CN116478837A - 库德里阿兹威毕赤酵母菌zb426及其在黄酒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426及其在黄酒中的应用，属于微生物技术领域。本发明的库德里阿兹威毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)ZB426，已于2022年10月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCCNo.62923。本发明的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426具有较强的产醇能力和强产酯能力。将该库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426应用与黄酒的发酵中，能显著提升黄酒关键风味物质含量，丰富黄酒香气，提升陈化黄酒质量。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426及其在黄酒中的应用。
背景技术
黄酒是我国特有的、历史最为悠久的传统酒种，酒性柔顺，酒体丰满，酒味醇厚。在黄酒酿造过程中，酒曲中的微生物不断消长、演替，稻米中有机大分子被逐级代谢、转化，风味物质随之产生、积累，最终赋予了黄酒酒体独特的风格。黄酒的风味物质主要来源于原料香、发酵香和陈化香。原料香是指黄酒酿造原料(粮食、麦曲、浆水等)自身所带的香气物质；发酵香是由发酵过程中微生物利用酒醪原料代谢生成；陈化香是指黄酒在陈化过程中各物质经物理化学变化形成的新的香气物质。其中发酵香是黄酒风味物质产生的最重要的途径，黄酒中大多数风味物质都是通过微生物的代谢作用而产生，因而在发酵过程产生的风味物质也影响陈化的风味。而酵母是黄酒酿造过程关键微生物，它不仅对发酵醪中的糖进行分解，产生乙醇，同时，伴随着大量香气代谢产物的生成，这些代谢产物的差异直接影响到黄酒的风味。在黄酒酿造过程中，一般存在两种类型的酵母，一类是产酒酵母，该类酵母发酵能力强，典型的是酿酒酵母，其具有高效发酵性能。另一类是产香酵母，其发酵能力较弱，但能产生酯酶将醇和酯结合，从而赋予黄酒浓郁的芳香。目前在黄酒行业中，酿酒所中使用的酵母主要为酿酒酵母，对于黄酒产香酵母的筛选及应用的研究和发明很少。
杨昳津(优良黄酒酵母的筛选及其抗逆性能分析，2015)从上海地区黄酒酿造企业的主发酵液、酒母和酒糟中分离得到4株起酵能力、产酒精能力和发酵性能较好的BR20、BR25、BR26和BR30菌株。经5.8S rDNA-ITS测序分析，鉴定分离筛选所得的4株菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，并且具有高浓度乙醇、高糖浓度、高浓度乳酸和高渗透压的耐受性。杨鲁君(黄酒酵母优良抗逆菌株的筛选、鉴定及发酵特性研究，2013)从黄酒厂的麦曲、酒药、发酵醪中分离到52株菌株，通过比较这些菌株的耐乙醇和渗透压的能力，筛选出抗逆性强的菌株F-18，起酵速度快，对糖的转化利用能力高，使黄酒中总酸、高级醇等含量适中，经测序鉴定其为酿酒酵母。吴丹丽(低产尿素与高级醇黄酒酵母菌株的筛选、鉴定与发酵，2019)通过发酵实验比较分离得到的5株具有产尿素与高级醇的能力酵母菌株，筛选出低产尿素和高级醇的菌株AW001和J-16-2，鉴定其均为酿酒酵母，所得样品中总糖、总酸等含量均满足国标中黄酒发酵指标。以“黄酒酵母筛选”为关键词在中国知网搜索关于黄酒酵母筛选的研究，研究数量很少，且多数是对黄酒酵母抗逆行及低产尿素和高级醇的研究，对产香酵母的筛选及应用的研究几乎没有。专利CN201210360165.0公开了一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母的方法，通过前处理得到稳定的药物(真菌抑制剂)抗性酵母菌，再从抗性酵母中筛选获得快速发酵黄酒酿酒酵母。该发明亦是着重于黄酒酵母抗逆性的筛选，而没有关注其对黄酒风味的影响。专利CN201210087666.6公开了一种大罐发酵黄酒专用酒母的制备工艺，其中三角瓶酵母液由XZ-10酵母液与XZ-11酵母液配制而成，但该发明中的XZ-10和XZ-11均为酿酒酵母。专利号CN201910622949.8公开了一种提高液化法黄酒质量的酿造方法，采用从绍兴黄酒小曲中筛选的扣囊复膜孢酵母与黄酒酵母菌混合培养制备高温糖化酒母，来达到改善黄酒的香气和口感的目的，该发明筛选出一株产酯酵母(扣囊复膜孢酵母)，但其产醇能力较弱，还需与酿酒酵母混合使用。
鉴于目前本领域对黄酒产香酵母的研究很少，筛选一株产酯能力较强、丰富黄酒风味，提升黄酒香气，成为行业急需解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一株库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426及其在黄酒中的应用，本发明的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426应用于黄酒制备中，能显著提高黄酒中风味物质的含量。
为实现上述目的，本发明提供一种库德里阿兹威毕赤酵母菌，所述库德里阿兹威毕赤酵母菌命名为库德里阿兹威毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)ZB426，已于2022年10月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCCNo.62923。本申请发明人从黄酒生产车间环境中，经培养、分离、纯化、筛选等步骤，得到一株库德里阿兹威毕赤酵母ZB426，该库德里阿兹威毕赤酵母ZB426具有产酯能力强的特点，将其应用于黄酒的酿造中，能增加黄酒关键风味物质含量，丰富黄酒香气，提升陈化黄酒质量。
作为本发明所述库德里阿兹威毕赤酵母菌的优选实施方式，所述库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426在制备黄酒中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述黄酒为清爽型黄酒。
本发明还提供所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426在提高黄酒中的风味物质的含量中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述风味物质包括乳酸乙酯、2,3-丁二醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、苯乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙缩醛、丁二酸二乙酯、丙位壬内酯、乙酸苯乙酯、γ-丁内酯中的至少一种。
乳酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、苯乙酸乙酯、丁酸乙酯被研究认为是黄酒的典型酯类物质，乳酸乙酯具有类似坚果、奶油香气或者水果香气，且在酒体中与各成分的分子间形成胶体溶液，具有较柔和的味觉，以适当的比例和含量存在于酒体中能减轻酒体的刺激感；乙酸乙酯呈香蕉或苹果水果香气，能协调各种香味物质的平衡；丙酸乙酯具有醚香、葡萄、苹果、香精、菠萝蜜的香气；苯乙酸乙酯有浓烈而甜的蜂蜜香气；丁酸乙酯有强烈的香蕉和菠萝果香香气。2,3-丁二醇是甜味成分，其含量的增加可以增强黄酒的浓厚感，中和黄酒苦涩感；乙缩醛具有愉悦清香气，似果香，带甜味，含量增加可使黄酒更加柔和醇甜。本申请发明人经分析发现，将本发明的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426应用于黄酒的发酵中，在发酵阶段就能增加黄酒风味物质含量、产生丰富的风味物质，进而促进黄酒陈化香，提升黄酒香气质量。
本发明还提供一种黄酒，所述黄酒采用所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426发酵得到。
本发明还提供一种黄酒的制备方法，所述方法将所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426加入酿酒原料中发酵得到黄酒。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供一株库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426及其在黄酒中的应用，本发明的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426具有较强的产醇能力和强产酯能力。将该库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426应用与黄酒的发酵中，能显著提升黄酒关键风味物质含量，丰富黄酒香气，提升陈化黄酒质量。
附图说明
图1为库德里阿兹威毕赤酵母ZB426的分离、筛选和应用的流程图；
图2为库德里阿兹威毕赤酵母ZB426的菌落形态图；
图3为库德里阿兹威毕赤酵母ZB426显微镜下的菌体形态图；
图4为库德里阿兹威毕赤酵母ZB426测序比对结果构建的***发育树；
图5：A为实施例2中对照组黄酒风味色谱图；B为ZB426发酵黄酒风味色谱图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，本发明通过下列实施例进一步说明。显然，下列实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，本发明实施例仅用于说明本发明的技术效果，而非用于限制本发明的保护范围。除非特别说明，否则本发明实施例中采用的方法和试验条件均为本领域常规使用的方法和试验条件，使用的试剂、设备和培养基均为本领域常规使用的试剂、设备和培养基，均可通过现有方法制备获得或通过市售购买获得。
实施例1库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426的分离与筛选
(1)培养：将配置好的麦芽汁培养基倒入平板，待平板凝固后，敞开放置于黄酒车间，2天后观察平板菌落生长情况；
(2)分离、纯化：挑选不同形态的酵母菌落，用麦芽汁培养基对分离得到的菌株通过平板划线法不断纯化；
(3)筛选：通过嗅闻的方式，得到一株产果香明显的产膜酵母，并对其进行镜检观察菌体形态，酵母菌落形态和菌体形态如图2、3所示，该菌株形状多为狭长的纺锤体，少量椭圆形，芽殖，菌落呈奶白色，中间微微凸起，边缘整齐，表面哑光不透明。将该菌转移至斜面管上保藏，并用于后续的试验中；
(4)扩培：将保藏于斜面管上菌株进行二级扩培，以收集足够量的菌体，保存待用；
(5)菌种鉴定与保藏：将保藏的库德里阿兹威毕赤酵母菌株ZB426送至北京诺禾致源科技股份有限公司测序鉴定，其基因序列如SEQ ID NO:1所示，结果为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。
经上述筛选分离以及鉴定，将菌株ZB426进行保藏。发明人已于2022年10月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，并命名为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)ZB426，获得的保藏号为GDMCC NO:62923。
(6)***发育树构建：将菌种鉴定测序结果导入NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行核酸序列Blast，根据比对结果挑选相似度超过97％菌株，下载其fasta格式序列文件。将下载的序列文件导入Mega 11软件进行序列比对，并根据比对结果构建***发育树，结果如图4所示。
实施例2库德里阿兹威毕赤酵母ZB426在制备清爽型黄酒中的应用
采用本发明的库德里阿兹威毕赤酵母ZB426制备清爽型黄酒，具体实验方法如下：
(1)液化：按照料液比1：1～1：3.5，称量一定量大米和水，投入糖化锅中，加入大米用量0.5‰～2‰液化酶，升温至90～98℃，保温60～90min，整个过程充分搅拌，避免糊锅；
(2)糖化：冷水降温至60～70℃，加入大米用量0.5‰～2‰糖化酶，保温1h～2h，整个过程充分搅拌，避免糊锅；
(3)冷却、投料：将糖化醪冷却至28～35℃，称重补充液化和糖化蒸发的水分，然后投入1～5‰ZB426酵母、5～15％酒曲，对照组投入1～5‰黄酒酵母、5～15％酒曲；
(4)发酵：于28～32℃前酵2～5d，后转入10～18℃后酵10～20d；
(5)压榨：使用珍珠岩作为助滤剂进行过滤，收集得到清酒；
(6)煎酒：于70～90℃下保持10～40min，进行灭菌；完成灭菌的酒于常温下贮藏并测定理化指标及酯类风味物质；
(7)陈化：于常温下存放3个月～1年，测序其理化指标及酯类风味物质含量。
对上述得到的新酒和陈酒的理化指标进行测定，理化指标按《GB/T13662-2018黄酒》测定，结果如表1所示。分别与对照组新酒和陈酒相比，使用酵母ZB426发酵所得清爽型黄酒的酒精度、总酸、氨基酸态氮和pH均稍高于对照组黄酒。
表1酵母ZB426应用于清爽型黄酒各项理化指标
对上述得到的新酒和陈酒的风味物质进行测定，使用Agilent 7890-5977GCMS对黄酒的风味物质进行测定，具体测试条件参数如下：SPME萃取条件：DVB/CAR/PDMS三相萃取头萃取，取5mL样品于20mL顶空瓶中，40℃、300RPM震荡孵化10min，萃取30min后，于250℃进样口热解析脱附10min进样。GCMS条件：色谱柱HP-INNOWAX(60M*0.25MM*0.25UM)；进样口温度250℃，初始温度40℃，保持5min；以5℃/min速度升温到250℃并保持10min；恒流模式，柱流速1.2mL/min；质谱接口温度250℃；离子源250℃，四极杆150℃；全扫描模式采集信号(29-550da)。定性定量分析：基于NIST 17标准谱库检索结果和保留指数(RI)对挥发性化合物定性，采用内标法计算挥发性化合物的浓度。结果如表2、图5所示。
表2酵母ZB426应用于清爽型黄酒关键风味物质分析(单位：mg/L)
乳酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、苯乙酸乙酯、丁酸乙酯被研究认为是黄酒的典型酯类物质，乳酸乙酯具有类似坚果、奶油香气或者水果香气，且在酒体中与各成分的分子间形成胶体溶液，具有较柔和的味觉，以适当的比例和含量存在于酒体中能减轻酒体的刺激感；乙酸乙酯呈香蕉或苹果水果香气，能协调各种香味物质的平衡；丙酸乙酯具有醚香、葡萄、苹果、香精、菠萝蜜的香气；苯乙酸乙酯有浓烈而甜的蜂蜜香气；丁酸乙酯有强烈的香蕉和菠萝果香香气；2,3-丁二醇是甜味成分，其含量的增加可以增强黄酒的浓厚感，中和黄酒苦涩感；乙缩醛具有愉悦清香气，似果香，带甜味，含量增加可使黄酒更加柔和醇甜。由表2可知，在风味物质方面，酵母ZB426发酵清爽型黄酒的新酒中，较对照组黄酒关键风味物质有明显提高，其中乳酸乙酯含量提高约52倍，2,3-丁二醇提高约9倍，乙酸乙酯提高约7倍，丙酸乙酯提高约5倍，苯乙酸乙酯提高约4倍，丁酸乙酯提高约2倍，乙缩醛提高约3倍。而在陈化半年的陈酒中，乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、丙位壬内酯、乙酸苯乙酯、γ-丁内酯含量仍在不同程度上有所增加。表明ZB426酵母菌种在发酵阶段就能增加黄酒风味物质含量、产生丰富的风味物质，进而促进黄酒陈化香，提升黄酒香气质量。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种库德里阿兹威毕赤酵母菌，其特征在于，所述库德里阿兹威毕赤酵母菌命名为库德里阿兹威毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)ZB426，已于2022年10月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.62923。
2.根据权利要求1所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌，其特征在于，所述库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426在制备黄酒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黄酒为清爽型黄酒。
5.权利要求1所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426在提高黄酒中的风味物质的含量中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述风味物质包括乳酸乙酯、2,3-丁二醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、苯乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙缩醛、丁二酸二乙酯、丙位壬内酯、乙酸苯乙酯、γ-丁内酯中的至少一种。
7.一种黄酒，其特征在于，所述黄酒采用权利要求1～2任一项所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426发酵得到。
8.一种黄酒的制备方法，其特征在于，所述方法将权利要求1～2任一项所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌ZB426加入酿酒原料中发酵得到黄酒。
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| CN117247850B (zh) * | 2023-10-18 | 2024-05-17 | 甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所 | 一株耐酸库德里阿兹威毕赤酵母gaas-jg-1及其在制备高酸度水果发酵酒中的应用 |
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