骤把细胞洗涤一遍。
分选：弃上清后加入细胞分选缓冲液，调整细胞浓度为2×107/mL，加入一抗CD140、CD146抗体，每1×106细胞加入0.25μg；4℃孵育30min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心5-10分钟洗涤；弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，调整细胞浓度为2×107/mL，加入二抗包被的磁珠，每1×106细胞加入5μL二抗包被的磁珠，8-15℃孵育10-15min；加入20倍体积分选缓冲液，300g离心7分钟洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，加入分选缓冲液的量为500μL/108个细胞，预先用缓冲液冲洗分离柱，把柱子安装到磁3场中，把细胞悬液加入到柱子中，用缓冲液冲洗柱子三遍，将柱子移开磁场到一新离心管中，用少量缓冲液用力冲洗，把细胞冲洗到离心管中，收取到的细胞，即为CD140+、CD146+脐动脉外膜周细胞(APC)。
3、CD140+、CD146+细胞3D培养：将CD140+、CD146+细胞悬液(100-200)g离心10-20min，弃上清液，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×105细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的细胞培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×106细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1mL，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。
4、CD140+、CD146+细胞3D传代培养：3D培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入36-37℃ PBS 10mL并放置于36-37℃水浴中，40-60min后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入离心管中，(100-200)g离心力离心10-20min，弃上清，再加入水凝胶混匀，加入到细胞培养瓶中，使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×106细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1mL，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况，取第二、三代CD140和CD146双阳性细胞(认定是周细胞APC)进入下一工序。
5、低氧培养：取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×105，取10mL加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)×106，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后进入下一工序。通过低氧培养，提高细胞耐性、活性和生存能力。
(四)人脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)制备，其过程为：
1、人脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)提取：取人新鲜脐带，使用等渗的平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成小段，将每一段脐带沿脐静脉腔剪开，再使用等渗的平衡盐溶液洗去静脉腔中残留的血液，将脐带平铺于无菌皿中，剔除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织，剪切成1立方毫米及以下块状，再以等渗的平衡盐溶液清洗剪成块状的华通胶组织。
华通胶间充质干细胞提取培养：在培养瓶中加入10mL无血清细胞培养基，将剪成块状的华通胶组织均匀放置于培养瓶中，将已放入华通胶组织的培养瓶放置于36-37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中进行培养，3天半量换液，5-6天可观察到有间充质干细胞贴壁生长，10-12天贴壁生长的华通胶间充质干细胞融合至80％以上，进入下一工序。
2、纯化
制成单细胞悬液：弃细胞培养瓶中的培养基，加入PBS冲洗瓶底，弃冲洗液，加入浓度为0.08％-0.15％的胰蛋白酶，并均匀的铺满瓶底进行消化，1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩，加入3mL细胞培养基中止消化，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液。
洗涤：将细胞悬液经过100μm筛网移到50mL离心管中，加入20mL PBS混匀，(100-200)g离心10min，弃上清液，此为洗涤细胞，可重复前述步骤把细胞洗涤一遍。
传代：加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×105/mL，将细胞悬液加入到细胞培养瓶中，使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×106细胞，此步骤为传代，将传代细胞放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中扩增培养，每三天换液，待细胞融合至80-90％时再传代培养，以便进入下一工序(或即时用于混合培养)。
3、WJMSCs的3D培养：将第二代WJMSCs细胞悬液以(100-200)g离心10-20min，弃上清液，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为(0.8-1)×105细胞/mL，此为水凝胶细胞悬液，在新的培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×106细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1mL，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。
4、WJMSCs的3D传代培养：3D培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入36-37℃ PBS10mL并放置于36-37℃水浴中，40-70min后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入50mL离心管中，(100-200)g离心力离心10m-20in；弃上清，再加入水凝胶混匀，加入细胞培养瓶中，使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×106细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1mL，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况，取第二、三代WJMSCs进入下一工序。
5、低氧培养：取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×105，取10mL加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)×106，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后进入下一工序。通过低氧培养，提高细胞耐性、活性和生存能力。
(五)人脐带动脉心肌血管前体细胞CVPSCs制备，其过程为：
分别在经过低氧培养后洗涤的人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs里加入无血清细胞培养基重悬细胞，使细胞的浓度分别为1×105/mL，取APC悬液0.1ml，取Flk-1+细胞悬液5ml，取WJMSCs悬液10ml共同加入一个底面积为75cm2的培养瓶中充分混匀，放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中扩增培养，使三种细胞的比例为1∶50∶100，每三天换液，待细胞融合至80-90％时，弃培养基，加入PBS 5ml轻轻冲洗瓶底，弃冲洗液，加入0.125％胰蛋白酶3ml，并均匀的铺满瓶底进行消化，1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩，加入3mL无血清细胞培养基中止消化，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液，即为CVPSCs悬液。比例设为1∶50∶100，主要是依据周细胞、Flk-1+细胞、WJMSCs在人体解剖学存在的位置特点及特殊的生理功能设计的配比。当周细胞与Flk-1+细胞二者比例在1∶50左右时最为适用于再生多数种器官的血管。而WJMSCs主要作用是为周细胞APC、Flk-1+细胞分化/再生血管提供微环境，其细胞数量占比相对更大一些。故本发明将三种细胞按其生物功能需要以1∶50∶100的数量比混合。
洗涤：将CVPSCs悬液经过100μm筛网移到50mL离心管中，加入20mL PBS混匀，(100-200)g离心10min，弃上清液，沉淀细胞为洗涤CVPSCs，可重复前述步骤把CVPSCs再洗涤一遍。
(六)血小板膜纳米囊泡PNV融合CVPSC制备，其过程为：
取出冷冻保存的血小板纳米囊泡PNV，放置于370C水浴复融，再-800C冷冻，反复冻融三次，将反复冻融过的PNV 16000g离心5分钟，弃去上清，收获PNV血小板纳米囊泡。
将步骤(五)中的CVPSCs加入PBS重悬，室温200g离心5min，弃去上清，加入50ulPBS重悬CVPSCs，制备成CVPSCs悬液，将CVPSCs悬液贴壁缓缓加入收获的PNV血小板纳米囊泡中，并使血小板纳米囊泡不被吹起，混合后的PNV和CVPSCs为PNV-CVPSCs混合液，在PNV-CVPSCs混合液中加入50ul聚乙二醇凝胶，温和吹打重悬，然后将其置于370C水浴孵育5min，加入5ml无血清细胞培养基终止融合，室温200g离心5min，弃去上清，沉淀即为血小板纳米囊泡融合的心肌血管前体细胞PNV-CVPSCs，加入生理盐水，200g离心力离心5min，弃上清进行洗涤PNV-CVPSCs，再重复上术洗涤流程2遍，将PNV-CVPSCs用生理盐水重悬，制备成注射液，放置于注射液药管中，每管中的细胞总数量为(1.5-2.5)×107，用生理盐水补充至2mL。
PNV-CVPSCs注射液经过安全性检测后，加入人血白蛋白，人血白蛋白的质量浓度为0.2％-0.25％，制备成每2mL人血白蛋白/生理盐水中含有(1.5-2.5)×107细胞数量为一个包装单位的注射液；密封，即时使用，或4-8度保存，12小时内使用。
(七)PNV-CVPSCs的鉴定，其过程为：
1、免疫荧光鉴定PNV-CVPSCs，把PNV-CVPSCs用无血清培养调整细胞的浓度为1×105/ml，制备成PNV-CVPSCs悬液，预先在六孔细胞培养板中放入22×22mm的无菌洁净玻片，在玻片上滴加1ml的PNV-CVPSCs悬液，使悬液完全铺满玻片，不流入六孔板中，放入培养箱，2小时后细胞完全沉到玻片上，再在六孔板中加入2ml无血清细胞培养基，将六孔板放入37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，此过程称为细胞爬片，当细胞汇合度达到80％以上时，开始进行染色处理，从六孔板中取出细胞爬片，用PBS漂洗一遍，滴加4％的多聚甲醛固定液固定细胞15min，用PBS漂洗三遍，每次约5min，用山羊血清封闭30min，加入FITC标记的CD42b抗体，避光孵育1h，PBS漂洗三遍，加入DAPI染核5min，PBS再漂洗三遍，加入20ul封片剂封片，共聚焦显微镜下检测CD42b阳性表达。
2、流式细胞仪检测PNV-CVPSCs CD42b(GPIbα)、CD41(IIb/IIIa)表达，其过程为：
将PNV-CVPSCs接种于六孔板中，同时平行接种未融合PNV的心血管前体干细胞CVPSCs作为对照细胞，每孔板接种细胞数量为1×105，加入无血清培养基量为3ml，放入37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，当细胞汇合度达85％以上时，弃培养基，加入PBS轻洗细胞，然后加入1ml浓度为0.125％胰酶370C消化细胞1-2min，待细胞收缩脱离六孔板时加入2ml无血清细胞培养基终止消化，细胞悬液移入15ml离心管中，200g离心力室温离心5min，弃去上清，收获细胞，再加入PBS 3ml洗涤2遍细胞，再在每管中加入0.5ml PBS，重悬细胞，每管中加入荧光标记的CD41、CD42抗体，室温避光孵育30min，加入PBS 5ml漂洗一遍，200g离心力室温离心5min，弃上清，在每管中加入0.5ml PBS重悬细胞，进行流式细胞仪检测CD41、CD42表达。
3、Western blot检测PNV-CVPSCs表达CD42b(GPIbα)、CD41(IIb/IIIa)，其过程为：
(1)PNV-CVPSCs总蛋白的提取：
弃掉PNV-CVPSCs培养瓶中的培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，同时提取未融合PNV的CVPSCs的蛋白一同检测做为对照，在细胞培养瓶中加入3ml 4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液，重复以上清洗操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液，将PBS弃净后把培养瓶置于冰上，配制1ml裂解液加10μl 100mM PMSF，摇匀置于冰上，制备成PMSF细胞裂解液，在细胞培养瓶中加400μl PMSF细胞裂解液，置于冰上裂解30min，将培养瓶要经常来回摇动使细胞充***解，裂解完成后，将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心5min，将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管，测定蛋白浓度，进入下一工序，或放于-20℃保存。
(2)电泳
制备10％的分离胶和4％的浓缩胶灌胶，将已测定的蛋白计算50ng蛋白的溶液体积为上样量，取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×(即工作液浓度)，上样总体积为15μl，上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性，加足够的电泳液后即开始上样，上样后即开始电流，电泳电压为40V，电泳时间为4.5小时。
(3)转膜
将硝酸纤维素膜剪好浸泡好，将夹子中的分离胶玻璃板取下，与硝酸纤维素膜、滤纸、海绵按顺序放好，排除气泡，放入转移槽中，并做好降温措施，进行电泳转膜，转膜电压为60V，转膜时间为2小时。
(4)免疫反应、显影
将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h，将一抗用TBST稀释，从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温下孵育1-2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min；同上述方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1-2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min，再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应；将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合，1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触，1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中显影；在PNV-CVPSCs中高表达CD42b、PNVCD41。
4、PNV-CVPSCs活力、增殖力检测，其过程为：
(1)Calcein-AM/PI(钙黄绿素-乙酰甲氧基甲酯/碘化丙啶)双荧光活细胞染色检测细胞的活力，把PNV-CVPSCs和CVPSCs分别用1×Assay Buffer充分清洗细胞2-3次，以充分去除残留的酯酶活性，再用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1×105～1×106细胞/mL，取100μL Calcein-AM/PI染色工作液加入200μL细胞悬液内，混匀，37℃孵育15-30min，Calcein-AM工作液浓度为2μM，PI工作液浓度为4.5μM，孵育结束后，荧光显微镜下使用490±10nm激发滤片同时检测活细胞染色绿色荧光，死细胞染色红色荧光(结果如图3)，在显微镜下计数5个高倍视野下绿色荧光细胞数/绿色荧光+红色荧光细胞数，即得到PNV-CVPSCs与CVPSCs细胞活率(图4b)，PNV-CVPSCs与CVPSCs活力无差异。
(2)CCK8检测PNV-CVPSCs增殖力，分别取数量为2×103的PNV-CVPSCs和CVPSCs置于96孔细胞培养板中，每孔中加入无血清培养基的体积为100ul，均做复孔，放入37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养2-3天，细胞处于对数生长期融合80％时，每孔加入10ul浓度为5mg/ml的CCK8溶液继续培养4h，结晶充分形成，将上清去掉，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪波长为490nm处测量各孔的吸光度值(OD值)。
图3为细胞活力检测结果。其中a为对照组CVPSCs经Calcein-AM染色后活细胞着色绿色；b为实验组PNV-CVPSCs经Calcein-AM染色后活细胞着色绿色；c为对照组CVPSCs经PI染色后死亡细胞着色红色；d为实验组PNV-CVPSCs经PI染色后死亡细胞着色红色。由检测结果可知，PNV-CVPSCs与CVPSCs活力无差异。
图4为CCK8检测细胞增殖力检测结果。a为经CCK8检测，PNV-CVPSCs吸光度值与CVPSCs比较无差异，CVPSCs在经PNV融合后增殖能力未减弱，b为计算PNV-CVPSCs与CVPSCs活细胞比率，两者无差异。由以上检测结果可知，CVPSCs融合PNV后增殖力未降低、活力未降低。
5、ELISA测定PNV-CVPSCs分泌HGF、VEGF、FGF-2、IL-6、TGF-β，其过程为：
(1)ELISA方法检测PNV-CVPSCs培养上清中细胞分泌因子：取PNV-CVPSCs低氧培养24小时，再放入37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养2天细胞融合90％后的培养上清，用ELISA方法分别检测：肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维生长因子-2(FGF-2)，白介素-6(IL-6)，转化生长因子-β(TGF-β)等因子分泌水平。
(2)具体方法如下：
包被孔板：用0.05M PH9牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
加样：在孔板中加细胞上清液0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔和阳性对照孔。
加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟，终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
结果判定：在ELISA检测仪上检测OD值，于450nm处，以空白对照孔调零后检测各孔OD值，减空白对照后计算LCMSCs培养上清中细胞分泌的肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维生长因子-2(FGF-2)，白介素-6(IL-6)，转化生长因子-β(TGF-β)等因子分泌水平。
检测的上清液中HGF中浓度最高，其次是VEGFA、FGF-2、IL-6、TGF-β。
6、体内PNV-CVPSCs归巢心脏检测，其过程为：
(1)小鼠急性心肌梗死模型建立：取20g的BALB/c小鼠，气管插管后，经皮左胸三四肋间开胸结扎心脏前降支，制作小鼠心肌梗死模型，术中心电图可见ST段明显抬高为心梗表现，术后7天，小鼠心脏超声较术前左心室收缩末面积(LVESA)、左心室舒张末面积(LVEDA)、左心室收缩末内径(LVEDS)增加、左心室舒张末内径(LVEDD)，左心室壁厚度、左心室射血分数(LVEF％)、左心室短轴缩短率(LVFS％)明显减低，心梗模型制作成功。
(2)细胞移植及超声、免疫荧光检测结果：将心梗小鼠分组，实验组为移植PNV-CVPSCs，对照组移植CVPSCs，并将两组细胞都转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，EGFP均转染入两组细胞的CVPSCs中，以方便在后续对小鼠心脏病理切片检测时可以准确定位移植细胞的存在。
将两组分别以1×106/kg的细胞数量通过鼠尾静脉移植入小鼠体内，1个月后超声检测PNV-CVPSCs实验组左心室收缩末面积(LVESA)、左心室舒张末面积(LVEDA)、左心室收缩末内径(LVEDS)、左心室舒张末内径(LVEDD)比对照组显著缩小，PNV-CVPSCs实验组左心室短轴缩短率(LVFS％)比对照组增加(表1)，PNV-CVPSCs实验组左心室壁厚度、左心室射血分数(LVEF％)比对照组明显增加。一个月后处死小鼠，取心脏并进行心肌冷冻切片免疫荧光染色，共聚焦显微镜检测，移植PNV-CVPSCs和CVPSCs因移植前两种细胞转染了EGFP，在488nm激发光时显示绿色荧光；使用荧光标记的抗CD41抗体染色的上述病理切片，检测含有PNV的存在，显示天蓝色荧光；DAPI染色细胞核为蓝色；经共聚焦显微镜检测，PNV-CVPSCs移植组可见绿色荧光，并在相同的位置可见染PNV的浅蓝色荧光，二者能完美的重合(图5上方三组图片)，证明PNV-CVPSCs有较好的归巢作用；而CVPSCs移植组可见少量的绿色荧光，在相同的位置未见浅蓝色荧光，见有少量的染细胞核的蓝色荧光，只有少量的CVPSCs绿色荧光和细胞核蓝色荧光重合(图5下方三组图片)。由此证明，PNV-CVPSCs较CVPSCs归巢作用明显更强(图5)。
如表1所示，为超声心动图检查结果。小鼠移植PNV-CVPSCs和CVPSCs后一个月，2维超声心动图一致性显示了AMI小鼠经静脉注射PNV-CVPSCs后1个月，明显限制了心室重构，保护了心脏功能。
表1：二维超声心动图对比结果
Figure BDA0002659339960000261
注：LVESA：左心室收缩末面积；LVEDA：左心室舒张末面积；LVFS：左心室短轴缩短率；LVESD：左心室收缩末内径；LVEDD：左心室舒张末内径(*P＜0.05：AMI+PNV-CVPSCs vsAMI+CVPSCs)
由上表可知，急性心肌梗死小鼠移植PNV-CVPSCs和CVPSCs 1个月后，小鼠移植PNV-CVPSCs组心脏左心室收缩末面积、舒张末面积、收缩末内径、舒张末内径均明显比CVPSCs组减低，小鼠移植PNV-CVPSCs组明显限制了心室重构，保护了心脏功能。
图5为PNV-CVPSCs和CVPSCs移植小鼠一个月后处死小鼠，小鼠心肌进行免疫荧光染色，进行共聚焦显微镜的检测结果。其中a.为PNV-CVPSCs移植组中归巢细胞激发的绿色荧光；b为PNV-CVPSCs移植组中归巢PNV染色激发的浅蓝色荧光；c为PNV-CVPSCs移植组中染CVPSCs的绿色荧光和染PNV的浅蓝色荧光重合；d为CVPSCs移植组中细胞激发的绿色荧光；e为CVPSCs移植组中细胞核染色激发的蓝色荧光；f为CVPSCs移植组中染色的绿色荧光和染细胞核的蓝色荧光重合。
(3)小鼠心肌检测：小鼠处死后，取心肌进行TTC染色测量梗死面积，小鼠心肌经冷冻切片后进行TTC染色，计算心肌梗死面积，实验组心肌梗死面积低于对照组。病理学检测，小鼠心脏取出后4％多聚甲醛溶液固定，石蜡切片，HE染色，镜下检查，实验组心肌梗死产生的瘢痕组织少于对照组。以上实验结果表明，实验组移植PNV-CVPSCs较对照组移植CVPSCs取得较好的治疗效果。
图6所示为PNV-CVPSCs和CVPSCs移植小鼠一个月后处死小鼠，小鼠心肌进行TTC染色，测量心肌梗死面积的实验结果。图6中，a为CVPSCs移植组心肌纵切面TTC染色后图，灰白色区域为心肌梗死瘢痕组织；b为PNV-CVPSCs移植组心肌纵切面TTC染色后图，灰白色区域为心肌梗死瘢痕组织。结果显示，PNV-CVPSCs移植组小鼠心肌梗死面积明显较CVPSCs对照组小。
在小鼠心肌梗死模型，经鼠尾静脉注射PNV-CVPSCs 1x106个细胞/kg(体重)一个月后，进行病理检测，结果显示：PNV-CVPSCs注射组小鼠心肌梗死面积明显较CVPSC组小。
7、PNV-心血管前体干细胞对凝血影响的鉴定(安全性鉴定)：
采用促血栓试验来评估PNV装饰是否促进凝血，
将富血小板血浆(PRP)1ml置于比色管中，加入PNV-CVPSCs做为诱聚剂，细胞数量为1×104，同时平行做CVPSCs为对照组，用一涂硅的小磁粒进行搅拌，血小板逐渐聚集，血浆浊度降低，透光度增加，记录此变化，形成血小板聚集的动态曲线，以PRP的聚集率和透光度为0，乏血小板血浆(PPP)所测得的聚集率和透光度为100％，用血小板聚集仪进行自动测定、记录、描绘血小板聚集曲线，不同诱聚剂可产生不同类型的血小板聚集曲线，可见PRP加入PNV-CVPSCs和CVPSCs对血小板的聚集两者无变化。由此说明，本发明采用PNV融合心血管前体干细胞靶向归巢受损或病变心肌血管，进入人体血管内不会产生凝血、促血栓形成等不良反应的风险，具有安全性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (15)

1.一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，其包括：心血管前体干细胞，所述心血管前体干细胞表面包被了血小板膜纳米囊泡PNV；其中，所述血小板纳米囊泡保留了血小板膜上糖蛋白受体，同时去掉了血小板膜内的凝血信号***。
2.根据权利要求1所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，所述心血管前体干细胞包含华通胶间充质干细胞WJMSCs、动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞。
3.根据权利要求2所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，所述动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞是以新生儿遗弃的脐带为材料来源，从脐动脉外膜中提取的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和人脐带动脉外膜周细胞APC。
4.根据权利要求3所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，在所述心血管前体干细胞中，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1∶40-60∶80-120混合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，所述血小板纳米囊泡为从新生儿脐带血血小板中提取。
6.根据权利要求1所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，所述药物为注射液，所述注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2％～0.25％。
7.一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1：血小板纳米囊泡PNV的制备；
S2：心血管前体细胞CVPSCs的制备；
S3：采用步骤S1制备的血小板纳米囊泡PNV融合步骤S2制备的心血管前体细胞CVPSCs，得到PNV-CVPSCs；
S4：以该PNV-CVPSCs制成干细胞药物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，血小板纳米囊泡PNV的制备过程如下：
S1-1：以新生儿脐带血为材料来源，先采用离心方法除去红细胞，制备富血小板血浆，再加入EDTA和***素E1(PGE1)的PBS溶液，再次离心，沉淀分离血小板，向血小板加入EDTA的PBS溶液，并与蛋白酶抑制剂混合，-80℃下储存；
S1-2：室温解冻血小板3500-4500g离心，用含蛋白酶抑制剂PBS溶液洗涤三次，用水重悬，使用水浴超声波仪在42kHz的频率和100W的功率超声处理4-6分钟后得到血小板纳米囊泡(PNV)，冻存。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1-2之后还包括：形态学检查、蛋白质印迹分析和免疫组化检测；
形态学检查是指对步骤S1-2的产物使用动态光散射和透射电子显微镜，根据形态学检查结果表征PNV的存在；
蛋白质印迹分析PNV的CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)表达水平；
免疫组化检测PNV表面标志CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述心血管前体细胞CVPSCs是由华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞按比例混合组成；
其制备方法如下：
S2-1：人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的制备，其包括按顺序进行的如下步骤：从新生儿新鲜脐带中提取人脐带动脉外膜Flk-1+细胞，经纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养，以完成低氧培养后的Flk-1+细胞备用；
S2-2：人脐带动脉外膜周细胞APC的制备，其包括按顺序进行的如下步骤：从新生儿新鲜脐带中提取人脐带动脉外膜周细胞APC、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养，完成低氧培养后，保留CD140和CD146双阳性细胞备用；
S2-3：华通胶间充质干细胞WJMSCs的制备，其包括按顺序进行的如下步骤：从新生儿新鲜脐带中提取WJMSCs、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养，以完成低氧培养后的第二代或第三代WJMSCs备用。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤S2-1、S2-2、S2-3还分别包括一个细胞冻存步骤，即将完成了低氧培养的细胞，洗涤后，加入含8-12％DMSO的完全细胞培养基中充分混匀，细胞浓度为1.5×107～2.5×107/mL，使用程序降温仪以0.5～1.5℃/min的速度降温，当温度降至-80℃时，将细胞放入液氮冻存，以备需要时取用。
12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2还包括S2-4，即预混合培养步骤：将步骤S2-1至S2-3制备的人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三种细胞按比例混合培养，混合细胞数量比为1∶40-60∶80-120。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤S3的方法为：
S31：将冷冻保存的血小板纳米囊泡反复冻融2次以上，15000-16500g离心4-10分钟，弃去上清，收获PNV纳米囊泡，加入PBS，形成PNV悬液；
S32：将混合培养且汇合度达到90％以上的FLK-1+细胞、APC、WJMSCs细胞混合物，加入胰酶消化细胞，待细胞收缩后，加入无血清细胞培养基终止消化，离心收集细胞，用PBS重悬细胞，制备成心血管前体细胞CVPSCs混悬液；
S33：将CVPSCs混悬液贴壁缓缓加入PNV悬液中，将混合后的PNV和CVPSCs混悬液在室温900-1200rpm离心，弃去上清，加入聚乙二醇凝胶，温和吹打重悬，然后将其置于37-37.5℃中孵育4-8min，加入无血清细胞培养基终止融合，室温900-1200rpm离心，弃去上清，沉淀即为血小板纳米囊泡融合的心血管前体细胞PNV-CVPSCs。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，对步骤S3的处理结果的检测指标包括：采用免疫荧光鉴定PNV-CVPSCs融合细胞情况，流式细胞仪检测PNV-CVPSCs表达PNVCD42b(GPIbα)、PNVCD41(IIb/IIIa)，Western blot检测PNV-CVPSCs表达PNVCD42b(GPIbα)，PNVCD41(IIb/IIIa)，CCK8法检测PNV包被细胞增殖力，ELISA测定分泌生长因子、VEGF、FGF-2、IL-6、TGF-β，体内PNV-CVPSCs归巢心脏检测。
15.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述干细胞药物为注射剂，配制方法为：加入生理盐水和人血白蛋白，配制成细胞浓度为(0.75-1.25)×107个/ml的注射液，人血白蛋白的质量浓度为0.2％～0.25％。
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