CN114057552A - 一种检测用***二酚标准物质的制备的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测用***二酚标准物质的制备方法。选取酚类物质基因相对表达量为7.0以上的工业***叶片并制浆,取5.0g该叶片浆样品与100mL质量分数80%的甲醇溶液,置于三角瓶中超声处理,时间15min、功率149W,然后在0.09MPa、65℃条件下,减压蒸馏除甲醇后备用。选取枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌,制备复合直投式发酵剂。复合直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01%,36℃静止发酵24h。发酵液经离心后取上清液经正己烷萃取后氮吹干燥,然后经甲醇溶解取上清液备用。制备表面均匀分布羟基的活化硅胶固相萃取柱,将上述上清液经固相萃取柱分离后,获得一种检测用***二酚标准品,经测定纯度范围为92.2%‑98.5%。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种检测用***二酚标准物质的制备方法,具体涉及一种荧光定量PCR技术和一种生物发酵技术,结合固相萃取技术制备一种检测用***二酚标准物质,属生物和化学领域。
(二)背景技术
***是***科***属一年生草本植物,是我国传统经济作物,具有重要的工业及药用价值,在我国已有5000多年的栽培利用历史。***的产品利用涉及纺织、造纸、军需、化工、建材、食品及制药等多个方面。***素是***植株中特有的含烷基和单萜基团的次生代谢物。目前,自***植物中分离得到的***素有70多种,主要包括THC(tetrahydrocan-nabinol,四氢***酚)、CBD(cannabidiol,***二酚)、CBC(cannabichromene,***环萜酚)、CBN(cannabinol,***酚)、CBG(cannabigerol,***萜酚)及其丙基同系物THCV、CBDV、CBCV和CBGV等。其中的CBD是***中的非毒性和非成瘾性成分,能阻碍THC对人体神经***的不利影响,是***酚类物质中最重要的生理活性成分之一,对于抗焦虑,镇痛、抗失眠、阿尔茨海默病和抗惊厥等有一疗效,并且具有治疗糖尿病、口腔疾病、风湿性疾病等生理活性功能,具有重要的临床应用前景。受遗传控制、生长环境和栽培条件影响,***CBD含量在个体之间存在差异,主要体现在***叶、种子和茎等部位中。研究发现***中CBD含量与***二酚酸合成酶基因(CBDAS)mRNA表达量之间呈正相关。目前***酚类物质含量的检测方法所用的标准物质均为化学合成,成本高、合成难度较大,限制了***酚类物质的检验,天然高纯度***酚类物质的制备尚属国内空白领域。
本发明利用荧光定量PCR,筛选CBD含量高的组织,采用生物发酵技术,将***中高分子纤维素水解后释放出***酚类物质,根据***二酚的分子量,制备COF修饰硅胶固定相,利用有机溶剂萃取,经色谱柱分离后获得一种纯度范围为92.2%-98.5%的检测用***二酚标准物质。该发明的实施填补了天然***二酚标准物质的制备的领域空白,实现我国对***酚类物质医药产品领域的初步突破。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种结合荧光定量PCR技术和生物发酵技术制备***二酚标准物质的方法。
本发明的目的是这样实现的:
1实验材料的选择
选取工业***叶片,液氮速冻,保存于-80℃。
1.1工业***叶片组织的RNA提取及反转录
提取工业***叶片的总RNA,浓度为415.6ng/μl,经DNase I消化处理后,反转录合成cDNA,反转录时体系中加入0.8μg RNA。并以此为模板进行荧光定量PCR反应。
1.2CBDAS的荧光定量PCR
以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应,复孔重复三次。使用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR中CBDAS的引物为:
CBDAS F:5’-ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT-3’
CBDAS R:5’-TTAATGACGATGCCGTGGAAG-3’
内参基因18S的引物为:
18S F:5’-CGCTCCTACCGATTGAATGG-3’
18S R:5’-CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC-3’
反应体系:
SYBR Green,Mix和引物混合物配制:
Mix 10μl
Primer F+R 1μl
SYBR Green(16μl)96孔板配制:
Mix+引物 8μl
cDNA 8μl
反应条件:40个循环
溶解曲线:
60℃ 60s
95℃ 30s
60℃ 15s
***植株中CBD合成酶活性有高低之分,进而决定了CBD的含量差异。CBDAS参与CBD合成酶的生物合成过程,进而产生***植物中的CBD,所以利用荧光定量PCR可对CBDAS进行定量分析。以内参基因作为衡量标准,利用2-ΔΔCt法计算得出***叶片中CBDAS相对表达量为7.0以上即可作为提取实验材料。
2***二酚粗提物的制备
2.1实验材料的预处理
选取工业***的叶片,洗净粉碎成叶片浆,于4℃储存备用。
2.2超声处理
取5.0g叶片浆样品与100mL质量分数为80%的甲醇溶液,置于250mL三角瓶中,进行超声处理。超声时间15min、超声功率为149W,该步骤制备的浆液为超声处理液。
2.3超声处理液真空蒸馏去除甲醇
真空度0.09MPa,蒸馏温度65℃,当超声处理液体积低于蒸馏前体积的30%即可停止蒸馏。
3工业***叶片的高分子纤维素的水解
3.1菌种的选择及培养基的制备
A菌—枯草芽孢杆菌CICC10089(Bacillus subtilis)培养基为:NaCl 5.0g,牛肉膏10.0g,蛋白胨10.0g,蒸馏水1.0L,pH 7.2。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
B菌—地衣芽孢杆菌CICC10831(Bacillus licheniformis)培养基为:蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,NaCl 10.0g,蒸馏水1.0L,pH7.0。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
3.2复合菌直投式发酵剂的制备
3.2.1菌种的活化
分别取10mL 0.9%的生理盐水于2只试管内,经121℃灭菌15分钟冷却至30℃,将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9%的生理盐水中,震荡使其溶解,在30℃恒温箱中静止活化30分钟,备用。
3.2.2菌种的扩大培养
3.2.2.1母发酵剂的制备
分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内,121℃灭菌15分钟冷却至30℃,按培养基体积的10%接种3.2.1步骤中已经活化的菌种,在36℃培养箱内静止培养24h,作为母发酵剂。
3.2.2.2生产发酵剂的制备
分别取上述两种培养基,分装于2只500mL三角瓶内,每瓶200mL,121℃灭菌15分钟冷却至36℃,分别按2%体积比例接种母发酵剂,36℃培养24—28h,检测2株菌发酵液活菌数,各发酵液活菌数≥109个/mL,视同为发酵成熟,如果活菌数<109个/mL,继续培养,直至达到109个/mL。
3.3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中,液面高度低于1cm,加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻,冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装,放入冻干机进行冷冻干燥,制备粉末冻干菌种。
3.4复合菌直投式发酵剂的制备
按各粉末冻干菌种重量,取A菌粉末3-5份,B菌粉末2-3份,充分混匀后制成复合菌直投式发酵剂,复合菌直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01%。
需要进一步说明的是:本发明中选用的菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,这些菌的活化、冻干方法不仅仅限于本发明所述的具体方法,培养基的成分也不限于此,其它常规技术和方法都是可以的,只要可以提高菌种的活力、并将其制备成冻干粉状而方便使用即可。
3.5复合菌直投式发酵剂水解工业***叶片中高分子纤维素
将经过2.3步骤处理获得的叶片浆按其重量的0.01%添加步骤3.4制备的复合菌直投式发酵剂,充分溶解后,36℃保温静止发酵24h。
4***二酚的纯化
4.1活化硅胶的制备
称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3=v/v),浸泡12h,在机械搅拌下回流24h除去金属离子,然后用G5砂芯漏斗过滤,用高纯水反复冲洗至中性,最后用丙酮洗涤两次,在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水,即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶,储于干燥器备用。
4.2COF修饰硅胶固定相
将180mg四-(4-氨基苯)乙烯和192.6mg 4,4'-联苯二甲醛溶解在9mL 1,4-二氧六环中,完全溶解后,加入到4.1制备的活化硅胶中,在超声条件下向其中缓慢滴加0.3mL6mol/L的醋酸,所得的混合液在常温条件下放置72h后,用N,N-二甲基乙酰胺和1,4-二氧六环交替洗涤,充分去除未反应的原料和杂质,洗干净的COF在60℃下真空干燥10h,最终获得橙黄色COF粉末。将得到的固体粉末用高纯水,乙醇,丙酮,三氯化碳分别洗涤3次,去除上层未连接到硅胶表面的COF,最终得到所需要的硅胶固定相。
4.3色谱柱的填装
将制得的COF修饰的硅胶固定相按照匀浆法(四氯化碳作为匀浆液,甲醇作为顶替液)装入清洗干净的不锈钢管色谱柱(4.6*150mm,5μm)中。称量2.5g COF修饰的硅胶加到100ml的烧杯中,接着加入50ml的四氯化碳。超声15min后快速倒入装柱机,打开泵,使压力迅速上升调整到25MP,保持10min,之后调整到40MP 40min后,关泵缓缓地降压。当压力降为零后,小心的卸下色谱柱,装上筛板与柱接头。标明方向(与装柱方向保持一致),柱子填料的名称,色谱柱的尺寸以及装柱的日期。新装的色谱柱用甲醇以0.2ml/min的流速冲洗12h,之后缓慢的增加流速直至1ml/min,待柱压稳定后开始使用。
4.4***二酚标准物质的制备
称取60mg COF吸附剂装入固相萃取小柱中(3ml规格),两端用聚丙烯筛板固定填料,制得标准化固相萃取柱。称取5.0g(精确到0.1g)发酵后的样品于50ml离心管中,加入50ml正己烷,涡旋混合2min;接着超声提取5min,6000r/min离心3min,取上清液于40℃水浴中氮吹至干。然后加入3ml甲醇,超声涡旋各1min,静置取上清液备用。COF固相萃取柱依次用3ml甲醇活化、3ml水平衡,取上述上清液过柱,弃去上清液,用3ml水淋洗固相萃取柱,然后用3ml丙酮溶液洗脱并超声30min,收集洗脱液,于40℃水浴氮气吹干,用流动相定容至1ml,滤液过0.22μm有机滤膜,即得到***二酚标准物质。用HPLC归一化法对***二酚标准物质进行均匀性、稳定性分析,采用质量平衡法进行定值,采用LC-MS法对有机杂质进行定性分析,电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机残留和水分等杂质的含量。最终确定制备的***二酚标准物质纯度范围为92.2%-98.5%。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述:
实施例一:
1.实验材料的选择
选取工业***叶片,液氮速冻,保存于-80℃。
1.1工业***叶片组织的RNA提取及反转录
提取工业***叶片的总RNA,浓度为415.6ng/μl,经DNase I消化处理后,反转录合成cDNA,反转录时体系中加入0.8μg RNA。并以此为模板进行荧光定量PCR反应。
1.2CBDAS的荧光定量PCR
以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应,复孔重复三次。使用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR中CBDAS的引物为:
CBDAS F:5’-ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT-3’
CBDAS R:5’-TTAATGACGATGCCGTGGAAG-3’
内参基因18S的引物为:
18S F:5’-CGCTCCTACCGATTGAATGG-3’
18S R:5’-CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC-3’
反应体系:
SYBR Green,Mix和引物混合物配制:
Mix 10μl
Primer F+R 1μl
SYBR Green(16μl)96孔板配制:
Mix+引物 8μl
cDNA 8μl
反应条件:40个循环
溶解曲线:
60℃ 60s
95℃ 30s
60℃ 15s
***植株中CBD合成酶活性有高低之分,进而决定了CBD的含量差异。CBDAS参与CBD合成酶的生物合成过程,进而产生***植物中的CBD,所以利用荧光定量PCR可对CBDAS进行定量分析。以内参基因作为衡量标准,利用2-ΔΔCt法计算得出***叶片中CBDAS相对表达量为7.0以上即可作为提取实验材料。
2***二酚粗提物的制备
2.1实验材料的预处理
选取工业***的叶片,洗净粉碎成叶片浆,于4℃储存备用。
2.2超声处理
取5.0g叶片浆样品与100mL质量分数为80%的甲醇溶液,置于250mL三角瓶中,进行超声处理。超声时间15min、超声功率为149W,该步骤制备的浆液为超声处理液。
2.3超声处理液真空蒸馏去除甲醇
真空度0.09MPa,蒸馏温度65℃,当超声处理液体积低于蒸馏前体积的30%即可停止蒸馏。
3工业***叶片的高分子纤维素的水解
3.1菌种的选择及培养基的制备
A菌—枯草芽孢杆菌CICC10089(Bacillus subtilis)培养基为:NaCl 5.0g,牛肉膏10.0g,蛋白胨10.0g,蒸馏水1.0L,pH 7.2。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
B菌—地衣芽孢杆菌CICC10831(Bacillus licheniformis)培养基为:蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,NaCl 10.0g,蒸馏水1.0L,pH7.0。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
3.2复合菌直投式发酵剂的制备
3.2.1菌种的活化
分别取10mL 0.9%的生理盐水于2只试管内,经121℃灭菌15分钟冷却至30℃,将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9%的生理盐水中,震荡使其溶解,在30℃恒温箱中静止活化30分钟,备用。
3.2.2菌种的扩大培养
3.2.2.1母发酵剂的制备
分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内,121℃灭菌15分钟冷却至30℃,按培养基体积的10%接种3.2.1步骤中已经活化的菌种,在36℃培养箱内静止培养24h,作为母发酵剂。
3.2.2.2生产发酵剂的制备
分别取上述两种培养基,分装于2只500mL三角瓶内,每瓶200mL,121℃灭菌15分钟冷却至36℃,分别按2%体积比例接种母发酵剂,36℃培养24-28h,检测2株菌发酵液活菌数,各发酵液活菌数≥109个/mL,视同为发酵成熟,如果活菌数<109个/mL,继续培养,直至达到109个/mL。
3.3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中,液面高度低于1cm,加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻,冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装,放入冻干机进行冷冻干燥,制备粉末冻干菌种。
3.4复合菌直投式发酵剂的制备
按各粉末冻干菌种重量,取A菌粉末3份,B菌粉末2份,充分混匀后制成复合菌直投式发酵剂,复合菌直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01%。
需要进一步说明的是:本发明中选用的菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,这些菌的活化、冻干方法不仅仅限于本发明所述的具体方法,培养基的成分也不限于此,其它常规技术和方法都是可以的,只要可以提高菌种的活力、并将其制备成冻干粉状而方便使用即可。
3.5复合菌直投式发酵剂水解工业***叶片中高分子纤维素
将经过2.3步骤处理获得的叶片浆按其重量的0.01%添加步骤3.4制备的复合菌直投式发酵剂,充分溶解后,36℃保温静止发酵24h。
4***二酚的纯化
4.1活化硅胶的制备
称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3=v/v),浸泡12h,在机械搅拌下回流24h除去金属离子,然后用G5砂芯漏斗过滤,用高纯水反复冲洗至中性,最后用丙酮洗涤两次,在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水,即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶,储于干燥器备用。
4.2COF修饰硅胶固定相
将180mg四-(4-氨基苯)乙烯和192.6mg 4,4'-联苯二甲醛溶解在9mL 1,4-二氧六环中,完全溶解后,加入到4.1制备的活化硅胶中,在超声条件下向其中缓慢滴加0.3mL6mol/L的醋酸,所得的混合液在常温条件下放置72h后,用N,N-二甲基乙酰胺和1,4-二氧六环交替洗涤,充分去除未反应的原料和杂质,洗干净的COF在60℃下真空干燥10h,最终获得橙黄色COF粉末。将得到的固体粉末用高纯水,乙醇,丙酮,三氯化碳分别洗涤3次,去除上层未连接到硅胶表面的COF,最终得到所需要的硅胶固定相。
4.3色谱柱的填装
将制得的COF修饰的硅胶固定相按照匀浆法(四氯化碳作为匀浆液,甲醇作为顶替液)装入清洗干净的不锈钢管色谱柱(4.6*150mm,5μm)中。称量2.5g COF修饰的硅胶加到100ml的烧杯中,接着加入50ml的四氯化碳。超声15min后快速倒入装柱机,打开泵,使压力迅速上升调整到25MP,保持10min,之后调整到40MP 40min后,关泵缓缓地降压。当压力降为零后,小心的卸下色谱柱,装上筛板与柱接头。标明方向(与装柱方向保持一致),柱子填料的名称,色谱柱的尺寸以及装柱的日期。新装的色谱柱用甲醇以0.2ml/min的流速冲洗12h,之后缓慢的增加流速直至1ml/min,待柱压稳定后开始使用。
4.4***二酚标准物质的制备
称取60mg COF吸附剂装入固相萃取小柱中(3ml规格),两端用聚丙烯筛板固定填料,制得标准化固相萃取柱。称取5.0g(精确到0.1g)发酵后的样品于50ml离心管中,加入50ml正己烷,涡旋混合2min;接着超声提取5min,6000r/min离心3min,取上清液于40℃水浴中氮吹至干。然后加入3ml甲醇,超声涡旋各1min,静置取上清液备用。COF固相萃取柱依次用3ml甲醇活化、3ml水平衡,取上述上清液过柱,弃去上清液,用3ml水淋洗固相萃取柱,然后用3ml丙酮溶液洗脱并超声30min,收集洗脱液,于40℃水浴氮气吹干,用流动相定容至1ml,滤液过0.22μm有机滤膜,即得到***二酚标准物质。用HPLC归一化法对***二酚标准物质进行均匀性、稳定性分析,采用质量平衡法进行定值,采用LC-MS法对有机杂质进行定性分析,电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机残留和水分等杂质的含量。最终确定制备的***二酚标准物质纯度范围为92.2%-98.5%。
实施例二:
1.实验材料的选择
选取工业***叶片,液氮速冻,保存于-80℃。
1.1工业***叶片组织的RNA提取及反转录
提取工业***叶片的总RNA,浓度为415.6ng/μl,经DNase I消化处理后,反转录合成cDNA,反转录时体系中加入0.8μg RNA。并以此为模板进行荧光定量PCR反应。
1.2CBDAS的荧光定量PCR
以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应,复孔重复三次。使用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR中CBDAS的引物为:
CBDAS F:5’-ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT-3’
CBDAS R:5’-TTAATGACGATGCCGTGGAAG-3’
内参基因18S的引物为:
18S F:5’-CGCTCCTACCGATTGAATGG-3’
18S R:5’-CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC-3’
反应体系:
SYBR Green,Mix和引物混合物配制:
Mix 10μl
Primer F+R 1μl
SYBR Green(16μl)96孔板配制:
Mix+引物 8μl
cDNA 8μl
反应条件:40个循环
溶解曲线:
60℃ 60s
95℃ 30s
60℃ 15s
***植株中CBD合成酶活性有高低之分,进而决定了CBD的含量差异。CBDAS参与CBD合成酶的生物合成过程,进而产生***植物中的CBD,所以利用荧光定量PCR可对CBDAS进行定量分析。以内参基因作为衡量标准,利用2-ΔΔCt法计算得出***叶片中CBDAS相对表达量为7.0以上即可作为提取实验材料。
2***二酚粗提物的制备
2.1实验材料的预处理
选取工业***的叶片,洗净粉碎成叶片浆,于4℃储存备用。
2.2超声处理
取5.0g叶片浆样品与100mL质量分数为80%的甲醇溶液,置于250mL三角瓶中,进行超声处理。超声时间15min、超声功率为149W,该步骤制备的浆液为超声处理液。
2.3超声处理液真空蒸馏去除甲醇
真空度0.09MPa,蒸馏温度65℃,当超声处理液体积低于蒸馏前体积的30%即可停止蒸馏。
3工业***叶片的高分子纤维素的水解
3.1菌种的选择及培养基的制备
A菌—枯草芽孢杆菌CICC10089(Bacillus subtilis)培养基为:NaCl 5.0g,牛肉膏10.0g,蛋白胨10.0g,蒸馏水1.0L,pH 7.2。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
B菌—地衣芽孢杆菌CICC10831(Bacillus licheniformis)培养基为:蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,NaCl 10.0g,蒸馏水1.0L,pH7.0。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
3.2复合菌直投式发酵剂的制备
3.2.1菌种的活化
分别取10mL 0.9%的生理盐水于2只试管内,经121℃灭菌15分钟冷却至30℃,将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9%的生理盐水中,震荡使其溶解,在30℃恒温箱中静止活化30分钟,备用。
3.2.2菌种的扩大培养
3.2.2.1母发酵剂的制备
分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内,121℃灭菌15分钟冷却至30℃,按培养基体积的10%接种3.2.1步骤中已经活化的菌种,在36℃培养箱内静止培养24h,作为母发酵剂。
3.2.2.2生产发酵剂的制备
分别取上述两种培养基,分装于2只500mL三角瓶内,每瓶200mL,121℃灭菌15分钟冷却至36℃,分别按2%体积比例接种母发酵剂,36℃培养24-28h,检测2株菌发酵液活菌数,各发酵液活菌数≥109个/mL,视同为发酵成熟,如果活菌数<109个/mL,继续培养,直至达到109个/mL。
3.3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中,液面高度低于1cm,加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻,冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装,放入冻干机进行冷冻干燥,制备粉末冻干菌种。
3.4复合菌直投式发酵剂的制备
按各粉末冻干菌种重量,取A菌粉末5份,B菌粉末3份,充分混匀后制成复合菌直投式发酵剂,复合菌直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01%。
需要进一步说明的是:本发明中选用的菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,这些菌的活化、冻干方法不仅仅限于本发明所述的具体方法,培养基的成分也不限于此,其它常规技术和方法都是可以的,只要可以提高菌种的活力、并将其制备成冻干粉状而方便使用即可。
3.5复合菌直投式发酵剂水解工业***叶片中高分子纤维素
将经过2.3步骤处理获得的叶片浆按其重量的0.01%添加步骤3.4制备的复合菌直投式发酵剂,充分溶解后,36℃保温静止发酵24h。
4***二酚的纯化
4.1活化硅胶的制备
称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3=v/v),浸泡12h,在机械搅拌下回流24h除去金属离子,然后用G5砂芯漏斗过滤,用高纯水反复冲洗至中性,最后用丙酮洗涤两次,在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水,即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶,储于干燥器备用。
4.2COF修饰硅胶固定相
将180mg四-(4-氨基苯)乙烯和192.6mg 4,4'-联苯二甲醛溶解在9mL 1,4-二氧六环中,完全溶解后,加入到4.1制备的活化硅胶中,在超声条件下向其中缓慢滴加0.3mL6mol/L的醋酸,所得的混合液在常温条件下放置72h后,用N,N-二甲基乙酰胺和1,4-二氧六环交替洗涤,充分去除未反应的原料和杂质,洗干净的COF在60℃下真空干燥10h,最终获得橙黄色COF粉末。将得到的固体粉末用高纯水,乙醇,丙酮,三氯化碳分别洗涤3次,去除上层未连接到硅胶表面的COF,最终得到所需要的硅胶固定相。
4.3色谱柱的填装
将制得的COF修饰的硅胶固定相按照匀浆法(四氯化碳作为匀浆液,甲醇作为顶替液)装入清洗干净的不锈钢管色谱柱(4.6*150mm,5μm)中。称量2.5g COF修饰的硅胶加到100ml的烧杯中,接着加入50ml的四氯化碳。超声15min后快速倒入装柱机,打开泵,使压力迅速上升调整到25MP,保持10min,之后调整到40MP 40min后,关泵缓缓地降压。当压力降为零后,小心的卸下色谱柱,装上筛板与柱接头。标明方向(与装柱方向保持一致),柱子填料的名称,色谱柱的尺寸以及装柱的日期。新装的色谱柱用甲醇以0.2ml/min的流速冲洗12h,之后缓慢的增加流速直至1ml/min,待柱压稳定后开始使用。
4.4***二酚标准物质的制备
称取60mg COF吸附剂装入固相萃取小柱中(3ml规格),两端用聚丙烯筛板固定填料,制得标准化固相萃取柱。称取5.0g(精确到0.1g)发酵后的样品于50ml离心管中,加入50ml正己烷,涡旋混合2min;接着超声提取5min,6000r/min离心3min,取上清液于40℃水浴中氮吹至干。然后加入3ml甲醇,超声涡旋各1min,静置取上清液备用。COF固相萃取柱依次用3ml甲醇活化、3ml水平衡,取上述上清液过柱,弃去上清液,用3ml水淋洗固相萃取柱,然后用3ml丙酮溶液洗脱并超声30min,收集洗脱液,于40℃水浴氮气吹干,用流动相定容至1ml,滤液过0.22μm有机滤膜,即得到***二酚标准物质。用HPLC归一化法对***二酚标准物质进行均匀性、稳定性分析,采用质量平衡法进行定值,采用LC-MS法对有机杂质进行定性分析,电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机残留和水分等杂质的含量。最终确定制备的***二酚标准物质纯度范围为92.2%-98.5%。
荧光定量PCR中CBDAS的引物为:
CBDAS F:5’- ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT-3’
CBDAS R:5’-TTAATGACGATGCCGTGGAAG-3’
内参基因18S的引物为:
18S F:5’-CGCTCCTACCGATTGAATGG-3’
18S R: 5’-CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC-3’
Claims (8)
1.一种检测用***二酚标准物质的制备方法,其特征是:选取酚类物质基因相对表达量为7.0以上的工业***叶片并制浆,取5.0g该叶片浆样品与100mL质量分数80%的甲醇溶液,置于三角瓶中超声处理,时间15min、功率149W,然后在0.09MPa、65℃条件下,减压蒸馏除甲醇后备用,选取枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌,制备复合直投式发酵剂,复合直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01%,36℃静止发酵24h,发酵液经离心后取上清液经正己烷萃取后氮吹干燥,然后经甲醇溶解取上清液备用,制备表面均匀分布羟基的活化硅胶固相萃取柱,将上述上清液经固相萃取柱分离后,获得一种检测用***二酚标准物质,经检测纯度范围为92.2%-98.5%。
3.根据权利要求1所述一种检测用***二酚标准物质的制备方法,其特征是:直投式发酵剂采用这样方法制备:分别取10mL 0.9%的生理盐水于2只试管内,经121℃灭菌15分钟冷却至30℃,将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9%的生理盐水中,震荡使其溶解,在30℃恒温箱中静止活化30分钟,备用;分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内,121℃灭菌15分钟冷却至30℃,按培养基体积的10%接种2.2.1步骤中已经活化的菌种,在36℃培养箱内静止培养24h,作为母发酵剂;分别取上述两种培养基,分装于2只500mL三角瓶内,每瓶200mL,121℃灭菌15分钟冷却至36℃,分别按2%体积比例接种母发酵剂,36℃培养24-28h,检测2株菌发酵液活菌数,各发酵液活菌数≥109个/mL,视同为发酵成熟,如果活菌数<109个/mL,继续培养,直至达到109个/mL;将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中,液面高度低于1cm,加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻,冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装,放入冻干机进行冷冻干燥,制备粉末冻干菌种。
4.根据权利要求1所述一种检测用***二酚标准物质的制备方法,其特征是:微生物发酵法制备叶片浆水解液:将叶片浆按其重量的0.01%添加复合菌直投式发酵剂,充分溶解后,36℃保温静止发酵24h。
5.根据权利要求1所述一种检测用***二酚标准物质的制备方法,其特征是:活化硅胶采用这样方法制备:称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3=v/v),浸泡12h,在机械搅拌下回流24h除去金属离子,然后用G5砂芯漏斗过滤,用高纯水反复冲洗至中性,最后用丙酮洗涤两次,在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水,即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶。
6.根据权利要求1所述一种检测用***二酚标准物质的制备方法,其特征是:COF修饰硅胶固定相采用这样方法制备:将180mg四-(4-氨基苯)乙烯和192.6mg 4,4'-联苯二甲醛溶解在9mL 1,4-二氧六环中,完全溶解后,加入到4.1制备的活化硅胶中,在超声条件下向其中缓慢滴加0.3mL 6mol/L的醋酸,所得的混合液在常温条件下放置72h后,用N,N-二甲基乙酰胺和1,4-二氧六环交替洗涤,充分去除未反应的原料和杂质,洗干净的COF在60℃下真空干燥10h,最终获得橙黄色COF粉末;将得到的固体粉末用高纯水,乙醇,丙酮,三氯化碳分别洗涤3次,去除上层未连接到硅胶表面的COF,最终得到所需要的硅胶固定相。
7.根据权利要求1所述一种检测用***二酚标准物质的制备方法,其特征是:色谱柱采用这样方法填装:将制得的COF修饰的硅胶固定相按照匀浆法(四氯化碳作为匀浆液,甲醇作为顶替液)装入清洗干净的不锈钢管色谱柱(4.6*150mm,5μm)中,称量2.5g COF修饰的硅胶加到100ml的烧杯中,接着加入50ml的四氯化碳,超声15min后快速倒入装柱机,打开泵,使压力迅速上升调整到25MP,保持10min,之后调整到40MP 40min后,关泵缓缓地降压。当压力降为零后,小心的卸下色谱柱,装上筛板与柱接头;标明方向(与装柱方向保持一致),柱子填料的名称,色谱柱的尺寸以及装柱的日期;新装的色谱柱用甲醇以0.2ml/min的流速冲洗12h,之后缓慢的增加流速直至1ml/min,待柱压稳定后开始使用。
8.根据权利要求1所述一种检测用***二酚标准物质的制备方法,其特征是:***二酚采用这样方法纯化:称取60mg COF吸附剂装入固相萃取小柱中(3ml规格),两端用聚丙烯筛板固定填料,制得标准化固相萃取柱;称取5.0g(精确到0.1g)发酵后的样品于50ml离心管中,加入50ml正己烷,涡旋混合2min;接着超声提取5min,6000r/min离心3min,取上清液于于40℃水浴中氮吹至干;然后加入3ml甲醇,超声涡旋各1min,静置取上清液备用;COF固相萃取柱依次用3ml甲醇活化、3ml水平衡,取上述上清液过柱,待上清液流出后,用3ml水淋洗固相萃取柱,最后用3ml丙酮溶液洗脱并超声30min,收集洗脱液,于40℃水浴氮气吹干,用流动相定容至1ml,滤液过0.22μm有机滤膜,即得到***二酚标准物质。用HPLC归一化法对***二酚标准物质进行均匀性、稳定性分析,采用质量平衡法进行定值,采用LC-MS法对有机杂质进行定性分析,电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机残留和水分等杂质的含量。最终确定制备的***二酚标准物质纯度范围为92.2%-98.5%。
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Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101845509A (zh) * | 2010-06-12 | 2010-09-29 | 徐君怡 | 狮源性dna的pcr检测引物、试剂盒及检测方法 |
CN102178057A (zh) * | 2011-05-06 | 2011-09-14 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 枯草芽孢杆菌及其饲料添加剂和发酵剂 |
CN105268415A (zh) * | 2015-10-09 | 2016-01-27 | 郑州大学 | 一种固相萃取填料及其在测定食品中磺胺残留的应用 |
CN107362785A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-11-21 | 华南师范大学 | 一种腙键连接型的手性共价有机框架键合硅胶固定相及其应用 |
CN109232191A (zh) * | 2018-08-20 | 2019-01-18 | 润贝(安徽)饮料食品有限公司 | 一种提取工业***叶中***二酚的方法 |
CN109862901A (zh) * | 2019-01-22 | 2019-06-07 | 金湘范 | 一种提取生物活性成分的方法及由此获得的生物活性成分 |
CN110041172A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-07-23 | 云南绿新生物药业有限公司 | 一种利用微生物处理***花叶提高***二酚提取率的工艺 |
CN110386860A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-10-29 | 李卫 | 一种***二酚的高效提取方法 |
US20210016245A1 (en) * | 2018-03-14 | 2021-01-21 | Deepak Pahwa | METHOD FOR IN-SITU SYNTHESIS OF METAL ORGANIC FRAMEWORKS (MOFs), COVALENT ORGANIC FRAMEWORKS (COFs) AND ZEOLITE IMIDAZOLATE FRAMEWORKS (ZIFs), AND APPLICATIONS THEREOF |
CN112573612A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-03-30 | 天津科技大学 | 一种利用亚胺型共价有机框架同时吸附苏丹红i-iv的方法和应用 |
-
2021
- 2021-11-22 CN CN202111381554.7A patent/CN114057552A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101845509A (zh) * | 2010-06-12 | 2010-09-29 | 徐君怡 | 狮源性dna的pcr检测引物、试剂盒及检测方法 |
CN102178057A (zh) * | 2011-05-06 | 2011-09-14 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 枯草芽孢杆菌及其饲料添加剂和发酵剂 |
CN105268415A (zh) * | 2015-10-09 | 2016-01-27 | 郑州大学 | 一种固相萃取填料及其在测定食品中磺胺残留的应用 |
CN107362785A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-11-21 | 华南师范大学 | 一种腙键连接型的手性共价有机框架键合硅胶固定相及其应用 |
US20210016245A1 (en) * | 2018-03-14 | 2021-01-21 | Deepak Pahwa | METHOD FOR IN-SITU SYNTHESIS OF METAL ORGANIC FRAMEWORKS (MOFs), COVALENT ORGANIC FRAMEWORKS (COFs) AND ZEOLITE IMIDAZOLATE FRAMEWORKS (ZIFs), AND APPLICATIONS THEREOF |
CN109232191A (zh) * | 2018-08-20 | 2019-01-18 | 润贝(安徽)饮料食品有限公司 | 一种提取工业***叶中***二酚的方法 |
CN109862901A (zh) * | 2019-01-22 | 2019-06-07 | 金湘范 | 一种提取生物活性成分的方法及由此获得的生物活性成分 |
CN110041172A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-07-23 | 云南绿新生物药业有限公司 | 一种利用微生物处理***花叶提高***二酚提取率的工艺 |
CN110386860A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-10-29 | 李卫 | 一种***二酚的高效提取方法 |
CN112573612A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-03-30 | 天津科技大学 | 一种利用亚胺型共价有机框架同时吸附苏丹红i-iv的方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
N. MASTROIANNI ET AL.: "Illicit and abused drugs in sewage sludge: Method optimization andoccurrence", 《J. CHROMATOGR. A》, vol. 1322, pages 29 - 37, XP028790414, DOI: 10.1016/j.chroma.2013.10.078 * |
张远: "微孔有机聚合物作为色谱固定相的制备及应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》, no. 3, pages 23 - 25 * |
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