CN112946281A - 一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其检测方法 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条，包括支撑板，支撑板表面从测试端到吸水端依次粘附有样品垫、试剂垫、检测区、吸水垫。所述试纸条的使用方法：采集待测样本加入磷酸盐缓冲液或水混匀；滴入检测试纸条的样品垫；水平放置5‑10分钟，在检测线和控制线处滴加氯化铜乙醇溶液，观察结果。本发明的试纸条在检测非洲猪瘟的整个过程，可直接利用猪全血，体液检测，具备方便、快速、经济、灵敏和特异等优点，特别适用于现场非洲猪瘟病毒检测、流行病学调查和生猪国际贸易检疫，具有实际应用意义。

Description

一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其检测方法
技术领域
本发明属于免疫分析、动物传染诊断技术领域，具体为一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其检测方法。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(英文名称：African swine fever virus，简称：ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，***、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。
非洲猪瘟与猪瘟的其他出血性疾病的症状和病变都很相似，他们的亚急性型和慢性型在生产现场实际上是不能区别的，因而必须用实验室方法才能鉴别。目前，实验室检测方法有以下几类：红细胞吸附试验；直接免疫荧光试验；动物接种试验；间接免疫荧光试验；酶联免疫吸附试验；免疫电泳试验；间接酶联免疫蚀斑试验。然而上述检测方法具备检测周期长或检测仪器要求高等等缺点，特别不适合ASFV的现场检测。
发明内容
为了解决现有技术中的检测非洲猪瘟病毒大多只能依靠实验室检测的缺陷，本发明提供了非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其检测方法，实现的目的为具备使用更加安全、可靠、快速的优点，解决了现有其他方法检测ASFV时需要特殊试剂设备的问题，需要再实验室检测的问题。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供的一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条，包括支撑板，支撑板表面从测试端到吸水端依次粘附有样品垫、试剂垫、检测区、吸水垫；试剂垫吸附有3,3',5,5'-四甲基联苯胺纳米颗粒标记的蛋白单克隆抗体；检测区设置有测试线、控制线，测试线上吸附有蛋白单克隆抗体，控制线上吸附有免疫球蛋白；该检测试纸条还包括显色剂，显色剂用于在检测之前滴涂在检测区上。本发明制备出的试纸条，TMB纳米颗粒的制备能够极大的提高TMB的负载能力，TMB分子的氨基能够与铜离子在乙醇溶液中配位形成黄色的铜离子络合物。TMB分子与铜离子具有极快的配位速度，在半分钟内能够观察到明显的颜色变化，从而实现了快速、精准的现场检测。
进一步的，所述试剂垫的制备方法由如下步骤制备：
(1)4℃下，在10mL 0.01mol/L，PH为7.4的磷缓冲溶液中加入25mg PEG、1mg BSA和0.1mg蛋白单克隆抗体，在磁力搅拌下缓慢滴加含5mg/mL TMB的DMSO溶液2mL，TMB溶液滴加完成后继续搅拌6小时；
(2)4℃5000rpm离心洗涤三次，冻干待用，以2μL/cm2的喷量将2mg/mL的步骤(1)制备好的3,3',5,5'-四甲基联苯胺纳米颗粒标记的蛋白单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上，37℃烘箱干燥1h即为试剂垫。
进一步的，所述蛋白单克隆抗体为衣壳蛋白P72蛋白单抗、P54蛋白单抗、P32蛋白单抗、五邻体蛋白单抗中任意一种。
进一步的，试剂垫吸附的3,3',5,5'-四甲基联苯胺纳米颗粒粒径范围为50nm-150nm。
进一步的，测试线上的蛋白单克隆抗体浓度为1.0mg/mL，控制线上的免疫球蛋白浓度为1.0mg/mL。
进一步的，显色剂为氯化铜乙醇溶液、溴化铜乙醇溶液、氯化铜乙氰溶液、溴化铜乙氰溶液、甲亚砜溶液中任意一种，显色剂的浓度为1-10mM。
本发明还提供了检测方法，包括如下步骤：
(1)采集待检测样本，猪全血或猪体液100μL加到400μL样品稀释液中，充分混匀1min；样品稀释液为PBS或水；
(2)取所述稀释待测样品200μL滴入样品垫，水平放置5min；
(3)在所述试纸条检测区滴涂1μL显色剂，若试纸条的检测线T与控制线C同时出现两条黄色条带，表示待测样品中含有非洲猪瘟病毒；若试纸条检测线T和控制线C仅显现一条黄色条带，表示待检测样品中不含有非洲猪瘟病毒；若试纸条未出现任何条带表明检测操作不当或检测卡失效。
综上，本发明采用上述技术方案，所具有的有益效果包括，本发明的试纸条在检测非洲猪瘟的整个过程，可直接利用猪全血，体液检测，具备方便、快速、经济、灵敏和特异等优点，特别适用于现场非洲猪瘟病毒检测、流行病学调查和生猪国际贸易检疫，具有实际应用意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中试剂垫吸附有TMB纳米颗粒标记的P72蛋白单克隆抗体的透射电子显微镜图像。
图2为本发明实施例1中试剂条的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。实施例中涉及到的原料均为商购所得。
实施例一：本发明提供的一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条，包括PVC支撑板，支撑板表面从测试端到吸水端依次粘附有样品垫、试剂垫、检测区、吸水垫；试剂垫吸附有3,3',5,5'-四甲基联苯胺纳米颗粒标记的P72蛋白单克隆抗体；检测区设置有测试线、控制线，测试线上吸附有P72蛋白单克隆抗体，控制线上吸附有免疫球蛋白；该检测试纸条还包括显色剂，显色剂用于在检测之前滴涂在检测区上，试剂垫吸附有TMB纳米颗粒标记的P72蛋白单克隆抗体如图1所示。
进一步的，所述试剂垫的制备方法由如下步骤制备：
(1)4℃下，在10mL 0.01mol/L，PH为7.4的磷缓冲溶液中加入25mg PEG、1mg BSA和0.1mg P72蛋白单克隆抗体，在磁力搅拌下缓慢滴加含5mg/mL TMB的DMSO溶液2mL，TMB溶液滴加完成后继续搅拌6小时；
(2)4℃5000rpm离心洗涤三次，冻干待用。以2μL/cm2的喷量将2mg/mL的TMB纳米颗粒复溶溶液喷涂于玻璃纤维膜上，37℃烘箱干燥1h即为试剂垫。
进一步的，试剂垫吸附的TMB纳米颗粒标记的P72蛋白单克隆抗体粒径范围为50nm-150nm。
进一步的，测试线上的P72蛋白单克隆抗体浓度为1.0mg/mL，控制线上的免疫球蛋白浓度为1.0mg/mL，检测线与控制线的距离为5mm。
采用玻璃纤维棉作为样品垫，0.2％Tween 20(v/v)的1xPBS溶液浸泡玻璃纤维棉，40℃真空干燥后室温干燥存放。
进一步的，显色剂为氯化铜乙醇溶液、溴化铜乙醇溶液、氯化铜乙氰溶液、溴化铜乙氰溶液、二甲亚砜溶液中任意一种，显色剂的浓度为1-10mM。本实施例以显色剂为氯化铜乙醇溶液为例，浓度为10mM。
试纸条的结构和外观如图2所示，并按如下操作组装试纸条：
(1)将25mm的检测膜粘附于66mm的PVC塑料底板；
(2)吸附18mm长的吸水滤纸，吸水滤纸与检测膜重叠2mm；
(3)吸附10mm长的试剂垫，试剂垫与检测膜重叠2mm；
(4)样品垫长15mm，与试剂垫重叠2mm；
(5)将组装的试剂条切割成4mm宽的条带，可以在外部套上塑料保护壳。
采用上述试纸条检测非洲猪瘟病毒，检测包括如下步骤：
(1)采集待检测样本，猪全血或猪体液100μL加到400μL样品稀释液中，充分混匀1min；
(2)取所述稀释待测样品200μL滴入样品垫，水平放置5min；
(3)在所述试纸条检测区滴涂显色剂，若试纸条的检测线T与控制线C同时出现两条黄色条带，表示待测样品中含有非洲猪瘟病毒；若试纸条检测线T和控制线C仅显现一条黄色条带，表示待检测样品中不含有非洲猪瘟病毒；若试纸条未出现任何条带表明检测操作不当或检测卡失效。本发明的检测原理为TMB与Cu2+配位显色：
Figure BDA0002913984630000041
特异性与灵敏性试验：
以PCR检测结果为标准。选择ASFV P72蛋白阴性猪全血去10份，人工感染ASFV后的ASFV P72蛋白弱阳性全血20份，ASFV P72蛋白强阳性全血20份，按上述程序采用本试纸条进行检测。结果显示：采用本试剂条检测ASFVP72蛋白阴性的符合率为90％(9/10)，弱阳性和强阳性的符合率为100％。
可重复性试验全血：
将上述10份ASFV P72蛋白全血、20份ASFV P72蛋白弱阳性及20份ASFV P72蛋白强阳性全血进行3次重复检测，结果显示每一份全血检测结果均一致，表明该试纸条具有良好的可重复性。
在此需要说明的是，本申请的蛋白单克隆抗体还可以使用P54蛋白单抗或P32蛋白单抗或五邻体蛋白单抗去替代，显色剂还可以使用浓度在1-10mM，例如浓度为1mM、5mM、2mM、8mM的溴化铜乙醇溶液或氯化铜乙氰溶液或溴化铜乙氰溶液或二甲亚砜溶液去替代，在实际试验时，与实施例一的效果均是一致的，检测结果正确率均大于90％，并且3次重复平行试验，检测结果均一致，具有良好的重复性，为了减少不必要的重复，节约篇幅，故不再逐一列举实施例。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条，其特征在于，包括支撑板，支撑板表面从测试端到吸水端依次粘附有样品垫、试剂垫、检测区、吸水垫；试剂垫吸附有3,3',5,5'-四甲基联苯胺纳米颗粒标记的蛋白单克隆抗体；检测区设置有测试线、控制线，测试线上吸附有蛋白单克隆抗体，控制线上吸附有免疫球蛋白；该检测试纸条还包括显色剂，显色剂用于在检测之前滴涂在检测区上。
2.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述试剂垫的制备方法由如下步骤制备：
(1)4℃下，在10mL 0.01mol/L，PH为7.4的磷缓冲溶液中加入25mg PEG、1mg BSA和0.1mg蛋白单克隆抗体，在磁力搅拌下缓慢滴加含5mg/mL TMB的DMSO溶液2mL，TMB溶液滴加完成后继续搅拌6小时；
(2)4℃5000rpm离心洗涤三次，冻干待用，以2μL/cm2的喷量将2mg/mL的步骤(1)制备好的3,3',5,5'-四甲基联苯胺纳米颗粒标记的蛋白单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上，37℃烘箱干燥1h即为试剂垫。
3.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述蛋白单克隆抗体为衣壳蛋白P72蛋白单抗、P54蛋白单抗、P32蛋白单抗、五邻体蛋白单抗中任意一种。
4.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，试剂垫吸附的3,3',5,5'-四甲基联苯胺纳米颗粒粒径范围为50nm-150nm。
5.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，测试线上的蛋白单克隆抗体浓度为1.0mg/mL，控制线上的免疫球蛋白浓度为1.0mg/mL。
6.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，显色剂为氯化铜乙醇溶液、溴化铜乙醇溶液、氯化铜乙氰溶液、溴化铜乙氰溶液、二甲亚砜溶液中任意一种，显色剂的浓度为1-10mM。
7.一种应用权利要求1-6任意一项所述的检测试纸条的检测方法，其特征在于，检测包括如下步骤：
(1)采集待检测样本，猪全血或猪体液100μL加到400μL样品稀释液中，充分混匀1min；
(2)取所述稀释待测样品200μL滴入样品垫，水平放置5min；
(3)在所述试纸条检测区滴涂1μL显色剂，若试纸条的检测线T与控制线C同时出现两条黄色条带，表示待测样品中含有非洲猪瘟病毒；若试纸条检测线T和控制线C仅显现一条黄色条带，表示待检测样品中不含有非洲猪瘟病毒；若试纸条未出现任何条带表明检测操作不当或检测卡失效。
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