CN109212067B - 烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法及检测样品处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法及检测样品处理方法，属于烟草成分检测技术领域。本发明的烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法，包括如下步骤：将样品与萃取剂混合进行萃取，然后加入衍生化试剂进行衍生化反应，然后进行GC‑MS/MS测试；所述萃取剂为二氯甲烷。本发明的烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法采用二氯甲烷作为溶剂进行萃取，并进行衍生化反应，能够检测出烟叶中的12‑甲基十四烷酸。而且，配合GC‑MS/MS技术，能够实现灵敏度更高、检测限更低，能用于分析烟叶中的低含量的高级脂肪酸：十一酸、12‑甲基十四烷酸、十七酸、二十酸。

Description

烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法及检测样品处理 方法
技术领域
本发明涉及一种烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法及检测样品处理方法，属于烟草成分检测技术领域。
背景技术
有机酸广泛存在于烟草中，含量约为10％～16％，对卷烟的香气和气味具有重要作用，C10以上的高级脂肪酸是其中非常重要的一类。长链饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸会增加烟气的脂肪和蜡味，使烟气醇和，调节烟草的酸碱度，还可以增加烟气浓度，影响烟气香气。不同的长链脂肪酸香味也具有一定差异，例如，十一酸、十二酸能使烟气醇和、和顺；十四酸(即肉豆蔻酸)有柔和烟气作用，与烟香谐调，提高甜而醇和的风味；亚麻酸有蜡脂气息，能增加丰满度，并有一定刺激性；十六酸除了具有腊味，还具有甜味，并可增加丰满度；二十酸具有坚果味，可增加烟气浓度。
对烟叶中高级脂肪酸的检测一般采用硫酸甲醇衍生的方法，但该方法只适合含量高的高级脂肪酸的测定，如十六酸、十八酸、硬脂酸、亚油酸等。也有文献报道采用加速溶剂萃取硅烷化衍生测定高级脂肪酸，但由于有些高级脂肪酸含量低，不容易被检测出如十一酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸等。
申请公布号为CN106353429A的中国发明专利申请公开了一种基于有机酸的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法。其采用二氯甲烷/乙腈作为萃取溶剂进行超声萃取，然后用BSTFA进行衍生化反应，再进行GC/MS分析，检测有机酸的含量。该方法能够检测十七酸和丁酸的含量比值，但是无法对其他含量较低的高级脂肪酸进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够检测出低含量高级脂肪酸的烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法。
本发明的目的还在于提供一种烟草及烟草制品的检测样品处理方法。
为实现上述目的，本发明的烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法的技术方案是：
一种烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法，包括如下步骤：将样品与萃取剂混合进行萃取，然后加入衍生化试剂进行衍生化反应，然后进行GC-MS/MS测试；所述萃取剂为二氯甲烷。
本发明的烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法采用二氯甲烷作为溶剂进行萃取，并进行衍生化反应，能够检测出烟叶中的12-甲基十四烷酸等低含量高级脂肪酸。而且，配合GC-MS/MS技术，能够实现灵敏度更高、检测限更低，能用于分析烟叶中的低含量的高级脂肪酸。
所述高级脂肪酸为十一酸、月桂酸、肉豆蔻酸、12-甲基-十四烷酸、棕榈酸、珍珠酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、花生酸中的至少一种。
进一步的，本发明的方法能同时测定烟叶中11种具有特征香气和气味的高级脂肪酸，扩大了高级脂肪酸的检测范围。所述11种具有特征香气和气味的高级脂肪酸为十一酸、月桂酸、肉豆蔻酸、12-甲基-十四烷酸、棕榈酸、珍珠酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、花生酸。
所述烟草样品与萃取剂混合前进行样品处理，所述样品处理包括：将样品制成粉末，过筛。所述过筛是过40目筛。所述制成粉末是将样品研磨成粉。所述萃取剂的用量为每1g样品对应6-20mL萃取剂。
所述混合进行萃取是将样品与萃取剂、内标溶液混合后涡旋10-50min。所述涡旋的转速为2500rpm。
将样品与萃取剂混合时，加入内标溶液。所述内标溶液的用量为每1g样品对应50-100μL内标溶液。所述内标溶液为十九酸溶液。所述内标溶液的浓度为50-100μg/mL。
所述烟草及烟草制品为烟叶或者烟丝。
样品与萃取剂混合进行萃取后得到萃取液。
所述衍生化试剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。
所述衍生化试剂的用量为每0.5-1mL的萃取液对应50-200μL衍生化试剂。
所述衍生化反应的时间为10-40min。
所述样品与萃取剂混合进行萃取后进行过滤。所述过滤为采用有机相滤膜进行过滤。
所述GC-MS/MS测试的条件为：进样口温度为280℃，进样量为1.0μL。分流比为10：1。载气为氦气。恒流流速为1.0mL/min。
色谱柱采用DB-5MS色谱柱。色谱柱的规格为60m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)。升温程序为：初温80℃，以10℃/min的升温速率升至280℃，保温20min。电离方式为EI。传输线温度为280℃。离子源温度：300℃。扫描方式为多反应监测(MRM)模式。CID气体压力为2.0mTorr；对每个离子的监测时间为100ms。
本发明的烟草及烟草制品的检测样品处理方法的技术方案是：
一种烟草及烟草制品的检测样品处理方法，包括如下步骤：将样品与萃取剂混合进行萃取，然后加入衍生化试剂进行衍生化反应，即得；所述萃取剂为二氯甲烷。
附图说明
图1为本发明的实施例1中十一酸的标准溶液及样品中十一酸的色谱图；
图2为本发明的实施例1中十二酸(月桂酸)的标准溶液及样品中十二酸的的色谱图；
图3为本发明的实施例1中十四酸(肉豆蔻酸)的标准溶液及样品中十四酸的色谱图；
图4为本发明的实施例1中12-甲基十四烷酸的标准溶液及样品中12-甲基十四烷酸的色谱图；
图5为本发明的实施例1中十六酸(棕榈酸)的标准溶液及样品中十六酸的色谱图；
图6为本发明的实施例1中十七酸的标准溶液及样品中十七酸的色谱图；
图7为本发明的实施例1中亚油酸的标准溶液及样品中亚油酸的色谱图；
图8为本发明的实施例1中油酸的标准溶液及样品中油酸的色谱图；
图9为本发明的实施例1中亚麻酸的标准溶液及样品中亚麻酸的色谱图；
图10为本发明的实施例1中硬脂酸的标准溶液及样品中硬脂酸的色谱图；
图11为本发明的实施例1中二十酸(花生酸)的标准溶液及样品中二十酸的色谱图；
图12为本发明中十九酸的标准溶液及样品中内标物的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
标准溶液的配制：
分别称取一定量标准品于10mL容量瓶中，配制单标母液。将单标母液稀释，或直接取母液一定量，加入10mL容量瓶中，配制标线最高浓度混标，通过逐级稀释制作标准曲线。六级标线浓度范围如表1所示，单位为μg/mL。
表1各脂肪酸的标准液参数
Figure BDA0001808061430000041
实施例1
本实施例的烟草中高级脂肪酸的检测方法包括如下步骤：
1)将烟叶C3F样品磨成粉末，过40目筛得到烟粉。取0.5克烟粉放入样品瓶中，然后向样品瓶中加入5mL二氯甲烷作萃取剂，然后再向样品瓶中加入100μL浓度为50μg/mL的十九酸内标溶液。以2500rpm的速度涡旋萃取30min，过有机相滤膜，得萃取液。
2)取步骤1)中得到的萃取液0.5mL，向其中加入150μL双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化试剂，在室温下进行衍生化反应10min。
3)将衍生化反应后的体系进行GC-MS/MS测试。
GC-MS/MS测试条件为：
GC-MS/MS仪器进样口温度为280℃，进样量：1.0μL，分流比为10：1，载气为氦气，恒流流速为1.0mL/min。
色谱柱采用DB-5MS色谱柱(60m×0.25mm i.d.×0.25μm d.f.)；程序升温：初温80℃，以10℃/min的升温速率升至280℃，保温20min。电离方式：EI；传输线温度：280℃；离子源温度：300℃。扫描方式：多反应监测(MRM)模式，CID气体压力为2.0mTorr；对每个离子的监测时间为100ms。
11种高级脂肪酸及内标化合物的保留时间、母离子、子离子以及优化后的碰撞能量(CE)值等参数见表2。各脂肪酸标准溶液及样品中目标化合物的色谱图如图1-12所示。
表2各脂肪酸的质谱分析参数
Figure BDA0001808061430000051
实施例2
选取烤烟、白肋烟、香料烟、晒红烟四种不同类型烟叶C3F样品各一个，采用实施例1中的方法进行样品前处理及GC-MS/MS仪器分析。烟叶中11种高级脂肪酸含量结果如表3所示。
表3不同类型烟叶中11种高级脂肪酸的含量(μg/g)
Figure BDA0001808061430000052
Figure BDA0001808061430000061
试验例
选取典型烤烟样品，进行方法日内及日间精密度实验。在同一天中，对所选样品一天内进行5次平行实验以考察方法日内精密度，对所选样品连续五天进行实验以考察方法日间精密度。以实际样品含量为参考，分别加混标50、100、200μL，混标浓度如表4所示。做方法准确度表征，回收率平均结果如表5所示。结果表明：各目标酸性成分平均回收率在85.66％-106.12％，日内、日间精密度均小于10％。
表4加标液浓度
ug/mL
十一酸 2.5
十二酸 2
十四酸 200
12-甲基十四烷酸 20
十六酸 5000
十七酸 200
亚油酸 2000
油酸 2000
亚麻酸 2000
硬脂酸 2000
二十酸 1000
按无限稀释方法计算检测限及定量限，结果表明，该方法灵敏度完全满足测试样品的需要。结果如表5所示。
表5本发明的方法的精密度、回收率、检测限和定量限
Figure BDA0001808061430000062
Figure BDA0001808061430000071

Claims (4)

1.一种烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：将样品与萃取剂混合进行萃取，然后加入衍生化试剂进行衍生化反应，然后进行GC-MS/MS测试；所述萃取剂为二氯甲烷；将样品与萃取剂混合时，加入内标溶液，所述内标溶液为十九酸溶液；所述内标溶液的用量为每1g样品对应50-100μL内标溶液；所述内标溶液的浓度为50-100μg/mL；所述混合进行萃取是将样品与萃取剂、内标溶液混合后涡旋10-50min；所述衍生化试剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺；所述高级脂肪酸为十一酸、月桂酸、肉豆蔻酸、12-甲基十四烷酸、棕榈酸、十七酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸和二十酸；所述GC-MS/MS测试条件为：GC-MS/MS仪器进样口温度为280℃，进样量：1.0μL，分流比为10:1，载气为氦气，恒流流速为1.0ml/min；色谱柱采用DB-5MS色谱柱；程序升温：初温80℃，以10℃/min的升温速率升至280℃，保温20min，电离方式：EI；传输线温度：280℃；离子源温度：300℃；扫描方式：多反应监测模式，CID气体压力为2.0mTorr；对每个离子的监测时间为100ms。
2.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法，其特征在于：所述萃取剂的用量为每1g样品对应6-20mL萃取剂。
3.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法，其特征在于：样品与萃取剂混合进行萃取后得到萃取液；所述衍生化试剂的用量为每0.5-1mL的萃取液对应50-200μL衍生化试剂。
4.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中高级脂肪酸的检测方法，其特征在于：所述衍生化反应的时间为10-40min。
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