CN109232191A - 一种提取工业***叶中***二酚的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提取工业***叶中***二酚的方法，属于细胞生物学技术领域，该方法的步骤包括：取工业***叶片，干燥粉碎，加入细胞壁分解酶纤维素酶和果胶酶混合液后，水解，然后加入萃取溶剂搅拌萃取；将萃取上清液进行旋蒸得到油状物；在油状物中加入甲醇，低温离心获取上清液，对上清液活性炭脱色，脱色后过滤所得的滤液再次进行旋蒸；然后在旋蒸产物中加入氯仿溶解后通过有机膜膜过滤，即可获得工业***二酚溶液。本发明的方法可以大大提高***二酚的提取率，可以解决现有技术中存在的工业***叶片中***二酚提取率低的问题。具有快速，高回收率的特性。其方法设计合理、工艺安全可靠，具有良好的推广使用价值。

Description

一种提取工业***叶中***二酚的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体地说是一种提取工业***叶中***二酚的方法。
背景技术
工业***(Stevia rebaudiana Bertoni)为***科***属一年生雌雄异株的草本植物，广泛分布于世界各地。世界上***属植物主要有野生***(Cannabis ruderalisJanisch)、印度***(Cannabis indica Lam)和栽培***(Cannabis sativaL)3个种，在长期的生物进化过程中又产生了许多***变种和亚种。由于***中含有一种致幻成瘾的次生代谢产物—四氢***酚(tetrahydrocannabinol，THC)，因而成为公众熟知的毒品原植物之一。为了方便监管和合理使用，国际上将***中THC含量<0.3％的***品种定义不具备毒品利用价值的工业***。目前世界上种植工业***的国家已达27个，培育出的符合THC含量<0.3％的工业***品种26个。工业***植株高大，枝杈少，纤维含量高，其经济价值涉及造纸、纺织、建材、食品、医药等多个方面。
已有研究表明，工业***中非成瘾性成分***二酚(cannabidiol，CBD)具有抗炎、杀菌、镇痛、抗焦虑、抗精神病、抗氧化、改善学习记忆、神经保护和减少肠蠕动等作用，可用于治疗多发性动脉硬化与帕金森病、预防心肌梗死、阻断乳腺癌转移、抑制神经胶质瘤细胞转移和抑制性激素分泌等，也可用于治疗青光眼、截瘫与多发性硬化症病人的痉挛状态及运动障碍、癌痛、神经痛、偏头痛、癫痫等作用。因此，大力开发和利用工业***是一项利国利民和保护自然生态环境的绿色工程，其多样化制品具有广阔的国际市场。
目前，许多国家通过品种选育与改良、杂交与基因工程育种手段，已经选育出了很多优良工业***的新品种。我国也对工业***的种植和育种方面进行了不断的探索。如云南省农业科学院率先选育出云麻1号、云麻2号、云麻3号、云麻4号和云麻5号、云麻6号、云麻7号等多个云麻系列的工业***品种，这些品种在国内已有推广种植，如在内蒙古、黑龙江、安徽等地都有栽培应用。
但是，目前虽然对于工业***的药用成分***二酚的提取方法和分析已有较多研究报道，但这些提取方法不够完善，大多未采用细胞壁分解酶直接提取，导致***二酚提取的含量较低，而且虽然使用细胞壁分解酶也基本上单独用纤维素酶或者果胶酶，其结果虽然比不使用细胞壁分解酶对***二酚的得率有所提高，但毕竟工业***叶片细胞壁中含有大量纤维素和果胶质，所以利用纤维素酶和果胶酶同时作为提取溶剂，则***二酚含量的得率将有所提高。
因此，我们利用纤维素酶和果胶酶的混合液作为细胞壁分解酶，对工业***叶中***二酚的提取方法进行了优化和完善，旨在为更好地为工业***产业发展提供技术支撑。
发明内容
本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种提取工业***叶中***二酚的方法，该方法具有提高***二酚提取率的特点，可以解决现有技术中存在的工业***叶片中***二酚提取率低的问题。
本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种提取工业***叶中***二酚的方法的步骤包括：取工业***叶片，干燥粉碎，加入细胞壁分解酶纤维素酶和果胶酶混合液后，水解，然后加入萃取溶剂搅拌萃取；将萃取上清液进行旋蒸得到油状物；在油状物中加入甲醇，低温离心获取上清液，对上清液活性炭脱色，脱色后过滤所得的滤液再次进行旋蒸；然后在旋蒸产物中加入氯仿溶解后通过有机膜膜过滤，即可获得工业***二酚溶液。
工业***叶片选用云麻7号品种的工业***叶片。
细胞壁分解酶采用纤维素酶和果胶酶的混合液。
细胞壁分解酶的添加量为按工业***叶片重和酶液量1:10g:mL加入含有相对于工业***叶片质量浓度为0.5％的酶液量。
萃取溶剂采用正己烷。
甲醇的加入剂量按油状物与甲醇为1:5的质量比例加入甲醇。
上清液活性炭脱色采用在上清液中加入相对于油状物10％质量的活性炭脱色30min。
旋蒸过程采用旋转蒸发仪进行旋蒸。
一种提取工业***叶中***二酚的方法的优选工艺步骤是：称取干燥粉碎的工业***品种为云麻7号的叶片10g，按1g:10mL的比例加入含有相对于工业***叶片质量浓度为0.5％的酶量的纤维素酶和果胶酶混合液后，在摇床内水解1h，然后加入400mL萃取溶剂正己烷，置于转速为1000r/min的搅拌器中快速搅拌3.0h；将上清液在旋转蒸发仪上进行旋蒸得到油状物；按油状物与甲醇为1:5的质量比例加入甲醇，置于-40℃的低温条件下静置1h后，同等低温条件下离心获取上清液，在上清液中加入相对于油状物10％质量的活性炭脱色30min；脱色后过滤所得的滤液再次进行旋蒸；然后称取旋蒸产物，加入氯仿溶解5min后过0.22μm有机膜，即可获得工业***二酚溶液。利用高效液相色谱仪进行检测。
细胞壁分解酶在提取工业***叶中***二酚中的应用，细胞壁分解酶采用纤维素酶和果胶酶的混合液。
本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：
本发明的一种提取工业***叶中***二酚的方法可以大大提高***二酚的提取率，可以解决现有技术中存在的工业***叶片中***二酚提取率低的问题。
本发明的方法具有快速，高回收率的特性。
本发明的一种提取工业***叶中***二酚的方法设计合理、工艺安全可靠，具有良好的推广使用价值。
附图说明
附图1：为工业***品种‘云麻7号’植株；
附图2：为利用细胞壁分解酶提取后的CBD高效液相色谱图；
附图3：为对照的CBD高效液相色谱图；
附图4：CBD标样的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的一种提取工业***叶中***二酚的方法作以下详细说明。
如附图所示，本发明的一种提取工业***叶中***二酚的方法，利用国内优良工业***品种，通过高效液相色谱仪检测后，选取了CBD含量较高的工业***品种云麻7号，采取干燥粉碎的叶片作为原材料，利用细胞壁分解酶提取工业***叶片中***二酚，其方法具体如下：包括以下步骤：
(1)称取工业***叶片样品放入试管中，然后向试管中加入纤维素酶和果胶酶混合溶剂。
工业***叶片样品为干燥粉碎重量10.0g，试管中加入含有相对于工业***叶片0.5％的酶量的纤维素酶和果胶酶混合液体积为100ml，料液比为1:10(g:mL)，在摇床上摇动水解1h。
(2)将上述混合溶液在摇床上充分水解，并静置一段时间后，加入正己烷，并置于搅拌器中快速搅拌后，利用旋转蒸发仪旋蒸，其旋蒸产物中加入甲醇后离心获得上清液。
正己烷的体积为400mL，并在转速为1000r/min的搅拌器中快速搅拌3.0h。
旋蒸产物与甲醇为1:5的比例加入甲醇，置于-40℃的冰箱内静置1h后，低温条件下离心获取上清液，在上清液中加入相对于油状物10％的活性炭脱色30min。过滤所得的滤液再次进行旋蒸。
(3)将上述上清液中加入活性炭脱色后，过滤所得的滤液再次进行旋蒸。然后在旋蒸产物中，加入氯仿溶解后用有机膜过滤。即可获得工业***二酚溶液。利用高效液相色谱仪进行检测。得到样品中***二酚CBD组分的色谱峰面积，按照外标法以峰面积定量计算***二酚CBD的含量。
按1:50比例加入氯仿溶解5min后，过0.22μm有机膜。
实施例：
本发明的一种提取工业***叶中***二酚的方法的步骤是：称取干燥粉碎的工业***‘云麻7号’叶片10g，按1:10(g:mL)加入含有相对于工业***叶片0.5％质量的酶量的纤维素酶和果胶酶混合液后，在摇床内水解1h，然后加入400mL萃取溶剂正己烷，置于转速为1000r/min的搅拌器中快速搅拌3.0h。将上清液在旋转蒸发仪上进行旋蒸得到油状物。按油状物与甲醇为1:5质量比的比例加入甲醇，置于-40℃的冰箱内静置1h后，低温条件下离心获取上清液，在上清液中加入相对于油状物10％质量的活性炭脱色30min。过滤所得的滤液再次进行旋蒸。然后称取0.1g旋蒸产物，加入5mL氯仿溶解5min后过0.22μm有机膜，即可获得工业***二酚溶液。利用高效液相色谱仪进行检测。本发明具有快速，高回收率的特性。
此方法提取的结果表明，利用细胞壁分解酶提取的***二酚得率与未加细胞壁分解酶的对照得率显著提高。本发明的方法具有快速，高回收率的特性。
本发明提供的利用细胞壁分解酶提取工业***叶片中***二酚得率(0.23％)与未加细胞壁分解酶的对照得率(0.18％)相比，提高了1.28倍，由此提高了***二酚的提取效果。

Claims (10)

1.一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于该方法的步骤包括：取工业***叶片，干燥粉碎，加入细胞壁分解酶纤维素酶和果胶酶混合液后，水解，然后加入萃取溶剂搅拌萃取；将萃取上清液进行旋蒸得到油状物；在油状物中加入甲醇，低温离心获取上清液，对上清液活性炭脱色，脱色后过滤所得的滤液再次进行旋蒸；然后在旋蒸产物中加入氯仿溶解后通过有机膜膜过滤，即可获得工业***二酚溶液。
2.根据权利要求1所述的一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于：工业***叶片选用云麻7号品种的工业***叶片。
3.根据权利要求1所述的一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于：细胞壁分解酶采用纤维素酶和果胶酶的混合液。
4.根据权利要求1所述的一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于：细胞壁分解酶的添加量为按工业***叶片重和酶液量1:10g:mL加入含有相对于工业***叶片质量浓度为0.5％的酶液量。
5.根据权利要求1所述的一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于：萃取溶剂采用正己烷。
6.根据权利要求1所述的一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于：甲醇的加入剂量按油状物与甲醇为1:5的质量比例加入甲醇。
7.根据权利要求1所述的一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于：上清液活性炭脱色采用在上清液中加入相对于油状物10％质量的活性炭脱色30min。
8.根据权利要求1所述的一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于：旋蒸过程采用旋转蒸发仪进行旋蒸。
9.一种提取工业***叶中***二酚的方法，其特征在于该方法的步骤包括：称取干燥粉碎的工业***品种为云麻7号的叶片10g，按1g:10mL的比例加入含有相对于工业***叶片质量浓度为0.5％的酶量的纤维素酶和果胶酶混合液后，在摇床内水解1h，然后加入400mL萃取溶剂正己烷，置于转速为1000r/min的搅拌器中快速搅拌3.0h；将上清液在旋转蒸发仪上进行旋蒸得到油状物；按油状物与甲醇为1:5的质量比例加入甲醇，置于-40℃的低温条件下静置1h后，同等低温条件下离心获取上清液，在上清液中加入相对于油状物10％质量的活性炭脱色30min；脱色后过滤所得的滤液再次进行旋蒸；然后称取旋蒸产物，加入氯仿溶解5min后过0.22μm有机膜，即可获得工业***二酚溶液。
10.细胞壁分解酶在提取工业***叶中***二酚中的应用，其特征在于：细胞壁分解酶采用纤维素酶和果胶酶的混合液。
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