CN109207580A - 鉴定处于慢性损伤风险的肾异体移植物接受者的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴定处于慢性损伤风险的肾异体移植物接受者的方法。一种鉴定处于慢性异体移植物损坏或间质性纤维化和肾小管萎缩(IF/TA)风险的肾异体移植物接受者的方法，该方法通过将预选的基因标志集的转录水平与对比标准的转录水平进行比较，如果所述预选的基因标志集的转录水平显著地高于所述对比标准的转录水平，诊断所述接受者处于慢性异体移植物损坏的风险。

Description

鉴定处于慢性损伤风险的肾异体移植物接受者的方法

本申请是中国专利申请201580024911.0的分案申请，原申请 201580024911.0的申请日为2015年3月12日，其名称为“鉴定处于慢性损伤风险的肾异体移植物接受者的方法”。

技术领域

本发明涉及鉴定处于慢性损伤风险中的肾异体移植物(allograft)接受者的方法和用于本发明的试剂盒。所述方法包括分析从稳定功能肾异体移植物的早期活检物获得的转录组标志，以鉴定和治疗此类患者。

背景技术

肾移植是美国进行的最常见的实体器官移植；在2010年进行了超过 16,000例移植(2011SRTR数据报告)。尽管急性排斥的发生率降低了，尚没有实现在长期的异体移植物存活方面的进步(1-2)。

慢性异体移植物损坏(CAD)，或未知原因的间质性纤维化和肾小管萎缩 (IF/TA)是移植第一年后移植物损失的主要决定因素(3)。与IF/TA相关的临床和组织学事件对于移植物损失的预示性不好(4)，使得难以鉴定可受益于早期介入以防止纤维化发展的异体移植物。响应于肾功能障碍的异体移植物活检仍然是当前对慢性损伤的诊断途径，在这个阶段已经发展了不可逆的纤维化。有确实证据的是，肾异体移植物中的病理改变发生于功能改变之前(5)。程序性活检(protocol biopsies)已经提示，具有稳定肾脏功能的移植物的百分之五十以上在1年时有IF/TA的迹象(6)。开发在移植后早期鉴定有风险移植物的预测性分析对于设计有目标的治疗介入是必不可少的。本发明人已经认识到，从移植后早期进行的程序性活检获得的分子改变发生于纤维化发展之前。根据本发明，已经开发了鉴定有渐进性损伤风险的异体移植物的预测性的基因集。这一发现允许在治疗性介入可预防IF/TA的时候鉴定有移植物损失风险的接受者。

发明内容

已经鉴定了13个基因的集，其对于1年时纤维化的发展和早期移植物损失是独立地有预测性的。所述基因集的高预测能力(AUC 0.947)优于临床指标 (AUC 0.78)。常规组织学参数不能鉴定出纤维化进展的组织学正常的异体移植物，而所述预测性的基因集精确地辨别和鉴定了纤维化最终进展的组织学正常的异体移植物(AUC＝0.987)。该13个基因也精确地预测了早期移植物损失(2年和3年AUC分别为0.86和0.83)。使用独立的群组和两个独立的公众可获得的表达数据集验证了这一基因集的预测价值。

在3个月时从稳定功能的肾异体移植物获得的基因集，与12个月时对慢性异体移植物损坏建立的标志物的发展是相关的，并被证明了优于鉴定有异体移植物损坏和损失风险的肾移植接受者的临床实践中当前使用的临床-病理变量。

在一个方面中，本发明提供了鉴定处于慢性异体移植物损坏风险的肾异体移植物接受者的方法，包括提供在移植后3个月从肾异体移植物获得的活检样本的步骤。

在进一步的方面中，本发明提供了用于选定的13基因标志集的引物，所述基因标志集包含基因KLHL13、KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、 CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、RXRA和ASB15。

在进一步的方面中，本发明提供了为治疗选择肾异体移植物接受者以降低慢性异体移植物损坏或IF/TA风险的方法，该方法通过将从异体移植物获得的预选的基因标志集的转录水平与对比表达文库的转录水平比较，以及如果所述预选的基因标志集的转录水平明显高于对比标准的转录水平，选择所述患者来治疗异体移植排斥或损坏。

在本发明的另一个方面中提供了用于鉴定处于慢性肾损害或IF/TA风险的患者的基因标志集，所述基因标志集包含基因KLHL13、KAAG1、MET、 SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、 RXRA和ASB15。

在更进一步的方面中，本发明提供了用于鉴定处于慢性异体移植物损坏风险的肾异体移植物接受者的试剂盒，该试剂盒在独立的容器中包含13成员的基因标志集的引物、缓冲剂、三种持家基因和阴性对照以及使用说明书。

根据本说明书和权利要求，本发明的这些和其他方面对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。

具体实施方式

定义

如本文使用的，术语“约”或“大约”通常是指对于值的类型和测量方法处于可接受的误差范围内。例如，它可意指在给定值或范围的20％之内，更优选10％之内，还最优选在5％之内。可选地，特别是在生物***中，术语“约”是指在约一个log(即，一个数量级)之内，优选的在给定值的两个因数之内。

本文公开的是一项使用唯一的和详细的临床、组织学和分子数据集，在预定时间点的系列程序性活检的前瞻性研究。已经鉴定并验证了在移植后3 个月从稳定功能的肾异体移植物获得的基因集(基因标志集，KLHL13、 KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、 ST5、TGIF1、RXRA、ASB15)。这个基因集可以用于预测慢性异体移植物损坏的进展。对于在几个患者群组中移植物损伤的组织学进展，以及在公众可获得的群组中的移植物损失，已经发现这种分子性风险基因标志在鉴定有风险的肾移植接受者方面优于临床-病理的变量。本发明提供了鉴定处于慢性异体移植物损伤风险的肾异体移植物接受者的方法，该方法采用了如本文描述的选定的基因标志集。具有13成员标志集表达升高的异体移植物接受者处于慢性异体移植物损伤的风险中。本发明提供了鉴定本文描述的此类患者的材料和方法。

慢性异体移植物损伤的自然史已经揭示了移植后十二个月的早期和快速的组织学衰退(3)。在标准的和低风险肾脏中12个月时有害的组织学改变 (纤维化和/或炎症)的存在与有害的长期异体移植物结局相关联(14-16)。具体地，12个月时慢性异体移植物损坏指数分值(CADI-12)≥2已在本文描述的群组和来自先前公开的群组中鉴定了3年时移植物损失风险的接受者(5,17)。由于在12个月后异体移植物中观察到的更多逐步的组织学衰退，一旦慢性异体移植物损坏已经建立，免疫治疗的介入很少会改变结局(3)。

虽然更早时点的异体移植物组织学已经与慢性异体移植物神经病变 (CAN)的进展和异体移植物损失(18)相关联，但将异体移植物分类为面临早期组织学衰退风险和后期移植物损失的、甚至是具有中度敏感性的临床-病理变量还未能被鉴定出来。例如，虽然群组的60％在3个月时具有低的CADI 分值(0-1)，到12个月时，具有异体移植物损坏的组织学进展的患者的超过一半属于这个组，并且不能在3个月时单独通过组织学鉴定出来。也已经注意到在第一年内Banff分值(6)进展而没有肌酐的可检测的改变(19)。反之，已经报道了在3个月时观察到的组织学改变被12个月的评估逆转(20)。

在本文公开的群组中，具有高CADI-3的异体移植物的40％改善为0-1的 CADI-12。因此，本发明的13成员基因标志集的重要的临床应用是在适合介入的阶段鉴定有CAN发展和进展风险的肾脏的能力，该风险当前单独通过临床-病理参数是不可鉴别的。此外，与“一刀切(one size fits all)”免疫抑制策略相反，本文的基因集有潜力区分低风险的异体移植物接受者，所述受试者此后可从降低的免疫抑制受益。

如许多个小组所显示的，慢性肾异体移植物损伤的原因是多样的和累加的(3，15)。这反映在相对大数量的基因上，所述基因在2个现有技术验证的群组中与有害的异体移植物结局相关。Einecke等人鉴定了组织基因标志(与组织损伤、TGF-β效应相关的886个基因)，对于移植后1-31年之间进行的因故异体移植物活检中的移植物损失是预测性的(8)。在低风险儿科接受者中来自6个月程序性活检的601探针集标志显示了，相比没有组织学进展的患者，在有组织学进展的患者中免疫应答基因的上调(9)。本发明的13基因的标志集以高预测值在所有这些群组中被验证，具有预测异体移植物结局的能力，而不论人口统计学、移植后活检时间、先有纤维化的存在、以及各自的研究终点的不同(表9)。另外，这两项现有技术研究使用了基于早先的数据或预测的病理途径的有限的基因集。相比之下，采用了全包含的、非假说驱动的方法，其由样本大小来推动并基于慢性损伤的多层面的性质。由于CADI-12m是有序变量，基于相关性的信号、在3个月时更高的基因表达以及与CADI-12的相关性，而不是基于早先的研究中2个明确定义的临床群组之间基因表达的比较，来得出初始的基因列表。本发明的方法提高了鉴别出的关系的健壮性，并增强了在未定义的群组中的临床应用。

添加预测高CADI-12的临床预测因子(供体年龄、接受者性别、死亡的供体器官和移植3个月内的急性排斥)不会显著增强所述基因集在预测CAN方面的性能。主要位于边界上的亚临床的排斥存在于20例3个月的活检中。其中排除了患者具有急性细胞排斥(ACR)或i+t(炎症(i)和小管炎(t)的组合计分)>2的额外的分析清楚地表明，对于鉴定AUC剩余1的13基因标志集，炎症不是主要的驱动因素(数据未显示)。本文使用的新的无偏差的方法由此鉴定出风险基因标志，其区分群组中有组织学进展风险的异体移植物。在多个患者群组中预测异体移植物损伤和衰竭时的确认表明，本发明对于鉴定有风险的肾脏具有更广泛的适用性，这些患者的活检物有或没有预先存在的损害，在移植后不同时点采集。

对功能稳定的异体移植物的程序性活检提供了一窥致病机制的窗口，所述机制在可检测的异体移植物功能障碍发展之前启动。可以鉴定出进行中的亚临床的排斥、多瘤病毒BK感染、钙调磷酸酶抑制物(CNI)毒性和抗体介导的损坏，这些过程对CAN有贡献，CAN在检出之时可被介入(24-26)。然而，其他研究还不能展现在对检出的亚临床现象进行介入时异体移植物结局中的显著差异(27)。这种不一致可能反映了在解释程序性活检时单独使用组织学的限制，这可能受到内部观察者和采样变异性的影响。另一方面，与12个月时异体移植物组织学相关的3个月和6个月的程序性活检转录组改变(11， 28)，以及与异体移植物损失相关的12个月异体移植物基因标志(15)都已经被报道。如本文公开的，通过Spearman相关性分析(Spearman correlations analysis) 鉴定出其表达与3个月或12个月CADI相关的基因，然后进行总体的基因本体 (Gene Ontology)富集。来自相关性分析的与CADI相关基因相关的基因本体 (Gene Ontology，GO)功能/途径也用基因集富集分析(Gene SetEnrichment Analysis，GSEA)进行验证(9)。

在一个实施方式中，本发明涉及对于13成员基因标志序列的RT-PCR的引物。在另一个实施方式中，本发明涉及用于鉴定有肾异体移植物损伤风险的异体移植物接受者的试剂盒，其包含容器，其中有对于13成员基因标志集的RT-PCR的引物和使用说明书。在进一步的实施方式中，所述试剂盒包含第一容器，其中具有对于13成员基因标志的RT-PCR的引物，第二容器，其中具有用于持家基因的引物，第三容器，其中具有缓冲溶液，以及使用说明书。根据表达将患者分层，13基因标志集的高表达的患者被诊断为处于慢性异体移植物损坏的风险，此后进行治疗来预防这种损坏。按照本发明，具有 13种基因的高表达的患者可以使用例如实时PCR、Nanostring或miSeq来鉴定。在每种情况下，产生标准物作为基线，用于鉴定处于慢性异体移植物损坏或IF/TA风险的患者。

使用RT-PCR、nanostring和miSeq的诊断截断值的确定

使用患者的训练集，将对来自活检样品的mRNA分析13基因标志集的表达水平。根据这种表达数据，将开发数学模型来评估一年时患者发展纤维化的概率。将根据这种计分敏感性/特异性来将患者分层，确定阳性预测值(PPV) 和阴性预测值(NPV)。根据PPV和NPV，将建立最佳截断值，其最好地归类患者的排斥风险。这可以清楚地截断为两个组，如果他们处于顶部组，他们的表达水平显著更高，他们有更高的可能性发展纤维化，并且测试确定为阳性，但如果他们处于底部，他们有极低的可能发展纤维化，测试确定为阴性。在可选择的实施方式中，可以根据如上确定的他们的概率分值将患者分入三分位(tertiles)。在这种情况下，如果患者处于(1)顶部三分位，他们的表达水平显著更高，他们具有很高可能性发展纤维化，且测试确定为阳性；(3)如果他们处于第二三分位或中间组，他们的风险不能精确地确定；以及(3)如果他们处于底部三分位，他们有极低的可能发展纤维化，测试确定为阴性。

RT-PCR分析试剂盒包括：

1)引物容器(16个试管，每管一个qPCR分析，对16个基因，包括本发明的13 个面板基因标志集和持家基因(ACTB和GAPDH)以及对照探针18s)。分析购自LifeTech。引物如下。

2)Universal Master Mix II：用于qPCR反应的试剂

3)ARRAY 96-孔板6x16

4)Agilent Affinity Script QPCR cDNA合成试剂盒：用于最高效率地将RNA转化为cDNA，并且是为实时定量PCR(QPCR)应用完全优化的

*INV＝存货

实验过程和数据分析：

使用Allprep试剂盒(QIAGEN-ALL prep kit,Valencia,CA USA)从异体移植物活检样品中提取总RNA。以oligo dt引物用Affinity Script RT试剂盒 (AgilentInc.SantaClara,CA)合成cDNA。13基因标志集、2个持家基因(ACTB、 GAPDH)和18s的TaqMan qPCR分析购自ABI Life Technology(Grand Island, NY)。使用TAQMAN通用混合物在cDNA上进行qPCR实验，并且将用 ABI7900HT***监视和获取PCR反应。样品将测量三次。将对13成员标志基因集以及2个持家基因产生循环时间(CT)值。通过从每个基因的CT值中减去持家基因的平均CT值来计算每个基因的ΔCT值，然后将使用logistf R包的惩罚型逻辑回归拟合模型应用在ΔCT值上来推导出统计模型，从其计算每个患者的高概率分值。

其中(p(x)是高CADI的概率，β^* _i是惩罚系数，gi是基因i的表达ΔCT)

基于概率分值、预测AUC、敏感性/特异性，确定阳性(PPV)和阴性预测值(NPV)。在给定的特异性(90％)下建立最佳的截断值，其最好地归类患者肾脏纤维化的风险。

实施例A

45人群组患者(18人：CADI≥2，27人：CADI<2)的独立群组用作qPCR 分析的训练集。提取RNA样品并使用这种qPCR分析试剂盒进行qPCR实验。在数据获取和标准化之后，构建具有以下β值(表1)的惩罚型逻辑模型，且训练集上的预测AUC是0.866。基于训练集的统计模型将用于预测新样品的肾纤维化的概率，概率计分截断值在90％特异性下是0.548。

表1.来自qPCR训练集的用于惩罚型逻辑回归模型的参数

	β	sd(β)	低95	高95	Chisq
						(截距)	-0.365	5.499985	11.1826	10.41205	0.005216
KLHL13	0.121359	0.121611	0.06046	0.514791	1.642695
						MET	-0.31735	0.247157	0.93868	0.066704	2.564086
KAAG1	0.279196	0.532691	0.75299	1.40152	0.266769
						SERINC5	0.110388	0.492916	-0.785	1.022298	0.06097
CHCHD10	0.594793	0.513221	0.32058	1.637405	1.58411
						SPRY4	-0.39334	0.721153	2.26251	0.839415	0.349045
FJX1	0.204501	0.33905	0.43074	0.932129	0.403804
						RNF149	0.06954	0.457496	0.73284	0.898595	0.03126
ST5	0.740591	0.767047	0.48276	2.930863	1.272416
						TGIF1	-0.40004	0.454692	1.32842	0.344652	1.089256
RXRA	-0.28701	0.237485	0.76594	0.099958	2.098098
						ASB15	-0.23106	0.173426	-0.6974	0.062775	2.251056

Nanostring分析试剂盒：

Nanostring分析试剂盒包括：

1)订制的CodeSet(用于13基因面板的条码探针集，包括3个持家基因和阴性对照，由Nanostring提供)包

2)Master试剂盒，包括nCounter Cartridge、nCounter Plate Pack和 nCounter Prep Pack

3)用于提取高质量总RNA的QIAGEN试剂盒

Nanostring实验：

遵照制造商的实验方案用QIAGEN试剂盒提取总RNA；使用主试剂盒在65℃下的溶液中使条码探针与总RNA退火。捕获探针将捕获要被固定用于数据的目标。在杂交之后，将样品转移到nCounter Pre Station，探针/ 目标固定在nCouter Cartridge上，然后通过nCounter数字分析仪计数探针。

mRNA转录组数据分析

来自Nanostring分析仪的原始计数数据在以下过程中处理，原始计数数据首先相对于持家基因的计数进行标准化，计数低于阴性对照计数的中值加 3倍标准偏差的mRNA将被滤出。由于来自试剂批次的数据变异，来自不同试剂批次的每个mRNA的计数将通过乘以在不同试剂批次上样品的平均计数比例的因子来校准。来自不同实验批次的校准的计数将进一步通过 ComBat程序包来调整。

然后用logistfR程序包将惩罚型逻辑回归拟合模型应用于标准化的计数值来推导出统计模型，从所述统计模型计算每个患者的概率分值。

来自Nanostring分析仪的原始计数数据将按以下过程处理：原始计数数据首先相对于持家基因的计数进行标准化，计数低于阴性对照计数的中值加 3倍标准偏差的mRNA将被滤出。由于来自试剂批次的数据变异，来自不同试剂批次的每个mRNA的计数将通过乘以在不同试剂批次上样品的平均计数比例的因子来校准。来自不同实验批次的校准的计数将进一步通过 ComBat程序包来调整。

然后用logistf R程序包将惩罚型逻辑回归拟合模型应用于标准化的计数值来推导出统计模型，从所述统计模型计算每个患者的高可能性的概率分值。

其中(p(x)是高CADI的概率，β^* _i是惩罚系数，gi是基因i的计数)

基于概率分值、预测AUC、敏感性/特异性，确定阳性(PPV)和阴性预测值(NPV)。在给定的特异性(90％)下建立最佳的截断值，其最好地归类患者肾纤维化的风险。这可以清楚地截断为两个组，如果他们处于顶部组，他们有更高的可能性发展纤维化，并且测试确定为阳性，但如果他们处于底部，他们有极低的可能发展纤维化，并且测试确定为阴性。可选择的是，可以根据如上确定的他们的概率分值将患者分入三分位。在这种情况下，如果患者处于(1)顶部三分位，他们具有很高可能性发展纤维化，且测试确定为阳性；(2) 他们处于第二三分位或中间组，他们的风险不能精确地确定；以及(3)如果他们处于底部，他们有极低的可能发展纤维化，测试被确定为阴性。

MiSEQ实验：

MiSEQ分析试剂盒将包括：

1)订制分析(用于13基因面板的条码探针集，包括5个持家基因面板)

2)RNA样品制备试剂盒v2

3)QIAGEN试剂盒，用于提取高质量总RNA

MiSEQ实验：

使用QIAGEN试剂盒提取总RNA。遵照制造商的实验方案用RNA样品制备试剂盒v2生成测序文库：简要地，首先从总RNA纯化含有polyA的mRNA并片段化。使用随机六聚体引物和逆转录酶进行第一链cDNA合成，随后是第二链cDNA合成。在将cDNA的突出端转化为钝端的末端修复过程之后，多个标引衔接子添加到双链cDNA的末端。接下来，使用对基因面板和持家基因特异的引物对进行PCR来富集靶标。最后，标引的文库进行验证、标准化并集中，用于在MiSEQ测序仪上测序。

mRNA转录组数据分析

MiSEQ测序仪产生的原始RNAseq数据将使用以下过程处理：使用公知的BWA比对算法，优质的读出结果首先与包括hg19人类基因组、外显子、剪接接点的几个人类参考数据库，以及包括核糖体和线粒体RNA序列的污染数据库比对。在滤除了定位于污染数据库的读取结果之后，与期望的扩增子区域最大2个碱基错配而独特对齐的读取结果被作为相应基因的表达水平进行计数，在log2变换之后进一步进行样品间的分位数标准化。

然后将logistf R程序包的惩罚型逻辑回归拟合模型应用于标准化的计数值来推导出统计模型，从所述统计模型计算每个患者的高可能性的概率分值。

(其中(p(x)是高CADI的概率，β^* _i是惩罚系数，gi是基因i的计数)。基于概率分值、预测AUC、敏感性/特异性，确定阳性(PPV)和阴性预测值(NPV)。在给定的特异性(90％)下建立最佳的截断值，其最好地归类患者肾纤维化的风险。这可以清楚地截断为两个组，如果他们处于顶部组，他们具有13成员基因标志集的显著更高的转录水平和高的可能性发展纤维化，并且测试被确定为阳性，但如果他们处于底部，他们有极低的可能发展纤维化，并且测试被确定为阴性。可选择的是，可以根据如上确定的他们的概率分值将患者分入三分位。在这种情况下，如果患者处于(1)顶部三分位，他们具有13成员基因标志集的显著更高的转录水平和发展纤维化的高可能性，并且测试被确定为阳性；(3)如果他们处于第二三分位或中间组，他们的风险不能精确地确定；以及(3)如果他们处于底部三分位，他们有极低的可能发展纤维化，测试确定为阴性。

鉴定移植后早期面临渐进性移植物损伤风险升高的患者的预测性基因集的开发具有若干种应用：基于风险概况(risk profile)的个体化治疗，包括靶向“风险”个体用于早期，基于风险概况的个体化治疗，包括靶向“风险”个体用于早期介入和在具有良好预后的个体中最小化治疗。此外，它可以用于临床试验中的风险分层，容许在目标人群中测试新的治疗方案。

总之，已经开发和验证了来自于3个月时功能稳定的肾异体移植物的程序性活检的基因标志。所述基因标志鉴定到12个月时有组织学衰退和功能下降风险的肾异体移植物接受者。这种基因标志被外部证实了预测遭遇各种有害结局的异体移植物，呈现了中期和长期有风险的肾脏。所述基因标志还有潜力鉴定可以受益于较低强度的较低风险的异体移植物接受者。

本发明涉及鉴定处于发展慢性异体移植物损伤风险中的肾异体移植物接受者的方法，所述损伤表现为间质性纤维化和肾小管萎缩(IF/TA)。患者可以在3、6、9、12个月时监测，此后每年监测。当患者被鉴定为处于发生慢性异体移植物损伤风险中时，本发明包括治疗这样的患者的方法。治疗途径可以是如下的：在通过参数确定为低免疫学风险的、被鉴定为慢性异体移植物纤维化高风险的患者中，所述参数包括没有急性排斥、亚临床的排斥，包括通过Banff标准(American Journal of Transplantation 2008；8:753–760)所定义的边界线亚临床排斥，供体特异性抗体，以及低的计算的面板反应性抗体 (Panel ReactiveAntibodies，PRA-抗HLA抗体的度量)，所述方法包括但不限于，撤除钙调磷酸酶抑制物(CNI)，例如环孢霉素或他克莫司，用较少产生纤维的免疫抑制药物替代，例如，贝拉西普(belatacept)或西罗莫司；以及，在具有亚临床的排斥，包括通过Banff指标(AmericanJournal of Transplantation 2008；8:753-760)所定义的边界线亚临床排斥，被鉴定为处于慢性异体移植物纤维化风险的那些患者中，所述方法包括但不限于，提高免疫抑制，例如，钙调磷酸酶抑制物(CNI)如环孢霉素或他克莫司剂量的提高，或添加另一种药剂，例如，***或吗替麦考酚酯。

此外，被鉴定为处于发生慢性异体移植物损伤风险的患者可以用抗纤维化药剂治疗，例如，吡非尼酮、松弛素、骨骼形态发生蛋白7(BMP-7)、肝脏生长因子(HGF)6。

以下使用实施例描述本发明，所述实施例意图进一步描述本发明而不限制其范围。

在以下的实施例中，使用以下的材料和方法。

患者群体和活检样本

本文描述的患者的排除指标包括，阳性的T/B-CDC交叉匹配，供体特异性抗体的脱敏作用，儿科接受者和不能给予知情同意的。程序性肾异体移植物活检物在移植后0、3、12和24个月在3个位点获取，在0和24个月在2个位点获取。三个月的程序性活检对244名患者进行，其中的204人具有相应的12 个月活检。对前159例3个月程序性活检物(下文中，“m3_Bx”)进行微阵列，其余45例用于验证。

数据采集

在基线采集供体和接受者数据。供体信息包括供体年龄、种族、性别、 HLA、死亡原因、存活还是死亡的状态(SCD、ECD或DCD)。接受者数据包括年龄、性别、种族、末期肾病(ESRD)的原因、HLA、PRA、抗-HLA抗体、冷缺血时间(CT)、延迟的移植物功能(DGF)、诱导和维持免疫抑制、巨细胞病毒(CMV)状态、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)状态，持续3、 6、12和24个月，包括身体检查、当前的感染、实验室结果(CBC、BUN、肌酐、代谢面板和免疫抑制水平)。此外，当进行临床指示的活检时采集临床数据。

HLA抗体筛选

使用One Lambda珠子(One Lambda Inc,Canoga Park,CA)在基线时分析血清的循环抗-HLA抗体。平均荧光强度(MFI)>1000被认为是阳性的。使用HLA Fusion软件在Luminex Lab Scan200^TM上分析样品。使用供体和接受者HLA分型来确定供体特异性抗体(DSA)。在移植之前或之时具有预先形成的DSA而需要脱敏程序的患者被排除出这项研究。

组织病理学和诊断分类

从研究群组的3个月和1年程序性肾脏活检物的每一个中采集两个组织核心。处理一个核心用于组织学，处理另一个核心用于mRNA。当仅可获得一个核心时，优先给予mRNA。

处理肾脏活检物，在中央进行读取。处理***固定的、石蜡包埋的切片用于组织学染色(苏木精和伊红，高碘酸Schiff，三色和Weigerts弹性染料)。对用兔多克隆抗体(American Research Products,Inc.)染色的石蜡切片在自动化染色仪上进行C3d的免疫组织化学。所有载玻片用全片扫描仪(Aperio CS)进行扫描，高分辨率的数字图像归档于图像数据库中。

由不了解临床数据的2位肾脏病理学家，使用肾异体移植物病理学的公知的修订Banff 2007分类法独立地对活检物进行评估和计分。当诊断不一致时，与第三位病理学家会诊取得一致的诊断。所有的病例在全载玻片图像上进行计分。分值输入常规的FilemakerPro数据库，所述数据库计算Banff类别和慢性异体移植物损坏指数(CADI)。

微阵列实验、数据分析和交叉验证

以下描述微阵列实验和数据分析的细节。简要地，提取来自活检样品的总RNA样品，使用Affymetrix人类外显子1.0ST阵列进行微阵列实验。用RMA 算法7提取基因级别的强度数据，在质量评估之后使用开源的ComBatR程序包8校正实验分批效应。通过Spearman相关性分析鉴定出表达与3个月或12个月CADI相关的基因，然后进行总体的基因本体(GeneOntology)富集。根据相关性分析与CADI相关基因有关的GO功能/途径也使用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)进行验证(9)。

为了鉴定最小的基因集来预测未来的肾脏纤维化，采用焦点基因集。根据通过100次随机化分析，随后校正混杂的临床参数(CIT、死亡供体、供体年龄、抗HLA抗体、急性排斥)所确定的，基因集与12个月CADI特异性地相关。在对焦点基因集进行拟合罚分逻辑回归模型的5000次迭代之后，鉴定出具有最佳的预测AUC分值的最优基因集。在我们的数据上进行100次迭代，使用3重交叉验证方法交叉验证了所述基因集。通过对独立的患者群组进行定量聚合酶链式反应(qPCR)，也通过对来自不同阵列平台的三个独立的公众可获得的数据集(11-13)进行分析，进一步验证了所述基因集。微阵列表达文件上传到Gene ExpressionOmnibus网站(GSE)上。

临床数据的统计分析

描述性统计学(平均值和标准偏差)用于概述供体和接受者的基线特征，并使用卡方检验和Fisher确切检验在研究组(高CADI-12对比低CADI-12，发展者对比非发展者)之间进行比较。使用非配对T-检验(用于相应的非参数分析的Mann-Whitney检验)进行连续变量的单变量比较。对研究的持续期间标绘Kaplan–Meier曲线，以移植物损失(未审查死亡)作为结局。使用Log秩检验和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验比较不同群组的存活曲线。P<0.05被认为是显著的(Graph Pad Prism version 5.03,Graphpadinc,LaJolla,CA)。为了确定在移植后十二个月具有高CADI(分值≥2)的预测因子，使用回溯预测子选择进行多重逻辑回归。评估的预测子有：供体年龄、供体种族、供体性别、供体状态、3个月之前的急性排斥、接受者种族、接受者性别、扩展的指标供体、诱导和维持免疫抑制治疗、以及抗HLA抗体的存在。冷缺血时间和延迟的移植物功能在仅包括死亡供体的亚组分析中考虑。构建使用相同预测子的逻辑模型来评估在全部移植群体中，以及在仅死亡供体的群体中12个月时进展的预测因子。所有的分析使用SAS9.2版(SAS,Cary,North Carolina)完成。

补充方法

临床数据采集

在基线采集供体和接受者数据。供体信息包括供体年龄、种族、性别、 HLA基因分型、死亡原因，以及异体移植物状态(即，SCD、ECD或DCD)。接受者数据包括年龄、性别、种族、ESRD的原因、HLA基因分型、PRA、抗-HLA抗体的存在和类型、交叉匹配状态、冷缺血时间(CIT)、延迟的移植物功能(DGF)、免疫抑制疗法、CMV状态、HCV和HBV状态、透析年期(dialysis vintage)、透析形式、输血历史、妊娠历史和早先的移植。

组织病理学：

从慢性异体移植排斥(GoCAR)群组的基因组的3个月和1年程序性肾脏活检物的每一个中采集两个组织核心。处理一个核心用于组织学，处理另一个核心用于mRNA。当仅可获得一个核心时，3个月的优先给与mRNA，12 个月的优先给与组织学。处理肾脏活检物，在中央进行读取。处理***固定的、石蜡包埋的切片用于组织学染色(苏木色素和曙红，高碘酸Schiff，三色和Weigerts弹性染料)。对用兔多克隆抗体(American ResearchProducts, Inc.)染色的石蜡切片在自动化染色仪上进行C4d的免疫组织化学。所有载玻片用全片扫描仪(AperioCS)进行扫描，高分辨率的数字图像归档于图像数据库中。

由不了解临床数据的2位肾脏病理学家，使用肾异体移植物病理学1(SIS 参考文献)的Revised Banff 2007分类法独立地对活检物进行评估和计分。当诊断不一致时，与第三位病理学家会诊取得一致的诊断。所有的病例在全载玻片图像上进行计分。分值输入计算Banff类别和慢性异体移植物损坏指数 (CADI)的订制Filemaker Pro数据库。CADI-分值是复合的计分，包括六个组织学部分——血管内膜硬化(cv)、肾小管萎缩(ct)、间质性纤维化(ci)间质性炎症(i)、肾小球膜基质升高(mm)和肾小球硬化(g)。每个部分在0至3之间计分，最大可能的分值为18。程序性活检物中的CADI-分值已经由几名作者2-3 验证与结局直接相关。

微阵列实验

使用Allprep试剂盒(QIAGEN-ALL prepkit,Valencia,CAUSA)从移植后3 个月获得的经皮异体移植物活检样品提取总RNA，并使用RNA-later(Qiagen, Inc)稳定化。使用Bioanalyzer2100(Agilent Technologies)评估RNA质量。RNA 完整性数大于八的样品用于随后的微阵列实验。根据厂家(Affymetrix Inc.)提供的标准方案使用Affymetrix小鼠外显子1.0ST阵列。简言之，ENCORE扩增和标签试剂盒(NuGen,SanCarlos,CA)应用于第一批样品，从约100ng总RNA 开始产生用于与芯片杂交的生物素标记的RNA片段。对于低RNA浓度的样品，使用Nugen Ovation PICO扩增试剂盒(NuGen,SanCarlos,CA)。使用GeneChipScanner7G(Affymetrix Inc.)扫描芯片。

微阵列数据处理

提取基因级别的微阵列实验的强度数据，用RMA算法4总和。使用 AffymetrixExpression Console(Affymetrix Inc)评估数据质量。Affymetrix对照探针集和在所有样品中低强度的探针集从下游分析中排除。使用ComBatR软件包5调节分批效应。

生物信息分析

使用统计学的R程序包进行生物信息分析的工作流程。分析的目标是得到相对健壮的基因的集(～10-20个)，其预测慢性异体移植物肾病的发生。

异体移植物转录标志的鉴定：

在3个月的异体移植物基因表达数据上，为3个月异体移植物CADI分值 (CADI-3)以及12个月CADI分值(CADI-12)进行Spearman相关性分析。对每个基因计算表达水平和CADI分值之间相关性的相关系数和p-值。还使用线性回归模型计算基因表达相对于CADI分值的斜率。选择p值<0.05的基因。相应于 3个月或12个月的CADI分值产生两列p<0.05的基因。基于Fisher确切检验通过基因本体(GO)富集分析确定这两列基因的注释的功能和分子机制。可选地，分析基因表达数据集来确定在具有更高CADI分值的活检物中富集的生物学功能。为了实现这一点，我们将基因集富集分析(GSEA)(6-7)应用于整个微阵列数据集，并确定与低CADI分值(CADI<2)对比在高CADI分值(CADI≥2)的样品中富集的基因功能。确定与高CADI组和低CADI组都相关的高位的GO 术语，与上文描述的从基因表达水平和CADI分值之间的相关性分析推导的 GO富集分析结果相比较。

预测分析：

为了从与CADI分值具有统计上显著相关性的大的基因列表中推导出更显著的和焦点的基因集，通过应用各种统计预测模型来过滤基因列表。首先，患者的整个群组按1：1比例随机分配到2个组中。应用Spearman相关性分析来确定表达水平与3个月和12个月的CADI分值的严重度相关的基因。所述1:1 的随机化重复100次，对100次迭代的每一次进行基因表达与3个月和12个月的CADI分值的相关性分析。在随机化的100次迭代中在两个组中与CADI的相关性P<0.05发生超过两次的基因被认为是聚焦的基因集，从其中鉴定出最小的预测集用于预测肾脏纤维化。推导出专属于CADI-12焦点基因集的基因 (即不与CADI-3焦点基因集共有的基因)，通过校正临床干扰因子(供体年龄、活的vs死的供体、供体性别和种族、CTI min、诱导治疗、抗HLAI类和II类抗体)，使用多重线性回归分析来进一步过滤，并排除低的中值log2强度小于 5的基因。

最后，进行迭代逻辑模型拟合(5000次迭代)来鉴定用于预测未来的肾脏纤维化的最佳和最小的基因集。起初，从过滤的CADI-m12焦点基因集中随机选择20个基因。20个基因的组的表达数据拟合到惩罚型逻辑回归模型中，用于预测高(CADI≥2)和低(CADI<2)CADI。对20个基因的组的每一个，从回归模型鉴定与高/低CADI显著相关(p<0.05)的基因。上述步骤重复5000次。从每次迭代操作中鉴定出统计学上显著的基因(P<0.05)。计算5000次迭代中显著性基因的出现。最后，将通过出现数量排序的前40个基因应用回惩罚型逻辑回归模型，用于高vs.低CADI预测。使用这一模型的统计学上显著的基因 (P<0.05)被认为是最终的最佳基因集。使用该最终的最佳基因集从逻辑回归模型计算AUC值和敏感性和特异性。最终的最佳基因集的接收工作特性曲线与相等大小的随机选择的基因集比较用于预测高vs.低CADI，来证明最终的最佳基因集得到最好的预测。此外，选出10000个随机选择的基因集，计算这些基因集的AUC，与最终的最佳基因集的AUC比较。

最终的最佳基因集使用3倍交叉验证方法进行交叉验证。简要地，患者随机分入相等大小以及高低CADI患者数量相等的3个组中，任意两个组的数据用作训练集，第三个用作预测集。将在训练集上构建的惩罚型逻辑回归模型应用于预测集，来预测结局和真假阳性率。从预测数据集计算预测精确性，然后从三种可能的排列中进行平均。这些步骤重复超过100次。计算总体的真假阳性率和预测精确性。对于100次迭代，基于使用训练集推导出的模型在测试集上AUC的分布进行绘图。为了进一步评估预测的置信度，将小组标记随机分配给患者，在小组标记变序的数据上计算AUC。上述步骤重复10000 次，计算来自10000次迭代的AUC高于原始AUC的比例。

也进行不同的CADI-12阈值(高CADI-12≥3，或高CADI-12≥4)下的预测，来评估13基因集预测的健壮性。为了研究所述基因集的预测是否优于临床变量的预测，通过包括入以下人口统计学/临床变量进行多变量逻辑回归用于预测高/低CADI-12：CADI-3、供体_年龄、死亡的_供体、ECD_肾脏、DGF、性别、种族、CIT_min、诱导_治疗、抗_HLA_Ab_类_I、抗_HLA_Ab_类_II、他克莫司和CYA。在分步的选择之后，保持显著性的变量用于最终的模型中。然后计算最终模型的ROC曲线的AUC，与用所述基因集的CADI-12预测相比较。最后检查炎症是否是13基因集的驱动因素，在101位患者中在12个月时评估急性排斥的预测精确性，以及对于没有急性排斥的患者，评估高/低 CADI-12的预测精确性。

为了测试基因集是否可以预测移植后的早期移植物损失，对于初始的 155位患者，在排除了携带有功能的移植物死亡的4位患者之后，首先，对3 年内有移植物损失或已经跟踪至少三年而没有移植物损失的那些患者应用所述基因集的逻辑回归预测模型，并计算AUC。第二，对所有155名患者进行存活分析，来检查所述基因集是否与移植物损失相关：首先进行13个基因的表达数据的主成分分析(PCA)，前10个主成份(PC)被应用于移植物损失时间的Cox比例危险模型。选择与移植物损失显著相关的主成份(PC)，显著成分的特征值的线性组合乘以来自Cox模型的相应PC的相关系数，用作基因集风险分值(GR-分值)。人口统计学的和临床的变量，包括CADI-3、延迟的移植物功能、3个月或之前的急性排斥、针对HLA1或HLA2的抗体、供体种族、供体年龄、接受者种族、接受者年龄、供体状态(活的/死亡的)以及诱导治疗，单独地或与基因集风险分值组合，在移植物损失时间的Cox比例危险模型中拟合，来研究是否有任何人口统计学的或临床的变量与移植物损失相关。然后根据基因集风险分值(GR-分值)将患者分层到两个群体中，用于 Kaplan-meier存活分析。最后，标绘出移植后2年或3年内移植物损失预测的时间依赖性ROC，并计算AUC。

基因集的验证：

还在两个独立的公众数据集上验证了最终的最佳基因集。两个公众数据集都位于Affymetrix GeneChip平台HU430plus2上(GSE213748,GSE259029)。与上文描述的请求的数据集进行的类似，这些公众数据集的原始数据在 Affymetrix Expression Console上处理。提取最终的最佳基因集中每个基因的表达数据。使用惩罚型逻辑回归模型进行临床数据的预测(对于GSE21374，活检后任何时间的移植物损失，和对于GSE25902，基于CADI分值的进展者/非进展者)。从ROC曲线计算这2个数据集的每一个的AUC分值，用于预测特异性和敏感性。还使用与GOCAR数据集相同的方法，对数据集1进行 (GSE21374)移植物损失时间分析。

还使用如上所述相同的方法应用最佳基因集来预测进展者和非进展者。 CADI-3≤3并到12个月时展现了ΔCADI≥2的患者被认为是进展者，ΔCADI ≤1的患者被认为是非进展者。对于在24个月时有CADI分值的患者，以及 CADI-3≤2的患者进行类似的评估。

qPCR实施例

使用Allprep试剂盒(QIAGEN-ALLprep试剂盒，Valencia,CA USA)从45 名独立的群组患者(18人：CADI≥2；27人：CADI<2)的异体移植物活检样品中提取总RNA。用寡聚dt引物(Agilent Inc.SantaClara,CA)使用Affinity ScriptRT试剂盒合成cDNA。用于13基因集、3个持家基因(ACTB、GAPDH 和RPLP0)和18s的TaqManqPCR分析购自ABI LifeTechnology(GrandIsland, NY)。使用TAQMAN通用混合物对cDNA进行qPCR实验，使用ABI7900HT ***监视和获取PCR反应。样品测量三次。产生预测基因集以及3个持家基因的CT值。通过从每个基因的CT值中减去持家基因的平均CT值来计算每个基因的ΔCT值，然后对ΔCT值应用惩罚型逻辑回归拟合模型用于预测45名患者的高和低CADI，然后如上所述计算AUC值。

实施例1：患者群体和移植物结局。

588名患者被包括在群组中；基于包含指标，204名患者被包括在当前的研究中。当使用CADI分值量化时，60％的12个月活检物具有0-1的CADI，23％为2-4，17％的超过4。正如所料，CADI-12与12个月的eGFR负相关(r＝0.35； p＝0.0004)，和CADI-12≥2与3年移植物存活相关(log排名p＝0.007)；根据与移植物存活的相关性，高CADI-12被定义为≥2 5 10。表1概括了基于CADI的患者人口资料。在多变量回归中，与高CADI-12显著相关的临床因子是供体年龄，接受者)。

在159个m3_Bx上进行微阵列，其中101个具有相应的12个月的程序性活检。缺乏12个月的活检的原因包括移植物损失(n＝8)、死亡(n＝1)、跟踪丢失 (n＝9)、禁忌症/不能获得活检物(n＝40)。在159名微阵列患者与101位有一年活检的之间，在临床变量上没有差异(表1)。86名患者有可用于病理学的第二个 m3活检物核心，55％的CADI0-1，33％的2-3，12％的CADI>3。在20/86人(23.5％) 的m3_Bx[13人-边线，3人-IA，1人-IB，3人-IIA]中诊断出亚临床的急性排斥，而52％被报告为正常。

实施例2：移植物内分子表型是时间依赖性的。

通过相关性分析和基因集富集分析(GSEA)分析来自m3_Bx的基因表达分布，以了解IF/TA的分子机制(n＝159)。在未调节的截断值p<0.05下，鉴定出1,316个基因与CADI-3显著相关(806个正相关，510个负相关)，1,056个基因与CADI-12显著相关(852个正相关，204个负相关)。仅176个基因(13.2％) 与CADI-3和CADI-12都相关。基因本体富集表明，单独与CADI-3特异性相关的转录产物与异体免疫相关，包括T-细胞活化；而涉及程序性细胞死亡/ 细胞凋亡和细胞粘附的基因与CADI-12单独相关。通过GSEA方法进一步确认生物学功能，其中比较了在3个月或12个月时具有高(≥2)和低(<2)CADI的患者之间GO类别中的基因表达数据。

实施例3：3-个月的转录组鉴定出处于慢性异体移植物损坏风险的肾脏

分析获自m3_Bx的转录组来鉴定对CADI-12有预测性的最小基因集(补充方法)。起初，鉴定出169个基因，与CADI-12特异性相关而不与CADI-3相关。在排除低强度的与和对临床参数调整之后，这169个基因减少为85个基因的集合(表4)。对这85个基因的表达数据迭代应用惩罚型逻辑回归拟合鉴定出13基因集，其以1的曲线下面积(AUC)从低CADI-12中区分出高CADI-12(表 2)。这高于从初始的85个基因中随机选择的13基因集的AUC(平均AUC0.87 ±0.025)。使用训练集和测试集的随机分配，对该基因集进行3重交叉验证 (100次)。测试集的平均敏感性、特异性和预测准确性分别是95％、82％、86％。 100个测试集的平均AUC[0.947(95％CI:0.942-0.952]高于10000次迭代对随机分配的高和低CADI患者组预测获得的任何AUC。在不同的截断下，包括 CADI-12≥3或≥4，对CADI-12获得的AUC分别是0.986和0.963，确认了本发明的基因集的健壮性。基因集的预测优于临床-病理学变量(AUC＝0.783)，组合高CADI-12的临床参数预测不会增强所述基因集的性能。重要的是，该基因集还基于Banff分值(Ci+Ct)精确地预测纤维化(AUC＝0.092)。亚临床的排斥存在于二十例m3_Bx中，并且与高CADI-12(p＝0.0003)和BANFF分值 (Ci+Ct)(p＝0.002)相关。排除有排斥的或i+t>2的m3_Bx，不改变由本文公开的基因集的高CADI-12预测(AUC＝1)，同时13基因不良地预测ACR (AUC＝0.743)。这一点与预测Ci+Ct能力一起证明了炎症不是它的衍生的优势驱动因素。最后，当用相似的人口资料作为训练集在独立的GoCAR群组上通过qPCR验证时(表S4)，该基因集精确地区分高vs.低CADI-12(AUC＝0.866)。

实施例4：转录组预测慢性异体移植物损坏的进展

接下来，应用该基因集来将具有最小纤维化或没有纤维化的m3_Bx分类为发展或不发展渐进性纤维化。从初始的101名患者中，CADI-3≤3的那些异体移植物(n＝68)被鉴定出，根据从3个月到12个月时CADI的改变表征了两个组：(1)ΔCADI≥2的进展者(n＝1)；和(2)ΔCADI≤1的非进展者(n＝51)。表5比较了进展者vs.非进展者的3个月和12个月的活检病理分值。进展者具有主要由 ci分值驱动的3个月时的较高的CADI；然而，单独的CADI-3不能用于从非进展者区分进展者。临床参数也是进展的不良预测子(AUC＝0.642)。在12个月(AUC0.984)和24个月(AUC0.859)下，所述公开的基因集精确地从非进展者中鉴定出CADI进展者。当分析CADI-3≤2的原始异体移植物时，它预测了到12 个月和24个月时的CADI进展(分别地，AUC＝1和0.84)。这些发现具有临床重要性，因为在36个月跟踪中，进展者的移植物存活比非进展者差 (Gehan-Breslow-Wilcoxonp＝0.01；Log-排名p＝0.06)。

实施例5：转录组标志预测早期异体移植物损失

接下来用本发明的基因集和临床变量产生Cox-模型来对公开的群组预测死亡审核的移植物损失(移植物损伤n＝11)。13基因的表达数据的三个主要成分(P4、P6和P7)与Cox比例危险模型中的移植物损失显著相关(p<0.05)(表S5)，被用于推导(基因集风险分值”(GR-分值)(移植物损失HR 2.719，95％CI 1.60-4.63)。基于这种GR-分值，患者被分层到相等大小的两个组中，更高的分值与移植物损失显著相关(Log-排名p<0.002)。使用GR-分值，移植后2年和 3年的时间依赖性移植物损失的AUC分别是0.863和0.849。在临床变量中，仅延迟的移植物功能与移植物损失显著相关(表6)。然而，基因集与延迟的移植物功能的组合不能改善预测。

实施例6：预测性基因集的验证

为了确认13基因集在各种情境下的实用性，两个独立的公众可获得的数据集使用移植物损失的终点和CADI作为慢性异体移植物损伤的指标来进行分析(表9)。对于每个数据集，该基因集精确地预测相关的终点，性能好于原始研究报道的AUC。使用本发明的基因集对数据集-1的存活分析显示了对于移植物损失分层为高风险和低风险组之间的显著差异(p＝2.1e-9)；活检后1年和2年内移植物损失的AUC分别是0.865和0.807。这些数据证明了，这种13 基因集可以跨群体应用，用于预测多样的而又临床上重要的结局，包括异体移植物存活。

实施例7：根据本发明的13基因标志集

KLHL13、KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、 WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、RXRA、ASB15。这些基因的本领域公认的名称在表2中显示。

表1：人口统计学和临床特征(高-和低-CDAI-12；CDAI-进展者和非进展者)

图例：CADI-12个月时慢性同种异体移植物损坏指数；MFI-平均荧光强度；MMF-霉酚酸酯；CNI-钙调磷酸酶抑制物；DSA-供体特异性抗体；*仅死亡的供体； **94/101名患者具有测量的HLA抗体

#通过Mann-Whitney检验(非参数性比较)或非配对T-检验确定的P值

表2：多变量分析--12个月的CADI-分值≥2的临床协变量预测

#P-值-Wald卡方，*DD-死亡的供体，**LD-活的供体

***诱导治疗类别比较了淋巴细胞耗尽和淋巴细胞非耗尽诱导与无诱导治疗。

表3：13基因预测集

表4：85焦点基因集

表5：进展者非进展者之间的CADI子分值比较

*Mann-Whitney检验

表6：GoCAR患者群组的基线临床和人口学特征

*P-值，通过非配对T-检验(或非参数的)以及，卡方/Fisher确切检验。

**94/101&38/45名患者具有测量的HLA抗体。

#86/101&40/45名患者具有报道用于组织学的3个月活检

表7：13基因集的10个主成分与移植物损失在Cox比例危险模型中的相关性。

对10个df的可能性比例测试＝20.7，p＝0.023，n＝155，事件数＝11

表8；Cox比例危险模型中人口学或临床变量与移植物损失的相关性

*HLA抗体：dsa：供体特异性抗原，参考；ndsa：非dsa抗体；n：无抗体

诱导类型：LD：淋巴细胞耗尽；LND：淋巴细胞非耗尽；None；无诱导

*种族的参考：亚洲人

对24个df的可能性比例测试＝32.1，p＝0.123n＝135，事件数＝10

表9：GoCAR基因集在其他肾脏移植群组中的验证。

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本发明不能被限定于本文描述的具体实施方式的范围中。实际上，除此处描述的之外本发明的各种修改根据上述的说明书对本领域技术人员而言是显而易见的。这种修改也将落在附随的权利要求的范围之中。进一步要理解的是，所有的数值是近似的，是为了描述而提供的。整个本申请中引用的专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案为了所有的目的通过完全引用将其公开内容合并在本文中。

Claims (24)

1.一种鉴定处于慢性异体移植物损坏或间质性纤维化和肾小管萎缩(IF/TA)风险的肾异体移植物接受者的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供来自所述肾异体移植物接受者的活检样本；

(b)提供对比标准；

(c)从所述活检样本分离mRNA；

(d)从所述mRNA合成cDNA；

(e)检测步骤(d)的cDNA中的预选的基因标志集的转录水平

(f)将所述预选的基因标志集的转录水平与所述对比标准的转录水平比较，和

(g)如果所述预选的基因标志集的所述转录水平高于所述对比标准的所述转录水平，将所述肾异体移植物接受者诊断为处于慢性异体移植物损坏或IF/TA的风险。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述预选的基因标志集包含基因KLHL13、KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、RXRA和ASB15。

3.根据权利要求2所述的方法，其包括如果所述预选的基因标志集的转录水平显著地高于所述对比标准的转录水平，治疗所述肾异体移植物接受者来预防慢性异体移植物损坏或IF/TA。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述治疗包括向被鉴定为处于慢性异体移植物损坏或IF/TA风险的肾异体移植物接受者给予免疫抑制剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫抑制剂是环孢菌素。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述治疗包括通过向所述肾异体移植物接受者施用血管紧张肽转化酶来治疗被鉴定为处于慢性异体移植物损坏或IF/TA风险的肾异体移植物接受者。

7.根据权利要求1所述的方法，其包括使用选自由β肌动蛋白(ACTB)、60S核糖体蛋白P0(RPLP0)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和18s核糖体RNA构成的组的基因作为阴性对照。

8.一种用于鉴定处于慢性异体移植物损坏或IF/TA风险的肾异体移植物接受者的试剂盒，其包含具有对于13成员基因标志集的引物和印刷的使用说明书的容器。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其进一步包含具有用于持家基因的集合的引物的第二容器。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其进一步包含具有缓冲溶液的第三容器。

11.一种用于鉴定处于慢性肾损坏或IF/TA风险的肾异体移植物接受者的基因标志集，其包含基因KLHL13、KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、RXRA和ASB15。

12.根据权利要求3所述的方法，其中所述治疗包括向所述肾异体移植物接受者给予抗纤维化剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗纤维化剂是吡非尼酮。

14.根据权利要求3所述的方法，其中所述异体移植物损坏包括异体移植物排斥。

15.根据权利要求3所述的方法，其中所述异体移植物损坏是肾纤维化。

16.一种用于选择要治疗以降低慢性异体移植物损坏或IF/TA风险的肾异体移植物接受者的方法，其包括

(a)提供来自所述肾异体移植物接受者的活检样本；

(b)提供对比标准；

(c)从所述活检样本分离mRNA；

(d)从所述mRNA合成cDNA；

(e)检测步骤(d)的cDNA中的预选的基因标志集的转录水平；

(f)将所述预选的基因标志集的转录水平与对比标准的转录水平比较

和

(g)如果所述预选的基因标志集的所述转录水平显著地高于所述对比标准的所述转录水平，选择所述肾异体移植物接受者来治疗。

17.一种选择要治疗以降低慢性异体移植物损坏或间质性纤维化和肾小管萎缩(IF/TA)风险的肾异体移植物接受者的方法，其包括

将从所述肾异体移植物接受者获得的预选的基因标志集的转录水平与对比标准的转录水平比较，和

如果所述预选的基因标志集的所述转录水平显著地高于所述对比标准的所述转录水平，选择所述肾异体移植物接受者来治疗异体移植排斥、损坏或IF/TA。

18.根据权利要求17所述的方法，其包括治疗所选择的肾异体移植物接受者的异体移植物排斥。

19.根据权利要求17所述的方法，其包括治疗所选择的肾异体移植物接受者的异体移植物损坏。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述治疗包括给予免疫抑制剂。

21.根据权利要求1所述的方法，其包括用RT-PCR检测步骤(e)的预选的基因标志集的所述转录水平。

22.根据权利要求1所述的方法，其包括用Nanostring检测步骤(e)的预选的基因标志集的所述转录水平。

23.根据权利要求1所述的方法，其包括用MiSeq检测步骤(e)的预选的基因标志集的转录水平。

24.根据权利要求8所述的试剂盒，其进一步包含对比标准。